CN111748621A - 一种检测肺癌相关41基因的探针库、试剂盒及其应用 - Google Patents
一种检测肺癌相关41基因的探针库、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种检测肺癌相关41基因的探针库、试剂盒及其应用,所述探针库包括有肺癌相关41基因捕获探针,所述肺癌相关41基因捕获探针为1464条,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1~1464所示,将所述探针库应用于下一代测序技术中,可同时高通量地对肺癌相关41基因进行检测,具有覆盖率高、准确性高等优点。所述探针库的检测基因纳入了41个与肺癌治疗敏感性、抗拒性、毒副反应相关的基因,其检测结果能够直接对肺癌治疗疗效和毒性反应进行预先评估,可帮助筛选出合适的药物和治疗方案,有助于医生进行治疗决策和患者的合理用药,同时,也可为未来的药物开发和提高治疗的精确性提供基本突变谱资料和检测策略。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种检测肺癌相关41基因的探针库、试剂盒及其应用。
背景技术
肺癌是我国发病率最高的肿瘤,肺癌的治疗方法有手术、化疗、放疗、靶向治疗,如何为每个患者选择最合适的治疗方法是决定肺癌治疗效果的关键,随着对肺癌发生、发展、耐药等分子机制的广泛研究,人们对肺癌发生发展在基因层面有了广泛和较为深入的认识,越来越多的针对各种特定基因突变人群的分子靶向药物已经或正在进入临床。基因检测在肺癌治疗决策起到越来越重要的作用。目前已有靶向药物的基因有十余个,还有针对数十个基因的药物正处于临床研发阶段,检测这些基因的突变情况对肺癌的治疗具有重要的临床意义。另外,由于肺癌细胞的复杂性和抑制性,检测肺癌相关基因的突变对于肺癌的研究也具有十分重要的意义,例如可根据基因突变数据进行新的药物靶点和精准治疗方案的研究。
目前,Sanger测序技术作为主要的基因测序工具在PCR产物、基因分型方面发挥重要作用。然而由于技术原理的限制Sanger测序的灵敏度通常只有10%,对于异质性高、肿瘤细胞含量不确定的肿瘤临床样品,Sanger测序技术远远不能满足肿瘤基因检测的需要。同时,由于Sanger测序技术对电泳分离技术的依赖,很难实现低成本、高通量、自动化检测。
下一代基因测序技术(NGS)的发展已经彻底改变了肿瘤基因的临床检测。相对于传统的Sanger测序或者PCR方法,NGS可以实现同时多基因(数十至数百个基因的全外显子区域)、多样本(上千样本量)、精细化(分辨度到每个碱基)的检测,因此能够相对便宜和快速地进行基因突变分析,对推进和实现精准医疗奠定了技术基础。利用基于NGS的高通量靶向测序技术对肺癌相关的数十个基因进行精细准确的测序(Gene-Panel Sequencing),可为肺癌相关基因检测提供更为高效、高通量、低成本的检测技术方法,并能够在一次检测中获得全面的基因数据,对于标本量非常有限的临床样本有非常重要的意义。
也有已公开专利使用PCR方法来检测肺癌EGFR基因突变,例如专利“一种用于检测EGFR基因突变的探针、引物、检测体系及试剂盒”(CN 105349654 A)。但是,该专利所用的多重PCR仅限定在EGFR基因部分外显子上的部分突变位点上,而这明显不能覆盖与肺癌治疗相关的足够基因遍布,因此该专利在使用上有较大局限。
现阶段研究结果表明,与肺癌治疗敏感性、抗拒性、毒副反应相关的基因有41个,具体为AKT1,ALK,ATM,BRAF,CCND1,CDK4,CDK6,CDKN2A,CTNNB1,DDR2,EGFR,ERBB2,FBXW7,FGFR1,FGFR2,FGFR3,FLT3,GNA11,GNAQ,GNAS,HRAS,JAK2,JAK3,KEAP1,KIT,KRAS,MAP2K1,MET,MYC,NFE2L2,NRAS,NTRK1,PDGFRA,PIK3CA,PTEN,RET,ROS1,STK11,TERT,TP53,VHL。这些基因均为CFDA批准治疗肺癌的药物靶向基因或者处于临床试验阶段肺癌治疗药物靶向基因,或者已被证实与肺癌的耐药或者预后密切相关的基因,如EGFR、ALK、ROS1、ERBB2、MET、RET、NTRK1、BRAF等基因为与分子靶向药物敏感性相关的基因;如KRAS、TP53等基因为与耐药和不良预后相关的基因;如编码周期蛋白的CDKN2A、激活mTOR信号通路的STK11、鳞癌中突变频率高达20%的与肿瘤生成和进展相关的FGFR1、激活PI3K-AKT-mTOR信号通路的PTEN、与细胞生长和增殖有关编码血小板源性生长因子受体α的PDGFRA、RAS-RAF-MEK通路重要成员MAP2K1、PIK3CA等基因所对应的药物也已处于研发或者临床试验阶段。通过对这些基因进行检测,可帮助筛选出合适的药物和治疗方案,有助于医生进行治疗决策和患者的合理用药,同时也可为未来的药物开发和提高治疗的精确性提供基本突变谱资料和检测策略。
