CN110229897A - Med12基因突变检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了MED12基因突变检测试剂盒及其应用。本发明的试剂盒包括用于检测MED12基因突变的探针组，所述探针组由探针1‑探针48组成。本发明的试剂盒不仅可用于检测肿瘤基因组层面的MED12体细胞突变和胚系突变，也可用于血液肿瘤患者，特别是急性髓系细胞白血病患者的辅助诊断、微小残留病监测和预后的评估等，且本发明试剂盒的检测方法简便、灵敏、准确，将在医学检测领域发挥重要作用。

Description

MED12基因突变检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于医学检测技术领域，具体涉及MED12基因突变检测试剂盒及其应用。

背景技术

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，具有高度的分子生物学和临床异质性。分子诊断技术的发展在AML的精准分型和个体化治疗中起了巨大推动作用，但尽管如此，AML患者的临床预后仍然展示出巨大的异质性，复发仍然是临床医生及AML患者所共同面临的挑战之一，而新型生物学标记物的发现是实现AML个体化诊疗的必经之路。

MED12(mediator complex subunit 12)位于X性染色体上，编码介体复合物亚基12蛋白，与介体中的CDK8、细胞周期蛋白C和MED13一起形成四亚基激酶模块，通过CDK8激酶影响其特定靶标以促进或抑制肿瘤发生。在激酶模块内，MED12直接结合细胞周期蛋白C，并且是触发细胞周期蛋白C依赖性CDK8活化所必需的。目前已经在多种肿瘤包括子宫平滑肌瘤、乳腺纤维上皮肿瘤等中发现了MED12突变，大多数突变聚集在MED12的N末端部分。然而，目前尚未见关于MED12突变及其确切的促肿瘤作用在AML中的研究报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于检测MED12基因突变的探针组。

