CN115261249B - 一种豌豆根瘤菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有黑麦草促生功能的豌豆根瘤菌及其应用，涉及生物材料技术领域。菌株编号YP‑2S4，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 202203。实验证明豌豆根瘤菌Rhizobium leguminosarum菌株YP‑2S4具有显著提高黑麦草植株高度，提高黑麦草种子的发芽率的特性。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种豌豆根瘤菌及其应用。
背景技术
黑麦草(Lolium perenne L.)是禾本科常见的一种牧草，一年生或多年生，草质柔软具微毛，叶片细长，部分种长有叶耳。黑麦草适应能力强且产量高，发芽所需时间短且生长速度快，是各地普遍引种栽种的优良牧草。黑麦草具有鲜草适口性好，能促进动物消化吸收，干草粗蛋白含量高，各种氨基酸、维生素等营养物质含量丰富的特点，在畜牧业生产方式中发挥着重要作用(林雨鑫等, 2021)。因黑麦草种子萌芽生长周期短，适应性强，能在绝大多数生境中正常生长，因而也广泛应用于促生实验(刘晓霞等, 2019)。
根瘤菌(Rhizobium spp.)一般认为与豆科植物共生，将空气中的氮气转化为植物可以利用的化合态氮。在这个固氮体系中，根瘤菌可为豆科作物提供50%-90%的氮素营养，从而减少氮肥的施用，防止土壤酸化的发生(张秋磊等, 2008)。根瘤菌也可以定殖于非豆科植物根际，具有植物促生(Plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)作用。如定殖于水稻、油菜、小麦、棉花的根际，可以显著促进其根系的生长，提高植株的高度和干重(李婷等, 2013)。然而促生菌与植物间的相互作用也不尽相同，有的能促进植物生长，有的却会抑制植物生长(Herrmann et al. 2013)。鉴于根瘤菌在豆科植物与非豆科植物的相互关系中发挥的多重作用，深入研究其作用机理，进一步扩大根瘤菌的宿主植物范围尤其是禾本科植物，进一步提高根瘤菌对各种非豆科植物的促生作用效果，是未来实现农业可持续发展的方向之一。
所以，亟需一种具有黑麦草促生作用的根瘤菌。
发明内容
鉴于上述问题，本发明提供一种豌豆根瘤菌及其应用，以实现促进黑麦草生长以及提高黑麦草种子的发芽率的技术效果。
为实现上述目的，一种豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）菌株，菌株编号YP-2S4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022031。
进一步的，16SDNA 的序列为SEQ ID No.1所示。
本发明还保护一种豌豆根瘤菌菌株在黑麦草促生中的应用。
本发明还保护一种豌豆根瘤菌菌株在黑麦草促生菌剂中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的一种豌豆根瘤菌 YP-2S具有显著提高黑麦草植株高度，提高黑麦草种子的发芽率的技术效果，在黑麦草的促生菌剂方面具有广大的应用前景。
附图说明
图1为豌豆根瘤菌YP-2S4的菌落形态图。
实施方式
本发明将根据下列实施例进行更具体的说明。然而，本发明的保护范围并不受限于下列的实施例。
实施例1豌豆根瘤菌YP-2S4的分离、纯化和保存
1、菌株分离和培养基制备
样品采集：土壤样品采集自拉萨市的当雄县(91°29'47.45" E，30°35'29.12" N)，收集的土壤样品装入干净的采样袋中，做好标记，保存在-80℃冰箱。需要说明的是，所采样地区为高寒草地，海拔高且气温低。
制备用于细菌培养的LB 培养基；用于溶无机磷菌的筛选的蒙金娜无机磷(PKO)培养基 (赵伟进等，2018)；用于溶有机磷菌的筛选的蒙金娜有机磷培养基 (马骢毓等，2017)；用于解钾菌的筛选的亚历山大罗夫培养基 (李新新等，2014)。所有培养基配制完毕后，经高压蒸汽灭菌锅 121℃灭菌20min；备用。
2、菌株分离
在超净工作台中称取土壤样品 5g，小心加入锥形瓶中，瓶内含有50mL无菌水，振荡摇匀。取上清液逐级梯度稀释100倍和1000倍，每平板取 1000倍梯度浓度样品0.1mL分别涂布于溶有机磷菌的蒙金娜有机磷培养基、溶无机磷菌的蒙金娜无机磷(PKO)培养基和解钾菌选择性亚历山大罗夫培养基上，加盖后倒置于30℃的恒温培养箱中培养3~6d。
选择生长较快、透明圈较明显且完整的单菌落进行纯化。将初筛的单菌落用灭菌过的牙签挑起，并转至装有相对应选择性液体培养基的EP管中， 30℃，180rmp 培养 2~3d。其中，溶有机磷的蒙金娜有机磷培养基对应溶有机磷液体培养基、溶无机磷的蒙金娜无机磷培养基对应溶无机磷液体培养基、解钾菌选择性亚历山大罗夫培养基对应解钾菌选择性液体培养基。
待EP 管中液体浑浊后，用接种环接种于对应的选择性固体平板培养基中四区划线，加盖后倒置于30℃的恒温培养箱中培养 3~6d，待长出明显单菌落后，重复上述实验操作，直至平板培养基上仅有同种单菌落。
3、菌株鉴定
图1对豌豆根瘤菌YP-2S4的菌落形态进行了整体描述；如图1所示，在LB平板培养基上形成圆形中央凸起状，边缘光滑，菌落表面湿润光滑有光泽，粘稠有弹性，颜色乳白色的菌落；菌落形态符合典型豌豆根瘤菌Rhizobium leguminosarum的形态特征。
