CN117323423A - 一种重组呼吸道合胞病毒疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种重组呼吸道合胞病毒疫苗及其制备方法和应用，属于病毒疫苗制剂技术领域。其中，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗为包括pre‑F蛋白抗原的液体剂型的疫苗制剂；其中，所述pre‑F蛋白抗原的氨基酸序列为如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.7所示氨基酸序列中的任一种。本发明所提供的重组呼吸道合胞病毒疫苗为包括重组呼吸道合胞病毒(RSV)蛋白原液的液体疫苗制剂，疫苗制剂具有更好的稳定性，通过肌肉注射给予BALB/c小鼠的免疫实验研究，证明了自制重组呼吸道合胞病毒疫苗具有良好的免疫原性。

Description

一种重组呼吸道合胞病毒疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于病毒疫苗制剂技术领域，尤其涉及一种重组呼吸道合胞病毒疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus，hRSV)属于肺炎病毒科家族的正肺病毒属，是一种有包膜、非节段的单负链RNA病毒。hRSV是全球范围内引起婴幼儿、免疫缺陷人群及老年人急性下呼吸道疾病的主要病原体之一，具有高度传染性，主要通过飞沫和直接接触(体液分泌物)传播。
2015年，工业化国家的老年人约150万例患有RSV相关的急性呼吸道感染(RSV-ARI)。据估计，因RSV-ARI住院的老年人为33.6万例，约有14000例与RSV-ARI相关的住院死亡。2019年，全球5岁以下儿童中因感染RSV引起的住院病例超过360万，死亡病例超过10万，1-6月龄婴儿中有36％的死亡与RSV感染相关。RSV给婴幼儿和老年人带来了沉重的疾病负担，因其具有高感染率和高重症发病率，已成为严重的公共卫生问题[8]，目前临床上仍缺乏特异的治疗手段。
接种疫苗主动免疫预防或使用抗体制剂被动免疫预防是避免重症感染和减少死亡的重要措施。WHO将RSV疫苗的研发列为优先项目之一，开发一种安全有效的呼吸道合胞病毒疫苗也是我国亟待解决的临床需求。
RSV的表面融合蛋白(F)及黏附糖蛋白(G)是仅有的能诱导RSV产生中和抗体的病毒成分，因而是疫苗学研究的重要目标。其中，F蛋白保守性较高，通过构象的转变介导病毒包膜和细胞膜的融合。F蛋白采用亚稳态的融合前F蛋白(Prefusion Fusion Protein，PreF)表达在病毒包膜表面，当与宿主细胞膜接触后，结构重排为高度稳定的融合后F蛋白(Postfusion Fusion Protein，PostF)。相较于PostF，PreF诱导的中和抗体能力更强。对高中和抗体的研究发现，它们主要识别PreF的构象表位，并且部分高中和抗体仅识别PreF，而不识别PostF。因此，PreF作为靶抗原已成为RSV疫苗的优先选择。然而，Pre-F是一种亚稳态结构，极不稳定，容易转化成PostF，解决PreF的构象稳定性是几十年来RSV疫苗开发的重要难点。
其中，Novavax对F蛋白进行了改造，设计了“Pre-fusogenic”构象，认为这是间于融合前和融合后之间的中间构象。但该疫苗针对老年人和孕妇的临床III期试验却均以失败告终，主要原因还是疫苗抗原结构设计。而GSK和Pfizer采用了经过改造的稳定PreF进行RSV疫苗开发，临床三期试验显示，二者均安全有效；这更证明了具有稳定的PreF蛋白构象对RSV疫苗有效性的至关重要。
目前国内尚无RSV疫苗上市，GSK专利(CN112566654A)中以重组RSV可溶性F蛋白作为抗原，制备了疫苗组合物。其稳定性研究结果表明，当采用液体剂型，5℃存放1个月，PreF蛋白位点发生损失(即PreF蛋白构象发生了变化)。但采用冻干剂型，可保持PreF蛋白的长时间稳定性。国外已上市AREXVY和ABRYSVO也均为冻干制剂。
然而冻干疫苗生产过程复杂、成本高、用药过程繁琐。相对于冻干制剂，全液体制剂的RSV疫苗更能满足临床使用需求。因此，如何提高RSV疫苗液体制剂的稳定性是亟待解决的问题。
此外，我国现多采用传统铝佐剂制备疫苗，而铝佐剂无法激发细胞免疫，因此急需开发基于新型佐剂的疫苗，能够诱发高滴度的中和抗体和细胞免疫反应。和的临床数据对比结果也验证了新型佐剂***在RSV疫苗开发中的关键作用。
综上，开发一种新型佐剂和基于新型佐剂的RSV全液体制剂疫苗对于RSV的防治具有重大意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种重组呼吸道合胞病毒疫苗，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗为包括pre-F蛋白抗原的液体剂型的疫苗制剂；
其中，所述pre-F蛋白抗原的氨基酸序列为如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.7所示氨基酸序列中的任一种；
优选地，所述pre-F蛋白抗原在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中的含量为120μg/mL-480μg/mL；
优选地，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的渗透压为210mOsmol/kg-420mOsmol/kg；
优选地，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的平均粒径为60nm-220nm；
优选地，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的平均粒径为80nm-160nm；
优选地，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的pH值为6.0-7.0；
优选地，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗还包括：药用辅料和佐剂组合物。
优选地，在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中，所述药用辅料包括如下浓度的组分：
聚山梨酯80，100μg/mL-500μg/mL；
蔗糖或海藻糖，20mg/mL-100mg/mL；
氯化钠，1.3mg/mL-9mg/mL。
优选地，在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中，所述佐剂组合物包括如下浓度的组分：
DOPC，700μg/mL-3000μg/mL；
胆固醇，175μg/mL-750μg/mL；
QS-21，35μg/mL-120μg/mL。
