CN115120713A - 氢氧化铝-CpG寡核苷酸-多肽复合佐剂、疫苗及制备方法和用途 - Google Patents

氢氧化铝-CpG寡核苷酸-多肽复合佐剂、疫苗及制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于疫苗制备领域，具体涉及一种氢氧化铝‑CpG寡核苷酸‑多肽复合佐剂、疫苗及制备方法和用途。本发明所要解决的技术问题是提供一种性能良好的、新型复合免疫佐剂。解决该技术问题的技术方案是提供一种主要含有铝佐剂、CpG寡核苷酸和多肽的复合免疫佐剂。本发明复合免疫佐剂具有免疫活性强、临床安全性高等优点，是一种优秀的针对多种抗原的复合免疫佐剂。经实验证明，本发明的氢氧化铝‑CpG‑多肽复合佐剂制备的多种疫苗都具有更高的免疫效果和治疗效果，能有效激发机体产生抗原特异性免疫反应，并延长免疫记忆。更为重要的是，本发明免疫佐剂所制备抗肿瘤的疫苗具有非常好的效果，为本领域疫苗的开发和应用提供了新的选择。

Description

氢氧化铝-CpG寡核苷酸-多肽复合佐剂、疫苗及制备方法和 用途
技术领域
本发明属于疫苗制备领域，具体涉及一种以氢氧化铝、CpG寡核苷酸和多肽为主要成分的复合免疫佐剂，制成的疫苗及制备方法和用途。
背景技术
佐剂在疫苗的效能中发挥着重要作用，它是决定疫苗发展的重要因素之一。疫苗中加入佐剂目的是为了加强抗原的免疫原性和免疫保护效果，表现为增强特异性抗原的特异性体液免疫和/或细胞免疫反应，从而可以提高特异性抗体的产生或/和特异性细胞免疫功能，减少有效免疫接种所需的抗原量，减少需要加强免疫接种的频率，提高早期免疫应答和免疫功能不全者的应答成功率等等。目前，市场上常用的疫苗佐剂主要是铝佐剂(主要种类为氢氧化铝凝胶主要成分AL(OH)3或者ALPO3，简称铝盐)，氢氧化铝是唯一被FDA批准用于临床的疫苗佐剂。氢氧化铝作为佐剂激发免疫反应的主要机制是：利用其凝胶状的乳浊液将抗原包裹后，在机体注射位点缓慢释放抗原，提高抗原在体内的“半衰期”，从而达到提高疫苗的免疫反应；它主要诱导机体的Th2型细胞作用于B细胞从而诱发机体的体液免疫。铝佐剂其另一个优点是良好的安全性；但是，铝佐剂可以诱导机体产生的IgE抗体，该类抗体可以诱发过敏反应，而且，该类佐剂不可以诱发Th1免疫反应，这种免疫反应参与清除细胞内微生物侵染的反应，即杀伤性T淋巴细胞反应(CTL)。这些都限制了铝盐作为佐剂的应用。
因此，对于那些已经取得研发成功的用于人类或者兽用疫苗来说，研发一种可以有效的提高或者调节抗原特异性免疫反应的新型佐剂或者佐剂复合物就是一个重大进步。脊椎动物的自然免疫***已经发展出基于各种特定抗原信号分子的不同的机制来识别抗原，包括toll-样受体(TLR)，NOD等等。在机体清除外来微生物感染这一应急免疫反应中，基于TLR受体的配体识别而产生的一系列的信号传导发挥着重要作用；而且，TLR受体还可以诱导DC细胞的成熟--这是启动适应性免疫必须的和最重要的一步。在TLR受体识别分子中，研究最多最成熟是识别TLR-9的大肠杆菌来源的非甲基化的CpG寡核苷酸(CpGoligodeoxynucleotide，CpG ODN，简称CpG)。CpG ODN可与Toll样受体家族中TLR9结合激活DC细胞，诱导IL-12、IFN-γ、TNF-α等Th1型细胞因子；也可激活NK细胞，增强巨噬细胞和NK细胞的细胞毒作用，促进抗原特异性Th1型免疫反应。
但是，CpG ODN缺乏细胞特异性，而且带有负电荷，不易被细胞摄取，且CpG ODN受体TLR9位于细胞内，单独作为佐剂利用率低。而有研究报道，高剂量CpG ODN还会导致组织水肿，并可能引发自身免疫性疾病。如何提高使用效率和安全性是CpG ODN应用道路上的一大难点。
一些多肽具有免疫调节功能和直接抗菌能力。这些免疫调节功能主要体现在它们可以诱导细胞因子和趋化因子的表达增强、直接或者间接募集粒细胞到达感染部位、刺激肥大细胞释放组织胺、树突细胞(DC)成熟和伤口愈合，而要得到好的免疫调节能力的多肽比较困难。
近年来，肿瘤免疫疗法作为***的新的可能途径而日益受到人们的关注，用于预防和***的肿瘤疫苗也成为肿瘤免疫治疗的研究热点。其中，寻找特异性肿瘤抗原和有效的抗原摄取递呈辅助手段是肿瘤疫苗研制的关键问题之一。但是，由于肿瘤抗原的免疫原性都往往较弱，在单独使用时，激发的免疫反应不够强，必须在免疫佐剂的协助下才能诱导机体产生有效的抗肿瘤免疫反应。而现有的常规佐剂在配合肿瘤抗原使用时效果并不理想，必须要研发适合于肿瘤免疫疗法的新的抗原佐剂。
本领域目前急需开发能会激发更多的信号通路达到协同增加免疫反应的效果，进而实现激发更强的特异性免疫反应的免疫佐剂，更为适用于制备肿瘤疫苗，为本领域肿瘤疫苗的研发提供新的有效选择。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种性能良好的、新型复合免疫佐剂。
解决该技术问题的技术方案是提供一种复合免疫佐剂。该复合免疫佐剂主要含有铝佐剂、CpG寡核苷酸和选自氨基酸序列为SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10中的至少一条多肽。
其中，上述所述复合免疫佐剂中各主要成分的重量配比为铝佐剂︰CpG寡核苷酸︰多肽＝1～25︰1︰1～4。
其中，上述免疫佐剂中各主要成分的优选的重量配比为铝佐剂︰CpG寡核苷酸︰多肽＝1～25︰1︰2。
进一步的，上述铝佐剂为氢氧化铝凝胶。
优选的，所述氢氧化铝凝胶为粒径为2μm～4μm的氢氧化铝凝胶颗粒。更优选的，所述氢氧化铝凝胶的粒径为3μm。
其中，上述复合免疫佐剂中所述的CpG寡核苷酸的核苷酸序列为：
5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID No.1)。
其中，上述免疫佐剂中的多肽SEQ ID No.7的氨基酸序列为：VQWRIRVAVIRK(命名为DP7)；SEQ ID No.8的氨基酸序列为：VQLRIRVCVIRK(命名为DP8)；SEQ ID No.2的氨基酸序列为：VQLRCRVCVIRK(命名为DP10)。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述的复合免疫佐剂在制备疫苗中的用途。
其中，上述的的疫苗为治疗性疫苗或者预防性疫苗。
同时，本发明还提供了上述复合免疫佐剂添加抗原形成的免疫佐剂-抗原复合物。
其中，上述免疫佐剂-抗原复合物中的抗原和复合免疫佐剂之间的重量配比为抗原重量:免疫调节活性肽重量＝1︰1～400。
其中肿瘤抗原重量:免疫调节活性肽重量＝1︰1～10，病毒抗原重量:免疫调节活性肽重量＝1︰200～400。
进一步的，上述免疫佐剂-抗原复合物可制备为治疗性疫苗或者预防性疫苗。
其中，上述免疫佐剂-抗原复合物中所述的抗原为肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原中的至少一种。
