CN113278089A - 一种山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法，属于山茱萸籽多糖提取技术领域，包括以下步骤:将山茱萸籽干燥后粉碎，脱脂，均匀分散于水溶剂中，于亚临界反应釜中反应，抽滤，得到提取液；利用活性炭去除提取液中的有色杂质，得澄清的粗多糖溶液，随后加入Sevage试剂并使Sevage试剂均匀分散于粗多糖溶液后静置，收集上清液，获得脱蛋白多糖溶液；将脱蛋白多糖溶液减压浓缩，真空冷冻干燥，得到山茱萸籽多糖粗品；将山茱萸籽多糖粗品依次使用DEAE‑52纤维素柱和Sephadex G‑100柱进行洗脱，将洗脱液真空冷冻干燥，即得到山茱萸籽多糖纯品。本发明整个分离提取与纯化的耗时短，且得到的山茱萸籽多糖纯度高，适合大规模生产，有效解决了对于山茱萸籽资源浪费的情况。

Description

一种山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法

技术领域

本发明涉及植物多糖提取技术领域，尤其涉及一种山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法。

背景技术

山茱萸，又名山萸肉、蜀枣，为山茱萸科山茱萸属落叶小乔木，主要分布于我国浙江、河南、山东等地。临床上，以其干熟果肉入药，有补益肝肾，涩精固脱的功效，是我国传统的中药材。

近年来，由于山茱萸果肉中含有丰富的糖类，有机酸，酯类，鞣质类，酮等药用及营养保健成分，是治疗糖尿病，冠心病和高血压病的主要药材。且有研究表明，山茱萸多糖是山茱萸生物学活性物质的重要成分，具有抗氧化及免疫调节等生理活性，因此，山茱萸果肉得到了广泛应用。然而，由于对于山茱萸籽的研究比较少，是山茱萸籽常被作为填充枕头的材料或直接废弃，造成资源浪费。且现有研究表明其他山茱萸籽含糖量较高，达64.7％，山茱萸籽占山茱萸果实的80％左右，而作药用的果肉只占很小一部分，因此非常有必要对山茱萸籽中的多糖进行研究，这将有助于提高山茱萸的利用价值，并对增加农民收入具有重要意义。

现有技术公开了一种提取方法，将山茱萸籽粉碎后浸泡，再将浸泡液旋干后得到山茱萸籽的提取物，该方法虽然操作简单，但是提取过于粗糙，得到的提取物中山茱萸籽多糖含量少且含有杂质。为了得到含量高且不含杂质的纯山茱萸籽多糖，本发明提供一种山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法。

发明内容

为了解决上述现有技术中的不足，本发明提供一种山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法。该方法整体制备周期耗时短，通过亚临界反应在短时间内，破坏山茱萸籽的结构，从而使多糖和蛋白质大分子更大程度的溶出，再通过脱蛋白和柱层析得到高纯度的山茱萸籽多糖，从而有效解决了对于山茱萸籽资源浪费的情况。

本发明的一种山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法，具体是通过以下技术方案实现的:

本发明提供一种山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法，包括以下步骤:

S1，将山茱萸籽干燥后粉碎，脱脂，得脱脂后的山茱萸籽粉末；将脱脂后的山茱萸籽粉末均匀分散于水溶剂中，并将其置于亚临界反应釜中进行水热反应，冷却至室温后抽滤，得到提取液；

S2，利用活性炭将提取液中的有色杂质去除，获得澄清的粗多糖溶液，随后向粗多糖溶液中加入Sevage试剂，振荡使Sevage试剂均匀分散于粗多糖溶液后静置，收集上清液，获得脱蛋白多糖溶液；将所得脱蛋白多糖溶液减压浓缩，真空冷冻干燥，得到山茱萸籽多糖粗品；

S3，将获得的山茱萸籽多糖粗品依次使用DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-100柱进行洗脱，将洗脱液真空冷冻干燥，即得到山茱萸籽多糖纯品。