优选地，在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中，所述佐剂组合物包括如下浓度的组分：
DOPC，1200μg/mL-2600μg/mL；
胆固醇，300μg/mL-650μg/mL；
QS-21，50μg/mL-100μg/mL。
优选地，在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中，所述佐剂组合物包括如下浓度的组分：
DOTAP，70μg/mL-240μg/mL；
DOPC，500μg/mL-2000μg/mL；
胆固醇，175μg/mL-600μg/mL；
QS-21，50μg/mL-120μg/mL；
聚山梨酯80，100μg/mL-500μg/mL；
蔗糖，20mg/mL-100mg/mL；
氯化钠，1mg/mL-9mg/mL；
Poly I:C，400μg/mL-900μg/mL。
优选地，在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中，所述佐剂组合物包括如下浓度的组分：
DOTAP，100μg/mL-175μg/mL；
DOPC，1200μg/mL-2000μg/mL；
胆固醇，350μg/mL-600μg/mL；
QS-21，60μg/mL-100μg/mL；
聚山梨酯80，300μg/mL-500μg/mL；
蔗糖，30mg/mL-75mg/mL；
氯化钠，3mg/mL-7mg/mL；
Poly I:C，550μg/mL-900μg/mL。
此外，为解决上述问题，本发明还提供一种如上述所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的制备方法，包括：
S1、取纯化后的pre-F蛋白抗原，添加药用辅料中的聚山梨酯80、蔗糖或海藻糖，以及氯化钠，调节pH后制得抗原原液；
S2、根据佐剂组合物中的DOPC和胆固醇，制备得到中性脂质体；或者，根据所述佐剂组合物中的DOTAP、DOPC和胆固醇，分别制备得到中性脂质体和阳离子脂质体；
S3、取步骤S1和步骤S2所制备得到的产物，加入所述佐剂组合物中的剩余原料，经混合后进行分装，即得到所述重组呼吸道合胞病毒疫苗；
其中，在所述步骤S2为：根据佐剂组合物中的DOPC和胆固醇，制备得到中性脂质体时，所述佐剂组合物中的剩余原料为QS-21；
在所述步骤S2为：根据所述佐剂组合物中的DOTAP、DOPC和胆固醇，分别制备得到中性脂质体和阳离子脂质体时，所述佐剂组合物中的剩余原料为QS-21、聚山梨酯80、蔗糖、氯化钠和Poly I:C。
优选地，所述步骤S2中，根据佐剂组合物中的DOPC和胆固醇，制备得到中性脂质体，包括：
S21，取DOPC和胆固醇，根据质量比4:1混合，分散后得到第一脂质成分；
S22，将所述第一脂质成分采用乙醇注入法、薄膜分散法、超声波分散法、逆向蒸发法中的任意一种方法制备得到所述中性脂质体；
所述步骤S2中，根据所述佐剂组合物中的DOTAP、DOPC和胆固醇，分别制备得到中性脂质体和阳离子脂质体，包括：
根据所述步骤S21和所述步骤S22的方法制备得到所述中性脂质体；以及，利用如下方法制备得到所述阳离子脂质体：
S23，将DOTAP、DOPC和胆固醇，按照质量比为2:2:1进行混合，得到第二脂质成分；
S24，对所述第二脂质成分采用乙醇注入法、薄膜分散法、超声波分散法和逆向蒸发法中的任意一种方法制备得到所述阳离子脂质体。
优选地，所述步骤S22和所述步骤S24中均采用所述乙醇注入法，分别制备得到所述中性脂质体和所述阳离子脂质体；
所述乙醇注入法包括：
对所述第一脂质成分或第二脂质成分依次使用孔径200nm和100nm的挤出膜进行挤出成型，然后进行过滤除菌即得到所述中性脂质体或所述阳离子脂质体。
优选地，所述对所述第一脂质成分或第二脂质成分依次使用孔径200nm和100nm的挤出膜进行挤出成型，然后进行过滤除菌即得到所述中性脂质体或所述阳离子脂质体，包括：
将所述第一脂质成分或第二脂质成分溶于乙醇中，与水相在线剪切1次-3次，得到剪切原料；
将所述剪切原料进行200nm脂质体挤出处理，使用孔径200nm的滤膜过滤，得到200nm挤出料；
将所述200nm挤出料进行100nm脂质体挤出处理，使用孔径为100nm的滤膜过滤，得到100nm挤出料；
对所述100nm挤出料利用磷酸盐缓冲液进行超滤置换，并使用无菌过滤器过滤除菌，即得到所述中性脂质体；以及，对所述100nm挤出料利用醋酸缓冲液进行超滤置换，并使用无菌过滤器过滤除菌，即得到所述阳离子脂质体；
优选地，所述超滤置换的浓缩倍数为3倍-6倍，洗滤倍数为6倍-8倍；
优选地，所述中性脂质体的平均粒径D50为80nm-140nm；
优选地，所述中性脂质体的溶液pH值为5.5-7.0；
优选地，所述中性脂质体的溶液pH值为6.4-6.6；
优选地，所述阳离子脂质体的平均粒径D50为60nm-120nm；
优选地，所述阳离子脂质体的溶液pH值为4.5-6.5；
优选地，所述阳离子脂质体的Zeta电位为50mV-90mV。
此外，本发明还提供一种如上述所述重组呼吸道合胞病毒疫苗在制备用于治疗和/或预防呼吸道合胞病毒引起的疾病的产品的应用，所述产品包括疫苗产品、药物、诊断试剂和检测试剂盒。
本发明提供一种重组呼吸道合胞病毒疫苗及其制备方法和应用，其中，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗为包括pre-F蛋白抗原的液体剂型的疫苗制剂；其中，所述pre-F蛋白抗原的氨基酸序列为如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.7所示氨基酸序列中的任一种。本发明所提供的重组呼吸道合胞病毒疫苗为包括重组呼吸道合胞病毒(RSV)蛋白原液的液体疫苗制剂，疫苗制剂具有更好的稳定性，通过肌肉注射给予BALB/c小鼠的免疫实验研究，证明了自制重组呼吸道合胞病毒疫苗具有良好的免疫原性。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同样品的溶血活性试验结果图；
图2为本发明实施例1中2℃-8℃与37℃放置1周DOPC与胆固醇含量结果图；
图3为本发明实施例1中2℃-8℃放置与37℃放置1周QS-21含量结果图；
图4为本发明实施例8中各实验组一免后IgG及其亚型抗体滴度柱状图(佐剂1指第二佐剂组合物，佐剂2指第一佐剂组合物，902代表RSV PreF蛋白)；
图5为本发明实施例8中各实验组二免后IgG及其亚型抗体滴度柱状图(佐剂1指第二佐剂组合物，佐剂2指第一佐剂组合物，902代表RSV PreF蛋白)；
图6为本发明实施例9中各实验组二免后免疫细胞数柱状图(CD4+T细胞反应)；
图7为本发明实施例9中各实验组二免后免疫细胞数柱状图(CD8+T细胞反应)；
