CN109706189B - 一种d-手性肌醇的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用微生物全细胞和/或其裂解液催化肌肉肌醇制备D‑手性肌醇的方法，包括构建表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和/或耐热肌醇单酮异构酶基因的工程菌，并将工程菌进行细胞膜通透性处理和/或破碎，然后利用透性工程菌或其裂解液将肌肉肌醇转化为D‑手性肌醇。本发明的方法与现有生产D‑手性肌醇的方法相比，具有生产工艺简单、生产成本低、产率高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种D-手性肌醇的制备方法，具体涉及一种利用微生物全细胞和/或其裂解液催化肌肉肌醇将其转化为D-手性肌醇的方法。
背景技术
D-手性肌醇(D-chiro-inositol，简称DCI)是肌肉肌醇(myo-inositol，MI)的一种差向异构体(图1)，在自然界中主要存在于豆科植物中。研究表明，D-手性肌醇在胰岛素信号传递过程中发挥着重要作用，是一种调节机体血糖的功能因子，其可改善机体对胰岛素的敏感性和葡萄糖代谢，因此可用于治疗II型糖尿病。另外，由于D-手性肌醇可降低血液中的雄性激素并促进***，目前在美国市场已有多个品牌的D-手性肌醇保健品用于治疗***。此外，D-手性肌醇还具有抗氧化活性和抗炎活性，并可抑制肝纤维化的发展。
D-手性肌醇可从荞麦等植物中提取，然而D-手性肌醇在这些植物中的含量不高，导致资源的利用率较差，分离提取的成本较高。D-手性肌醇也可以通过有机合成法制备，但由于步骤繁琐，副产物难以分离，同时会有毒性物质的残留，影响产品的品质；另外需要用到大量的有机溶剂，环境友好性差。此外D-手性肌醇可通过水解D-松醇或春日霉素生产，然而原料D-松醇或春日霉素的价格昂贵，因而经济性差。
近年来，随着生物工程技术的发展，生物转化合成D-手性肌醇成为新的发展趋势。Yoshida等(Yoshida K,et al,Genetic modification of Bacillus subtilis forproduction of D-chiro-inositol,an investigational drug candidate fortreatment of type 2diabetes and polycystic ovary syndrome.Appl EnvironMicrobiol 72:1310-1315,2006.)利用基因改造的枯草芽孢杆菌通过发酵法从肌肉肌醇转化为D-手性肌醇，但产率仅为6％。
因此，亟待开发一种生产工艺简单、产率高、低成本地制备D-手性肌醇的新方法。
发明内容
针对现有的制备D-手性肌醇的方法所存在的问题，本发明提供一种利用表达肌肉肌醇脱氢酶(myo-inositol 2-dehydrogenase，EC 1.1.1.18，简称IDH)和肌醇单酮异构酶(inosose isomerase，EC 5.3.99.11，简称KII)的全细胞和/或其裂解液催化肌肉肌醇生产D-手性肌醇的方法。该方法具有生产工艺简单、生产成本低、产率高等优点。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明涉及一种制备D-手性肌醇的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
(1)构建共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的工程菌、和/或分别表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的工程菌；
(2)将步骤(1)构建的工程菌进行发酵获得全细胞；
(3)将步骤(2)获得的全细胞进行细胞膜通透性处理和/或破碎，获得透性全细胞和/或裂解液；
(4)利用步骤(3)获得的共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的透性全细胞，表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的透性全细胞和表达耐热肌醇单酮异构酶的透性全细胞的混合物，共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的透性全细胞、表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的透性全细胞和表达耐热肌醇单酮异构酶的透性全细胞的混合物，共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的全细胞裂解液，表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的全细胞裂解液和表达耐热肌醇单酮异构酶的全细胞裂解液的混合物，和/或共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的全细胞裂解液、表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的全细胞裂解液和表达耐热肌醇单酮异构酶的全细胞裂解液的混合物催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇。
根据本发明，所述催化途径包括：由耐热肌肉肌醇脱氢酶在NAD+存在下将底物肌肉肌醇(MI)氧化为中间体2-酮基-肌肉肌醇(2-KMI)；由耐热肌醇单酮异构酶将中间体2-酮基-肌肉肌醇(2-KMI)异构化为另一中间体1-酮基-D-手性肌醇(1-KDCI)；由耐热肌肉肌醇脱氢酶在NADH存在下将中间体1-酮基-D-手性肌醇(1-KDCI)还原为产物D-手性肌醇(DCI)，如图2所示。在本发明的催化途径中，所需NAD+来自于所述工程菌细胞，即，本发明的方法不包括额外添加NAD+的步骤。