本发明提供的用于检测MED12基因突变的探针组由探针1-探针48组成：

所述探针1为序列表中序列1所示的单链DNA分子；

所述探针2为序列表中序列2所示的单链DNA分子；

所述探针3为序列表中序列3所示的单链DNA分子；

所述探针4为序列表中序列4所示的单链DNA分子；

所述探针5为序列表中序列5所示的单链DNA分子；

所述探针6为序列表中序列6所示的单链DNA分子；

所述探针7为序列表中序列7所示的单链DNA分子；

所述探针8为序列表中序列8所示的单链DNA分子；

所述探针9为序列表中序列9所示的单链DNA分子；

所述探针10为序列表中序列10所示的单链DNA分子；

所述探针11为序列表中序列11所示的单链DNA分子；

所述探针12为序列表中序列12所示的单链DNA分子；

所述探针13为序列表中序列13所示的单链DNA分子；

所述探针14为序列表中序列14所示的单链DNA分子；

所述探针15为序列表中序列15所示的单链DNA分子；

所述探针16为序列表中序列16所示的单链DNA分子；

所述探针17为序列表中序列17所示的单链DNA分子；

所述探针18为序列表中序列18所示的单链DNA分子；

所述探针19为序列表中序列19所示的单链DNA分子；

所述探针20为序列表中序列20所示的单链DNA分子；

所述探针21为序列表中序列21所示的单链DNA分子；

所述探针22为序列表中序列22所示的单链DNA分子；

所述探针23为序列表中序列23所示的单链DNA分子；

所述探针24为序列表中序列24所示的单链DNA分子；

所述探针25为序列表中序列25所示的单链DNA分子；

所述探针26为序列表中序列26所示的单链DNA分子；

所述探针27为序列表中序列27所示的单链DNA分子；

所述探针28为序列表中序列28所示的单链DNA分子；

所述探针29为序列表中序列29所示的单链DNA分子；

所述探针30为序列表中序列30所示的单链DNA分子；

所述探针31为序列表中序列31所示的单链DNA分子；

所述探针32为序列表中序列32所示的单链DNA分子；

所述探针33为序列表中序列33所示的单链DNA分子；

所述探针34为序列表中序列34所示的单链DNA分子；

所述探针35为序列表中序列35所示的单链DNA分子；

所述探针36为序列表中序列36所示的单链DNA分子；

所述探针37为序列表中序列37所示的单链DNA分子；

所述探针38为序列表中序列38所示的单链DNA分子；

所述探针39为序列表中序列39所示的单链DNA分子；

所述探针40为序列表中序列40所示的单链DNA分子；

所述探针41为序列表中序列41所示的单链DNA分子；

所述探针42为序列表中序列42所示的单链DNA分子；

所述探针43为序列表中序列43所示的单链DNA分子；

所述探针44为序列表中序列44所示的单链DNA分子；

所述探针45为序列表中序列45所示的单链DNA分子；

所述探针46为序列表中序列46所示的单链DNA分子；

所述探针47为序列表中序列47所示的单链DNA分子；

所述探针48为序列表中序列48所示的单链DNA分子。

上述探针组中，每条所述探针的5’端均标记生物素。

本发明的另一个目的是提供用于检测MED12基因突变的试剂盒。

本发明提供的用于检测MED12基因突变的试剂盒包括上述探针组。

进一步的，所述试剂盒还可包括构建文库所需的试剂和/或PCR扩增所需试剂。所述构建文库所需的试剂具体可包括末端修复所需试剂、加A尾所需试剂。所述PCR扩增所需试剂具体可为KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)试剂盒(KAPA，KK2602)中的试剂。

更进一步的，所述试剂盒还可包括基因组DNA提取所需试剂和/或纯化试剂。

本发明还有一个目的是提供上述探针组或上述试剂盒或检测MED12基因是否发生突变的物质的新用途。

本发明提供了上述探针组或上述试剂盒在检测或辅助检测待测样本中MED12基因突变或变异中的应用。

本发明还提供了上述探针组或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样本中MED12基因突变或变异的产品中的应用。

本发明还提供了上述探针组或上述试剂盒在检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病中的应用。

本发明还提供了上述探针组或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病的产品中的应用。

本发明还提供了检测MED12基因是否发生突变的物质在诊断或辅助诊断急性髓系白血病中的应用。

本发明还提供了检测MED12基因是否发生突变的物质在制备诊断或辅助诊断急性髓系白血病的产品中的应用。

本发明还提供了检测MED12基因是否发生突变的物质在检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病中的应用。

本发明还提供了检测MED12基因是否发生突变的物质在制备检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病的产品中的应用。

MED12基因作为靶标在急性髓系白血病诊断中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还有一个目的是提供检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病的产品。

本发明提供的检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病的产品包括检测MED12基因是否发生突变的物质。

上述应用或产品中，所述检测MED12基因是否发生突变的物质为上述探针组。

上述应用或产品中，若待测患者MED12基因发生突变或变异，则待测患者患有或候选患有急性髓系白血病。所述突变或变异的类型具体可为下述实施例的表2中所示。

本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本中MED12基因突变或变异的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测样本中MED12基因突变或变异的方法包括如下步骤：

1)将待测样本的基因组DNA进行片段化后，构建gDNA文库；

2)用上述探针组与所述gDNA文库杂交，得到杂交产物；

3)对所述杂交产物进行测序，根据测序结果分析待测样本中MED12基因的突变或变异情况。

上述方法中，所述1)中，所述片段化为将基因组DNA打断成长度为200-300bp的片段。

所述gDNA文库的构建方法可按照如下步骤进行：将片段化的DNA片段进行末端修复；然后将“A”碱基加入到DNA片段的3’末端；最后在DNA片段两端分别连接上带有特异index的接头，得到连接产物；纯化连接产物，并对纯化后的连接产物进行PCR扩增，得到带有特异index的DNA文库。

所述2)中，所述探针组中的各探针的摩尔量相同。

所述2)或所述3)之间还包括如下步骤：使用带链霉素的磁珠捕获杂交产物中的目的DNA片段，并采用KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)试剂盒对捕获的DNA片段进行PCR线性扩增，扩增产物经质检合格后即可进行测序。

所述3)中，所述测序为利用Illumina HiSeq平台进行PE150测序。

上述探针组或试剂盒或应用或产品中，所述MED12基因突变可为MED12体细胞突变和MED12胚系突变。所述MED12基因突变包括单个核苷酸变异、小片段***缺失和拷贝数变异。

上述探针组或试剂盒或应用或产品中，所述待测样本可为来源于待测患者的外周血或骨髓。

上述探针组或试剂盒或应用或产品中，所述MED12基因序列如序列表的序列49所示，所述MED12基因编码区序列为序列49第160-6693位所示，所述MED12基因编码的蛋白的氨基酸序列的Genbank号为NP_005111。