图8为本发明实施例10中各实验组二免后中和抗体滴度柱形图(佐剂1指第二佐剂组合物，佐剂2指第一佐剂组合物，902代表RSV PreF蛋白)。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种重组呼吸道合胞病毒疫苗，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗为包括pre-F蛋白抗原的液体剂型的疫苗制剂；
其中，所述pre-F蛋白抗原的氨基酸序列为如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.7所示氨基酸序列中的任一种；
上述，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗，即为RSV疫苗制剂。其中，本发明中提供的为液体剂型形态的疫苗制剂，并且能够与冻干进行剂型同样达到长时间的稳定性的技术效果。
进一步的，所述pre-F蛋白抗原在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中的含量为120μg/mL-480μg/mL；例如，可以为120μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL、400μg/mL、450μg/mL、480μg/mL等等。
需要说明的是，本发明中的所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量，可以为0.5mL，即每剂疫苗0.5mL。
进一步的，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的渗透压为210mOsmol/kg-420mOsmol/kg。例如，可以为210mOsmol/kg、220mOsmol/kg、250mOsmol/kg、280mOsmol/kg、300mOsmol/kg、320mOsmol/kg、350mOsmol/kg、380mOsmol/kg、400mOsmol/kg、410mOsmol/kg、420mOsmol/kg等等。
进一步的，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的平均粒径为60nm-220nm；例如可以为60nm、80nm、100nm、120nm、140nm、160nm、180nm、200nm、220nm等等。
进一步的，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的平均粒径为80nm-160nm；例如可以为80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm等等。
进一步的，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的pH值为6.0-7.0。例如，可以为6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0等等。
进一步的，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗还包括：药用辅料和佐剂组合物。
本发明中提供的所述重组呼吸道合胞病毒疫苗，可以包括如下3种主要组分：
(1)pre-F蛋白抗原；
(2)药用辅料；
(3)佐剂组合物。
并且，其中，pre-F蛋白抗原的氨基酸序列，为如下氨基酸序列中的任意一种：SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7。
本发明所提供的重组呼吸道合胞病毒疫苗通过于重组呼吸道合胞病毒(RSV)蛋白原液中加入佐剂组合物，获得液体剂型的重组呼吸道合胞病毒疫苗，相对于冻干的疫苗制剂具有更好的稳定性。通过肌肉注射给予BALB/c小鼠的免疫实验研究，证明了自制重组呼吸道合胞病毒疫苗具有良好的免疫原性。
进一步的，在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中，所述药用辅料包括如下浓度的组分：
(1)聚山梨酯80，100μg/mL-500μg/mL；例如，可以为100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL等等。
(2)蔗糖或海藻糖，20mg/mL-100mg/mL；例如，可以为20mg/mL、40mg/mL、60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL等等。
(3)氯化钠，1.3mg/mL-9mg/mL。例如，可以为1.3mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL等等。
本发明中，采用的药用辅料主要由聚山梨酯80、蔗糖或海藻糖、氯化钠三种，可以应用于保持疫苗稳定性。其中，聚山梨酯80，即为吐温80，是一种有机物，化学式是C64H124O26，为非离子型表面活性剂，有异臭，温暖而微苦。系聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系列产品之一。
上述，蔗糖与海藻糖两种辅料可以替换使用，此外，也可以混合使用。
进一步的，在疫苗制剂中，针对于佐剂组合物，提供如下两种组合，可以为第一佐剂组合物和第二佐剂组合物，分别如下：
1、第一佐剂组合物：
在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中，所述佐剂组合物包括如下浓度的组分：
(1)DOPC，700μg/mL-3000μg/mL；例如，可以为700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1000μg/mL、1500μg/mL、2000μg/mL、2500μg/mL、3000μg/mL等等；
(2)胆固醇，175μg/mL-750μg/mL；例如，可以为175μg/mL、180μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL、400μg/mL、450μg/mL、500μg/mL、550μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、750μg/mL等等；
(3)QS-21，35μg/mL-120μg/mL。例如，可以为35μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL、100μg/mLμg/mL、110μg/mL、120μg/mL等等。
上述，佐剂组合物，该组合物可以应用于提高抗原诱导的抗体水平和细胞免疫水平，其中包括DOPC、胆固醇和QS-21。