优选地，根据本发明，步骤(1)中，所述工程菌包含共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的载体、或者同时包含表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的载体和表达耐热肌醇单酮异构酶的载体、或者包含表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的载体、或者包含表达耐热肌醇单酮异构酶的载体。本领域技术人员可以理解，本发明所涉及的载体和工程菌可以通过本领域已知的常规方法制备，例如，通过重组DNA技术构建，获取肌肉肌醇脱氢酶的编码基因iolG和肌醇单酮异构酶的编码基因iolI，构建重组表达载体，转入宿主菌获得基因工程菌。
优选地，根据本发明，步骤(1)中，“耐热肌肉肌醇脱氢酶”指在50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将肌肉肌醇(MI)氧化为2-酮基-肌肉肌醇(2-KMI)和/或将1-酮基-D-手性肌醇(1-KDCI)还原为D-手性肌醇(DCI)功能的酶。
进一步优选地，所述耐热肌肉肌醇脱氢酶来源于嗜热微生物，例如嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)、嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、Pseudothermotogathermarum等；或所述耐热肌肉肌醇脱氢酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热肌肉肌醇脱氢酶具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。
更优选地，所述耐热肌肉肌醇脱氢酶来源于Geobacillus kaustophilus；或所述耐热肌肉肌醇脱氢酶的氨基酸序列与来源于Geobacillus kaustophilus的耐热肌肉肌醇脱氢酶具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。
优选地，根据本发明，步骤(1)中，“耐热肌醇单酮异构酶”指在50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、或80℃以上具有将2-酮基-肌肉肌醇(2-KMI)异构化为1-酮基-D-手性肌醇(1-KDCI)功能的酶。
进一步优选地，所述耐热肌醇单酮异构酶来源于嗜热微生物，例如嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)、嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、Pseudothermotogathermarum等；或所述耐热肌醇单酮异构酶的氨基酸序列与来源于所述嗜热微生物的耐热肌醇单酮异构酶具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。
更优选地，所述耐热肌醇单酮异构酶来源于Geobacillus kaustophilus；或所述耐热肌醇单酮异构酶的氨基酸序列与来源于Geobacillus kaustophilus的耐热肌醇单酮异构酶具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。
优选地，根据本发明，所述共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的载体包括第一启动子、耐热肌肉肌醇脱氢酶基因、第一终止子、第二启动子、耐热肌醇单酮异构酶基因和第二终止子，或者包括第一启动子、耐热肌醇单酮异构酶基因、第一终止子、第二启动子、耐热肌肉肌醇脱氢酶基因和第二终止子，或者包括启动子、耐热肌醇单酮异构酶基因、耐热肌肉肌醇脱氢酶基因、终止子，或者包括启动子、耐热肌肉肌醇脱氢酶基因、热肌醇单酮异构酶基因、终止子；所述表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的载体包括启动子、耐热肌肉肌醇脱氢酶基因、终止子；所述表达耐热肌醇单酮异构酶的载体包括启动子、耐热肌醇单酮异构酶基因、终止子。
本领域技术人员可以理解，本领域已知的各种表达载体均可用于本发明，包括但不限于pET系列、pGEX系列、pACYCDuet-1、pRSFDuet-1等。优选地，所述载体为pETDuet-1、pET-29a(+)。
本领域技术人员可以理解，本领域已知的各种宿主菌均可用于本发明，包括但不限于大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等。优选地，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
本领域技术人员可以理解，本领域已知的各种启动子均可用作本发明的启动子、第一启动子和/或第二启动子，包括但不限于T7启动子、lac启动子、tac启动子、trc启动子、PR启动子等。优选地，所述启动子、第一启动子、第二启动子彼此独立地为T7启动子。
本领域技术人员可以理解，本领域已知的各种终止子均可用作本发明的终止子、第一终止子和/或第二终止子，包括但不限于T7终止子、rrnB T1终止子、rrnB T2终止子等。优选地，所述终止子、第一终止子、第二终止子彼此独立地为T7终止子。
根据本发明，步骤(2)中，所述全细胞的制备使用本领域已知的方法进行。发酵可使用任何适合外源蛋白表达的培养基，包括但不限于LB培养基、TB培养基等。