进一步地，所述水热反应是在120～200℃下反应3～60min。

进一步地，将所述山茱萸籽多糖粗品置于DEAE-52纤维素柱上，依次用蒸馏水、NaCl溶液进行分级洗脱，收集洗脱液并将其真空冷冻干燥，得到初步纯化的山茱萸籽多糖。

进一步地，将所述初步纯化的山茱萸籽多糖置于Sephadex G-100柱上，用蒸馏水对其进行洗脱，收集洗脱液并将其进行真空冷冻干燥，得到山茱萸籽多糖纯品。

进一步地，所述Sevage试剂为氯仿:正丁醇＝4:1(v/v)的混合液，所述粗多糖溶液与所述Sevage试剂的体积比为1:4～6。

进一步地，加入Sevage试剂后，振荡使Sevage试剂均匀分散于粗多糖溶液后静止，弃取中间蛋白层和下层，重复多次至无明显的中间蛋白层，收集上层的浓缩多糖溶液，获得脱蛋白多糖溶液。

进一步地，步骤S2中，所述活性炭与提取液的用量比为1g：40～60mL。

进一步地，步骤S1中，所述山茱萸籽干燥至含水量10％以下，粉碎至粉末能通过80目筛。

进一步地，步骤S1中，使用石油醚脱脂，脱脂后将石油醚挥干，得到脱脂后的山茱萸籽粉末。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果:

本发明首先将山茱萸籽干燥后粉碎成粉末，增大其表面积，便于后续处理，再将山茱萸籽粉末使用石油醚进行脱脂处理，除去山茱萸籽中的脂类，从而提高山茱萸籽多糖提取的纯度。随后将脱脂后的山茱萸籽粉末均匀分散于水溶剂中，通过亚临界反应在短时间内，破坏山茱萸籽的结构，使山茱萸籽多糖和蛋白质大分子大程度的溶出至提取液中，随后迅速冷却至室温，使其他杂质析出，随后将杂质和山茱萸籽的残渣滤出，提高山茱萸籽多糖在提取液中含量的同时提升提取液中山茱萸籽多糖的纯度。随后向提取液中加入活性炭，吸附掉其他杂质以及一些色素分子，进一步提高提取液中山茱萸籽多糖的纯度，同时去除其他有色物质对山茱萸籽多糖颜色的干扰。然后向脱色后的提取液中加入 Sevage试剂，以除去因亚临界反应溶出的蛋白质，进一步提高提取液中山茱萸籽多糖的纯度。随后将脱蛋白质的山茱萸籽多糖经过DEAE-52纤维素柱层析和 Sephadex G-100柱层析，最终得到高纯度的山茱萸籽多糖。本发明通过各个步骤依次进行，步骤之间紧密联系，逐步对山茱萸籽多糖进行纯化，且整个工艺耗时短且得到的山茱萸籽多糖纯度高，适合大规模生产。有效解决了对于山茱萸籽资源浪费的情况。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

本实施例一种山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法，包括以下步骤:

将山茱萸籽干燥至含水量为10％后，将其粉碎至粉末能通过80目筛，用石油醚脱脂3次，挥干石油醚，得到脱脂后的山茱萸籽粉末；按照每克山茱萸籽粉末40毫升的蒸馏水的比例，向脱脂后的山茱萸籽粉末中加入蒸馏水，置于亚临界反应釜中，于160℃温度下反应20min，随后迅速冷却至室温，抽滤，得到提取液和滤渣；

按照活性炭与提取液为1g：50mL的用量比，向提取液中加入活性炭，于 200r/min的速率下，25℃恒温振荡1h，使活性炭均匀分散于提取液中，从而将提取液中的有色杂质进行吸附，随后将活性炭滤出，获得澄清的粗多糖溶液；

向粗多糖溶液中加入Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝4:1(v/v))，粗多糖溶液与Sevage试剂的体积比为1:5，振荡使Sevage试剂均匀分散于粗多糖溶液后静置，弃取中间蛋白层和下层，重复三次后无明显的中间蛋白层，收集上层的浓缩多糖溶液，获得脱蛋白多糖溶液，随后将所得脱蛋白多糖溶液减压浓缩，真空冷冻干燥，得到山茱萸籽多糖粗品；

