CN106282316A - 一种适合Ion Torrent测序平台的16S rRNA测序方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体地说，涉及一种针对Ion Torrent高通量测序平台的Ion Torrent 16S rRNA测序引物设计、建库及高通量测序的方法，其包括样本DNA提取、16S rRNA测序引物设计、16S rRNA PCR 扩增、PCR 扩增产物纯化及定量、测序文库构建、高通量测序和序列分析，本发明的有益效果是：本发明的方法具有如下优点：(1)样品标记简单，(2)建库方法简单，(3)极大地降低测序成本，(4)位点选择灵活，(5)数据分析容易，非常适合中等数量样本的检测。

Description

一种适合Ion Torrent 测序平台的16S rRNA测序方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地说，涉及一种针对Ion Torrent高通量测序平台的Ion Torrent 16S rRNA测序引物设计、建库及高通量测序的方法。
背景技术
环境微生物群落(即微生物多样性)是指环境微生物的种类和种间差异，是表征环境生态***群落结构和稳定性的重要参数之一。由于环境微生物群落能较早地预测环境质量的变化，因而被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一，但由于环境中微生物数量巨大、种类繁多，环境微生物的研究很大程度上依赖于方法和技术的进步。目前通过16S rRNA测序以鉴定特定环境下细菌和古菌的微生物种类和丰度已成为公识。因此，一种操作方便、成本低廉并且高通量的16S rRNA检测技术是当前环境微生物检测的关键所在。
最近高通量测序技术的出现，使得每次获得的基因序列数可达几百万甚至以亿万计，不仅可以检测到环境中不可培养微生物及痕量微生物，而且能够定性定量地反映微生物的原始组成，从而为环境微生物多样性的研究开启了新的研究热潮。目前，应用于微生物16S rRNA测序的常见平台有454、Illumina测序平台，但高通量测序仪及其运行一次的高昂测序成本限制了其在实验室特别是中、小型实验室的正常运行。
最新出现的Ion Torrent PGM测序平台（Life Technologies, Guilford, CT)因其快速，特别合适于应急测序项目而越来越受到众多科研工作者的关注。目前提供了三种针对16S rRNA PCR 扩增产物的建库技术：（１）通过常规建库的方法，对每一种待测样本都必须一个建库，然后混合带不同barcode序列的文库进行测序，该法的缺点是建库成本化费巨大，操作繁琐； （２）通过Amplicon 文库构建文法，即在每一对引物的正反向都需加上60bp测序接头，然后对不同PCR产物混合测序，该法虽然不需建库，但引物过长，不仅引起引物合成成本昂贵，而且易引起引物扩增效率不高；（3）Ion Torrent公司还提供一种16S rRNA PCR 扩增建库试剂盒，但每一个样品需两次建库，成本更为昂贵。
基于这些建库方法的不足，需要建立一种针对Ion Torrent测序平台的多样品16S rRNA PCR 扩增产物检测建库和测序方法，从而彻底解决目前高通量测序仪平台成本高、周期长的问题，为环境微生物研究提供低化费、高时效的检测平台。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种适合Ion Torrent 测序平台的16S rRNA测序方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种适合Ion Torrent 测序平台的16S rRNA测序方法，其包括样本DNA提取、16S rRNA测序引物设计、16S rRNA PCR 扩增、PCR 扩增产物纯化及定量、测序文库构建、高通量测序和序列分析，所述16S rRNA测序引物设计按如下步骤进行：
（1）选取16S rRNA通用引物；
（2）选取Ion Torrent 测序平台DNA 1-96 barcode 序列；
（3）在PCR 上游引物5’端加上barcode 序列，得到Ion Torrent 16S rRNA测序上游引物，在PCR 下游引物5’端加上同样的barcode 序列，得到Ion Torrent 16S rRNA测序下游引物。
优选的，所述步骤（1）中步骤( 1) 中选取的PCR 上、下游引物为16S rRNA通用引物。
优选的，述的步骤(2) 中高通量测序的平台为Ion torrent 测序平台。
优选的：所述的步骤( 3 ) 中将步骤( 2 ) 中的barcode ***步骤( 1 ) 中得到的Ion Torrent 16S rRNA测序引物。
优选的，适合Ion Torrent 测序平台的16S rRNA测序方法具体步骤为：
(a) 提取基因组DNA：针对不同的样本来源选择合适的DNA提取试剂盒提取微生物基因组DNA；
(b) Ion Torrent 16S rRNA测序引物PCR 扩增：以步骤(a) 中得到的基因组DNA为模板，与权利要求1 中设计得到的引物进行PCR 扩增，每一种Barcode 特异性引物对应一种待测样本；
(c)PCR 扩增产物纯化及定量：用割胶回收试剂盒或者PCR 纯化试剂盒对步骤(b) 中得到的PCR 产物进行回收或纯化，以琼脂糖凝胶电泳进行片段大小分析，以Qubit® 2.0荧光计定量纯化后的PCR 产物；
(d) PCR 扩增产物建库：按定量结果，将每个纯化后PCR产物等量混匀，按Ion Torrent DNA建库试剂盒建库。
(d) 文库片段大小和浓度检测：以安捷伦2100 生物分析仪对文库片段大小和浓度进行检测。
(e) Ion Torrent高通量测序：用高通量测序仪对步骤(c) 中纯化后的PCR 产物进行高通量测序，根据Ion Torrent 16S rRNA测序引物中的barcode序列将测序结果分为不同的样本组；
(f)序列分析：利用mothur 软件包对PGM产生的高通量序列数据进行分析。
本发明的有益效果是：本发明的方法具有如下优点：(1)样品标记简单， (2) 建库方法简单， (3) 极大地降低测序成本，(4) 位点选择灵活，(5) 数据分析容易，非常适合中等数量样本的检测。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例：
一种适合Ion Torrent 测序平台的16S rRNA测序方法，其包括样本DNA提取、16S rRNA测序引物设计、16S rRNA PCR 扩增、PCR 扩增产物纯化及定量、测序文库构建、高通量测序和序列分析，所述16S rRNA测序引物设计按如下步骤进行：
（1）选取16S rRNA通用引物；
（2）选取Ion Torrent 测序平台DNA 1-96 barcode 序列；
（3）在PCR 上游引物5’端加上barcode 序列，得到Ion Torrent 16S rRNA测序上游引物，在PCR 下游引物5’端加上同样的barcode 序列，得到Ion Torrent 16S rRNA测序下游引物。
优选的，所述步骤（1）中步骤( 1) 中选取的PCR 上、下游引物为16S rRNA通用引物。
优选的，述的步骤(2) 中高通量测序的平台为Ion torrent 测序平台。
优选的：所述的步骤( 3 ) 中将步骤( 2 ) 中的barcode ***步骤( 1 ) 中得到的Ion Torrent 16S rRNA测序引物。
优选的，适合Ion Torrent 测序平台的16S rRNA测序方法具体步骤为：
(a) 提取基因组DNA：针对不同的样本来源选择合适的DNA提取试剂盒提取微生物基因组DNA；
(b) Ion Torrent 16S rRNA测序引物PCR 扩增：以步骤(a) 中得到的基因组DNA为模板，与权利要求1 中设计得到的引物进行PCR 扩增，每一种Barcode 特异性引物对应一种待测样本；
(c)PCR 扩增产物纯化及定量：用割胶回收试剂盒或者PCR 纯化试剂盒对步骤(b) 中得到的PCR 产物进行回收或纯化，以琼脂糖凝胶电泳进行片段大小分析，以Qubit® 2.0荧光计定量纯化后的PCR 产物；
(d) PCR 扩增产物建库：按定量结果，将每个纯化后PCR产物等量混匀，按Ion Torrent DNA建库试剂盒建库。
(d) 文库片段大小和浓度检测：以安捷伦2100 生物分析仪对文库片段大小和浓度进行检测。
(e) Ion Torrent高通量测序：用高通量测序仪对步骤(c) 中纯化后的PCR 产物进行高通量测序，根据Ion Torrent 16S rRNA测序引物中的barcode序列将测序结果分为不同的样本组；
(f)序列分析：利用mothur 软件包对PGM产生的高通量序列数据进行分析。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (7)