根据本发明，步骤(3)中，所述细胞膜通透性处理包括但不限于热处理、添加有机溶剂和/或添加表面活性剂等。其中，有机溶剂包括但不限于丙酮、乙腈等。表面活性剂包括但不限于十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、Tween-80等。优选地，细胞膜通透性处理为热处理。对细胞膜进行通透性处理的目的是为了使细胞外的肌肉肌醇能够通过细胞膜进入到细胞内。
优选地，热处理温度为45-95℃；进一步优选地，热处理温度为55-90℃；更优选地，热处理温度为60-80℃；最优选地，热处理温度为70℃。
优选地，热处理时间为1-40min；进一步优选地，热处理时间为5-30min；更优选地，热处理时间为10-25min；最优选地，热处理时间为20min。
优选地，热处理时的细胞浓度为OD600＝10-300；进一步优选地，细胞浓度为OD600＝20-200；更优选地，细胞浓度为OD600＝50-150；最优选地，细胞浓度为OD600＝100。
根据本发明，所述热处理可在无缓冲液体系或缓冲液体系中进行；优选地，所述热处理在缓冲液体系中进行，所述缓冲液可为HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液等。其中，磷酸盐缓冲液例如磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液等。
根据本发明，步骤(3)中，所述细胞破碎使用本领域已知的方法进行。细胞破碎方法包括但不限于超声破碎法、高压均质法等。
优选地，根据本发明，步骤(4)中，所述利用透性全细胞或透性全细胞的混合物催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇的反应体系中，底物肌肉肌醇的浓度为1-400g/L，透性全细胞或透性全细胞的混合物的加入量为OD600＝1-200；更优选地，底物肌肉肌醇的浓度为100-350g/L，透性全细胞或透性全细胞的混合物的加入量为OD600＝40-100；最优选地，底物肌肉肌醇的浓度为300g/L，透性全细胞或透性全细胞的混合物的加入量为OD600＝60-80。
优选地，根据本发明，步骤(4)中，所述利用透性全细胞或透性全细胞的混合物催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇的反应条件为：在pH 6.0-8.0、50-80℃下反应0.5-72h；更优选地在pH 6.5-7.5、55-75℃下反应12-60h；最优选地在pH 7.0、60-65℃下反应24-48h。
根据本发明，所述利用透性全细胞或透性全细胞的混合物催化反应可在无缓冲液体系或缓冲液体系中进行；优选地，所述利用透性全细胞或透性全细胞的混合物催化反应在缓冲液体系中进行，所述缓冲液可为HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液等。其中，磷酸盐缓冲液例如磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液等。
优选地，根据本发明，步骤(4)中，所述利用细胞裂解液或细胞裂解液的混合物催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇的反应体系中，底物肌肉肌醇的浓度为1-400g/L，细胞裂解液或细胞裂解液的混合物为全细胞OD600＝10-200时的裂解液，加入量为反应液总体积的5％-95％；更优选地，底物肌肉肌醇的浓度为100-250g/L，细胞裂解液或细胞裂解液的混合物为全细胞OD600＝40-150时的裂解液，加入量为反应液总体积的50％-90％；最优选地，底物肌肉肌醇的浓度为200g/L，细胞裂解液或细胞裂解液的混合物为全细胞OD600＝100时的裂解液，加入量为反应液总体积的90％。
优选地，根据本发明，步骤(4)中，所述利用细胞裂解液或细胞裂解液的混合物催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇的反应条件为：在pH 6.0-8.0、50-80℃下反应0.5-72h；更优选地在pH 6.5-7.5、55-75℃下反应12-60h；最优选地在pH 7.0、60-65℃下反应24-48h。
根据本发明，所述利用细胞裂解液或细胞裂解液的混合物催化反应可在无缓冲液体系或缓冲液体系中进行；优选地，所述利用细胞裂解液或细胞裂解液的混合物催化反应在缓冲液体系中进行，所述缓冲液可为HEPES缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液等。其中，磷酸盐缓冲液例如磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液等。
优选地，根据本发明，步骤(4)中，透性全细胞的混合物中表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的透性全细胞和表达耐热肌醇单酮异构酶的透性全细胞的比例为0.1:1-10:1；更优选地为0.5:1-5:1；最优选地为2:1；全细胞裂解液的混合物中表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的全细胞裂解液所用全细胞和表达耐热肌醇单酮异构酶的全细胞裂解液所用全细胞的比例为0.1:1-10:1；更优选地为0.5:1-5:1；最优选地为2:1。