进一步的，所述肿瘤抗原包括由肿瘤细胞表达的特异性的蛋白质或多肽。比如为WT1、MUC1、EGFRvIII、HER-2、MAGE-A3、NY-ESO-1、PSMA、GD2或MART1等现已报道的肿瘤抗原或基于病人肿瘤序列测定的个体化的突变新抗原组合。所述病毒抗原，可为组成病毒部分的蛋白质或多肽，或者在受病毒表达机制控制的病毒感染的细胞中表达的特异性的蛋白质或多肽。比如EBV、LMP2、HPV E6 E7、腺病毒5Hexon、HCMV pp65、HBsAg蛋白等病毒相关抗原。
所述细菌抗原，包括由细菌表达的蛋白质或多肽。比如绿脓杆菌抗原、破伤风杆菌抗原、肺炎链球菌、沙门氏菌等细菌抗原。
在上述技术方案的基础上，本发明还提供了制备上述复合免疫佐剂的方法。该方法包括以下步骤：
a、按配比取多肽和CpG寡核苷酸，混匀，室温孵育10-20min,；
b、再按配比加入氢氧化铝凝胶，混匀，得到复合免疫佐剂。
本发明还提供了制备上述免疫佐剂-抗原复合物的方法。
其特征在于包括以下步骤：
a、按配比取多肽并和CpG寡核苷酸，混匀，室温孵育10-20min；
b、再按配比加入氢氧化铝凝胶，混匀，得到复合免疫佐剂；
c、然后按配比加入抗原，混匀，得到免疫佐剂-抗原复合物。
上述方法步骤a中，一般室温孵育15min左右即可。步骤c得到的免疫佐剂-抗原复合物可用无菌PBS补齐所需体积进行后继使用。
本发明的有益效果为：本发明创造性地得到了氢氧化铝/CpG寡核苷酸/多肽构成的新的复合免疫佐剂配方。本发明复合免疫佐剂具有免疫活性强、临床安全性高等优点，是一种优秀的针对多种抗原的复合免疫佐剂。经实验证明，本发明的氢氧化铝/CpG寡核苷酸/多肽佐剂制备的多种疫苗都具有疫苗具有更高的免疫效果和治疗效果，能有效激发机体产生抗原特异性免疫反应，并延长免疫记忆。更为重要的是，本发明免疫佐剂所制备抗肿瘤的疫苗具有非常好的效果，为本领域疫苗的开发和应用提供了新的选择。
附图说明
图1CpG/免疫调节活性肽复合物配比的确定及毒性检测。a:凝胶阻滞实验第1泳道：CpG(5μg)+DP7(20μg)；第2泳道：CpG(5μg)+DP7(10μg)；第3泳道:CpG(5μg)+DP7(5μg)；第4泳道：CpG(5μg)+DP7(2.5μg)；第5泳道:CpG(5μg)+DP7(1.25μg)；第6泳道:CpG(5μg)；b:红细胞经CpG/DP(2-11)复合物刺激后血红素的释放和PBMCs经CpG/DP(2-11)复合物刺激后LDH的释放。
图2CpG/免疫调节活性肽复合物筛选。a:CpG ODN/防御短肽DP2～DP11复合物刺激人PBMC后释放MCP-1检测。b:HbsAg/alum/CpG/DP2～DP11激发的免疫反应的检测。c:DP7、DP8和DP10的体内趋化作用，每一组中从左到右分别为生理盐水、DP7、DP8和DP10。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001。
图3CpG/DP7复合佐剂刺激人外周血单核细胞产生细胞因子IL-1β、IFN-γ、TNF-α、IL-10的检测。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001。
图4CpG/DP7激活BMDC活性。a.CpG/DP7促进BMDCs摄取抗原；b-d.CpG/DP7促进BMDCs成熟；c.CpG/DP7上调pERK1/2和p-p65表达。
图5为NY-ESO-1蛋白或OVA蛋白与氢氧化铝凝胶/CpG寡核苷酸//免疫调节活性肽混合物制备的肿瘤疫苗的抗肿瘤效果。a:黑色素瘤预防性模型中各组小鼠肿瘤生长情况。b:黑色素瘤治疗性模型中各组小鼠肿瘤生长情况。c:T淋巴瘤预防性模型中各组小鼠肿瘤生长情况。d:T淋巴瘤治疗性模型中各组小鼠肿瘤生长情况。e:乳腺癌预防性模型中各组小鼠肿瘤生长情况。f:乳腺癌治疗性模型中各组小鼠肿瘤生长情况。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001。
图6为NACD肿瘤疫苗(NY-ESO-1蛋白与氢氧化铝凝胶/CpG寡核苷酸//免疫调节活性肽混合物制备而成)激发的体液免疫反应的检测。a:NY-ESO-1特异性抗体IgG滴度检测。b:NY-ESO-1特异性抗体亚型IgG1和IgG2c滴度检测。*,p<0.05；**,p<0.01。
图7为NACD肿瘤疫苗免疫激发的细胞免疫反应检测情况。a和b:流式细胞术检测分泌IFN-γ的CD4+(a)或CD8+T(b)细胞。c和d:ELISPOT检测分泌IL-4(c)和IFN-γ(d)的T细胞。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001。
图8为NACD肿瘤疫苗免疫后，各组小鼠的免疫记忆性T细胞检测。
图9为NACD肿瘤疫苗免疫后各组小鼠体重(a)及重要脏器HE染色(b)。
图10NACD肿瘤疫苗免疫后各组小鼠血常规分析。其中WBC：白细胞数目；RBC：红细胞数目；PLT：血小板数目；HGB：血红蛋白；HCT：红细胞压积；MPV：平均血小板体积；MCH：平均红细胞血红蛋白含量；MCHC：平均红细胞血红蛋白浓度；MCV：平均红细胞体积。图11.NACD肿瘤疫苗免疫后各组小鼠血生化分析。TP：总蛋白；ALB：白蛋白；ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶；ALP：碱性磷酸酶；CREA：肌酐；UREA：尿素；UA：尿酸；GLU：葡萄糖；LDH：乳酸脱氢酶；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇。
图12体外RT-PCR检测转录因子的表达。*,p<0.05；***,p<0.001。
图13.参与DP7活性信号通路研究。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001。
图14.GPR35与DP7相互作用研究。a.DP7诱导GPR35受体内化；b.RT-PCR检测GPR35沉默对转录因子表达的影响；c.DP7上调Erk1/2磷酸化依赖于GPR35。*,p<0.05；***,p<0.001。
具体实施方式
为了研发较理想的免疫佐剂，本发明在前期考察了多种现有免疫佐剂单一和复合的配方，偶然发现使用氢氧化铝、CpG寡核苷酸(CpG ODN，简称CpG)与某些活性多肽组成特定的复合物，在作为免疫佐剂使用时，有利于协助激发机体的免疫反应，提高抗原的免疫效果。