上述探针组或试剂盒或应用或产品中，所述MED12基因突变或变异具体可为如下(1)-(6)中的至少一种：

(1)野生型MED12基因(序列表的序列49第160-6693位所示)第603位核苷酸由G突变为A；

(2)野生型MED12基因(序列表的序列49第160-6693位所示)第605位核苷酸由C突变为G；

(3)野生型MED12基因(序列表的序列49第160-6693位所示)第1291位核苷酸由C突变为T；

(4)野生型MED12基因(序列表的序列49第160-6693位所示)第4111位核苷酸由C突变为T；

(5)野生型MED12基因(序列表的序列49第160-6693位所示)第6286-6288位核苷酸缺失；

(6)野生型MED12基因(序列表的序列49第160-6693位所示)第6150-6151位核苷酸中间***CAGCAGCAGCAGCAGCAA。

本发明提供了一种用于检测MED12基因突变的试剂盒，所述试剂盒不仅可用于检测肿瘤基因组层面的MED12体细胞突变和胚系突变，也可用于血液肿瘤患者，特别是急性髓系细胞白血病患者的辅助诊断、微小残留病监测和预后的评估等，且本发明试剂盒的检测方法简便、灵敏、准确，将在医学检测领域发挥重要作用。

附图说明

图1为MED12基因部分突变类型的Sanger测序验证结果。图1A为样本8794E；NM_005120(MED12):c.605C>G(p.A202G)，Exon5，C>G。图1B为样本9981C；NM_005120(MED12):c.4111C>T(p.P1371S)，Exon29，C>T。图1C为样本6124D；NM_005120(MED12):c.4111C>T(p.P1371S)，Exon42，6150_6151insCAGCAGCAGCAGCAGCAA。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、检测MED12基因突变的试剂盒及其检测方法

一、检测MED12基因突变的试剂盒

1、探针序列

本发明的用于检测MED12基因突变的试剂盒中包括48个探针序列，48个探针序列的名称及具体序列如表1所示。本发明的48条探针可覆盖MED12基因的全部编码序列。

表1、本发明的检测试剂盒中探针序列

2、目标区域检测原理

将待测样本的基因组DNA经Covaris超声破碎仪随机打断成长度为200-300bp的片段，末端修复和加A 尾后在片段两端分别连接上接头制备DNA文库。将步骤1中的探针进行生物素标记，然后将带有特异index的DNA文库与生物素标记的探针进行液相杂交，再使用带链霉素的磁珠将外显子捕获下来，经PCR线性扩增后进行文库质检，合格即可进行测序。后续利用Illumina HiSeq平台进行PE150测序，得到的测序数据利用相关生物信息学软件检出目标基因MED12突变或变异情况。

二、检测MED12基因突变的方法

(一)检测方法

1、检测样本

本实施例中的检测样本为310例来源于北京大学人民医院的急性髓系白血病(AML)患者，所有患者均经临床诊断确定，诊断标准依据世界卫生组织新的分型标准，且患者知情同意。

2、DNA样品的提取及检测

分别提取上述患者的骨髓的基因组DNA，并对DNA样品进行检测。检测主要包括3种方法：

1)毛细管电泳分析DNA降解程度；

2)Nanodrop检测DNA的纯度(OD260/OD280比值)；

3)Qubit对DNA浓度进行精确定量。

其中OD260/OD280值在1.8～2.0之间，DNA浓度≥20ng/μL，总量1μg以上的DNA样品被用来建库。

3、文库构建及目标基因捕获

(1)对基因组DNA进行片段化处理，将基因组DNA经Covaris超声破碎仪随机打断成长度为200-300bp的片段；

(2)对步骤(1)获得的片段化的双链DNA进行末端修复；然后将“A”碱基加入到DNA片段的3’末端；最后在DNA片段两端分别连接上带有特异index的接头，得到连接产物；纯化连接产物以除去未连接的接头序列，采用KAPA HiFi HotStartReadyMix(2X)试剂盒(KAPA，KK2602)对纯化后的连接产物进行PCR扩增，并纯化PCR产物，得到带有特异index的DNA文库；

(3)将表1中的各探针均进行生物素标记，得到生物素标记的探针。然后将带有特异index的DNA文库与生物素标记的探针进行液相杂交，捕获目的DNA片段；

(4)使用带链霉素的磁珠(Dynabeads^TM M-270Streptavidin，Invitrogen，65305)捕获杂交的目的DNA片段并分离纯化(Ampure XP beads，Beckman，A63882)，除去未结合的DNA片段；

