CN117265116A - 一种tfe3融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种TFE3融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库，属于基因检测技术领域。本发明开发了基于杂交捕获特定TFE3融合基因序列的方法，采用该方法可以获得成几千倍富集的TFE3融合基因DNA片段，富集后的TFE3融合基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术，特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变检测，以取得高效且准确的结果。
Description
技术领域
本发明涉及一种TFE3融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库，属于基因测序技术领域。
背景技术
TFE3基因编码的蛋白为一种转录因子，属于MiT家族，参与生物体内多种生物学过程包括细胞的生长、DNA依赖性的转录调控、蛋白质翻译时tRNA氨基化、聚合酶PolⅡ促进剂的转录、ATP的黏结、tRNA连接酶活性以及转录因子活化等。目前TFE3基因的融合突变在肾细胞癌、血管周围上皮良性肿瘤、肺泡样软组织肉瘤、骨化性纤维黏液样肿瘤及上皮样血管内皮瘤中被报道。TFE3基因与其伴侣基因发生融合后，受到伴侣基因启动子的影响，其表达量升高，高表达后的融合蛋白通过与特异的DNA结构相结合，转录调控体内多种基因表达，最终会导致癌症的发生。
TFE3基因融合突变具有较大的异质性，肺泡样软组织肉瘤、骨化性纤维黏液样肿瘤及上皮样血管内皮瘤中该基因的融合伴侣异质性小，肺泡样软组织肉瘤中常见ASPSCR1-TFE3融合，上皮样血管内皮瘤中常见YAP1-TFE3，骨化性纤维黏液样肿瘤中常见PHF1-TFE3。而在血管周围上皮良性肿瘤和肾细胞癌中TFE3基因的融合伴侣异质性较大，目前已报道的融合基因就包括ASPL-TFE3、PRCC-TFE3、CLTC-TFE3、SFPQ-TFE3、NONO-TFE3、RBM10-TFE3、MED15-TFE3和EWSR1-TFE3等十几种。此外该基因即使与同一个基因发生融合，也可能存在多个断裂位点。例如，TFE3可能在第5外显子或6号外显子与NONO基因发生融合。有研究报道血管内皮生长因子受体(VEGFR)或哺乳动物雷帕霉素(mTOR)分子靶向治疗对具有该类型融合突变的肿瘤患者敏感。另有研究表明，MET酪氨酸激酶为ASPL-TFE3融合基因的靶基因，并有望成为Xp11.2易位性肿瘤的治疗靶点。因此，精确的检测并区分TFE3不同的融合亚型和断裂位点，不仅可以作为患者用药治疗的依据，同时能够不断完善这类肿瘤的分子致病机制，为相应靶向药物开发和实验提供基础，具有重要的临床意义。
目前常用的TFE3融合检测方法为免疫组织化学(IHC)和荧光原位杂交(FISH)，IHC检测结果较为直观，但结果依靠主观判断，容易出现假阳性或假阴性。FISH检测根据荧光探针颜色位置进行判定，仅能检测已知的融合类型，对于染色体内微小倒位常规难以检出。这两种传统的检测技术均不能检测罕见的融合类型以及明确断裂位点。利用NGS检测融合的优势在于，NGS技术不仅能够检测出目前报道的各种TFE3基因融合形式，还能够检出未报道的融合类型，明确伴侣基因；此外NGS技术可以进行不同样本类型的检测，除了组织样本外，同时可以利用血浆等体液样本进行融合检测，其检测灵敏度也远高于目前传统检测技术。
发明内容
本发明的目的是：提供一种用于检测TFE3融合基因的探针库，利用本发明的探针库可以较好地检测到TFE3融合基因，应用于二代测序过程中，能够具有高覆盖率、测序深度均一性好、灵敏度高的优点。
一种TFE3融合基因突变的探针库，其中包括有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～105所示的任意一条探针，或者与其具有相同功能的探针。
优选的：探针库中包括上述的全部探针。
优选的：所述的具有相同功能的探针，是指将SEQ ID NO.1～105任意一条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同杂交捕获功能的探针。
优选的：所述的具有相同功能的探针与原探针具有80％以上相同的碱基，更优选是90％以上相同碱基，再优选是95％以上相同碱基。
本发明提供一种检测TFE3融合基因的方法，所述方法包括以下步骤：
1)获得受试者的DNA样本库；
2)获得所述的检测TFE3融合基因突变的探针；
3)使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交；
4)分离步骤3)的杂交产物，然后释放经杂交富集的TFE3融合基因DNA片段；
5)通过高通量测序的方法对TFE3融合基因DNA片段进行检测。
其中，所述步骤1)中的DNA样本库由双链DNA片段组成，并且，所述步骤1)包括：
1-1)提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者
1-2)提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA；
其中，所述受试者为哺乳动物，优选人，且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA。
优选地，所述DNA片段的长度为150～600bp；
进一步优选地，所述DNA片段的长度为150～200bp。