上述，DOPC是二油酰磷脂酰胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)的简称。它是一种磷脂类物质，应用于生物医学领域和药物研究中。DOPC是一种主要成分来自天然来源的磷脂，在细胞膜中具有重要的生理功能。它属于磷脂双分子层中的主要成分之一，可以调节细胞膜的稳定性、流动性和通透性。作为一种磷脂类物质，DOPC由两个油酸基和一个磷酸基与胆碱组成。胆碱部分具有亲水性，可以与水分子相互作用，而油酸基则是疏水性的。这使得DOPC分子在水环境中能够以双层磷脂结构的形式自组装，形成细胞膜的基本结构单元。
上述，QS-21，为一种皂苷类化合物，具有多种生物活性和药理作用。它主要用作免疫佐剂，能够增强疫苗的免疫原性并促进免疫响应。本发明中，将QS-21与抗原一起使用，可以提高抗原的免疫原性，激活免疫***，并增加体内对疫苗的免疫反应。
进一步的，在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中，所述佐剂组合物包括如下浓度的组分：
(1)DOPC，1200μg/mL-2600μg/mL；
(2)胆固醇，300μg/mL-650μg/mL；
(3)QS-21，50μg/mL-100μg/mL。
上述，为应用于提高抗原诱导的抗体水平和细胞免疫水平的疫苗制剂的第一佐剂组合物优选方案。
2、第二佐剂组合物：
在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中，所述佐剂组合物包括如下浓度的组分：
(1)DOTAP，70μg/mL-240μg/mL；例如，可以为70μg/mL、90μg/mL、100μg/mL、120μg/mL、140μg/mL、180μg/mL、200μg/mL、220μg/mL、240μg/mL等等；
(2)DOPC，500μg/mL-2000μg/mL；例如，可以为500μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL、120μg/mL、1500μg/mL、1700μg/mL、2000μg/mL等等。
(3)胆固醇，175μg/mL-600μg/mL；例如，可以为175μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL等等；
(4)QS-21，50μg/mL-120μg/mL；例如，可以为50μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、90μg/mL、100μg/mL、110μg/mL、120μg/mL等等；
(5)聚山梨酯80，100μg/mL-500μg/mL；例如，可以为100μg/mL、
200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL等等；
(6)蔗糖，20mg/mL-100mg/mL；例如，可以为20mg/mL、30mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL等等；
(7)氯化钠，1mg/mL-9mg/mL；例如，可以为1mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、7mg/mL、9mg/mL等等；
(8)Poly I:C，400μg/mL-900μg/mL。例如，可以为400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL等等。
上述，提供一种佐剂组合物，该组合物可以应用于提高抗原诱导的抗体水平和细胞免疫水平，其中包括DOTAP、DOPC、胆固醇和QS-21、聚山梨酯80、蔗糖、氯化钠和Poly I:C。
上述，DOTAP全称是1,2-二油酰基-3-三甲基氯化铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane)。这是一种合成的阳离子类表面活性剂。
上述，聚肌胞聚肌胞(Poly I:C)是一种人工合成的双链核糖核酸，是一种干扰素诱导剂，有抗病毒和免疫调节功能，用于慢性乙型肝炎、流行性出血热、流行性乙型脑炎、病毒性角膜炎、带状疱疹、各种疣类和呼吸道感染等。
进一步的，在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中，所述佐剂组合物包括如下浓度的组分：
(1)DOTAP，100μg/mL-175μg/mL；
(2)DOPC，1200μg/mL-2000μg/mL；
(3)胆固醇，350μg/mL-600μg/mL；
(4)QS-21，60μg/mL-100μg/mL；
(5)聚山梨酯80，300μg/mL-500μg/mL；
(6)蔗糖，30mg/mL-75mg/mL；
(7)氯化钠，3mg/mL-7mg/mL；
(8)Poly I:C，550μg/mL-900μg/mL。
上述，为应用于提高抗原诱导的抗体水平和细胞免疫水平的疫苗制剂的第二佐剂组合物优选方案。
总之，本发明中，采用自主研发的第一佐剂组合物(主要由QS-21和脂质体组成)或第二佐剂组合物(主要由Poly I:C、QS-21和脂质体组成)，能够实现诱发高滴度的中和抗体和细胞免疫反应。
同时，通过添加双糖及表面活性剂等药用辅料，实现了即便长时间存放疫苗制剂中的PreF蛋白构象仍然能够保持稳定的效果，大大增强了蛋白在液体制剂中的稳定性，避免出现现有疫苗采用液体剂型在5℃条件长时间存放(1个月及以上)，PreF蛋白位点发生损失，即PreF蛋白构象发生了变化的缺陷。
相较于目前现有的RSV产品，本发明所制备得到的疫苗制剂，采用第一佐剂组合物或第二佐剂组合物作为佐剂，同时与药用辅料和pre-F蛋白抗原共同组成疫苗制剂，使制剂的形态为液体单一制剂，使用方便，具有更好的稳定性。
此外，本发明还提供一种如上述所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的制备方法，包括：
S1、取纯化后的pre-F蛋白抗原，添加药用辅料中的聚山梨酯80、蔗糖或海藻糖，以及氯化钠，调节pH后制得抗原原液；
S2、根据佐剂组合物中的DOPC和胆固醇，制备得到中性脂质体；或者，根据所述佐剂组合物中的DOTAP、DOPC和胆固醇，分别制备得到中性脂质体和阳离子脂质体；
S3、取步骤S1和步骤S2所制备得到的产物，加入所述佐剂组合物中的剩余原料，经混合后进行分装，即得到所述重组呼吸道合胞病毒疫苗；
其中，步骤S2中，针对于佐剂组合物使用的不同，存在如下两种情况：
(1)当在所述步骤S2为：根据佐剂组合物中的DOPC和胆固醇，制备得到中性脂质体时，则所述步骤S3中的佐剂组合物中的剩余原料为QS-21；
(2)当在所述步骤S2为：根据所述佐剂组合物中的DOTAP、DOPC和胆固醇，分别制备得到中性脂质体和阳离子脂质体时，则所述步骤S3中的佐剂组合物中的剩余原料为QS-21、聚山梨酯80、蔗糖、氯化钠和Poly I:C。
进一步的在制备过程中，基于步骤S2中的处理方法和所得产物的不同，包括如下两种情况：
(1)所述步骤S2中，根据佐剂组合物中的DOPC和胆固醇，制备得到中性脂质体，包括：