(5)采用KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)试剂盒(KAPA，KK2602)对捕获的DNA片段进行PCR扩增，并纯化PCR产物。

4、文库质检

文库构建完成后进行质量检测：先使用Qubit 4.0进行初步定量，随后使用Agilent2100对文库的Insert size进行检测，Insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。

5、上机测序

库检合格后，根据文库的有效浓度及数据产出需求进行Illumina HiSeq PE150测序。PE150(Pair end 150bp)为高通量双端测序，每端各测150bp。在构建的小片段文库中***DNA，即***片段是高通量测序直接测序的片段。双端测序是将每条***片段的两端进行测序的方法。

6、生物信息分析流程

测序结束获得原始测序序列(Raw Data)后，进入信息分析流程，流程可概括为三个主要阶段：

1)测序数据质量控制：主要通过对测序质量、测序错误率、数据量、比对率、覆盖率等进行统计，评估测序数据是否达到了质控标准，符合标准则进行后续的分析；

2)变异检测：将高质量的序列比对到人参考基因组(GRCH37)上，对比对数据进行质量校正和去除duplication，然后检测样本中的变异信息。利用GATK软件检测Germline胚系突变，利用MuTect2软件检测Somatic SNV以及Indel；

3)变异注释和过滤：采用Annovar软件对检测变异进行注释，包括基因、HGVS、人群频率、变异类型等。此外，需要对检出的变异进行过滤，保留对蛋白有影响(如错义突变，移码突变等)且在正常人群位点突变频率<1％的位点。

(二)检测结果

310例急性髓系白血病(AML)患者中共检出MED12基因突变型患者7例，突变检出率为2.3％(7/310)。

7例MED12突变阳性患者的具体突变情况如下：

1例：与野生型MED12基因的编码区(序列表的序列49第160-6693位)的区别在于：第603位核苷酸由G突变为A。与野生型MED12蛋白的区别在于：第201位氨基酸由M突变为I；

1例：与野生型MED12基因的编码区(序列表的序列49第160-6693位)的区别在于：第605位核苷酸由C突变为G。与野生型MED12蛋白的区别在于：第202位氨基酸由A突变为G；

1例：与野生型MED12基因的编码区(序列表的序列49第160-6693位)的区别在于：第1291位核苷酸由C突变为T。与野生型MED12蛋白的区别在于：第431位氨基酸由R突变为W；

1例：与野生型MED12基因的编码区(序列表的序列49第160-6693位)的区别在于：第4111位核苷酸由C突变为T。与野生型MED12蛋白的区别在于：第1371位氨基酸由P突变为S；

2例：与野生型MED12基因的编码区(序列表的序列49第160-6693位)的区别在于：第6286-6288位核苷酸缺失。与野生型MED12蛋白的区别在于：第2096位氨基酸缺失；

1例：与野生型MED12基因的编码区(序列表的序列49第160-6693位)的区别在于：第6150-6151位之间***CAGCAGCAGCAGCAGCAA。与野生型MED12蛋白的区别在于：第2050位氨基酸由E突变为EQQQQQQ。

表2展示了7例MED12基因突变检出详情。

表2、MED12基因在7个AML样本中检出突变情况

对上述7例突变患者所涉及的3种突变类型进行了Sanger测序验证。测序结果如图1所示。测序结果表明：本发明方法得到的检测结果与Sanger测序法得到的结果完全一致。说明本发明得到的MED12基因突变检测结果是正确的。

上述结果表明：本发明的探针组可以有效检测出待测样本中的MED12基因突变情况，在急性髓系白血病诊断中可发挥重要作用。

Claims (10)