一种检测TFE3融合基因的试剂盒，包括有上述的探针库。
有益效果
本发明开发了基于杂交选择而捕获特定TFE3融合基因序列的方法，采用该方法可以获得成几千倍富集的TFE3融合基因DNA片段，该经富集的TFE3融合基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术，特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测，以取得高效且准确的结果，对相关症状的后续治疗提供有意义的理论及临床指导。
附图说明
图1为本发明技术方案的示例性工艺流程图，其中富集得到目标基因群，并用于基于下一代测序技术的基因融合检测。
图2为本发明的外显子临近内含子探针设计示意图。
图3是内含子区域探针设计与传统探针设计测序结果对比图。
图4是外显子临近内含子设计与传统探针设计测序结果对比图。
具体实施方式
在本文中所使用的术语“DNA”为脱氧核糖核酸(英文：Deoxyribonucleicacid，缩写为DNA)是一种由脱氧核糖核苷酸组成的双链分子。可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运行，其碱基排列顺序构成了遗传信息，所以在遗传病的诊断中具有重要的作用。
在本文中所使用的术语“高通量测序技术”指的是第二代高通量测序技术及之后发展的更高通量的测序方法。第二代高通量测序平台包括但不限于Illumina-Solexa(Miseq、Hiseq-2000、Hiseq-2500、Hiseq X ten等)、ABI-Solid和Roche-454测序平台等。随着测序技术的不断发展，本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他方法的测序方法和装置进行本检测。根据本发明的具体示例，可以将根据本发明实施例的核酸标签用于Illumina-Solexa、ABI-Solid和Roche-454测序平台等的至少一种进行测序。高通量测序技术，例如Miseq测序技术具有以下优势：(1)高灵敏度：高通量测序，例如Miseq的测序通量大，目前一个实验流程下来可以产生最多15G碱基数据，高的数据通量可以再测序序列数确定的情况下，使得每条序列获得高的测序深度，所以可以检测到含量更低的突变，同时因其测序深度高，其测序结果也更为可靠。(2)高通量，低成本：利用根据本发明实施例的标签序列，通过一次测序可以检测上万份样本，从而大大降低了成本。
本发明中的“突变”、“核酸变异”、“基因变异”可通用，本发明中的“SNP”(SNV)、“CNV”、“***缺失”(indel)和“结构变异”(SV)同通常定义，但本发明中对各种变异的大小不作特别限定，这样这几种变异之间有的有交叉，比如当***/缺失的为大片段甚至整条染色体时，也属于发生拷贝数变异(CNV)或是染色体非整倍性，也属于SV。这些类型变异的大小交叉并不妨碍本领域人员通过上述描述执行实现本发明的方法和/或装置并且达到所描述的结果。
本发明提供一种富集TFE3融合基因片段的方法。具体而言，本发明的方法包括：从哺乳动物例如人的细胞、体液或组织样本中提取基因组DNA或mRNA，经处理或合成cDNA，从而获得片段化的双链DNA作为DNA样本库；此外，针对要富集的TFE3融合基因片段，设计与该TFE3融合基因杂交的DNA探针，从中筛选出多个探针作为DNA探针库；然后，将该DNA样本库与DNA探针库进行杂交，从而从DNA样本库中富集得到TFE3融合基因DNA片段。根据本发明的具体实施方式，可以先将DNA探针库中的各个探针进行生物素化，然后在杂交后用链霉亲和素磁珠吸附杂交产物，再从磁珠上释放出富集的TFE3融合基因片段。经适应性处理，可以采用下一代测序基因对TFE3融合基因片段进行基因结构突变的检测，以确认TFE3融合基因的各类突变。
TFE3基因的融合伴侣多样，目前已报道的融合伴侣基因为ASPL、PRCC、SFPQ、CLTC、PARP14及NONO等基因，且断裂位点分布于零散。目前临床常用的传统检测技术FISH及IHC很可能出现漏检，此外，传统FISH和IHC检测融合，无法判别融合伴侣基因及融合形式。而通过NGS设计DNA探针库可以一次性全面覆盖包括罕见融合伴侣、罕见断裂位点在内的TFE3基因融合。
下面以富集得到的TFE3融合基因片段用于基于下一代测序技术的基因突变检测为例，示例性地说明本发明。
一、准备mRNA/DNA样本库
1.准备基因组DNA样本(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自全基因组的DNA样本库”)
1.1DNA提取
DNA提取，包括新鲜组织，新鲜血液和细胞，固定和石蜡样本，商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳***检测DNA模板质量和浓度。DNA模板260nm吸光率大于0.05以上，吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
1.2DNA片段化
将3微克高质量的基因组DNA用低TE缓冲液稀释至120微升。按照组织匀浆机使用说明书，将DNA片段化，片段长度为150～200碱基。
DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
1.3DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析，确认DNA片段长度峰值合理。
2.准备cDNA样本(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自mRNA的DNA样本库”即cDNA样本库)