S21，取DOPC和胆固醇，根据质量比4:1混合，分散后得到第一脂质成分；
S22，将所述第一脂质成分采用乙醇注入法、薄膜分散法、超声波分散法、逆向蒸发法中的任意一种方法制备得到所述中性脂质体；
(2)所述步骤S2中，根据所述佐剂组合物中的DOTAP、DOPC和胆固醇，分别制备得到中性脂质体和阳离子脂质体，包括：
根据所述步骤S21和所述步骤S22的方法制备得到所述中性脂质体；以及，利用如下方法制备得到所述阳离子脂质体：
S23，将DOTAP、DOPC和胆固醇，按照质量比为2:2:1进行混合，得到第二脂质成分；
S24，对所述第二脂质成分采用乙醇注入法、薄膜分散法、超声波分散法和逆向蒸发法中的任意一种方法制备得到所述阳离子脂质体。
在第二种情况(2)中，需要制备中性脂质体和阳离子脂质体，两种产物可以任意一种产物在先制备，也可以同时进行，其制备的顺序无需限定。
进一步的，所述步骤S22和所述步骤S24中均采用所述乙醇注入法，分别制备得到所述中性脂质体和所述阳离子脂质体；
所述乙醇注入法包括：
对所述第一脂质成分或第二脂质成分依次使用孔径200nm和100nm的挤出膜进行挤出成型，然后进行过滤除菌即得到所述中性脂质体或所述阳离子脂质体。
进一步的，所述对所述第一脂质成分或第二脂质成分依次使用孔径200nm和100nm的挤出膜进行挤出成型，然后进行过滤除菌即得到所述中性脂质体或所述阳离子脂质体，包括：
将所述第一脂质成分或第二脂质成分溶于乙醇中，与水相在线剪切1次-3次，得到剪切原料；
将所述剪切原料进行200nm脂质体挤出处理，使用孔径200nm的滤膜过滤，得到200nm挤出料；
将所述200nm挤出料进行100nm脂质体挤出处理，使用孔径为100nm的滤膜过滤，得到100nm挤出料；
(1)对所述100nm挤出料利用磷酸盐缓冲液进行超滤置换，并使用无菌过滤器过滤除菌，即得到所述中性脂质体；
(2)以及，对所述100nm挤出料利用醋酸缓冲液进行超滤置换，并使用无菌过滤器过滤除菌，即得到所述阳离子脂质体；
进一步的，所述超滤置换的浓缩倍数为3倍-6倍；例如，可以为3倍、4倍、5倍、6倍等等。
洗滤倍数为6倍-8倍；例如，可以为6倍、7倍、8倍等等。
进一步的，所述中性脂质体的平均粒径为80nm-140nm；例如，可以为80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm等等。
进一步的，所述中性脂质体的溶液pH值为5.5-7.0；例如，可以为5.5、5.8、6.0、6.2、6.4、6.8、7.0等等。
进一步的，所述中性脂质体的溶液pH值为6.4-6.6；例如，可以为6.4、6.5、6.6等等。
进一步的，所述阳离子脂质体的平均粒径为40nm-100nm；例如，可以为40nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、等等。
进一步的，所述阳离子脂质体的溶液pH值为4.5-6.5；例如，可以为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5等等。
进一步的，所述阳离子脂质体pH6.5条件下的Zeta电位为50mV-90mV。例如，可以为50mV、55mV、60mV、65mV、70mV、75mV、80mV、85mV、90mV等等。
此外，本发明还提供一种如上述所述重组呼吸道合胞病毒疫苗在制备用于治疗和/或预防呼吸道合胞病毒引起的疾病的产品的应用，所述产品包括疫苗产品、药物、诊断试剂和检测试剂盒。
上述，产品中可以包括但不限于疫苗制剂、药物、诊断试剂和检测试剂盒，用于治疗和/或预防呼吸道合胞病毒引起的疾病。其中，药物可以为用于治疗或预防呼吸道合胞病毒引起的疾病的适宜的剂型，可以为单用或联用型药物。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1：针对佐剂处方考察。
第一佐剂组合物，是含有皂树皂苷(QS-21)免疫增强成分的脂质体制剂，本实施例中，通过配方筛选确定了第一佐剂组合物的配方。
(1)QS-21加入前后理化性质的变化：
按照第一佐剂组合物配制工艺，使用三批中性脂质体分别加入QS-21，检测QS-21加入前后粒径分布和Zeta电位的变化情况，结果如下表所示。
按照第一佐剂组合物配制工艺，使用三批中性脂质体分别加入QS-21，检测QS-21加入前后粒径分布和Zeta电位的变化情况，结果如下表所示。
表1、在第一佐剂组合物配制过程中加入QS-21前后粒径分布与Zeta电位表
由上表可以看出，加入QS-21后，第一佐剂组合物的平均粒径和Zeta电位无明显变化。说明QS-21的加入对体系的粒径分布和Zeta电位无明显影响。
(2)QS-21加入后溶血活性的变化：
游离的QS-21会与细胞膜上的胆固醇结合，形成不可逆的复合物，当其与红细胞结合后会造成溶血现象。当QS-21与中性脂质体中的胆固醇发生吸附后，阻止了其与细胞膜的结合，降低了溶血活性。
本试验使用中性脂质体(即胆固醇，其含量为250μg)分别吸附50μg、100μg、200μg、300μg和400μg的QS-21，同时以50μg的QS-21作为对照。将以上样品分别依次连续进行2倍稀释，并加入鸡血红细胞室温孵育30分钟，用紫外分光光度计在570nm处测定上清的OD值，OD值越高表明溶血性越强。其结果如下表和图1所示。
表2、不同样品的溶血活性试验表
由上表和图1可以看出，当QS-21含量不高于200μg时，“QS-21+中性脂质体”组的OD值与空白对照无明显差异，说明含250μg的中性脂质体至少能吸附200μg的QS-21，使其不产生明显的溶血现象。
(3)佐剂***pH范围：
不同pH值的样品在2℃-8℃与37℃放置1周，测定其佐剂各组分含量，结果如下表所示。
表3、不同pH条件下2℃-8℃与37℃放置1周佐剂部分各组分含量表
由上表及图2和图3可知，在pH6.0-7.5范围内，DOPC与胆固醇在2℃-8℃放置均无明显变化，在37℃放置1周，其含量有一定的降低，不同pH的样品降低幅度无明显差别；考虑到pH7.5的样品QS-21含量降低最明显，且QS-21在碱性环境下易于水解，因此制品的pH值应不高于7.0。
实施例2：氯化钠浓度筛选。
氯化钠浓度不仅影响疫苗制品的渗透压，还可能影响抗原蛋白的稳定性。本实施例中，配制了含不同氯化钠浓度液体制剂，将不同氯化钠浓度的样品在2℃-8℃与37℃放置1天及1周，采用ELISA(AM14)法测定抗原含量。
表4、不同氯化钠条件下2℃-8℃与37℃放置1周抗原含量考察
由上表可以看出，在氯化钠浓度0.13％-0.90％范围内，37℃分别放置1天、7天，抗原含量未发生下降(即说明PreF蛋白构象稳定)，因此氯化钠浓度范围可选择为0.13％-0.90％。
需要说明的是，由于抗原蛋白原液中，需要事先加入NaCl以保持原液稳定，所以疫苗制剂的总体氯化钠含量最低只能配置到0.13％，无法降为0.13％之内，因此将0.13％作为下限值；此外，如果疫苗制剂中的氯化钠总含量增大至0.9％以上，则疫苗制剂的渗透压会出现明显高于生理渗透压的情况，因此根据上述原因及本实施例中的实验结果，最终确定氯化钠的浓度(含量)范围为0.13％-0.90％。