将获得的山茱萸籽多糖粗品加入到DEAE-52纤维素柱(2.5*60cm)上，依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl溶液、0.2mol/L NaCl溶液及0.3mol/L NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液，真空冷冻干燥，得到4组样品，分别命名为组分1、组分2、组分3和组分4，其得率分别为3.24％、6.18％、7.59％、22.11％。

将组分1、组分2、组分3和组分4分别溶于蒸馏水中、过滤弃取杂质，分别加入到Sephadex G-100凝胶色谱柱上，用蒸馏水进行洗脱(洗脱流速为 0.5mL/min，每管2mL)，收集洗脱液，并将其进行真空冷冻干燥，得到多糖纯品，综合DEAE-52纤维素柱层析纯化得率，组分1、组分2、组分3和组分4 的最终得率分别为2.5％、4.82％、5.92％、17.25％。

实施例2

本实施例一种山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法，包括以下步骤:

将山茱萸籽干燥至含水量为8％后，将其粉碎至粉末能通过80目筛，用石油醚脱脂3次，挥干石油醚，得到脱脂后的山茱萸籽粉末；按照每克山茱萸籽粉末40毫升的蒸馏水的比例，向脱脂后的山茱萸籽粉末中加入蒸馏水，置于亚临界反应釜中，于120℃温度下反应60min，随后迅速冷却至室温，抽滤，得到提取液和滤渣；

按照活性炭与提取液为1g：40mL的用量比，向提取液中加入活性炭，在于100r/min的速率下，30℃恒温振荡1.5h，使活性炭均匀分散于提取液中，从而将提取液中的有色杂质进行吸附，随后将活性炭滤出，获得澄清的粗多糖溶液；

向粗多糖溶液中加入Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝4:1(v/v))，粗多糖溶液与Sevage试剂的体积比为1:4，振荡使Sevage试剂均匀分散于粗多糖溶液后静置，弃取中间蛋白层和下层，重复三次后无明显的中间蛋白层，收集上层的浓缩多糖溶液，获得脱蛋白多糖溶液，随后将所得脱蛋白多糖溶液减压浓缩，真空冷冻干燥，得到山茱萸籽多糖粗品；

将获得的山茱萸籽多糖粗品溶于蒸馏水中，过滤，弃取杂质后加入到 DEAE-52纤维素柱(2.5*60cm)，依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl溶液、 0.2mol/L NaCl溶液及0.3mol/LNaCl溶液进行洗脱，收集吸收峰的洗脱液，真空冷冻干燥，得到4组样品，分别命名为组分1、组分2、组分3和组分4，其得率分别为3.01％、5.79％、7.11％、21.68％。

将组分1、组分2、组分3和组分4分别溶于蒸馏水中、过滤弃取杂质，分别加入到Sephadex G-100凝胶色谱柱，用蒸馏水进行洗脱(洗脱流速为0.5mL/ min，每管2mL)，收集吸收峰洗脱液，并将其进行真空冷冻干燥，得到多糖纯品，综合DEAE-52纤维素柱层析纯化得率，组分1、组分2、组分3和组分4 的最终得率分别为2.26％、4.34％、5.33％、16.26％。

实施例3

本实施例一种山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法，包括以下步骤:

将山茱萸籽干燥至含水量为9％后，将其粉碎至粉末能通过80目筛，用石油醚脱脂3次，挥干石油醚，得到脱脂后的山茱萸籽粉末；按照每克山茱萸籽粉末40毫升的蒸馏水的比例，向脱脂后的山茱萸籽粉末中加入蒸馏水，置于亚临界反应釜中，于200℃温度下反应3min，随后迅速冷却至室温，抽滤，得到提取液和滤渣；

按照活性炭与提取液为1g：60mL的用量比，向提取液中加入活性炭，于 300r/min的速率下，40℃恒温振荡0.5h，使活性炭均匀分散于提取液中，从而将提取液中的有色杂质进行吸附，随后将活性炭滤出，获得澄清的粗多糖溶液；

向粗多糖溶液中加入Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝4:1(v/v))，粗多糖溶液与所述Sevage试剂的体积比为1:6，振荡使Sevage试剂均匀分散于粗多糖溶液后静置，弃取中间蛋白层和下层，重复三次后无明显的中间蛋白层，收集上层的浓缩多糖溶液，获得脱蛋白多糖溶液，随后将所得脱蛋白多糖溶液减压浓缩，真空冷冻干燥，得到山茱萸籽多糖粗品；