根据本发明，也可以利用透性全细胞和细胞裂解液的混合物催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇，其反应条件为：在pH 6.0-8.0、50-80℃下反应0.5-72h；更优选地在pH 6.5-7.5、55-75℃下反应12-60h；最优选地在pH 7.0、60-65℃下反应24-48h。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及上述共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的载体、表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的载体和表达耐热肌醇单酮异构酶的载体。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及上述共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的工程菌、表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的工程菌和表达耐热肌醇单酮异构酶的工程菌。根据本发明，共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的工程菌包含共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的载体、或者同时包含表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的载体和表达耐热肌醇单酮异构酶的载体；表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的工程菌包含表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的载体；表达耐热肌醇单酮异构酶的工程菌包含表达耐热肌醇单酮异构酶的载体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明首次利用表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的全细胞和/或其裂解液催化肌肉肌醇生产D-手性肌醇，开发了一种简单且易于规模化制备D-手性肌醇的新方法。
(2)本发明反应体系中无需额外添加NAD+，即可实现NAD+/NADH的自循环，有利于降低生产成本，具有重要的工业应用价值。
(3)本发明的方法中D-手性肌醇的制备可以在较高温度下进行，从而可以增加底物肌肉肌醇的溶解度，相对于现有技术，本发明可在较高底物浓度下实现D-手性肌醇的制备，有利于提高生产效率，进一步降低生产成本。
(4)本发明采用表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的全细胞作催化剂，只需通过热处理改变细胞膜的通透性，有利于简化生产工艺，提高产品的安全性。
(5)本发明的方法中D-手性肌醇的转化反应可在无缓冲液体系或缓冲液体系中进行，不需要使用含有碳源、氮源、无机盐及抗生素的培养基，一方面有利于降低生产成本，另一方面有利于产物D-手性肌醇的分离纯化。
附图说明
图1为肌肉肌醇和D-手性肌醇的化学结构。
图2为本发明的透性全细胞和/或裂解液催化肌肉肌醇生产D-手性肌醇的示意图。MI：肌肉肌醇；2-KMI：2-酮基-肌肉肌醇；1-KDCI：1-酮基-D-手性肌醇；DCI：D-手性肌醇；IDH：肌肉肌醇脱氢酶；KII：肌醇单酮异构酶。
图3A-C分别为重组表达载体pETDuet-iolG、pET29a-iolI和pETDuet-iolG-iolI的图谱。
图4为肌肉肌醇和D-手性肌醇的HPLC谱图。
图5为利用不同条件下热处理的全细胞制备D-手性肌醇。
图6为D-手性肌醇的产量随反应时间变化过程曲线图。
图7为不同反应温度下制备D-手性肌醇。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1iolG和iolI基因的克隆
本实施例中耐热肌肉肌醇脱氢酶来自Geobacillus kaustophilus，NCBI登录号为WP_011231389；耐热肌醇单酮异构酶也来自Geobacillus kaustophilus，NCBI登录号为WP_042380806。Geobacillus kaustophilus购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。这两个基因分别使用不同的引物从基因组DNA中通过PCR获取：将Geobacilluskaustophilus接种于5mL液体营养肉汁琼脂培养基(蛋白胨10g/L，牛肉浸取物3g/L，NaCl5g/L，用NaOH调至pH 7.0)中，55℃培养至对数生长期，使用DNA Kit(天根生化科技有限公司，中国)提取基因组。使用引物iolG-F(含有BamHI酶切位点)：5′-CGCGGATCCGATGACTCGGGTGAAAGTAGG-3′和iolG-R(含有SalI酶切位点)：5′-ACGCGTCGACTTATTTTGACGGAGCTGTTTG-3′扩增iolG基因，使用引物iolI-F(含有NdeI酶切位点)：5′-GGAATTCCATATGAAGCTTGTATTTAATGAAG-3′和iolI-R(含有KpnI酶切位点)：5′-GGGGTACCTCAAACTCGTTCGATCTC-3′扩增iolI基因。
所有引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。基因的PCR条件为94℃变性5min，按如下参数循环30次：94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。PCR反应所得到的产物分别用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析结果。经凝胶成像***成像确认片段大小正确后，采用DNA纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司，中国)回收目的片段用于重组表达载体的构建。
实施例2重组工程菌的构建
(1)pETDuet-iolG的构建