实施例3：聚山梨酯80浓度筛选。
为选出合适的聚山梨酯80浓度，本实施例中，按下表设计了不同聚山梨酯80浓度的疫苗配方，通过37℃加速试验，采用SEC和ELISA(AM14)法分别测定蛋白纯度和抗原含量。
表5、不同聚山梨酯80浓度配方下的加速稳定性(SEC)
由上表可以看出，37℃放置14天后，不含聚山梨酯80的组别中，蛋白纯度无变化，而抗原含量发生了下降。其它含聚山梨酯80的组别中，蛋白纯度和抗原含量均无明显变化。表明吐温80的浓度在0.01％-0.05％能维持蛋白抗原的稳定。
在疫苗制剂的制备生产中，一般疫苗制剂的聚山梨酯80的浓度不高于0.05％。因此本实施例中，将聚山梨酯80的浓度限定在0.01％-0.05％的范围内。
实施例4：蔗糖和海藻糖比较。
蔗糖和海藻糖可能对pre-F蛋白抗原起保护作用，为比较蔗糖和海藻糖的保护作用，并选出合适的浓度，按下表设计了不同蔗糖和海藻糖浓度的疫苗配方，通过37℃28天加速试验，采用ELISA(AM14)测定抗原含量。
表6、不同蔗糖和海藻糖浓度配方下的加速稳定性
由上表可以看出，含蔗糖或海藻糖的配方，在37℃放置28天，和2℃-8℃的样品相比，抗原含量均未发生明显变化，而对照组加速28天后，和2℃-8℃的样品相比，抗原含量发生了明显的下降，说明蔗糖或海藻糖提高了pre-F蛋白抗原的稳定性。
此外，浓度范围为2％-10％的蔗糖或浓度范围为2％-10％的海藻糖均能对pre-F蛋白起足够的保护作用。
由于抗体原液中为了保持稳定，本身存在二糖(蔗糖和/或海藻糖)，因此疫苗制剂中的糖类物质无法配制到2％以下，因此本实施例中将2％作为糖类物质的下限；此外，蔗糖和/或海藻糖的浓度如果出现超过10％的情况，则疫苗制剂整体的渗透压会明显高于生理渗透压，因此将蔗糖和/或海藻糖的浓度(含量)范围确定为2％-10％。
实施例5：重组呼吸道合胞病毒疫苗的制备。
重组呼吸道合胞病毒疫苗配方(含第一佐剂组合物)如下表所示：
表7、重组呼吸道合胞病毒疫苗配方表
成分 用量(以1000mL计)
Pre-F原液 240mg
DOPC 2000mg
胆固醇 500mg
QS-21 70mg
蔗糖 50000mg
磷酸二氢钠 479.5mg
磷酸氢二钠 215.5mg
聚山梨酯80 300mg
氯化钠 4000mg
按照上述配方依次加入磷酸盐缓冲液(采用磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，氯化钠，蔗糖制备而成，具体如上表)、中性脂质体、QS-21溶液、聚山梨酯80溶液和pre-F原液，调节pH为6.0-7.0，过滤除菌后预灌封分装机进行分装至1mL预灌封注射器中(每支0.5mL)，将分装完成的样品进行贴签外包，即得重组呼吸道合胞病毒疫苗。
实施例6：重组呼吸道合胞病毒疫苗的初步稳定性研究。
本实施例中，对自制RSV疫苗(实施例5中所制备得到的疫苗制剂)进行加速稳定性研究，于37℃下分别放置14天和28天；于25℃下分别放置1个月和3个月，分别采用SEC法和ELISA法考察蛋白纯度和抗原含量的变化。
表8、加速稳定性结果
由上表可知，蛋白纯度和抗原含量均无明显变化。
需要说明的是，本实施例中，Elisa(AM14)未发生下降，表明pre-F的三聚体构象没有发生变化，进一步能够表明自制RSV疫苗于37℃放置28天、于25℃放置3月均稳定。
本实施例的加速实验中，若pre-F蛋白的位点发生损失或三聚体分解为单体，均会造成Elisa(AM14)发生下降，故本实施例证明了pre-F蛋白在当前配方中能维持稳定的pre-F三聚体构象，稳定的pre-F三聚体构象是该疫苗能让免疫***产生足够的中和抗体的关键。
实施例7：呼吸道合胞病毒疫苗的小鼠免疫试验。
实验分组：将SPF级BALB/c小鼠随机分为5组，10只/组，动物总数共50只，各组给药剂量和动物编号如下表。
表9、小鼠分组及免疫方案
实验组 数量 注射方式 注射次数 注射剂量
第二佐剂组合物+902(10μg) 10 肌肉注射 2 0.1剂
第一佐剂组合物+902(10μg) 10 肌肉注射 2 0.1剂
Al(OH)3+902(10μg) 10 肌肉注射 2 0.1剂
缓冲液+902(10μg) 10 肌肉注射 2 0.1剂
生理盐水 10 肌肉注射 2 0.1剂
备注：上表中，902，即代表RSV病毒PreF蛋白；缓冲液为20mM tris缓冲液。
免疫方式：供试品在使用前轻轻摇匀后，使用300μL一次性无菌注射器和针头抽取100μL的供试品溶液，注射于小鼠大腿双外侧肌肉。
免疫时间：间隔14天给药，两次给药。
血清采集：各试验组实验动物在D14以及D28采血，分离血清通过酶联免疫法(ELISA)测定血清特异性IgG抗体及其抗体亚型滴度(详见实例8)。在D28(每组前5只动物)分离小鼠脾脏，采用胞内细胞因子染色(ICS)检测抗原特异性CD4+T与CD8+T细胞免疫应答(详见实施例9)。通过免疫噬斑法来检测二免后14天动物血清(B2血，每组前5只动物)对RSV病毒的中和活性进行检测(详见实施例10)。
实施例8：小鼠免疫试验抗血清中特异性抗体的ELISA检测。
(1)特异性IgG抗体检测
将RSV PreF蛋白(抗原)用包被液稀释成4μg/mL，100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜。用洗涤液洗3次后，每孔加入200μL封闭液，25℃封闭1小时。封闭结束后倒掉封闭液，将鼠抗血清倍比稀释后和小鼠阴性血清加入ELISA板，100μL/孔，在25℃下孵育2小时。用洗涤液洗3次后，加入HRP标记的羊抗小鼠IgG(1:2500)，100μL/孔，在25℃下孵育1小时。用洗涤液洗5次后，加入TMB底物显色液，25℃避光反应15分钟，加100μL终止液终止反应。用酶标仪测定各孔OD450值。将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的滴度。
(2)特异性IgG抗体亚型检测
将RSV PreF蛋白(抗原)用包被液稀释成4μg/mL，100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜。用洗涤液洗3次后，每孔加入200μL封闭液，25℃封闭1小时。封闭结束后倒掉封闭液，将鼠抗血清倍比稀释后和小鼠阴性血清加入ELISA板，100μL/孔，在25℃下孵育2小时。用洗涤液洗3次后，加入biotin标记的羊抗小鼠IgG1(1:4000)、IgG2a(1:2500)、IgG2b(1:5000)，100μL/孔，在25℃下孵育1小时。用洗涤液洗3次后，加入HRP-Labeled Streptavidin(1:10000)，用洗涤液洗5次后，加入TMB底物显色液，25℃避光反应15分钟，加100μL终止液终止反应。用酶标仪测定各孔OD450值。将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的滴度。