在此基础上，进一步考察了多种氢氧化铝/CpG ODN/多肽配方。本发明对多种免疫调节活性多肽都进行筛选，得到了本发明的与活性多肽所组成的复合免疫佐剂的配方成分。同时，为了取得更好的效果，对不同配比的氢氧化铝、CpG ODN、免疫调节活性肽使用剂量进行了筛选，完成了对氢氧化铝，CpG ODN和多肽之间配方的优化。最后得到优化的配方比例为铝佐剂︰CpG寡核苷酸︰多肽＝1～25︰1︰1～4。优选的比例为铝佐剂︰CpG寡核苷酸︰多肽＝1～25︰1︰2。CpG ODN在本领域的具体使用中，可以进行硫代修饰处理，也可以不修饰。如进行硫代修饰可增加其稳定性，一般进行全链骨架的硫代修饰。
本发明对氢氧化铝凝胶、CpG ODN、免疫调节活性肽等单独或联合作为佐剂加入抗原进行了比较，发现氢氧化铝凝胶/CpG ODN/免疫调节活性肽复合作为佐剂，能有效激发机体产生抗原特异性免疫反应，并延长免疫记忆。
这种复合佐剂所采用的三种成分，都具有很好的优势：其中氢氧化铝凝胶佐剂，是一类含Al3+的无机盐，不仅具有良好的吸附作用，能将可溶性抗原吸附于铝胶分子表面；也是良好的沉淀剂，可以浓缩抗原，减少注射剂量。氢氧化铝凝胶成本低廉、使用方便、无毒，是应用最广的一种佐剂，也是至今唯一被FDA批准可用于人类疫苗的佐剂。而目前已有大量CpG ODN佐剂疫苗相关临床研究表明CpG ODN可以增强机体对病原体、过敏原和肿瘤抗原的体液免疫和细胞免疫反应。免疫调节活性肽可诱导机体产生细胞因子和趋化因子，直接或间接地招募DC细胞和单核细胞到感染部位，促进抗原呈递细胞对抗原的吞噬，而且它可以激发机体的固有免疫，进而增强获得性免疫反应。
本发明的上述复合免疫佐添加抗原可以形成免疫佐剂-抗原复合物，即疫苗。用于制备疫苗的抗原可以是本领域常用的各种抗原。比如具有蛋白性成分的全长抗原，如蛋白质或肽，也可以是在翻译后会进一步修饰的抗原，例如，某些糖蛋白或脂蛋白。抗原也可以是肿瘤抗原，包括由肿瘤细胞表达的特异性的蛋白质或多肽。比如WT1、MUC1、EGFRvIII、HER-2、MAGE-A3、NY-ESO-1、PSMA、GD2或MART1等现已报道的肿瘤抗原或基于病人肿瘤序列测定的个体化的突变新抗原组合。抗原也可以是病毒抗原，例如组成病毒部分的蛋白质或多肽，或者在受病毒表达机制控制的病毒感染的细胞中表达的特异性的蛋白质或多肽。比如EBV、LMP2、HPV E6 E7、腺病毒5Hexon或HCMV pp65等病毒相关抗原。抗原也可以是细菌抗原，包括由细菌表达的蛋白质或多肽。比如绿脓杆菌抗原、破伤风杆菌抗原、肺炎链球菌、沙门氏菌等细菌抗原。
在制备开发过程疫苗的过程中本发明发现了要取得好的疫苗的效果，加入的抗原重量和复合免疫佐剂中的多肽重量是有密切的相关性的。经过大量的研究，确定了抗原重量:免疫调节活性多肽＝1︰1～400的重量比例能够取得较好的效果。其中肿瘤抗原重量:免疫调节活性肽重量＝1︰1～10，病毒抗原重量:免疫调节活性肽重量＝1︰200～400为较优选择。或者也可根据抗原自身特性以及其他具体情况在上述的范围内另行选取合适配比。在肝炎抗原HBsAg和肿瘤抗原NY-ESO-1上进行了验证，结果表明制备得到的疫苗具备很好的效果。在肝炎疫苗模型中，免疫后小鼠机体产生了高滴度的HBsAg特异性抗体；在肿瘤疫苗模型中，能激发机体抗原特异性体液免疫和细胞免疫反应，并能进而有效抑制肿瘤生长。
本领域技术人员在获知本发明思想，以及氢氧化铝/CpG ODN/多肽复合佐剂的配比范围以及与抗原的配比范围等上述披露的技术方案的基础上，显然能够根据不同的具体抗原在上述获得的配方范围中进行更进一步的优化。在必要条件下，为了特定剂型的要求，不排除在上述的基本配方的基础上加入其他疫苗制备中可以接受的辅助性成分完成疫苗的制备。显然，这些实施方式均属于本发明的范围。
以下结合实施例对本发明方法进行进一步说明。
实施例中使用的主要试剂为：
氢氧化铝佐剂(Alhydrogel)购自丹麦Brenntag Biosector公司。
HBsAg购自美国ARP公司(American Rearch Products)。
CpG ODN(5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’，SEQ ID No.1)购自invitrogen公司。
辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG及亚型检测试剂盒购自SouthernBiotech公司。
C57BL/6、Balb/c小鼠购自北京维通利华公司。
MCP-1细胞因子检测试剂盒购于R&D公司。
细胞因子芯片检测试剂盒HCYTOMAG-60K购自Milliplex公司。
山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗及相关免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术公司，anti-CD4，anti-CD8，anti-CD56，F4/80，Gr1，CD11b等抗体购自Abcam公司。
使用的多肽DP2～DP11均由上海科肽生物有限公司合成，具体序列参见表1。
其他试剂均为进口或国产分析纯产品。
实施例一CpG/活性多肽配比及毒性初步检测
一、CpG/免疫调节活性肽配比确定
分别以4:1(wt/wt)、2:1(wt/wt)、1:1(wt/wt)、1:2(wt/wt)、1:4(wt/wt)的比例将CpG与备选的活性多肽(参见表一)混合，37℃静置10-15min，其中CpG的量为5μg。每个CpG与免疫调节活性肽混合物中加入10μl的6×loading buffer混匀。制备1％的琼脂糖凝胶，每个样品各取10μl点样，使用1％琼脂糖凝胶90V电泳，20min，使用凝胶成像***成像。
表一、实施例中使用的活性多肽的氨基酸序列
编号 氨基酸序列
DP2 VQWRIRVCVIRA(SEQ ID No.2)
DP3 VQWRIRIAVIRA(SEQ ID No.3)
DP4 VCWRIRVAVIRA(SEQ ID No.4)
DP5 VQLRIRVCVIRR(SEQ ID No.5)
DP6 KQWRIRVAVIRA(SEQ ID No.6)
DP7 VQWRIRVAVIRK(SEQ ID No.7)
DP8 VQLRIRVCVIRK(SEQ ID No.8)
DP9 KQWRIRVCVIRA(SEQ ID No.9)
DP10 VQLRCRVCVIRK(SEQ ID No.10)
DP11 VQWRIRIAVIRK(SEQ ID No.11)
结果显示(图1a)：随着防御短肽的增多，游离的CpG ODN越来越少，当CpG ODN与备选多肽的混合比例为1:2(wt/wt)时，CpG ODN与备选多肽可完全形成稳定复合物。
二、复合物作为佐剂的毒性检验
1、LDH释放实验