用BamHI/SalI双酶在37℃下分别酶切pETDuet-1质粒和实施例1中通过PCR获得的含有两个酶切位点的iolG基因，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将其在T4连接酶的作用下于22℃连接5h。连接产物用氯化钙法转化入感受态E.coli Top10，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定，选择2-3个阳性转化子送测序进一步验证，测序结果显示成功获得pETDuet-iolG重组载体。
pETDuet-iolG的质粒图谱如图3A所示。
(2)pET29a-iolI的构建
用NdeI/KpnI双酶在37℃下分别酶切pET-29a(+)质粒和实施例1中通过PCR获得的含有两个酶切位点的iolI基因，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将其在T4连接酶的作用下于22℃连接5h。连接产物用氯化钙法转化入感受态E.coli Top10，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定，选择2-3个阳性转化子送测序进一步验证，测序结果显示成功获得pET29a-iolI重组载体。
pET29a-iolI的质粒图谱如图3B所示。
(3)pETDuet-iolG-iolI的构建
用NdeI/KpnI双酶在37℃下分别酶切pETDuet-iolG质粒和实施例1中通过PCR获得的含有两个酶切位点的iolI基因，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将其在T4连接酶的作用下于22℃连接5h。连接产物用氯化钙法转化入感受态E.coli Top10，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定，选择2-3个阳性转化子送测序进一步验证，测序结果显示成功获得pETDuet-iolG-iolI重组共表达载体。
pETDuet-iolG-iolI的质粒图谱如图3C所示。
(4)重组工程菌的构建
将构建的重组质粒pETDuet-iolG、pET29a-iolI和pETDuet-iolG-iolI分别用氯化钙法转化入宿主菌BL21(DE3)，LB试管培养过夜，质粒抽提试剂盒抽提质粒，将正确的克隆子BL21(DE3)/pETDuet-iolG、BL21(DE3)/pET29a-iolI和BL21(DE3)/pETDuet-iolG-iolI保存。
实施例3重组工程菌全细胞的制备
分别挑取重组工程菌BL21(DE3)/pETDuet-iolG、BL21(DE3)/pET29a-iolI和BL21(DE3)/pETDuet-iolG-iolI接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡过夜培养。将培养物以1％的接种量转接于新鲜的含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600＝0.6-0.8，使用终浓度为0.1mM IPTG于18℃诱导过夜，5500rpm离心10min，弃去上清，获得表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的全细胞、表达耐热肌醇单酮异构酶的全细胞以及共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的全细胞。
实施例4全细胞催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇
将实施例3中制备的共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的全细胞使用50mM Tris-HCl(pH 7.5，含50mM NaCl)洗涤1次，5500rpm离心10min，弃去上清，向沉淀中加入50mM HEPES缓冲液(pH 7.0)，重悬菌体至OD600＝100左右。将重悬的菌体分别在65℃热处理30min、70℃热处理20min、以及75℃热处理10min。
在1mL反应体系中，分别加入终浓度为7.2g/L肌肉肌醇、50mM HEPES缓冲液(pH7.0)以及以上不同条件下热处理的全细胞，使OD600＝50左右。在55℃和150rpm的水浴摇床反应24h，取样进行高效液相色谱(HPLC)分析。HPLC检测条件如下：色谱柱为WakopakWakosil 5NH2；流动相为乙腈/水(v:v，80:20)；流速为2mL/min；柱温为40℃；检测器为示差折光检测器；进样量为10μL。肌肉肌醇和D-手性肌醇的液相色谱图如图4所示。
图5示出了利用不同条件下热处理的全细胞制备D-手性肌醇。结果显示，使用70℃热处理20min的全细胞作催化剂时，D-手性肌醇产率可达14％。
实施例5全细胞催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇
将实施例3中制备的共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的全细胞使用50mM Tris-HCl(pH 7.5，含50mM NaCl)洗涤1次，5500rpm离心10min，弃去上清，向沉淀中加入0.85％NaCl和5％(v:v)有机溶剂(丙酮、乙腈)，重悬菌体至OD600＝100左右。将重悬的菌体在16℃处理15min。
在1mL反应体系中，分别加入终浓度为7.2g/L肌肉肌醇、50mM HEPES缓冲液(pH7.0)以及以上不同有机溶剂处理的全细胞，使OD600＝50左右。在55℃和150rpm的水浴摇床反应24h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例4。
实验结果表明，使用丙酮和乙腈处理的全细胞作催化剂时，产率分别可达4.42％和5.89％。