结果：通过ELISA法检测血清中特异性IgG及其亚型抗体滴度。各实验组一免后(D14)和二免后(D28)IgG及其亚型抗体滴度柱状图分别见图4和图5(其中，佐剂1指第二佐剂组合物，佐剂2指第一佐剂组合物，902代表RSV PreF蛋白)。
一免后，相较于阴性对照组，其余各组的抗体滴度水平均明显增高。含第二佐剂组合物与第一佐剂组合物组分的供试品，其诱导IgG亚型抗体滴度水平显著高于其余实验组。二免后的IgG及其抗体亚型滴度值相较一免均有显著增高。含第二佐剂组合物组分与含第一佐剂组合物组分供试品诱导血清结合抗体IgG及其亚型的滴度值无显著差异，但均显著优于含Al(OH)3组分的供试品。
实施例9：小鼠免疫试验的细胞因子检测。
小鼠脾脏收集后，保存于装有4mL维持培养基的EP管中，在生物安全柜中进行研磨收集脾脏细胞，室温离心(531g，5分钟)；收集细胞加入5mL ACK裂解液裂解3分钟，加入细胞洗液，室温离心(531g，5分钟)；收集细胞再次室温离心(531g，5分钟)，弃上清收集细胞重悬并计数；计数完成后室温离心(531g，5分钟)收集细胞调整细胞密度为2×107cell/mL；加入细胞刺激物后，100μL/孔在96孔U型细胞培养板置于37℃5％ CO2培养箱中刺激1小时；刺激完成后10μL/孔加入Golgi plug工作液，调整终浓度为1μL/mL后继续在37℃5％ CO2培养箱中培养5h；室温离心(604g，5分钟)后加200μL/孔D-PBS重悬细胞，室温离心(604g，5分钟)染死活细胞后加入150μL/孔D-PBS重悬细胞；室温离心(604g，5分钟)收集细胞后加入50μL/孔FACS block进行封闭，4℃避光孵育5分钟；封闭结束加入50μL/孔表面抗体混合液进行细胞表面染色，4℃避光孵育30分钟；加入100μL/孔FACS Buffer，室温离心(604g，5分钟)收集细胞加入100μL/孔Cytofix/cytoperm，4℃避光孵育20分钟；加入100μL/孔Perm/wash室温离心(604g，5分钟)收集细胞后加入50μL/孔细胞因子抗体混合液染色，4℃避光孵育30分钟；加入150μL/孔Perm/wash室温离心(604g，5分钟)收集细胞，再次加入200μL/孔Perm/wash室温离心(750g，3分钟)收集细胞，最后加入150μL/孔固定液固定后以流式细胞仪进行检测。
结果：在D28天，分离小鼠脾脏，采用胞内细胞因子染色(ICS)法检测抗原特异性CD4+T与CD8+T细胞免疫应答。检测结果采用FlowJo软件进行数据分析，结果详见图6和图7。
相较于其余各实验组，含第二佐剂组合物组分与含第一佐剂组合物组分的供试品能产生较为明显的CD4+T与CD8+T细胞免疫应答，均显著高于其余各实验组。在CD8+T细胞免疫应答中，含第二佐剂组合物组分的供试品能够诱导更高的细胞因子(IFN-γ+IL-2-TNF-α+)水平。
实施例10：小鼠免疫试验的血清抗RSV病毒中和抗体检测。
实验前一天使用24孔板进行细胞铺板，每孔细胞铺板数为4×105cell/孔。培养约16小时。用无血清培养基将待测血清样本进行倍比稀释，加入3×104PFU/孔的病毒量震荡混匀后在37℃培养箱中孵育1小时。弃去细胞培养液，加入200μL/孔血清-病毒混合液到24孔板中，37℃共感染2小时。弃去感染液，加入1mL/孔的3％甲基纤维素培养基，37℃孵育箱中继续培养6天。弃掉孔板中甲基纤维素培养基，使用PBS洗去残余甲基纤维素培养基，加入组织固定液，室温固定过夜。通风橱内弃去组织固定液，用PBS清洗孔板残液，摇床清洗5分钟后弃去PBS，共洗涤3次。加入约500uL/孔封闭液(5％牛奶，0.2％ Triten-100)进行封闭，室温摇床封闭1小时。封闭完成后加入由封闭液稀释的一抗(1:1000)4℃冰箱孵育2小时。弃去一抗，使用PBST(0.5％ Tween-20)摇床洗涤3次，每次10分钟。加入抗羊二抗(1:300)室温孵育1小时，PBST摇床洗涤3次，每次10分钟。最后用DBA显色液进行显色5分钟-10分钟，至能看见明显噬斑后用水将显色液冲洗干净，沥干后进行噬斑统计。计算得到血清的PRNT50(使病毒造成的噬斑减少50％的血清稀释度)。
结果：通过免疫噬斑法检测二免后14天动物血清对RSV病毒的中和活性，测定不同实验组血清的噬斑减少量，具体结果详见图8(其中，佐剂1指第二佐剂组合物，佐剂2指第一佐剂组合物，902代表RSV PreF蛋白)。
相较于其余各实验组，含第二佐剂组合物组分与含第一佐剂组合物组分的供试品能减少更多的噬斑，其对应组别动物血清中的中和抗体滴度更高。
结论：
综上可知，自主研发的添加第一佐剂组合物和第二佐剂组合物佐剂的疫苗，在BALB/c小鼠体内均能产生良好的特异性免疫反应。
总之，本发明所提供的重组呼吸道合胞病毒疫苗通过于重组呼吸道合胞病毒(RSV)蛋白原液中加入佐剂组合物，获得液体剂型的重组呼吸道合胞病毒疫苗。通过肌肉注射给予BALB/c小鼠的免疫实验研究，证明了自制重组呼吸道合胞病毒疫苗具有良好的免疫原性。
以上所述的是本发明的优选实施方式和相应实施例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提，还可以做出若干变形和改进，包括但不限于比例、流程、用量和反应容器的调整，例如采用连续流动反应器，这些都属于本发明的保护范围之内。以上所述的是本发明的优选实施方式和相应实施例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提，还可以做出若干变形和改进，包括但不限于比例、流程、用量的调整，这些都属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组呼吸道合胞病毒疫苗，其特征在于，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗为包括pre-F蛋白抗原的液体剂型的疫苗制剂；
其中，所述pre-F蛋白抗原的氨基酸序列为如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.7所示氨基酸序列中的任一种；
优选地，所述pre-F蛋白抗原在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中的含量为120μg/mL-480μg/mL；
优选地，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的渗透压为210mOsmol/kg-420mOsmol/kg；
优选地，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的平均粒径为60nm-220nm；
优选地，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的平均粒径为80nm-160nm；
