CN117402847A - 一种4-氨基丁酸转氨酶及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种4‑氨基丁酸转氨酶及其编码基因与应用。本发明公开的4‑氨基丁酸转氨酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其突变体具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。本发明提供的4‑氨基丁酸转氨酶可以高效催化戊二酸合成。
Description
技术领域
本发明属于功能酶筛选技术领域，涉及一种4-氨基丁酸转氨酶及其编码基因与应用。
背景技术
戊二酸是一种广泛应用的化学物质，包括用于生产聚酰胺、聚氨酯、戊二酸酐、1,5-戊二醇和5-羟基戊酸。戊二酸是一种C5二羧酸，广泛应用于脂肪族聚酯、聚氨酯和聚乙烯等工业聚合物的制造常用作缓蚀剂和增塑剂。此外，戊二酸的二甲酯具有作为绿色溶剂的功能，可用于清洁产品、涂料和涂层成分。戊二酸通常是通过各种石油基化学方法生产出来的，包括硝酸催化的2-氰基戊烷酮的氧化和丙烯腈与丙二酸乙酯的缩合。然而，这些工艺依赖于不可再生的和有毒的起始原料。因此，人们采取了通过发酵和生物转化使用全细胞***产生。
4-氨基丁酸转氨酶可以催化5-氨基戊酸转化为戊二酸，在催化过程中需要用到β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和α-酮戊二酸(α-KG)等辅助因子。目前通过发酵和生物转化还没有实现戊二酸的大规模生产，所以仍然存在寻求一种戊二酸高产基因工程菌的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种4-氨基丁酸转氨酶及其突变体及其编码基因与应用，从而解决现有的4-氨基丁酸转氨酶催化合成戊二酸技术中存在的酶活性、转化率和稳定性不高的问题。
具体地，本发明从日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus yFS275)中获得4-氨基丁酸转氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，并进一步对其进行突变，得到了一种在酶活性、转化率和稳定性方面显著改善的4-氨基丁酸转氨酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在第一方面，本发明提供一种4-氨基丁酸转氨酶，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
本发明提供的上述4-氨基丁酸转氨酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到，例如使用重组技术从原核宿主(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如酵母、高等植物)中表达获得。
在一些实施方案中，上述4-氨基丁酸转氨酶是通过将含有其编码基因的重组载体导入大肠杆菌(例如E.coli BL21(DE3))得到重组基因工程菌，然后将该重组基因工程菌进行诱导表达得到4-氨基丁酸转氨酶。
在第二方面，本发明提供一种编码上述4-氨基丁酸转氨酶的核酸分子，其具有SEQID NO:2所示的核苷酸序列。
本发明提供的上述核酸分子通常可以通过PCR扩增或人工合成的方法获得。
在第三方面，本发明提供上述4-氨基丁酸转氨酶的突变体，其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其催化活力、稳定性以及转化率与上述4-氨基丁酸转氨酶相比进一步提高。
本发明提供的上述4-氨基丁酸转氨酶的突变体可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到，例如使用重组技术从原核宿主(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如酵母、高等植物)中表达获得。
在一些实施方案中，上述4-氨基丁酸转氨酶是通过将含有其编码基因的重组载体导入大肠杆菌(例如E.coli BL21(DE3))得到重组基因工程菌，然后将该重组基因工程菌进行诱导表达得到4-氨基丁酸转氨酶的突变体。
在第四方面，本发明提供一种编码上述4-氨基丁酸转氨酶的突变体的核酸分子，其具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
本发明提供的上述核酸分子通常可以通过PCR扩增或人工合成的方法获得。
在第五方面，本发明提供一种重组载体，其包含上述任一所述的核酸分子。