实施例6全细胞催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇
将实施例3中制备的共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的全细胞使用50mM Tris-HCl(pH 7.5，含50mM NaCl)洗涤1次，5500rpm离心10min，弃去上清，向沉淀中加入0.85％NaCl和0.5％(w:v)表面活性剂(CTAB、Tween-80)，重悬菌体至OD600＝100左右。将重悬的菌体在16℃处理15min。
在1mL反应体系中，分别加入终浓度为7.2g/L肌肉肌醇、50mM HEPES缓冲液(pH7.0)以及以上不同表面活性剂处理的全细胞，使OD600＝50左右。在55℃和150rpm的水浴摇床反应24h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例4。
实验结果表明，使用CTAB和Tween-80处理的全细胞作催化剂时，产率分别可达7.62％和7.54％。
实施例7全细胞催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇
将实施例3中制备的共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的全细胞使用50mM Tris-HCl(pH 7.5，含50mM NaCl)洗涤1次，5500rpm离心10min，弃去上清，向沉淀中加入50mM HEPES缓冲液(pH 7.0)，重悬菌体至OD600＝100左右。将重悬的菌体70℃热处理20min。
在5mL反应体系中，分别加入终浓度为10g/L肌肉肌醇、50mM HEPES缓冲液(pH7.0)以及以上热处理的全细胞分别使OD600＝25、50、100及200左右。在55℃和150rpm的水浴摇床反应，不同时间点取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例4。
图6示出了在不同全细胞加量下D-手性肌醇的产率随着时间变化的过程曲线。结果显示，产率为12-13％。
实施例8全细胞催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇
使用实施例7中的方式热处理全细胞。在5mL反应体系中，分别加入终浓度为20g/L肌肉肌醇、50mM HEPES缓冲液(pH 7.0)以及以上热处理的全细胞使OD600＝25左右。分别在55℃、60℃、65℃和150rpm的水浴摇床反应，不同时间点取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例4。
图7示出了在不同温度下D-手性肌醇的产率随着时间变化的过程曲线。结果显示，65℃条件下反应24h，D-手性肌醇产率可达12％。
实施例9全细胞催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇
使用实施例7中的方式热处理全细胞。在5mL反应体系中，分别加入终浓度为200g/L肌肉肌醇、50mM HEPES缓冲液(pH 7.0)以及以上热处理的全细胞使OD600＝60左右。在60℃和150rpm的水浴摇床反应48h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例4。
结果显示，D-手性肌醇的含量为23.1g/L。
实施例10全细胞催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇
使用实施例7中的方式热处理全细胞。在5mL反应体系中，分别加入终浓度为300g/L肌肉肌醇、50mM HEPES缓冲液(pH 7.0)以及以上热处理的全细胞使OD600＝80左右。在60℃和150rpm的水浴摇床反应48h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例4。
结果显示，D-手性肌醇的含量为37.7g/L。
实施例11全细胞催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇
将实施例3中制备的共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的全细胞使用0.9％NaCl洗涤1次，5500rpm离心10min，弃去上清，向沉淀中加入50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，重悬菌体至OD600＝100左右。将重悬的菌体70℃热处理20min。
在5mL反应体系中，分别加入终浓度为300g/L肌肉肌醇、50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)以及以上热处理的全细胞使OD600＝80左右。在60℃和150rpm的水浴摇床反应48h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例4。
结果显示，D-手性肌醇的含量为37.2g/L。
实施例12全细胞催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇
将实施例3中制备的共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的全细胞使用0.9％NaCl洗涤1次，5500rpm离心10min，弃去上清，向沉淀中加入水，重悬菌体至OD600＝100左右。将重悬的菌体70℃热处理20min。
在5mL反应体系中，分别加入终浓度为300g/L肌肉肌醇、水以及以上热处理的全细胞使OD600＝80左右。在60℃和150rpm的水浴摇床反应48h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例4。