1.一种适合Ion Torrent 测序平台的16S rRNA测序方法，其包括样本DNA提取、16S rRNA测序引物设计、16S rRNA PCR 扩增、PCR 扩增产物纯化及定量、测序文库构建、高通量测序和序列分析，其特征在于：所述16S rRNA测序引物设计按如下步骤进行：
（1）选取16S rRNA通用引物；
（2）选取Ion Torrent 测序平台DNA 1-96 barcode 序列；
（3）在PCR 上游引物5’端加上barcode 序列，得到Ion Torrent 16S rRNA测序上游引物，在PCR 下游引物5’端加上同样的barcode 序列，得到Ion Torrent 16S rRNA测序下游引物。
2. 根据权利要求1所述的适合Ion Torrent 测序平台的16S rRNA测序方法，其特征在于：所述步骤（1）中步骤( 1) 中选取的PCR 上、下游引物为16S rRNA通用引物。
3.根据权利要求1所述的适合Ion Torrent 测序平台的16S rRNA测序方法，其特征在于：述的步骤(2) 中高通量测序的平台为Ion torrent 测序平台。
4.根据权利要求1所述的述的步骤( ⅱ ) 中高通量测序的平台为Ion torrent 测序平台，其特征在于：所述的步骤( 3 ) 中将步骤( 2 ) 中的barcode ***步骤( 1 ) 中得到的Ion Torrent 16S rRNA测序引物。
5. 根据权利要求1所述适合Ion Torrent 测序平台的16S rRNA测序方法，其特征在于，具体步骤为：
(a) 提取基因组DNA：针对不同的样本来源选择合适的DNA提取试剂盒提取微生物基因组DNA；
(b) Ion Torrent 16S rRNA测序引物PCR 扩增：以步骤(a) 中得到的基因组DNA为模板，与权利要求1 中设计得到的引物进行PCR 扩增，每一种Barcode 特异性引物对应一种待测样本；
(c)PCR 扩增产物纯化及定量：用割胶回收试剂盒或者PCR 纯化试剂盒对步骤(b) 中得到的PCR 产物进行回收或纯化，以琼脂糖凝胶电泳进行片段大小分析，以Qubit® 2.0荧光计定量纯化后的PCR 产物；
(d) PCR 扩增产物建库：按定量结果，将每个纯化后PCR产物等量混匀，按Ion Torrent DNA建库试剂盒建库。
6.(d) 文库片段大小和浓度检测：以安捷伦2100 生物分析仪对文库片段大小和浓度进行检测。
7.(e) Ion Torrent高通量测序：用高通量测序仪对步骤(c) 中纯化后的PCR 产物进行高通量测序，根据Ion Torrent 16S rRNA测序引物中的barcode序列将测序结果分为不同的样本组；
(f)序列分析：利用mothur 软件包对PGM产生的高通量序列数据进行分析。
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