优选地，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的pH值为6.0-7.0；
优选地，所述重组呼吸道合胞病毒疫苗还包括：药用辅料和佐剂组合物。
2.如权利要求1所述重组呼吸道合胞病毒疫苗，其特征在于，在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中，所述药用辅料包括如下浓度的组分：
聚山梨酯80，100μg/mL-500μg/mL；
蔗糖或海藻糖，20mg/mL-100mg/mL；
氯化钠，1.3mg/mL-9mg/mL。
3.如权利要求1所述重组呼吸道合胞病毒疫苗，其特征在于，在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中，所述佐剂组合物包括如下浓度的组分：
DOPC，700μg/mL-3000μg/mL；
胆固醇，175μg/mL-750μg/mL；
QS-21，35μg/mL-120μg/mL。
4.如权利要求1所述重组呼吸道合胞病毒疫苗，其特征在于，在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中，所述佐剂组合物包括如下浓度的组分：
DOPC，1200μg/mL-2600μg/mL；
胆固醇，300μg/mL-650μg/mL；
QS-21，50μg/mL-100μg/mL。
5.如权利要求1所述重组呼吸道合胞病毒疫苗，其特征在于，在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中，所述佐剂组合物包括如下浓度的组分：
DOTAP，70μg/mL-240μg/mL；
DOPC，500μg/mL-2000μg/mL；
胆固醇，175μg/mL-600μg/mL；
QS-21，50μg/mL-120μg/mL；
聚山梨酯80，100μg/mL-500μg/mL；
蔗糖，20mg/mL-100mg/mL；
氯化钠，1mg/mL-9mg/mL；
Poly I:C，400μg/mL-900μg/mL。
6.如权利要求1所述重组呼吸道合胞病毒疫苗，其特征在于，在所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的单位剂量中，所述佐剂组合物包括如下浓度的组分：
DOTAP，100μg/mL-175μg/mL；
DOPC，1200μg/mL-2000μg/mL；
胆固醇，350μg/mL-600μg/mL；
QS-21，60μg/mL-100μg/mL；
聚山梨酯80，300μg/mL-500μg/mL；
蔗糖，30mg/mL-75mg/mL；
氯化钠，3mg/mL-7mg/mL；
Poly I:C，550μg/mL-900μg/mL。
7.一种如权利要求1-6任一项所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括：
S1、取纯化后的pre-F蛋白抗原，添加药用辅料中的聚山梨酯80、蔗糖或海藻糖，以及氯化钠，调节pH后制得抗原原液；
S2、根据佐剂组合物中的DOPC和胆固醇，制备得到中性脂质体；或者，根据所述佐剂组合物中的DOTAP、DOPC和胆固醇，分别制备得到中性脂质体和阳离子脂质体；
S3、取步骤S1和步骤S2所制备得到的产物，加入所述佐剂组合物中的剩余原料，经混合后进行分装，即得到所述重组呼吸道合胞病毒疫苗；
其中，在所述步骤S2为：根据佐剂组合物中的DOPC和胆固醇，制备得到中性脂质体时，所述佐剂组合物中的剩余原料为QS-21；
在所述步骤S2为：根据所述佐剂组合物中的DOTAP、DOPC和胆固醇，分别制备得到中性脂质体和阳离子脂质体时，所述佐剂组合物中的剩余原料为QS-21、聚山梨酯80、蔗糖、氯化钠和PolyI:C；
优选地，所述步骤S2中，根据佐剂组合物中的DOPC和胆固醇，制备得到中性脂质体，包括：
S21，取DOPC和胆固醇，根据质量比4:1混合，分散后得到第一脂质成分；
S22，将所述第一脂质成分采用乙醇注入法、薄膜分散法、超声波分散法、逆向蒸发法中的任意一种方法制备得到所述中性脂质体；
优选地，所述步骤S2中，根据所述佐剂组合物中的DOTAP、DOPC和胆固醇，分别制备得到中性脂质体和阳离子脂质体，包括：
根据所述步骤S21和所述步骤S22的方法制备得到所述中性脂质体；以及，利用如下方法制备得到所述阳离子脂质体：
S23，将DOTAP、DOPC和胆固醇，按照质量比为2:2:1进行混合，得到第二脂质成分；
S24，对所述第二脂质成分采用乙醇注入法、薄膜分散法、超声波分散法和逆向蒸发法中的任意一种方法制备得到所述阳离子脂质体。
8.如权利要求7所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S22和所述步骤S24中均采用所述乙醇注入法，分别制备得到所述中性脂质体和所述阳离子脂质体；
所述乙醇注入法包括：
对所述第一脂质成分或第二脂质成分依次使用孔径200nm和100nm的挤出膜进行挤出成型，然后进行过滤除菌即得到所述中性脂质体或所述阳离子脂质体。
9.如权利要求8所述重组呼吸道合胞病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述对所述第一脂质成分或第二脂质成分依次使用孔径200nm和100nm的挤出膜进行挤出成型，然后进行过滤除菌即得到所述中性脂质体或所述阳离子脂质体，包括：
将所述第一脂质成分或第二脂质成分溶于乙醇中，与水相在线剪切1次-3次，得到剪切原料；
将所述剪切原料进行200nm脂质体挤出处理，使用孔径200nm的滤膜过滤，得到200nm挤出料；
将所述200nm挤出料进行100nm脂质体挤出处理，使用孔径为100nm的滤膜过滤，得到100nm挤出料；
对所述100nm挤出料利用磷酸盐缓冲液进行超滤置换，并使用无菌过滤器过滤除菌，即得到所述中性脂质体；以及，对所述100nm挤出料利用醋酸缓冲液进行超滤置换，并使用无菌过滤器过滤除菌，即得到所述阳离子脂质体；
优选地，所述超滤置换的浓缩倍数为3倍-6倍，洗滤倍数为6倍-8倍；
优选地，所述中性脂质体的平均粒径D50为80nm-140nm；
优选地，所述中性脂质体的溶液pH值为5.5-7.0；
优选地，所述中性脂质体的溶液pH值为6.4-6.6；
优选地，所述阳离子脂质体的平均粒径D50为40nm-100nm；
优选地，所述阳离子脂质体的溶液pH值为4.5-6.5；
优选地，所述阳离子脂质体的Zeta电位为50mV-90mV。
10.一种如权利要求1-6任一项所述重组呼吸道合胞病毒疫苗在制备用于治疗和/或预防呼吸道合胞病毒引起的疾病的产品的应用，其特征在于，所述产品包括疫苗产品、药物、诊断试剂和检测试剂盒。
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