1.用于检测MED12基因突变的探针组，其由探针1-探针48组成：

所述探针1为序列表中序列1所示的单链DNA分子；

所述探针2为序列表中序列2所示的单链DNA分子；

所述探针3为序列表中序列3所示的单链DNA分子；

所述探针4为序列表中序列4所示的单链DNA分子；

所述探针5为序列表中序列5所示的单链DNA分子；

所述探针6为序列表中序列6所示的单链DNA分子；

所述探针7为序列表中序列7所示的单链DNA分子；

所述探针8为序列表中序列8所示的单链DNA分子；

所述探针9为序列表中序列9所示的单链DNA分子；

所述探针10为序列表中序列10所示的单链DNA分子；

所述探针11为序列表中序列11所示的单链DNA分子；

所述探针12为序列表中序列12所示的单链DNA分子；

所述探针13为序列表中序列13所示的单链DNA分子；

所述探针14为序列表中序列14所示的单链DNA分子；

所述探针15为序列表中序列15所示的单链DNA分子；

所述探针16为序列表中序列16所示的单链DNA分子；

所述探针17为序列表中序列17所示的单链DNA分子；

所述探针18为序列表中序列18所示的单链DNA分子；

所述探针19为序列表中序列19所示的单链DNA分子；

所述探针20为序列表中序列20所示的单链DNA分子；

所述探针21为序列表中序列21所示的单链DNA分子；

所述探针22为序列表中序列22所示的单链DNA分子；

所述探针23为序列表中序列23所示的单链DNA分子；

所述探针24为序列表中序列24所示的单链DNA分子；

所述探针25为序列表中序列25所示的单链DNA分子；

所述探针26为序列表中序列26所示的单链DNA分子；

所述探针27为序列表中序列27所示的单链DNA分子；

所述探针28为序列表中序列28所示的单链DNA分子；

所述探针29为序列表中序列29所示的单链DNA分子；

所述探针30为序列表中序列30所示的单链DNA分子；

所述探针31为序列表中序列31所示的单链DNA分子；

所述探针32为序列表中序列32所示的单链DNA分子；

所述探针33为序列表中序列33所示的单链DNA分子；

所述探针34为序列表中序列34所示的单链DNA分子；

所述探针35为序列表中序列35所示的单链DNA分子；

所述探针36为序列表中序列36所示的单链DNA分子；

所述探针37为序列表中序列37所示的单链DNA分子；

所述探针38为序列表中序列38所示的单链DNA分子；

所述探针39为序列表中序列39所示的单链DNA分子；

所述探针40为序列表中序列40所示的单链DNA分子；

所述探针41为序列表中序列41所示的单链DNA分子；

所述探针42为序列表中序列42所示的单链DNA分子；

所述探针43为序列表中序列43所示的单链DNA分子；

所述探针44为序列表中序列44所示的单链DNA分子；

所述探针45为序列表中序列45所示的单链DNA分子；

所述探针46为序列表中序列46所示的单链DNA分子；

所述探针47为序列表中序列47所示的单链DNA分子；

所述探针48为序列表中序列48所示的单链DNA分子。

2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于：每条所述探针的5’端均标记生物素。

3.用于检测MED12基因突变的试剂盒，其包括权利要求1或2所述的探针组。

4.权利要求1或2所述的探针组或权利要求3所述的试剂盒在检测或辅助检测待测样本中MED12基因突变或变异中的应用；

或，权利要求1或2所述的探针组或权利要求3所述的试剂盒在制备检测或辅助检测待测样本中MED12基因突变或变异的产品中的应用。

5.权利要求1或2所述的探针组或权利要求3所述的试剂盒在检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病中的应用；

或，权利要求1或2所述的探针组或权利要求3所述的试剂盒在制备检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病的产品中的应用。

6.MED12基因作为靶标在急性髓系白血病诊断中的应用。

7.检测MED12基因是否发生突变的物质在诊断或辅助诊断急性髓系白血病中的应用；

或，检测MED12基因是否发生突变的物质在制备诊断或辅助诊断急性髓系白血病的产品中的应用；

或，检测MED12基因是否发生突变的物质在检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病中的应用；

或，检测MED12基因是否发生突变的物质在制备检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病的产品中的应用。

8.检测或辅助检测待测患者是否患有急性髓系白血病的产品，其包括检测MED12基因是否发生突变的物质。

9.根据权利要求7所述的应用或权利要求8所述的产品，其特征在于：所述检测MED12基因是否发生突变的物质为权利要求1或2所述的探针组或权利要求3所述的试剂盒。

10.一种检测或辅助检测待测样本中MED12基因突变或变异的方法，包括如下步骤：

1)将待测样本的基因组DNA进行片段化后，构建gDNA文库；

2)用权利要求1或2所述的探针组与所述gDNA文库杂交，得到杂交产物；

3)对所述杂交产物进行测序，根据测序结果分析待测样本中MED12基因的突变或变异情况。