2.1mRNA提取
mRNA提取，包括新鲜组织，新鲜血液和细胞，固定和石蜡样本，商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳***检测mRNA质量和浓度，吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
2.2mRNA片段化
采用NEBNext RNA Fragmentation***或者其他商业化公司mRNA片段化试剂盒。
mRNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
2.3用商业化公司cDNA合成试剂盒进行mRNA合成第一链以及第二链cDNA。
cDNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
3.cDNA/DNA末端修补
将DNA片段进行末端修复可以利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行，其中，所述Klenow片段具有5’-3”聚合酶活性和3’-5’聚合酶活性，但缺少5’-3’外切酶活性。由此，能够方便准确地对DNA片段进行末端修复。根据本发明的实施例，还可以进一步包括对经过末端修复的DNA片段进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于cDNA/DNA 5'突出粘末端补平以及3'突出粘末端打平，产生平末端，用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行，20摄氏度，30分钟。
cDNA/DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
4.在cDNA/DNA样本3'末端加上碱基A
在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段。根据本发明的一个实施例，可以利用Klenow(3’-5’exo-)，即具有3’-5’外切酶活性的Klenow，在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A。由此，能够方便准确地将碱基A添加到经过末端修复的DNA片段的3’末端。根据本发明的实施例，还可以进一步包括对具有粘性末端A的DNA片段进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。
反应在PCR扩增仪中进行，37℃，30分钟。
cDNA/DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
5.在cDNA/DNA两端加上接头
cDNA/DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
如使用mRNA→cDNA，进行6和7；
如果是用基因组DNA，直接跳到8。
6.分离出合适长度的cDNA片段
使用电泳凝胶，对照DNA梯度标准，在凝胶上剪切出150－250碱基cDNA片段。
将含有cDNA样本库的凝胶样本过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
7.cDNA片段样本库质量检测
使用生物分析仪，进行cDNA定性定量分析，并确认分离出的cDNA片断长度峰值合理。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次(cDNA样本库)或者4－6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
8.扩增DNA模板
在本发明的一个实施例中，样本为含微量游离DNA片段的血浆样本，包含极其微量的目标游离DNA片段，第一扩增使得核酸的量能满足芯片/探针杂交捕获的需求
聚合酶链反应(PCR)，在PCR扩增仪中进行。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次(cDNA样本库)或者4－6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
9.扩增后cDNA/DNA样本库质量检测
使用生物分析仪，进行cDNA/DNA定性定量分析，并确认纯化后片段长度峰值合理，约200bp。
对于得到的cDNA/DNA样本库，如果cDNA小于30纳克/微升，DNA浓度小于150纳克/微升，须将样品经过真空浓缩机低温干燥(低于45℃)，再用无核酸酶水溶解至所需浓度。
二、探针的设计
针对TFE3融合基因准备DNA探针库。
本领域技术人员知晓：捕获的特异性受各种因素影响，如捕获探针的设计不佳，捕获条件不理想，基因组DNA中重复序列的封闭不充分及基因组DNA与捕获探针的比例不合适等因素都会影响捕获的特异性、敏感性、测序覆盖率等诸多结果。为了实现目标基因的高度富集和低脱靶率，本领域技术人员需要对探针的类型、长度、序列、杂交条件等进行大量实验摸索，需要通过创造性的探索工作才能够获得最佳的参数组合，没有在相应的证据证明下，其是否能够达到相同的效果，是本领域技术人员无法预期的。同时，对于产生突变的样本进行检测时，由于突变样本在组织样本中所占的比例会因个体而不同，因此，如果突变样本的丰度较低时，较容易导致的问题是探针往往无法准确地与突变的片断杂交，而导致检测的灵敏度低，这也需要对探针序列进行试验进行摸索。