在超净工作台，挑取LB平板培养基上透明圈明显、完整的单菌落于装有 LB 液体培养基的 EP 管中，盖紧。于30℃，180rmp 振荡培养 2d，离心后所得细菌菌剂进行 16S 测序 PCR 扩增，测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示。
在 NCBI 上通过 Blast程序用拼接后的序列比对同源性进行鉴定，鉴定为豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum, KR336601, 100%)，命名豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum）YP-2S4 ，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2022031。
实验例 黑麦草促生实验
将Caballeronia humi菌株Y-2X1(解钾菌)，Paenibacillus terrae 菌株YP-1S1(溶有机磷菌)，Paraburkholderia phytofirmans菌株WP-3X1(溶无机磷菌)和水均作为豌豆根瘤菌Rhizobium leguminosarum菌株YP-2S4(溶有机磷菌)的对照组，用于黑麦草的株高实验和发芽率实验。
1、制备菌剂
吸取100μL纯化后的豌豆根瘤菌YP-2S4，均匀地涂布在 LB 固体平板培养基上，加盖后置于30℃的恒温培养箱中进行暗培养，待LB 固体平板培养基上长出明显单菌落，且无污染时，挑取单菌落于 50mL LB 液体培养基中，30℃，180rpm 振荡培养 48h，选取OD 值为0.5 时，制成豌豆根瘤菌YP-2S4菌剂。
2、利用豌豆根瘤菌YP-2S4菌剂，进行黑麦草促生实验
挑选饱满完整的黑麦草种子；其中，在实验前需要对种子进行表面消毒：用 75%酒精对黑麦草种子消毒 1min，用无菌水洗3次，然后用 5% NaClO3消毒 3~5 min，再用无菌水洗 3~5 次。
用所制备的豌豆根瘤菌YP-2S4菌剂将消毒后的黑麦草种子浸泡 1h，加盖 3 层滤纸，5mL 无菌水浸湿的培养皿中，加盖后置于30℃的恒温培养箱中暗培养。其中，每个皿放30 粒浸泡同一菌剂的黑麦草种子；且，以无菌水浸种为对照。
实验10d后，黑麦草种子发芽率不再变化，停止培养。采用同样的实验方法，每个培养皿中放 10粒浸泡同一菌剂的黑麦草种子，每种菌剂 3 次重复。加盖后置于30℃的恒温培养箱中暗培养。实验10d后，黑麦草种子发芽率不再变化，停止培养。黑麦草促生实验结果的对比情况，见表1所示：
表1黑麦草促生实验结果对比情况
通过观察表1可见，在豌豆根瘤菌Rhizobium leguminosarum YP-2S4菌剂促生实验中，黑麦草发芽率为96.7%，平均株高为11.5cm，与水(对照组)相比，发芽率提高了7%以上，株高增加了20％，T-test具有极显著差异性(0.0059)。
同样是可溶有机磷菌，在Paenibacillus terrae菌株YP-1S1的促生实验发现，黑麦草发芽率为83%，平均株高为7.62cm；与水(对照组)相比，发芽率降低了10.8%以上，株高下降了19.8％，T-test具有显著差异性(0.029)。
在Paraburkholderia phytofirmans菌株WP-3X1的促生实验发现，黑麦草发芽率为30%，平均株高为7.61cm；与水(对照组)相比，发芽率降低了67.7%以上，株高下降了19.9％。
在解钾菌Caballeronia humi菌株Y-2X1的促生实验发现，黑麦草发芽率为86.7%，平均株高为8.2cm，与水(对照组)相比，发芽率降低了6.7%以上，株高下降了13.7％。
综上，本发明提供的豌豆根瘤菌Rhizobium leguminosarum YP-2S4菌株能有效促进非豆科植物黑麦草的发芽率提高和植株高度；在扩大根瘤菌的宿主植物范围尤其是禾本科植物，进一步提高根瘤菌对各种非豆科植物的促生作用效果领域具有推广价值。
本文中所涉及的各种实验用品（包括但不限于：化学试剂、生物制品、细胞、生物体、仪器等）之中，对于那些特殊的或不易获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验用品，在本申请日之前，可以通过各种方式（例如购买、自行制备等）很方便地获得。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式以及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）菌株，其特征在于，菌株编号YP-2S4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022031。
2.根据权利要求1所述的豌豆根瘤菌菌株，其特征在于， 16SDNA 的序列为SEQ IDNo.1所示。
3.一种如权利要求1所述的豌豆根瘤菌菌株在黑麦草促生中的应用。
4.一种如权利要求1所述的豌豆根瘤菌菌株在黑麦草促生菌剂中的应用。
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