所述重组载体包括克隆载体和表达载体，所述克隆载体用于复制相关序列，所述表达载体用于表达相关基因。
在一些实施方案中，上述重组载体为pET-SJAG或pET-ΔSJAG42，分别是将编码上述4-氨基丁酸转氨酶的核酸分子或上述4-氨基丁酸转氨酶的突变体的核酸分子替换pET-28a(+)的XbaI和BamHI酶切位点间序列，其余序列保持不变得到的。
在第六方面，本发明提供一种重组细胞，其包含上述任一所述的重组载体。
在一些实施方案中，所述重组细胞诱导产生上述4-氨基丁酸转氨酶或上述4-氨基丁酸转氨酶的突变体。
在一些实施方案中，所述重组细胞的构建方法包括如下：
将所述重组载体转化到宿主细胞中，经诱导，得到表达4-氨基丁酸转氨酶或上述4-氨基丁酸转氨酶的突变体。
进一步地，所述重组载体为上述任一所述的重组载体，所述宿主细胞为原核生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
在一些实施方案中，所述重组细胞为重组菌W和重组菌42，重组细胞可以是重组基因工程菌。重组基因工程菌表达4-氨基丁酸转氨酶或其突变体时所使用的培养基可以是本领域可使重组基因工程菌生长并产生本发明的4-氨基丁酸转氨酶或其突变体的培养基，优选LB培养基。
培养方法与培养条件没有特殊要求，只要能够使基因工程菌正常生长，并表达4-氨基丁酸转氨酶或其突变体可即可。
更具体地，上述重组细胞的构建方法，包含如下步骤：
(1)4-氨基丁酸转氨酶的基因SJAG扩增；
(2)4-氨基丁酸转氨酶的基因的突变体ΔSJAG的获得；
(3)重组表达质粒pET-SJAG和pET-ΔSJAG的构建；
(4)将重组表达质粒pET-SJAG和pET-ΔSJAG转化至宿主细胞中；
(5)经抗性培养基筛选得到阳性克隆。
在第七方面，本发明提供一种4-氨基丁酸转氨酶或其突变体的制备方法，包括：
对上述任一所述的重组细胞进行诱导培养，得到培养物；
从所述培养物中分离上述4-氨基丁酸转氨酶或上述4-氨基丁酸转氨酶的突变体；
其中，对重组细胞进行诱导培养的方法、从培养物中分离4-氨基丁酸转氨酶或其突变体的方法均为本领域的常规方法。
在第八方面，本发明提供上述4-氨基丁酸转氨酶、上述任一所述的核酸分子、上述4-氨基丁酸转氨酶的突变体、上述重组载体、上述重组细胞和/或上述方法制备的4-氨基丁酸转氨酶或其突变体在制备戊二酸中的应用。
在第九方面，本发明提供一种戊二酸的制备方法，包括：以上述4-氨基丁酸转氨酶、上述4-氨基丁酸转氨酶的突变体、上述重组细胞和/或上述方法制备得到的4-氨基丁酸转氨酶或其突变体作为催化剂，对5-氨基戊酸进行催化反应，得到戊二酸。
在一些实施方案中，上述催化反应中，温度为20-40℃，例如20℃、30℃、40℃，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选30℃；初始pH为7-9，可以用Tris碱(例如500mM的Tris)进行调整，例如调到pH8.5，
所述催化反应包含5-氨基戊酸、α-酮戊二酸、聚山梨酸酯80和NAD+；
5-氨基戊酸的浓度为200-500mM，例如200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选300mM；
α-酮戊二酸的浓度为100-300mM，例如100mM、150mM、200mM、250mM、300mM，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选150mM；
聚山梨酸酯80的体积百分数为0.01-1％，例如0.01％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选0.06％；
NAD+的浓度为5-20mM，例如5mM、10mM、15mM、20mM，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选10mM。
在一些实施方案中，上述催化反应中，包括以上述任一所述的重组细胞对5-氨基戊酸进行催化反应，得到戊二酸；
具体地，可以以上述重组细胞作为催化剂进行全细胞催化生产戊二酸，催化剂的用量为0.5-2mg细胞/mM 5-氨基戊酸，优选1mg细胞/mM 5-氨基戊酸。
应当理解的是，本发明所述的4-氨基丁酸转氨酶或其突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的4-氨基丁酸转氨酶或其突变体制成固定化酶或固定化细胞形式的催化剂。