分离人外周血PBMC淋巴细胞，用RPMI 1640+5％FBS培养基，将PBMC稀释成1×107cells/ml，500μl/孔铺24孔板，37℃，5％CO2孵箱中培养1小时。10μg CpG与免疫调节活性肽分别以4:1(wt/wt)、2:1(wt/wt)、1:1(wt/wt)、1:2(wt/wt)、1:4(wt/wt)的比例配制CpG/免疫调节肽混合物，室温静置10-15分钟，然后将CpG/免疫调节活性肽混合物加入上淋巴细胞培养液中，37℃，5％CO2共孵育24小时。收集上清，250g，4℃离心5min。按LDH试剂盒说明书，设置阳性、阴性和空白对照，测定其LDH值。
2、红细胞血红素释放实验
收集外周血红细胞，加入0.85％生理盐水清洗3遍。用生理盐水将红细胞稀释4倍，100μl/孔铺96孔板，加入50μl不同浓度的CpG/免疫调节活性肽，最终CpG和免疫调节肽的工作浓度为CpG 20μg/ml、免疫调节肽40μg/ml，37℃,5％CO2孵育过夜，其中使用Triton-100(1％)作为阳性对照，生理盐水作为阴对照。4000rpm,10min离心，收集上清，使用酶标仪A450读数，计算佐剂对红细胞的毒性。
实验结果显示(图1b)：CpG/免疫调节活性肽混合物对外周血单核细胞和红细胞均无可检测水平毒性作用。
实施例二CpG/免疫调节活性肽复合物的筛选
一、CpG/免疫调节活性肽复合物刺激人源PBMC分泌MCP-1检测
用淋巴细胞分泌液分离人外周单核淋巴细胞(PBMC)，使1640完全培养基将上述分离的淋巴细胞稀释成1×106cells/ml，铺24孔板，每孔500μl，37℃，5％CO2孵育1h。将佐剂或佐剂复合物CpG、DP2-11、CpG-DP2-11滴加入淋巴细胞培养液37℃，5％CO2共孵育24h，其中CpG:20μg/ml，DP2-11：40μg/ml。16000g，4℃离心5min，收集上清，使用ELISA试剂盒检测MCP-1释放情况。
实验结果显示(图2a)：MCP-1是单核细胞趋化因子，能够趋化单核细胞/巨噬细胞、T细胞、NK细胞和嗜中性粒细胞。双重复合佐剂CpG/DP7、CpG/DP8、CpG/DP10刺激PBMC后，MCP-1分泌量分别为4572pg/ml、4826pg/ml、3534pg/ml。与其他组相比，这三组MCP-1分泌量明显高于其他各组(P＜0.05)。而且CpG与DP7、DP8、DP10的协同系数均大于2，可见CpG与DP7、DP8、DP10均可协同促进PBMC分泌MCP-1。
二、HbsAg/氢氧化铝凝胶/CpG/DP2-11激发的免疫反应的检测
分别按下列方案配制蛋白疫苗，每只小鼠总给药量为100μl，不足100μl的加入PBS补齐。每组10只小鼠，每只小鼠给药剂量如下：
①NS组:100μl PBS
②alum组0.1μg HBsAg+25μg alum
③alum/CpG:0.1μg HBsAg+25μg alum+20μg CpG
④alum/DP2～11组:0.1μg HBsAg+25μg alum+40μg DP2～DP 11
⑤alum/CpG/DP2～11组0.1μg HBsAg+25μg alum+20μg CpG+40μg DP2～DP 11
上述疫苗制备方案为：
a、加入所需的多肽DP2～DP 11中的任一种与CpG ODN，混匀，37℃孵育15min；
b、加入所需氢氧化铝凝胶(丹麦Brenntag Biosector公司的产品Alhydrogel，实施例中简称alum)混匀,37℃孵育10min；
c、最后加入0.1μg HbsAg，并用无菌PBS补足至体积100μl。
采用预防性免疫方案对小鼠进行免疫，第0、2、4周免疫三次，第5周取血检测HbsAg特异性抗体。
结果表明(图2b),免疫第5周，alum/CpG组的抗HbsAg总抗体滴度中位值为64000，而alum/CpG/DP7、alum/CpG/DP8和alum/CpG/DP10组的抗HbsAg总抗体滴度中位值均为512000，与alum/CpG组相比具统计学差异。
三、DP7、DP8和DP10体内招募淋巴细胞
C57BL/6小鼠腹腔分别注射200μg多肽DP7、DP8和DP10，对照组注射同体积的无菌生理盐水。注射24h后，收集小鼠腹腔灌洗液并进行流式分析趋化的淋巴细胞。F4/80+CD11b+双阳性为巨噬细胞，F4/80+Gr1+双阳性为单核细胞，F4/80-Gr1+标记为中性粒细胞。
流式结果显示(图2c)，相比于对照组(saline，无菌生理盐水)，DP7和DP8注射组腹腔灌洗液总细胞中单核细胞细胞所占比例显著增加，DP10注射组腹腔灌洗液总细胞中单核细胞所占比例也有增加。DP7注射组腹腔灌洗液总细胞中性粒细胞所占比例显著增加，DP8和DP10注射组腹腔灌洗液总细胞中中性粒细胞所占比例也有增加。DP8注射组腹腔灌洗液总细胞中巨噬细胞所占比例显著增加，DP7和DP10注射组腹腔灌洗液总细胞中巨噬细胞所占比例也有增加。表明，DP7、DP8和DP10具有免疫调节作用，能够在体内招募淋巴细胞。
实施例三CpG/免疫调节活性肽复合物促进人外周血单核细胞细胞因子产生
分离人外周血单核细胞，方法同上。用1640+10％FBS将PBMC稀释至4×106/ml，125μl/孔铺48孔板。加入125μl 2×佐剂刺激物母液(DP7、CpG、CpG/DP7)，混匀后放于37℃孵箱中孵育48h。其中防御短肽刺激浓度为40μg/ml，CpG刺激浓度为20μg/ml。PHA(3μg/ml)刺激作为阳性对照，单纯的培养基作为空白对照，未刺激的人PBMC培养基上清作为阴性对照。250g离心5min，收集培养基上清用细胞因子芯片检测试剂盒检测(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12(P70)、IL-17A、TNF-α和IFN-γ)。
结果发现与单佐剂相比(图3)，双重复合佐剂明显促进免疫正向调节细胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ的分泌。CpG/DP7组培养基上清中细胞因子分泌情况如下：经双重佐剂刺激后IFN-γ的分泌量为542pg/ml；IL-1β分泌量为8045pg/ml；TNF-α分泌量为：6704pg/ml；IL-10分泌量为6260pg/ml。可见与DP7和CpG组相比，双重复合佐剂CpG/DP7可明显促进免疫正向调节细胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ的分泌，抑制免疫负向调节细胞因子IL-10分泌。实施例四CpG/免疫调节活性肽复合物激活BMDCs活性
一、CpG/免疫调节活性肽复合物促进抗原摄取
1、BMDCs细胞的分离和培养
6-8周小鼠，折颈处死，取胫骨和腓骨的骨髓细胞；收集含有骨髓细胞的培养基至50ml BD管，1500rpm离心3min，用红细胞裂解液重悬(1:10)，室温静置5min 1500rpm离心3min，用RPMI1640+FBS重悬。用70μm细胞筛网过滤细胞，去除残渣，用新鲜培养基培养并加入10ng/ml GM CSF和10ng/ml IL 4，隔天半量更换培养基。在培养第7天时进行后续试验。