因此,开发一种可同时高通量对肺癌相关的上述41个基因进行检测的探针库和试剂盒就具有了十分重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种检测肺癌相关41基因的探针库,利用本发明所述探针库能够较好地对肺癌相关41基因进行杂交捕获,应用于下一代测序过程中,具有覆盖率高、背景低、测序深度均一性好的优点。
本发明的另一个目的在于提供一种包括有所述检测肺癌相关41基因的探针库的试剂盒。
本发明的再一个目的在于提供所述检测肺癌相关41基因的探针库在在下一代测序技术中分析肺癌相关41基因突变情况的应用。
为了实现上述目的,本发明的技术方案如下:
1、本发明提供了一种检测肺癌相关41基因的探针库,所述探针库包括有肺癌相关41基因捕获探针,所述肺癌相关41基因捕获探针有1464条,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1~1464所示。
优选地,所述肺癌相关41基因捕获探针均采用生物素进行了选择性标记。
优选地,所述探针库还包括有能降低非特异性杂交的封闭探针。
优选地,所述封闭探针为DNA单链探针。
优选地,所述封闭探针有2574条,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1465~4038所示。
2、本发明还提供了一种检测肺癌相关41基因的试剂盒,所述试剂盒包括有所述检测肺癌相关41基因的探针库。
3、本发明还提供了所述检测肺癌相关41基因的探针库在下一代测序技术中分析肺癌相关41基因突变情况的应用。
优选地,所述应用包括如下步骤:
1)获得受试者的DNA样本库;
2)利用所述检测肺癌相关41基因的探针库与所述DNA样本库进行杂交;
3)分离步骤2)的杂交产物,然后释放经杂交富集的肺癌相关41基因的DNA片段;
4)检测所述肺癌相关的41基因的突变情况:采用下一代测序技术,对所述步骤3)中富集到的肺癌相关41基因的DNA片段进行测序,从而检测肺癌相关41基因的突变情况。
其中,所述步骤1)中的DNA样本库为双链DNA片段组成的DNA样本库,可通过提取全基因组DNA,然后将其片段化获得;或者通过提取mRNA,将其片段化,然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA的方式获得。
优选地,所述步骤1)中的DNA样本库中的DNA片段的长度为100~1000bp。
进一步地,所述步骤1)中的DNA样本库中的DNA片段长度为140~300bp。
有益效果:
(1)本发明提供的探针库和试剂盒检测基因更加前沿,纳入了41个与肺癌治疗敏感性、抗拒性、毒副反应相关的基因,具有覆盖率高、背景低、测序深度均一性好的特点,检测结果能够直接对肺癌治疗疗效和毒性反应进行预先评估,可帮助筛选出合适的药物和治疗方案,有助于医生进行治疗决策和患者的合理用药,同时也可为未来的药物开发和提高治疗的精确性提供基本突变谱资料和检测策略。
(2)本发明提供的探针库和试剂盒均为自主设计,在价格上存在优势,降低了患者的临床检测费用,可转化研究应用于临床,产生经济效益和优化临床资源配置;
(3)本发明提供的探针库和试剂盒以探针杂交捕获为基础,具有高通量性,可同时检测41个基因的全部SNP、INDEL、CNV以及Fusion变异情况,改变传统单基因检测价格昂贵,耗时长,操作繁琐等劣势,具有在肺癌的穿刺活检小样本中实现“单个小样本多基因的检测”,满足小样本最大化使用、获得最大信息量的临床实践需求。
(4)本发明提供的探针库还包括了封闭探针,可有效降低非特异性杂交,提高捕获的特异性和捕获在靶率,让检测取得高效且准确的结果。
(5)本发明提供的探针库和试剂盒基于下一代测序技术具有高准确性与高敏感性,较Sanger测序法具有明显优势。
附图说明
图1为扩增后DNA样本库的质量检测结果图,其中,Line1为Marker5000,Line2为DNA样本库1,Line3为DNA样本库2;
图2为扩增后富集DNA样本库的质量检测结果图,其中,Line1为Marker5000,Line2为DNA样本库1,Line3为DNA样本库2;
图3为部分区域测序结果图;