本发明的4-氨基丁酸转氨酶及其突变体可以高效催化戊二酸合成，尤其是其突变体，在适宜条件下，以5-氨基戊酸为底物，转化率为98.8％，酶活为986.8U/L，是原始酶的1.87倍，并且稳定性也比原始酶更好。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。如非特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域常规操作，或按照试剂盒及仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus yFS275)在文献“Ren L,McleanJ R,Hazbun T R,et al.Systematic Two-Hybrid and Comparative Proteomic AnalysesReveal Novel Yeast Pre-mRNA Splicing Factors Connected to Prp19[J].Plos One,2011,6(2):e16719-e16719”中公开过，公众可从万华化学集团股份有限公司获得。
pET-28a(+)为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，产品目录号为B540183。
实施例1：4-氨基丁酸转氨酶的基因序列的获得
1、提取日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus yFS275)的基因组DNA。
2、以步骤1获得的基因组DNA为模板，以引物1(5’-tctagaatgactgctgcacctttcttc-3’,SEQ ID NO:5)和引物2(5’-ggatccctaagcagagaagaccttgtc-3’,SEQ ID NO:6)为引物对进行PCR，获得含有4-氨基丁酸转氨酶基因的PCR扩增片段，其中，4-氨基丁酸转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码的4-氨基丁酸转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2：利用易错PCR技术获得4-氨基丁酸转氨酶突变体的基因序列
易错PCR方法是在标准PCR的基础上改变和提高聚合酶的自然错误率。Taq聚合酶是最为常用的易错PCR聚合酶。与基本的PCR反应(1.5mM)相比，易错PCR反应通常含有更高浓度的氯化镁(7mM)，以稳定非互补对，除此之外还可以添加氯化锰来增加错误率。本实施例利用易错PCR技术，获得4-氨基丁酸转氨酶基因的突变体。
以实施例1的PCR扩增片段为模板，以引物1和引物2为引物对进行如下易错PCR，共获得4-氨基丁酸转氨酶基因的96个突变体。
易错PCR反应体系：10×扩增缓冲液5μl，4种dNTP混合物(2.5mmol/L)各4μl，引物各50pmol，模板DNA1.5μg，Taq DNA聚合酶0.5μL，Mg2+7mmol/L，加双蒸水至50μl。
实施例3：4-氨基丁酸转氨酶基因(SJAG)的克隆和表达菌株的构建
1、XbaI和BamHI双酶切实施例1获得的含有4-氨基丁酸转氨酶基因的PCR扩增片段，得到基因片段；XbaI和BamHI双酶切pET-28a(+)，得到载体片段；将基因片段和载体片段连接得到重组表达质粒，将其命名为pET-SJAG，将该质粒送测序，结果与预期一致。
2、将步骤1获得的重组表达质粒pET-SJAG通过热激转入E.coli DH5α感受态细胞中，涂布含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，培养得到相应的单克隆菌株，将其命名为H，再经过扩增质粒提取，得到pET-SJAG质粒，将得到的质粒通过化学转化的方式转入E.coli BL21(DE3)中，涂布含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基进行筛选，得到表达4-氨基丁酸转氨酶的重组菌W。
实施例4：4-氨基丁酸转氨酶基因突变体的克隆和表达菌株的构建
按照实施例3的方法，利用实施例2获得的4-氨基丁酸转氨酶基因的96个突变体分别构建重组质粒pET-ΔSJAG1至pET-ΔSJAG96，并获得表达4-氨基丁酸转氨酶突变体的重组菌1-重组菌96。
实施例5：利用高通量筛选得到具有高效催化效率的4-氨基丁酸转氨酶突变体
将实施例3和4中经过PCR验证正确的重组菌分别在5mL LB培养基中培养，同时加入IPTG诱导蛋白表达，12h后测量菌液的OD600值，并用水稀释菌液使得OD600值为2左右。将稀释后的菌液分别加入96孔板中进行反应，反应体系为200μL，包含300mM 5-氨基戊酸、150mMα-酮戊二酸、0.06％(v/v)聚山梨酸酯80和10mM NAD+，并使用500mM Tris碱将初始pH调到8.5，在反应体系中按照1mg细胞/mM 5-氨基戊酸加入细胞。将制备的反应体系在30℃、120rpm的振荡混合器中孵育24小时。反应结束后在95℃下加热5min后终止反应。