2、用蛋白红色荧光标记试剂盒Alexa
Figure BDA0002992221650000101
594Microscale Protein LabelingKit将NY ESO1蛋白标记红色荧光。体外将荧光标记的NY ESO 1分别与佐剂或佐剂复合物混合DP7、CpG、CpG/DP7)，室温孵育10min，其中NY ESO 1:10μg/ml,CpG:20μg/ml,DP7 40μg/ml)。将佐剂或佐剂复合物加入BMDCs细胞培养物中混匀，孵育1h。先用PBS洗3次，再用4％多聚甲醛,室温避光固定10min。PBS清洗3次后，DAPI染色1min。PBS清洗3次后，用防淬灭封片，在共聚焦显微镜下观察。
结果显示(图4a)，CpG/DP7组BMDC细胞红色荧光的平均荧光强度明显高于其他对照组，可见CpG/DP7佐剂混合物组可促进BMDC细胞对NY-ESO-1抗原的摄取。
二、CpG/免疫调节活性肽复合物促进BMDCs成熟
体外将佐剂或佐剂复合物混合DP7、CpG、CpG/DP7(CpG:20μg/ml,DP7 40μg/ml)。加入BMDCs细胞培养物中混匀，孵育16h。抗体APC-anti-Mouse CD11c、FITC-anti-mouse-CD40、PerCP-Cy5.5-anti-mouse-CD8或FITC-anti-mouse-CD86染色BMDCs，后用流式细胞仪检测。
结果显示(图4b、4c和4d)，与Control、DP7、CpG相比，CpG/DP7明显提高了CD40、CD80和CD86的表达，可见CpG/DP7佐剂混合物组可促进BMDC细胞的成熟。
三、CpG/免疫调节活性肽复合物促进pERK1/2和p-p65表达
体外将佐剂或佐剂复合物混合DP7、CpG、CpG/DP7(CpG:20μg/ml,DP7 40μg/ml)。加入BMDCs细胞培养物中混匀，孵育30或60min。收集细胞样品，进行12％SDS-PAGE电泳分离样品中蛋白质并转移至PVDF膜。待室温封闭1h后，一抗孵育：将PVDF膜分别置于含抗NF-κBp65，Phospho-NF-κB p65，Erk1/2和Phospho-Erk1/2抗体中(稀释比为1:2000)，4℃摇动孵育过夜。次日相应二抗孵育1h后，曝光。
结果显示(图4e)，与Control、DP7、CpG相比，CpG/DP7明显提高了pERK1/2和p-p65的表达。
实施例五本发明使用氢氧化铝凝胶/CpG/活性多肽作为肿瘤疫苗的复合佐剂的抗肿瘤效果研究
一、预防性免疫模型
(1)NY-ESO-1肿瘤蛋白疫苗的制备
分别按下列方案配制蛋白疫苗，每只小鼠总给药量为100μl，不足100μl的加入PBS补齐。每组10只小鼠，每只小鼠给药剂量如下：
1、NS组:100μl PBS
2、alum组:5μg NY-ESO-1或10μg OVA+125μg alum
3、alum+CpG组:5μg NY-ESO-1或10μg OVA+125μg alum+20μg CpG
4、alum+DP7组:5μg NY-ESO-1或10μg OVA+125μg alum+40μg DP7
5、alum+CpG+DP7组:5μg NY-ESO-1或10μg OVA+125μg alum+20μg CpG+40μg DP7
上述疫苗制备方案为：
a、加入所需的DP7和CpG ODN，混匀，37℃孵育15min；
b、加入所需氢氧化铝凝胶混匀,37℃孵育10min；
c、最后加入5μg NY-ESO-1蛋白或10μg OVA，并用无菌PBS补足至体积100μl。
(2)免疫方案
选用5～7周龄，18g左右的雌性小鼠(B16-NY-ESO-1模型选择C57BL/6J小鼠；4T1-NY-ESO-1模型选择Balb/c小鼠)，在本实验室动物房饲养一周后，随机分组。0、2、4周多点皮下免疫，第5周每只小鼠背部皮下接种肿瘤细胞(B16-NY-ESO-1:2×105；EG7.OVA:2×106；4T1-NY-ESO-1:2×105)，待肿瘤长出后测量肿瘤，每隔3天一次，并观察生存期。肿瘤体积计算公式为0.52×长×宽2。
实验结果显示(图5a)：在B16黑色素瘤模型中，alum组、alum/DP7组和alum/CpG组小鼠肿瘤生长受到一定的抑制。接种肿瘤后第22天时，肿瘤平均体积分别为955±298mm3、906±623mm3和642±236mm3。alum/CpG/DP7组小鼠肿瘤生长明显受到抑制，其平均肿瘤体积为224±126mm3，与NS组相比，具有显著的统计学差异(p﹤0.05)。在接种肿瘤后第22天，alum组、alum/DP7组和alum/CpG组抑肿率分别为62.6％、64.5％和74.9％。而alum/CpG/DP7组抑肿率为91.2％。
在T淋巴瘤模型(EG7.OVA)中(图5c)，alum组、alum/DP7组和alum/CpG组小鼠肿瘤生长也受到一定的抑制。接种肿瘤后第26天时，肿瘤平均体积分别为3725±478mm3、2180±454mm3和2446±576mm3。而alum/CpG/DP7组小鼠肿瘤生长明显受到抑制，其平均肿瘤体积为1232±543mm3，与NS组和alum组相比，具有显著的统计学差异(p﹤0.05)。在接种肿瘤后第26天，alum/CpG/DP7组抑肿瘤率为74.9％。
在乳腺癌模型中(图5e)，接种肿瘤后第28天，小鼠开始出现炸毛，状态不佳，故在此时间点处死小鼠。实验结果显示NS组小鼠肿瘤生长迅速，肿瘤平均体积可达1382±86mm3。alum组、alum/DP7组、alum/CpG组和alum/CpG/DP7组小鼠的平均肿瘤体积分别为1232±87mm3、1116±91mm3、1104±65mm3和755±78mm3。可见，alum/CpG/DP7组小鼠肿瘤生长明显受到抑制，与其它对照组相比，具有显著的统计学差异(p﹤0.05)。在接种肿瘤后第28天，alum/CpG/DP7组抑肿瘤率为45.4％。
二、治疗性免疫模型
分组及小鼠给药剂量与预防性免疫免疫剂量相同。免疫方案如下：在第0天每只小鼠背部皮下接种肿瘤细胞(B16-NY-ESO-1:2×105；EG7.OVA:2×106；4T1-NY-ESO-1:2×105)，,待肿瘤体积约50mm3时，每周免疫1次，共3次。
在黑色素瘤模型中(图5b)，接种肿瘤后的第24天，NS、alum组、alum/DP7组、alum/CpG组和alum/CpG/DP7组小鼠的平均肿瘤体积分别为2081±201mm3、2447±692mm3、1507±539mm3、2144±707mm3和1111±201mm3。与NS组相比，alum/CpG/DP7组小鼠的肿瘤生长明显减缓(p﹤0.05)。
在T淋巴瘤模型中(图5d)，接种肿瘤后的第28天，NS、alum组、alum/DP7组、alum/CpG组和alum/CpG/DP7组小鼠的平均肿瘤体积分别为2913±407mm3、2880±402mm3、2333±722mm3、2677±614mm3和1073±284mm3。与NS组相比，alum/CpG/DP7组小鼠的肿瘤生长明显减缓(p﹤0.05)。