另外，探针捕获测序中探针的特异性和均一性与捕获后的测序质量密切相关：探针特异性过低可导致捕获大量无效区域，大量非目标区域的DNA序列被捕获测序，产生大量无效测序数据，浪费测序成本，而探针特异性过高可导致杂交错配容忍度低，在捕获测序中我们需要研究目标DNA片段中发生的突变、***/缺失、融合等突变类型，对探针的杂交错配容忍度有一定要求，杂交错配容忍度低可能导致突变后的DNA序列无法捕获，导致突变漏检，导致假阴性结果；探针均一性差可导致不同区域DNA序列捕获效果差异显著，部分目标区域捕获效果较好，具有合格甚至过度的测序覆盖，部分目标区域捕获效果较差，测序覆盖较浅甚至不覆盖，引起部分区域漏检，导致假阴性结果。因此在探针设计过程中需要开展大量摸索试验，设计出特异性适中以及高度均一性的探针库。
除了所有基因探针设计涉及共性因素外，TFE3融合基因自身的特征导致了其探针设计的过程需要进行更多的考量：TFE3基因即使与同一个基因发生融合，也可能存在多个断裂位点。例如，TFE3可能在第5外显子或6号外显子，可以与NONO基因发生融合。因此，在探针设计的时候，充分参考了大量已知文献报道，对于TFE3基因常见及罕见融合发生的断裂位置进行全外显子以及重要内含子覆盖，确保各种类型及不同位点的融合发生时都可以成功捕获。
使用每个探针分别对全基因组进行了富集和扩增并根据结果进行筛选。通过IDTDNA Technologies，单独合成了每一个探针并用质谱分析保证质量，在5’端有生物素(Biotin)。
三、DNA捕获探针杂交
1.将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将cDNA/DNA样本库与杂交缓冲液混合，反应条件为95℃5分钟，之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后将该混合物与探针库混合，反应条件为65℃5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中，65℃孵育24小时。
四、得到经杂交富集的TFE3融合基因片段
1.准备链霉亲和素(Streptavidin-Coated)磁珠
使用Dynabeads链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀，每个样本需要50微升磁珠。
磁珠洗涤：混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液，在混匀仪上混匀，使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠与缓冲液分离纯化，缓冲液弃掉不用。重复三次，每次加入200微升结合缓冲液。
2.分离杂交产物
混合1中的杂交反应混合物与2中的链霉亲和素磁珠，反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。
然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液，在65℃孵育10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。
以上步骤重复三次。
3.cDNA/DNA富集样本释放
将磁珠与50微升洗脱缓冲液混合，室温孵化10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的TFE3融合基因片段cDNA/DNA样本库。
将样本库过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
五、PCR扩增与纯化
因杂交捕获会损耗一定量的核酸，第二扩增能使捕获下的目标片段获得再次扩增以满足上机测序和质控检测的要求。本发明的这一文库构建方法特别适用于总游离核酸不低于10ng或者常规组织基因组DNA不低于1μg的样本的测序文库构建。
将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增，为测序仪器上样做准备。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次(cDNA样本库)或者4－6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
六、采用下一代测序技术检测TFE3融合基因的突变
使用下一代商业化的测序仪器进行测序，如Roche 454、Illumina Hiseq等。测序结果用已有的测序软件分析包进行分析。
示例性地，使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS，使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增：每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇，每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用Illumina HiSeq2000下一代测序***。和传统Sanger方法相比，利用“可逆性末端终结反应”技术，四种dNTP碱基末端被保护基团封闭，并分别以不同颜色荧光标记。
经过QC筛选后，对测序结果使用了Bowtie对所得片段进行序列映射，利用Bioconductor软件，成功映射片段进行突变分析。
实施例1富集并检测TFE3融合基因
一、构建样本库
1.DNA的提取
按照常规的组织样本的DNA提取方法提取样本DNA。
2.DNA片段化