反应结束后，取30μl反应液加入40μl 2M 2,4-二硝基苯阱的水溶液，置于37℃恒温培养箱中反应20min，加入100μl 0.3M氢氧化钠的水溶液，用水将反应体系稀释至200μl。反应结束后，水浴冷却至室温，在选定380nm波长测定吸光度。
将吸光度最低的反应液所对应的菌株(重组菌42)进行质粒提取，提取后的质粒测序，得到编码4-氨基丁酸转氨酶突变体的基因序列如SEQ ID NO:4所示，其编码的4-氨基丁酸转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。与SEQ ID NO:1所示的4-氨基丁酸转氨酶的氨基酸序列相比，该4-氨基丁酸转氨酶突变体具有如下突变：第114位的Vla突变为Ala，第345位的Tyr突变为His，第389位的Glu、第403位的Arg、第416位的Glu和第438位的Cys均突变为Gly。
实施例6：酶的制备及酶活测定
分别将实施例3获得的重组菌W和实施例4筛选得到的重组菌42进行扩大培养，扩大培养后将发酵液经离心(8000rpm，10min)、细胞破碎、冷冻干燥等常规处理，制备得到4-氨基丁酸转氨酶(原始酶)和其突变体(突变体酶)的冻干粉并于-80℃保存。
酶活力单位(U)的定义为：在实施例5的反应条件下，毎分钟催化生成1μmol戊二酸所需的酶量或每分钟消耗1μmol底物5-氨基戊酸所需的酶量。
原始酶和突变体酶的酶活分别为526.4U/L和986.8U/L，相比于原始酶，突变体酶的酶活是其1.87倍，通过HPLC分析5-氨基戊酸的残余量可以得到两种酶的转化率分别为78.8％和98.8％。
HPLC的具体方法如下：
(1)取1mL发酵液在120000rpm的转速下离心1min；
(2)离心后小心吸取上清液500μL于2mL离心管中，并加入500μL超纯水；
(3)用1mL注射器吸取稀释后的发酵液上清600-800μL，并用0.22μm的滤膜进行过滤并加到相应的液相瓶中；
(4)将液相瓶放入样品架上，建好方法，开始分析。HPLC分析的具体程序如下：岛津LC-20A型号的高效液相色谱，装配伯乐的Aminex HPX-87N色谱柱，初始柱温为室温，随着柱温的升高逐渐调高流速，分析时的柱温为65℃，流速为0.6mL/min，流动相为0.5mM的H2SO4溶液，示差折光检测器，进样量为10μL，其中戊二酸的出峰时间为16.6min，5-氨基戊酸的出峰时间为19.9min。
实施例7：稳定性测试
取少量实施例6中得到的原始酶和突变体酶的冻干粉，按照实施例5中的反应条件进行反应，反应结束后离心，将酶回收重新进行反应，各反应批次的两种酶的转化率如表1所示。
表1
结果表明，突变体酶具有较好的重复利用性，反应6个批次后，转化率仍可到95％以上，与原始酶相比具有更好的稳定性，在反应6个批次之后，原始酶酶活性降低了17.2％，而重组酶的活性只降低了2.7％。
序列
SEQ ID NO:1
MTAAPFFPNEPKGPKIVTEEIPGPQSKAAVAEMTKYIDTSATKLVVDYEKSIGNYLVDADGNVYLDVYAQIASIAVGYNNPTLIKAAKSDEVATLMMNRPALGNFPPKEWARIVKEGLIDNAPKGQKYAYVQMSGSDANESAFKIAFIHLAAQKRKGAGFSEEDLVSVMNNQAPGSPEVAILSFRRAFHGRLFGSLSTTRSKPIHKLDIPLFPWPQADFPALKYPLEDHVEENAAEEQRCIDQVDQILSTHHCPVAACIVEPIQSEGGDNHASPEFFHKLQATLKKHGVLFIVDEVQTGVCATGNMWAHEAWNLPYPPDMVTFSKKFQVAGFFYSDLLLRPALAYRHFNTWMGDPIRVVQAKYICQEIRDHNLLQNTIEVGNYVYQGLEKLAAKYPGKINNLRGKNKGTFIAFDCESPEARDKFCADMKHEGVNIGGCGPIGIRLRPMLVFQKHHADIMLAAIDKVFSA
SEQ ID NO:2