在乳腺癌模型中(图5f)，接种肿瘤后第32天，NS、alum组、alum/DP7组、alum/CpG组和alum/CpG/DP7组小鼠的平均肿瘤体积分别为1727±97mm3、1703±107mm3、1703±192mm3、1646±215mm3和1071±244mm3。与其他4组相比，alum/CpG/DP7组小鼠的肿瘤生长明显减缓(p﹤0.05)。。
试验例六肿瘤疫苗NY-ESO-1/alum/CpG/DP7激发的免疫反应的检测
一、体液免疫反应检测
检测实施例四中的预防型模型中，NACD激发的免疫反应。
1、Elisa检测NY-ESO-1特异性抗体
通过ELISA法检测NY-ESO-1特异性抗体及抗体亚型。检测方法如下：将NY-ESO-1蛋白用用包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释至1μg/ml，在96孔板中每孔加入100μl，4℃过夜。PBST(PBS+0.5％Tween20)洗涤3次。5％的脱脂奶粉37℃封闭1小时。PBST洗涤5次。梯度稀释血清，每孔加入100μl，37℃孵育1小时。PBST洗板5次。其后，每孔加入100μLHRP标记羊抗小鼠IgG(1:4000稀释)，37℃孵育1小时。PBST洗涤5次。各反应孔中加入临时配制的TMB溶液(KPL公司)100μl，室温显色20分钟后，加入0.5MH2SO4 100μl终止反应，450nm波长读数。
实验结果显示(图6a)，alum组、alum/DP7组、alum/CpG组和alum/CpG/DP7组IgG抗体滴度中位值分别为640000、960000、640000和1280000。alum/CpG/DP7组小鼠血清中NY-ESO-1特异性抗体明显高于其他各组，与alum组有统计学差异(p﹤0.05)。可见alum/CpG/DP7复合佐剂可明显增强NY-ESO-1特异性体液免疫反应。
2、抗体亚型的检测
先用混合血清从1:100开始，等10倍稀释，稀释后的血清作为一抗进行Elisa检测，待确定抗体亚型范围，选择合适的起始稀释比例，等2倍稀释8个梯度作为一抗，在分别用不同抗体亚型特异性抗体作为二抗(IgG1,IgG2c；均按1:4000稀释)，按上述ELISA方案测定其各亚型滴度。
我们对NY-ESO-1特异性抗体的亚型(IgG1和IgG2c)进行检测。通过计算(图6b)，alum组、alum/DP7组、alum/CpG组和alum/CpG/DP7组的IgG1/IgG2a比值分别为：21.3、6、25.6和2。与alum/CpG组相比，alum/CpG/DP7组小鼠血清中NY-ESO-1特异性IgG2c滴度明显升高，IgG1有所下降。
二、细胞免疫反应检测
检测实施例四中的预防型模型中，NACD激发的细胞免疫反应。
1、IFN-γ胞内染色
分离脾淋巴细胞，重悬计数，3×106个脾淋巴细胞/孔铺24孔板。加入10μg/ml NY-ESO-1(阴性对照用DMSO，阳性对照用5μg/ml conA)37℃刺激1h，随后加入Golgiplug(1μl加入至1ml细胞培养物中)孵育6-12h。然后收集细胞，用CD16/CD32 4℃封闭15min。stainingbuffer洗涤细胞后，重悬细胞，加入FITC-anti-mouse-CD3ε,PE-Cy7-anti-mouse CD8α或PE-Cy7-anti-mouse CD4，4℃避光孵育30min。随后用staining buffer洗涤2次，加入250μlfixation/permeabilization涡旋充分悬起，室温避光孵育20min固定透化细胞。经BDPerm/wash buffer清洗细胞后，重悬细胞，加入胞内抗原抗体(PE-anti-mouse IFN-γ)室温避光孵育30min，PBS洗2次后，即可进行流式分析。
结果显示(图7a和7b)，alum组、alum/DP7组和alum/CpG组小鼠脾脏淋巴细胞中可分泌IFN-γ的CD4+T细胞所占CD3+T细胞比例分别为0.44％、0.36％和0.47％，而alum/CpG/DP7组小鼠脾脏淋巴细胞中分泌IFN-γ的CD4+T细胞所占CD3+T细胞比例可达0.88％，与NS和alum/CpG组相比，具有统计学差异(p<0.05)。对分泌IFN-γ的CD8+T细胞进行分析发现：alum组、alum/DP7组所双阳性细胞占CD3+T细胞比例分别为0.52％、0.79％，而alum/CpG组和alum/CpG/DP7组双阳性细胞所占CD3+T细胞比例分别为0.88％和1.28％，明显高于其他各对照组，与NS相比，具有统计学差异(p<0.05)。可见alum/CpG/DP7组小鼠脾脏淋巴细胞中分泌IFN-γ的CD4+T细胞和CD8+T细胞均明显增加。
2、ELISPOT检测
5×105个脾淋巴细胞/孔铺入预先包被IFN-γ或IL-4的96孔板，加入10μg/ml NY-ESO-1，于37℃孵育24h，按照说明书检测阳性斑点。
结果显示(图7c和7d)，NS组，alum组、alum/DP7组和alum/CpG组小鼠脾脏淋巴细胞中可分泌IFN-γ的阳性细胞斑点分别为31、117、252和133，而alum/CpG/DP7组小鼠脾脏淋巴细胞中分泌IFN-γ的的阳性细胞斑点为379，与其余各组均有统计学差异(p<0.05)；而NS组，alum组、alum/DP7组和alum/CpG组小鼠脾脏淋巴细胞中可分泌IL-4的阳性细胞斑点分别为0.3、41、65和33，而alum/CpG/DP7组小鼠脾脏淋巴细胞中分泌IL-4的的阳性细胞斑点为116，与其余各组均有统计学差异(p<0.05)
三、免疫记忆性T细胞检测
采用实施例四中的预防型模型的预防性免疫方案，3次免疫2周后，分离小鼠脾脏淋巴细胞，标记荧光抗体CD44和CD62L，流式检测疫苗免疫后效应型记忆性T细胞和中枢性记忆性T细胞的情况。
结果显示(图8)：alum/CpG/DP7组小鼠脾脏细胞中CD4+CD44+CD62L-和CD8+CD44+CD62L-T淋巴细胞所占比例分别为23.56％和28.15％，均高于其他各组(p<0.05)。而CD4+CD44+CD62L+和CD8+CD44+CD62L+T淋巴细胞并无明显变化，这一结果可能与我们选择的时间点有关。在3次免疫2周后alum/CpG/DP7组小鼠脾脏细胞中效应型记忆性CD4+和CD8+T淋巴细胞明显增多。可见，NY-ESO-1/alum/CpG/DP7疫苗免疫后可明显延长免疫记忆。
试验例七 疫苗NY-ESO-1/alum/CpG/DP7安全性初步评价
一、体重检测和H&E染色
(1)按实施例四的预防型免疫方案分组，各组小鼠采用预防性免疫方案进行免疫。
(2)在整个实验过程中对小鼠体重进行称量，并观察小鼠的状态及日常行为是否异常。