结果显示，D-手性肌醇的含量为28.9g/L。
实施例13全细胞催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇
将实施例3中制备的表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的全细胞和表达耐热肌醇单酮异构酶的全细胞分别使用0.9％NaCl洗涤1次，5500rpm离心10min，弃去上清，分别向沉淀中加入50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，重悬菌体至OD600＝100左右。将重悬的菌体70℃热处理20min。
在5mL反应体系中，加入终浓度为300g/L肌肉肌醇、50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)以及以上两种热处理的全细胞使OD600＝60左右，表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的全细胞和表达耐热肌醇单酮异构酶的全细胞的加入比例为2:1。在60℃和150rpm的水浴摇床反应48h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例4。
结果显示，D-手性肌醇的含量为37.4g/L。
实施例14细胞裂解液催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇
将实施例3中制备的共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的全细胞使用50mM Tris-HCl(pH 7.5，含50mM NaCl)洗涤1次，5500rpm离心10min，弃去上清，向沉淀中加入50mM HEPES缓冲液(pH 7.0)，重悬菌体至OD600＝50左右。将重悬菌体进行超声破碎。4℃、8000rpm离心，获得共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的细胞裂解液。
在1mL反应体系中，分别加入终浓度为3.6g/L肌肉肌醇、50mM HEPES缓冲液(pH7.0)以及90％(细胞裂解液:反应液，v/v)上述OD600＝50左右的全细胞裂解液。在55℃和150rpm的水浴摇床反应24h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例4。
结果显示，D-手性肌醇的产率为10.5％。
实施例15细胞裂解液催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇
将实施例3中制备的共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的全细胞使用0.9％NaCl洗涤1次，5500rpm离心10min，弃去上清，向沉淀中加入50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，重悬菌体至OD600＝100左右。将重悬菌体进行高压均质。4℃、8000rpm离心，获得共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的细胞裂解液。
在5mL反应体系中，分别加入终浓度为200g/L肌肉肌醇、50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)以及90％(细胞裂解液:反应液，v/v)上述OD600＝100左右的全细胞裂解液。在60℃和150rpm的水浴摇床反应24h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例4。
结果显示，D-手性肌醇的含量为25.7g/L。
实施例16细胞裂解液催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇
将实施例3中制备的表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的全细胞和表达耐热肌醇单酮异构酶的全细胞分别使用0.9％NaCl洗涤1次，5500rpm离心10min，弃去上清，分别向沉淀中加入50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，重悬菌体至OD600＝100左右。将重悬的菌体分别进行高压均质，4℃、8000rpm离心，获得表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的细胞裂解液和表达耐热肌醇单酮异构酶的细胞裂解液。
在5mL反应体系中，加入终浓度为200g/L肌肉肌醇、50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)以及90％(细胞裂解液:反应液，v:v)上述OD600＝100左右的以上两种细胞裂解液，其中表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的细胞裂解液和表达耐热肌醇单酮异构酶的细胞裂解液的加入比例为2:1。在60℃和150rpm的水浴摇床反应48h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例4。
结果显示，D-手性肌醇的含量为24.8g/L。
Claims (22)
1.一种制备D-手性肌醇的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