atgactgctgcacctttcttccccaatgaacctaagggccccaagattgtgactgaggagattcccggtccccaaagcaaagctgccgtcgcagaaatgaccaagtacatcgacactagcgccacgaagcttgtggtcgactatgagaagtccattggaaactaccttgtcgatgccgatggaaacgtgtatcttgatgtatatgctcagattgcttccattgctgttggttacaacaacccgactttgatcaaggctgccaagtctgatgaagttgctacgctcatgatgaaccgtcctgcccttggaaacttccctcccaaggagtgggctagaattgtgaaggagggtctgattgacaatgcccccaagggccagaagtacgcttacgttcaaatgagcggtagtgatgccaacgagtctgcttttaagattgctttcattcacttggctgctcaaaagcgtaagggtgctggtttcagcgaggaagatttggtctctgttatgaacaaccaggctcctggtagtcctgaagttgcgattctctcattccgtcgcgcattccacggtcgtttgtttggatccttgtcgactactcgttccaagcccatccacaagctcgatatccccctgttcccctggcctcaagctgatttccccgctcttaagtatcctttggaggaccacgttgaagagaacgccgctgaggagcaacgttgtattgatcaagtcgaccaaatcttgtctactcaccattgccctgttgctgcttgtatcgttgagcccatccagtctgagggtggtgacaaccatgcttcccccgaattcttccacaagttgcaggcaactttgaagaagcacggtgttctgtttattgtcgatgaggttcagaccggtgtgtgcgctactggaaacatgtgggctcatgaagcttggaaccttccgtatccacccgacatggttaccttctccaagaagttccaggttgccggtttcttctacagtgatcttctccttcgtcccgcattggcttaccgtcacttcaacacctggatgggtgacccgatccgtgttgtccaagccaagtacatctgccaagagattcgcgaccacaacttgttgcaaaacacgattgaagtcggtaactacgtgtaccaaggtcttgaaaagctggcagccaagtaccctggaaagattaacaacctccgtggtaagaacaagggtactttcatcgcctttgactgtgaaagccctgaggctcgcgacaaattctgcgcggacatgaagcatgagggtgtgaacatcggtggctgcggtcccattggaattcgtctgcgtcccatgcttgtgttccagaagcaccatgctgacatcatgctggctgccattgacaaggtcttctctgcttag
SEQ ID NO:3
MTAAPFFPNEPKGPKIVTEEIPGPQSKAAVAEMTKYIDTSATKLVVDYEKSIGNYLVDADGNVYLDVYAQIASIAVGYNNPTLIKAAKSDEVATLMMNRPALGNFPPKEWARIAKEGLIDNAPKGQKYAYVQMSGSDANESAFKIAFIHLAAQKRKGAGFSEEDLVSVMNNQAPGSPEVAILSFRRAFHGRLFGSLSTTRSKPIHKLDIPLFPWPQADFPALKYPLEDHVEENAAEEQRCIDQVDQILSTHHCPVAACIVEPIQSEGGDNHASPEFFHKLQATLKKHGVLFIVDEVQTGVCATGNMWAHEAWNLPYPPDMVTFSKKFQVAGFFYSDLLLRPALAHRHFNTWMGDPIRVVQAKYICQEIRDHNLLQNTIEVGNYVYQGLGKLAAKYPGKINNLGGKNKGTFIAFDCGSPEARDKFCADMKHEGVNIGGGGPIGIRLRPMLVFQKHHADIMLAAIDKVFSA
SEQ ID NO:4
atgactgctgcacctttcttccccaatgaacctaagggccccaagattgtgactgaggagattcccggtccccaaagcaaagctgccgtcgcagaaatgaccaagtacatcgacactagcgccacgaagcttgtggtcgactatgagaagtccattggaaactaccttgtcgatgccgatggaaacgtgtatcttgatgtatatgctcagattgcttccattgctgttggttacaacaacccgactttgatcaaggctgccaagtctgatgaagttgctacgctcatgatgaaccgtcctgcccttggaaacttccctcccaaggagtgggctagaattgcgaaggagggtctgattgacaatgcccccaagggccagaagtacgcttacgttcaaatgagcggtagtgatgccaacgagtctgcttttaagattgctttcattcacttggctgctcaaaagcgtaagggtgctggtttcagcgaggaagatttggtctctgttatgaacaaccaggctcctggtagtcctgaagttgcgatactctcattccgtcgcgcattccacggtcgtttgtttggatccttgtcgactactcgttccaagcccatccacaagctcgatatccccctgttcccctggcctcaagctgatttccccgctcttaagtatcctttggaggaccacgttgaagagaacgccgctgaggagcaacgttgtattgatcaagtcgaccaaatcttgtctactcaccattgccctgttgctgcttgtatcgttgagcccatccagtctgagggtggtgacaaccatgcttcccccgaattcttccacaagttgcaggcaactttgaagaagcacggtgttctgtttattgtcgatgaggttcagaccggtgtgtgcgctactggaaacatgtgggctcatgaagcttggaaccttccgtatccacccgacatggttaccttctccaagaagttccaggttgccggtttcttctacagtgatcttctccttcgtcccgcattggctcaccgtcacttcaacacctggatgggtgacccgatccgtgttgtccaagccaagtacatctgccaagagattcgcgaccacaacttgttgcaaaacacgattgaagtcggtaactacgtgtaccaaggtcttggaaagctggcagccaagtaccctggaaagattaacaacctcggtggtaagaacaagggtactttcatcgcctttgactgtggaagccctgaggctcgcgacaaattctgcgcggacatgaagcatgagggtgtgaacatcggtggcggcggtcccattggaattcgtctgcgtcccatgcttgtgttccagaagcaccatgctgacatcatgctggctgccattgacaaggtcttctctgcttag
Claims (10)
1.一种4-氨基丁酸转氨酶，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的4-氨基丁酸转氨酶的核酸分子，其具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的4-氨基丁酸转氨酶的突变体，其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
4.编码权利要求3所述的4-氨基丁酸转氨酶的突变体的核酸分子，其具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
5.一种重组载体，其包含权利要求2或4所述的核酸分子。
6.一种重组细胞，其包含权利要求5所述的重组载体。
7.一种4-氨基丁酸转氨酶或其突变体的制备方法，其包括如下步骤：
对权利要求6所述的重组细胞进行诱导培养，得到培养物；
从所述培养物中分离权利要求1所述的4-氨基丁酸转氨酶或权利要求3所述的4-氨基丁酸转氨酶的突变体。
8.权利要求1所述的4-氨基丁酸转氨酶、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的4-氨基丁酸转氨酶的突变体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的重组细胞和/或权利要求7所述的方法制备得到的4-氨基丁酸转氨酶或其突变体在制备戊二酸中的应用。
9.一种戊二酸的制备方法，其包括如下步骤：以权利要求1所述的4-氨基丁酸转氨酶、权利要求3所述的4-氨基丁酸转氨酶的突变体、权利要求6所述的重组细胞和/或权利要求7所述的方法制备得到的4-氨基丁酸转氨酶或其突变体作为催化剂，对5-氨基戊酸进行催化反应，得到戊二酸。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述催化反应中，温度为20-40℃；初始pH为7-9；和/或
所述催化反应包含5-氨基戊酸、α-酮戊二酸、聚山梨酸酯80和NAD+；
5-氨基戊酸的浓度为200-500mM；
α-酮戊二酸的浓度为100-300mM；
聚山梨酸酯80的体积百分数为0.01-1％；
NAD+的浓度为5-20mM。
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