按照DNA破碎仪使用说明书，将DNA样本片段化，使片段长度为150-200碱基。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号：A63880)将DNA过柱纯化。
3.DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析，确认DNA片段长度峰值合理。
4.DNA末端修补
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于cDNA/DNA 5'突出粘末端补平以及3'突出粘末端打平，产生平末端，用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行，20摄氏度，30分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号：A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
5.在DNA样本3'末端加上碱基A
反应在PCR扩增仪中进行，37℃，30分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号：A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
6.在DNA两端加上接头
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号：A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。7.扩增6获得的DNA片段样本库
聚合酶链反应(PCR)，在PCR扩增仪中进行。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次(cDNA样本库)或者4～6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号：A63880)将PCR扩增产物过柱纯化。8.扩增后DNA样本库的质量检测
使用生物分析仪，进行DNA定性定量分析，并确认纯化后片段长度峰值合理，约200bp。
对于得到的DNA样本库，如果DNA浓度小于150纳克/微升，须将样品经过真空浓缩机低温干燥(低于45℃)，再用无核酸酶水溶解至所需浓度。
二、针对TFE3融合基因准备DNA探针库
根据上述的探针设计方法和思路，设计并合成探针进行试验，在5’端有生物素(Biotin)。三、将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将DNA样本库与杂交缓冲液(10mM Tris-HCl,2％牛血清白蛋白,pH8.0)混合(混合后，DNA样本库浓度至多不超过50ng/ul)，反应条件为95℃5分钟，之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后以DNA样本库：探针库为1:100的摩尔比，将探针库加入上述混合物，反应条件为65℃5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中，65℃孵育24小时。
四、得到经杂交富集的TFE3融合基因片段
1.准备链霉亲和素磁珠
使用Dynabeads(Life technologies,货号：11206D)链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀。
磁珠洗涤：混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液(10mM Tris-HCl,2％牛血清白蛋白,pH8.0)，在混匀仪上混匀，使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠与缓冲液分离纯化，缓冲液弃掉不用。重复三次，每次加入200微升结合缓冲液。
2.分离杂交产物
混合步骤三中得到的杂交反应混合物与步骤四的1中得到的链霉亲和素磁珠，反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。
然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液(磷酸缓冲液，0.1％ Tween-20,0.1％SDS,pH7.4)，在65℃孵育10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。以上步骤重复三次。
3.DNA富集样本释放
将磁珠与50微升洗脱缓冲液(10mM氢氧化钠溶液)混合，室温孵化10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的TFE3融合基因片段DNA样本库。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号：A63880)将样本库过柱纯化。
五、PCR扩增与纯化
将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增，为测序仪器上样做准备。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次(cDNA样本库)或者4－6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号：A63880)将PCR扩增产物过柱纯化。六、采用下一代测序技术检测TFE3融合基因的基因结构突变