(1)构建共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的工程菌、和/或分别表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的工程菌，其中所述耐热肌肉肌醇脱氢酶为在50℃以上具有将肌肉肌醇氧化为2-酮基-肌肉肌醇和/或将1-酮基-D-手性肌醇还原为D-手性肌醇功能的酶，所述耐热肌醇单酮异构酶为在50℃以上具有将2-酮基-肌肉肌醇异构化为1-酮基-D-手性肌醇功能的酶；
(2)将步骤(1)构建的工程菌进行发酵获得全细胞；
(3)将步骤(2)获得的全细胞通过热处理的方式进行细胞膜通透性处理，获得透性全细胞，其中所述热处理温度为55-90℃，热处理时间为5-30min；
(4)利用步骤(3)获得的共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的透性全细胞，表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的透性全细胞和表达耐热肌醇单酮异构酶的透性全细胞的混合物，和/或共表达耐热肌肉肌醇脱氢酶和耐热肌醇单酮异构酶的透性全细胞、表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的透性全细胞和表达耐热肌醇单酮异构酶的透性全细胞的混合物催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇；
所述耐热肌肉肌醇脱氢酶来源于嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)，并且所述耐热肌醇单酮异构酶来源于嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热处理温度为60-80℃。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述热处理温度为70℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热处理时间为10-25min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述热处理时间为20min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热处理条件为：70℃热处理20min或65℃热处理30min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热处理时的细胞浓度为OD600＝20-200。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述热处理时的细胞浓度为OD600＝50-150。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述热处理时的细胞浓度为OD600＝100。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热处理可在无缓冲液体系或缓冲液体系中进行。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述热处理在磷酸盐缓冲液体系中进行，所述磷酸盐缓冲液选自磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用透性全细胞或透性全细胞的混合物催化肌肉肌醇制备D-手性肌醇的反应体系中，底物肌肉肌醇的浓度为1-400g/L，透性全细胞或透性全细胞的混合物的加入量为OD600＝1-200。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，底物肌肉肌醇的浓度为100-350g/L，透性全细胞或透性全细胞的混合物的加入量为OD600＝40-100。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，底物肌肉肌醇的浓度为300g/L，透性全细胞或透性全细胞的混合物的加入量为OD600＝60-80。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述透性全细胞的混合物中表达耐热肌肉肌醇脱氢酶的透性全细胞和表达耐热肌醇单酮异构酶的透性全细胞的比例为2∶1。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，催化反应的条件为：在pH 6.0-8.0、50-80℃下反应0.5-72h。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，催化反应的条件为：在pH 6.5-7.5、55-75℃下反应12-60h。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，催化反应的条件为：在pH 7.0、60-65℃下反应24-48h。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化反应可在无缓冲液体系或缓冲液体系中进行。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述催化反应在磷酸盐缓冲液体系中进行，所述磷酸盐缓冲液选自磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备所述工程菌的宿主菌选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，制备所述工程菌的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
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