将获得的山茱萸籽多糖粗品溶于蒸馏水中，过滤，弃取杂质后加入到 DEAE-52纤维素柱(2.5*60cm)，依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl溶液、 0.2mol/L NaCl溶液及0.3mol/LNaCl溶液进行洗脱，收集吸收峰的洗脱液，真空冷冻干燥，得到4组样品，分别命名为组分1、组分2、组分3和组分4，其得率分别为3.18％、6.01％、7.38％、21.97％。

将组分1、组分2、组分3和组分4分别溶于蒸馏水中、过滤弃取杂质，分别加入到Sephadex G-100凝胶色谱柱，用蒸馏水进行洗脱(洗脱流速为0.5mL/ min，每管2mL)，收集吸收峰洗脱液，并将其进行真空冷冻干燥，得到多糖纯品，综合DEAE-52纤维素柱层析纯化得率，组分1、组分2、组分3和组分4 的最终得率分别为2.41％、4.57％、5.61％、16.70％。

本发明对实施例1至实施例3的各个最终产物均进行了紫外吸收测试，测试结果表明实施例1至实施例3的各个最终产物在260nm以及280nm处均没有明显的吸收峰，说明本发明方法得到的山茱萸籽多糖纯度高，没有蛋白质和核算残留。

本发明采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，具体测试方法与现有技术一致，顾不在此进行赘述。

显然，上述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (9)

1.一种山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法，其特征在于，包括以下步骤:

S1，将山茱萸籽干燥后粉碎，脱脂，得脱脂后的山茱萸籽粉末；将脱脂后的山茱萸籽粉末均匀分散于水溶剂中，并将其置于亚临界反应釜中进行水热反应，冷却至室温后抽滤，得到提取液；

S2，利用活性炭将提取液中的有色杂质去除，获得澄清的粗多糖溶液，随后向粗多糖溶液中加入Sevage试剂，振荡使Sevage试剂均匀分散于粗多糖溶液后静置，收集上清液，获得脱蛋白多糖溶液；将所得脱蛋白多糖溶液减压浓缩，真空冷冻干燥，得到山茱萸籽多糖粗品；

S3，将获得的山茱萸籽多糖粗品依次使用DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-100柱进行洗脱，将洗脱液真空冷冻干燥，即得到山茱萸籽多糖纯品。

2.如权利要求1所述的山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法，其特征在于，所述水热反应是在120～200℃下反应3～60min。

3.如权利要求1所述的山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法，其特征在于，将所述山茱萸籽多糖粗品置于DEAE-52纤维素柱上，依次用蒸馏水、NaCl溶液进行分级洗脱，收集洗脱液，得到含有初步纯化的山茱萸籽多糖溶液。

4.如权利要求3所述的山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法，其特征在于，将所含有初步纯化的山茱萸籽多糖溶液置于Sephadex G-100柱上，用蒸馏水对其进行洗脱，收集洗脱液并将其进行真空冷冻干燥，得到山茱萸籽多糖纯品。

5.如权利要求1所述的山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法，其特征在于，所述Sevage试剂为氯仿:正丁醇＝4:1，v/v的混合液，所述粗多糖溶液与所述Sevage试剂的体积比为1:4～6。

6.如权利要求5所述的山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法，其特征在于，加入Sevage试剂后，振荡使Sevage试剂均匀分散于粗多糖溶液后静止，弃取中间蛋白层和下层，重复多次至无明显的中间蛋白层，收集上层的浓缩多糖溶液，获得脱蛋白多糖溶液。

7.如权利要求1所述的山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法，其特征在于，步骤S2中，所述活性炭与提取液的用量比为1g：40～60mL。

8.如权利要求1所述的山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述山茱萸籽干燥至含水量10％以下，粉碎至粉末能通过80目筛。

9.权利要求1所述的山茱萸籽多糖的分离提取与纯化方法，其特征在于，步骤S1中，使用石油醚脱脂，脱脂后将石油醚挥干，得到脱脂后的山茱萸籽粉末。