(3)3次免疫一周后取小鼠的心肝脾肺肾等重要脏器进行H&E染色。
在本实验中检测该疫苗免疫是否会对机体产生毒副作用。在对疫苗的安全性检测试验中，采用预防性免疫方案对小鼠进行免疫，免疫后两周后处死小鼠，取心肝脾肺肾等重要脏器进行HE检测。在整个实验过程中，小鼠未出现体重下降、立毛、食欲下降、行为异常等现象，重要脏器HE染色检测亦未见明显异常(图9a和9b)。
二、血常规检测
(1)各组小鼠采用预防性免疫方案进行免疫。
(2)第3次免疫1周后，取小鼠眼眶血用于血常规分析。
在本实验中检测该疫苗免疫是否会对机体产生毒副作用。在对疫苗的安全性检测试验中，采用预防性免疫方案对小鼠进行免疫，第3次免疫后1周后，对小鼠检测血常规。五组小鼠的红细胞数目，血小板数目，血红蛋白，红细胞压积，平均血小板体积，平均红细胞血红蛋白含量，平均红细胞血红蛋白浓度和平均红细胞体积均处于正常值范围(图10)。
三、血生化检测
(1)按各组小鼠采用预防性免疫方案进行免疫。
在本实验中检测该疫苗免疫是否会对机体产生毒副作用。在对疫苗的安全性检测试验中，采用预防性免疫方案对小鼠进行免疫，免疫后对小鼠血生化进行检测。五组小鼠的总蛋白；白蛋白，谷丙转氨酶，谷草转氨酶，碱性磷酸酶，肌酐，尿素，尿酸，葡萄糖，乳酸脱氢酶，高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇均处于正常值范围，并且五组小鼠之间血生化无差异(图11)。
试验例八DP7激活Gi/PKC或PI3k/Erk1/2信号通路
1、RNA-seq分析DP7对BMDCs转录影响
BMDCs经GM-CSF和IL-4诱导的第五天，收集细胞并经CD11c磁珠分选后。40μg/mlDP7刺激分选的BMDCs 30min后(对照组为等量DMSO)，收集细胞，提取总RNA，进行第二代高通量测序。
结果显示，生物信息学分析显示在Control和DP7处理组中共检测22954个基因。与对照组相比，DP7处理组118个基因差异表达(表达倍数≥2倍)。利用在线String：蛋白-蛋白相互作用网络软件将118个基因进行蛋白互作网络分析，显示分为两个主要的网络。在整个互作网络中，进一步展示了最为重要的网络-以Egr1为核心的转录因子互作网络，网络中共有11个蛋白：Zfp36、Btg2、Atf3、Dusp1、JunB、Ier2、Egr1,Egr2,Egr3,c-Fos,Fosb和Nr4a1。我们挑取了网络中变化倍数较大且较为重要的6个转录因子进行进一步的研究，有Egr1、Egr2、Egr3、c-Fos、Fosb和Nr4a1，上调变化倍数分别为16.63、2.40、15.70、6.34、114.79和19.81，这6个转录因子也是在RNA-seq分析中变化比较大的基因。
2、DP7上调Egr1、Egr2、Egr3、c-Fos、Fosb和Nr4a1的表达
将JAWSII细胞分至6孔板，每孔2*105个细胞。40μg/ml DP7刺激细胞30min，对照组为等量DMSO刺激。去除上清培养液，每孔加入1ml Trizol试剂，提取样本总RNA并反转录为cDNA，RT-PCR法对目的基因进行定量检测。
结果显示(图12)，将Control中转录因子的表达量视作1，可见Egr1、Egr2、Egr3、c-Fos、Fosb和Nr4a1的表达两分别上调22.05、2.79、15.36、19.51、143.80和5.63，基本与RNA-seq的结果相符，表明上调的6个转录因子在DP7作用中起着重要作用。
3、DP7激活Gi/PKC或PI3k/Erk1/2信号通路
将JAWSII细胞分至6孔板，每孔2*105个细胞；预先用小分子抑制剂于37℃处理1-3h，40μg/ml DP7刺激细胞30min，对照组为等量DMSO刺激。RT-PCR法对目的基因进行定量检测。所用抑制剂及其受体为：Erk1/2的小分子抑制剂分别为Selumetinib，百日咳毒素(PTX)是Gi类蛋白的特异性抑制剂，AS-605240是PI3Kγ的选择性抑制剂，Sotrastaurin是PKCθ的抑制剂。
结果显示(图13a)，小分子抑制剂预先处理细胞后，DP7上调Egr1,Egr2,Egr3,c-Fos，Fosb和Nr4a1的表达受到抑制，差异具统计学意义(p<0.05)。
4、DP7激活Erk1/2磷酸化受到PTX抑制
将BMDCs分至6孔板，每孔5*105个细胞。PTX预先处理细胞3h后，40μg/ml DP7刺激细胞30min，对照组为等量DMSO刺激。去除上清培养液，每孔加入100μl RIPA裂解液，置于冰上30min充***解细胞。收取细胞裂解液后，13000rpm*10min*4℃离心。western blot检测Erk1/2和p-Erk1/2的表达。
从结果看(图13b)，DP7在作用细胞30min后，Erk1/2的磷酸化明显上调，而作用60min后，Erk1/2的磷酸化有所下降。同样的，PTX预先处理后，DP7对Erk1/2磷酸化的上调不同程度地被减弱。
5、DP7能够上调细胞内Ga2+的水平。
收集JAWSII细胞，每孔1*104个铺于黑色96孔板培养两天。弃去上清培养基，100μlHank’buffer洗涤一次细胞。每孔加入100μl终浓度5μM的Fluo 3-AM(稀释于Hank’buffer)于37℃孵育30min。除上清，100μl Hank’buffer再次洗涤细胞一次。每孔加入200μl培养基或者含40μg/ml DP7的培养基刺激后，celigo检测荧光。
从结果看(图13c)，DP7刺激细胞15min后，单个细胞的平均荧光强度显著增强(p<0.05vs Control)，DP7刺激30min时平均荧光强度继续增强(p<0.01vs Control)。
试验例九GPR35是DP7潜在作用靶点
1、DP7诱导GPR35受体内化
40μg/ml DP7刺激小鼠BMDCs 60min后，细胞经固定和封闭，GPR35一抗孵育过夜，并用FITC标记的兔抗山羊二抗染色，最后共聚焦显微镜观察。
结果显示(图14a)，在control中，GPR35主要位于细胞膜上，而DP7刺激后，GPR35有向细胞内化的现象。
2、DP7上调转录因子表达依赖于GPR35
40μg/ml DP7刺激GPR35 shRNA细胞和其对照组scrambled shRNA细胞30min后，收集样本，提取总RNA，RT-PCR方法检测β-actin、Egr1、Egr2、Egr3、c-Fos、Fosb和Nr4a1的表达。
结果显示(图14b)，相对于对照组scrambled shRNA细胞，在GPR35沉默细胞中，Egr1、Egr2、Egr3、c-Fos、Fosb和Nr4a1的相对变化倍数显著降低(p<0.05)。
3、DP7上调Erk1/2磷酸化依赖于GPR35
40μg/ml DP7刺激GPR35 shRNA细胞和其对照组scrambled shRNA细胞30min后，收集样品，进行western blot检测Erk1/2磷酸化。