使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS，使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增：每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇，每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用Illumina HiSeq2000下一代测序***，其原理是边合成边测序。和传统Sanger方法相比，利用“可逆性末端终结反应”技术，四种dNTP碱基末端被保护基团封闭，并分别以不同颜色荧光标记。
根据以上方法，采用不同探针进行测试结果如下：
一、不同探针长度检测数据对比
探针长度对检测的特异性和中靶率影响较大，因此，我们设计了5种不同长度的探针，探针长度分别是80bp、100bp、120bp、140bp和160bp，使用上述探针分别进行NGS捕获测序，并对测序数据进行质控，通过中靶率、目标区域覆盖率及经济性来确定不同探针长度对测序结果的影响。具体质控结果见下表：
根据上述测序结果可以看出，120bp的探针中靶率和目标区域覆盖率显著高于80bp和100bp的探针。继续增加探针长度至140bp和160bp时，中靶率和目标区域覆盖率未见明显提高，然而探针长度的增加势必会引起探针合成成本的提高，综合考虑选用了120bp长度探针。
二、不同探针overlap长度对比
相邻探针间的相连方式可能与探针覆盖均一性相关，因此我们设计了三种相连形式，分别为10bp gap、5bp overlap和20bp overlap，捕获后进行NGS测序，质控结果如下：
相邻探针间存在5bp overlap相比于10bp gap时50％覆盖率显著升高，与20bpoverlap无显著差异，综合考虑选用了5bp overlap。
三、检测灵敏度的验证
现有技术中，对于融合基因检测存在着检测灵敏度不高的问题，通常灵敏度为约为10％以上，因此如何提高检测灵敏度是一个亟需解决的问题。
针对SFPQ-TFE3融合突变构建了突变型和野生型的质粒，按照突变型在野生型中拷贝数比例混合而不同丰度的样品，采用上述的探针库进行捕获、测序考察灵敏性，将SEQIDNO.106-107的探针作为SEQ ID NO.84探针的对照，考察检测灵敏度，每个样本重复测试3次，结果如下：
从表中可以看出，本发明提供的检测探针库和检测方法能够对低丰度的样本也具有较好的检测灵敏度，能够达到0.5％左右的检测灵敏度水平。
四、探针检测准确性验证
采用优化后的探针库分别对9例经过FISH和IHC检测TFE3融合均阳性的患者肿瘤组织样本进行TFE3基因融合检测，并通过本发明优选的探针和方法进行测序，结果中显示，通过本发明提供的检测探针库和检测方法能够较好地对TFE3基因融合进行检测，并且检测结果与FISH和IHC检测结果相同，证明了本方法的可靠性，同时通过NGS检测能够明确融合伴侣基因及具体融合形式。
综上可以看出，本发明的检测试剂盒可以有效地对TFE3融合基因进行检测。
Claims (6)
1.一种TFE3家族的融合基因突变的探针库，其特征在于，其中包括有核苷酸序列如SEQID NO.1～105所示的全部探针。
2.一种检测TFE3融合基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)获得受试者的DNA样本库；
2)获得所述的检测TFE3融合基因突变的探针；
3)使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交；
4)分离步骤3)的杂交产物，然后释放经杂交富集的TFE3融合基因DNA片段；
5)通过高通量测序的方法对TFE3融合基因DNA片段进行检测。
3.根据权利要求2所述的检测TFE3融合基因的方法，其特征在于，所述步骤1)中的DNA样本库由双链DNA片段组成，并且，所述步骤1)包括：1-1)提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者1-2)提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA；其中，所述受试者为哺乳动物，优选人，且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA。
4.根据权利要求2所述的检测TFE3融合基因的方法，其特征在于，所述DNA片段的长度为150～600bp。
5.根据权利要求2所述的检测TFE3融合基因的方法，其特征在于，所述DNA片段的长度为150～200bp。
6.一种检测TFE3融合基因的试剂盒，包括有权利要求1所述的探针库。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311339578.5A CN117265116A (zh) | 2023-10-16 | 2023-10-16 | 一种tfe3融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311339578.5A CN117265116A (zh) | 2023-10-16 | 2023-10-16 | 一种tfe3融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库 |
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