结果显示(图14c)，scrambled shRNA细胞中，DP7作用后，与Control相比，Erk1/2磷酸化有所增强。而GPR35 shRNA细胞中，DP7作用30min后，Erk1/2磷酸化几乎不变。
4、氢氧化铝/CpG/DP7佐剂在BMDCs或巨噬细胞中的作用机制
多肽DP7与细胞表面上的GPR35相互作用，激活PI3Kγ，PKCθ和ERK1/2信号通路，诱导转录因子的产生，最终导致趋化因子或细胞因子的产生。另外，DP7激活NF-κB也可能许影响趋化因子或细胞因子的产生。CpG与TLR9结合激活ERK1/2或NF-κB，促进炎症因子如IL-6和TNF-α的释放。氢氧化铝激活NALP3炎性复合体，其调节促炎细胞因子IL-1β和IL-18的分泌。由氢氧化铝、CpG和DP7诱导产生的趋化因子和细胞因子为增强复合佐剂的免疫作用做出了贡献。
序列表
<110> 四川大学
<120> 氢氧化铝-CpG寡核苷酸-多肽复合佐剂、疫苗及制备方法和用途
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtcgtttt gtcgtttttg tcgtt 25
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Ala
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Gln Trp Arg Ile Arg Ile Ala Val Ile Arg Ala
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Val Cys Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Lys Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Lys
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Lys Gln Trp Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Val Gln Leu Arg Cys Arg Val Cys Val Ile Arg Lys
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Val Gln Trp Arg Ile Arg Ile Ala Val Ile Arg Lys
1 5 10

Claims (18)

1.复合免疫佐剂，主要含有铝佐剂、CpG寡核苷酸和多肽。
2.根据权利要求1所述的复合免疫佐剂，其特征在于：所述多肽为选自氨基酸序列为SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10所示的多肽中的至少一条。
3.根据权利要求1所述的复合免疫佐剂，其特征在于：所述免疫佐剂的重量配比为铝佐剂︰CpG寡核苷酸︰多肽＝1～25︰1︰1～4。
4.根据权利要求1所述的复合免疫佐剂，其特征在于：所述免疫佐剂的重量配比为铝佐剂︰CpG寡核苷酸︰多肽＝1～25︰1︰2。
5.根据权利要求1所述的复合免疫佐剂，其特征在于：所述铝佐剂为氢氧化铝凝胶。
6.根据权利要求1～5任一项所述的复合免疫佐剂，其特征在于：所述CpG寡核苷酸序列为5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID No.1)。
7.权利要求1～5任一项所述的复合免疫佐剂在制备疫苗中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述疫苗为治疗性疫苗或者预防性疫苗。
9.免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于：由权利要求1～5任一项所述的复合免疫佐剂与抗原为主要原料制成。
10.根据权利要求9所述的免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于：所述免疫佐剂-抗原复合物中的抗原和复合免疫佐剂之间的重量配比为抗原:多肽为1︰1～400。
11.根据权利要求10所述的免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于所述免疫佐剂-抗原复合物为治疗性疫苗或者预防性疫苗。
12.根据权利要求9～11任一项所述的免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于所述的抗原为肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原中的至少一种。
13.根据权利要求12所述的免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于所述的病毒抗原为EBV、LMP2、HPV E6 E7、腺病毒5Hexon、HCMV pp65、乙肝病毒HBsAg中的至少一种。
14.根据权利要求12所述的免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于所述的肿瘤抗原为WT1、MUC1、EGFRvIII、HER-2、MAGE-A3、NY-ESO-1、PSMA、GD2或MART1中的至少一种。
15.根据权利要求12所述的免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于所述的细菌抗原为绿脓杆菌抗原、破伤风杆菌抗原、肺炎链球菌、沙门氏菌抗原中的至少一种。
16.根据权利要求9～15任一项所述的免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于：所述疫苗中的抗原为肿瘤抗原时，抗原和复合免疫佐剂之间的重量配比为肿瘤抗原:多肽为1︰1～10；
或者，抗原为病毒抗原时，抗原和复合免疫佐剂之间的重量配比为病毒抗原:免疫调节活性肽＝1︰200～400。
17.制备权利要求1～6任一项所述的复合免疫佐剂的方法，其特征在于包括以下步骤：
a、按配比取多肽和CpG寡核苷酸，混匀，室温孵育10-20min；
b、再按配比加入氢氧化铝凝胶，混匀，得到复合免疫佐剂。
18.制备权利要求9～15任一项所述的免疫佐剂-抗原复合物的方法，其特征在于包括以下步骤：
a、按配比取多肽和CpG寡核苷酸，混匀，室温孵育10-20min；
b、再按配比加入氢氧化铝凝胶，混匀，得到复合免疫佐剂；
c、然后按配比加入抗原，混匀,得到免疫佐剂-抗原复合物。
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