图4为测序均匀性结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
在发明中所使用的术语“DNA”为脱氧核糖核酸(英文:Deoxyribonucleicacid,缩写为DNA)是一种由脱氧核糖核苷酸组成的双链分子。可组成遗传指令,引导生物发育与生命机能运行,其碱基排列顺序构成了遗传信息,所以在遗传病的诊断中具有重要的作用。
在发明中所使用的术语“下一代测序技术”指的是第二代高通量测序技术及之后发展的更高通量的测序方法。第二代高通量测序平台包括但不限于Illumina-Solexa(Miseq、Hiseq-2000、Hiseq-2500、Hiseq X ten等)、ABI-Solid和Roche-454测序平台等。随着测序技术的不断发展,本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他的测序方法和装置进行本检测。根据本发明的具体示例,可以将根据本发明实施例的核酸标签用于Illumina-Solexa、ABI-Solid和Roche-454测序平台等的至少一种进行测序。
本发明中的“突变”、“核酸变异”、“基因变异”可通用,本发明中的“SNP”(SNV)、“CNV”、“***缺失”(indel)和“结构变异”(SV)同通常定义,但本发明中对各种变异的大小不作特别限定,这样这几种变异之间有的有交叉,比如当***/缺失的为大片段甚至整条染色体时,也属于发生拷贝数变异(CNV)或是染色体非整倍性,也属于SV。这些类型变异的大小交叉并不妨碍本领域人员通过上述描述执行实现本发明的方法和/或装置并且达到所描述的结果。
本发明中的“肺癌相关41基因”是指与肺癌治疗敏感性、抗拒性、毒副反应相关的41个基因,其均为CFDA批准治疗肺癌的药物靶向基因或者处于临床试验阶段药物的靶向基因,或者已被证实与肺癌的耐药或者预后密切相关的基因,具体为AKT1,ALK,ATM,BRAF,CCND1,CDK4,CDK6,CDKN2A,CTNNB1,DDR2,EGFR,ERBB2,FBXW7,FGFR1,FGFR2,FGFR3,FLT3,GNA11,GNAQ,GNAS,HRAS,JAK2,JAK3,KEAP1,KIT,KRAS,MAP2K1,MET,MYC,NFE2L2,NRAS,NTRK1,PDGFRA,PIK3CA,PTEN,RET,ROS1,STK11,TERT,TP53,VHL。
肺癌41基因捕获探针的设计与靶向捕获测序的特异性和均一性密切相关,肺癌相关41基因捕获探针的捕获效果与探针长度、探针GC含量、探针overlap区域、杂交条件、需要检测的突变类型等因素相关,发明人根据其前期研究成果,采用了120bp长度的生物素修饰探针,绝大部分探针的GC含量尽量在40%-60%的范围,绝大部分探针与探针间存在10bp以上的overlap。根据捕获测序的结果,多次调整每条探针的浓度,对于捕获效果差的区域,采用增加探针浓度,加大探针overlap区域来改善捕获效果,经过多次优化实验最终取得均一性较高、特异性较好的捕获的探针库。
具体而言,本发明提供的检测肺癌相关41基因的探针库包括有肺癌相关41基因捕获探针,所述肺癌相关41基因捕获探针均采用生物素进行了选择性标记,所述肺癌相关41基因捕获探针有1464条,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1~1464所示,具体如表1所示。
表1
为了降低非特异性杂交,提高所述肺癌相关41基因捕获探针的捕获特异性,所述探针库还包括有能降低非特异性杂交的封闭探针,所述封闭探针可以为RNA探针、DNA单链探针、DNA双链探针。
在一个优选实施例中,所述封闭探针为DNA单链探针,探针数为2574条,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1465~4038所示,具体如表2所示。
表2
本发明还提供了一种检测肺癌相关41基因的试剂盒,所述试剂盒包括有所述检测肺癌相关41基因的探针库。
本发明还提供了所述检测肺癌相关41基因的探针库在下一代测序技术中分析肺癌相关41基因突变情况的应用。
所述检测肺癌相关41基因的探针库在下一代测序技术中分析肺癌相关41基因突变情况的应用包括的步骤如下:
1)获得受试者的DNA样本库;
2)利用所述检测肺癌相关41基因的探针库或试剂盒与所述DNA样本库进行杂交;
3)分离步骤2)的杂交产物,然后释放经杂交富集的肺癌相关41基因的DNA片段;
4)检测所述肺癌相关的41基因的突变:采用下一代测序技术,对所述步骤3)中富集到的肺癌相关41基因的DNA片段进行测序,从而检测肺癌相关41基因的突变情况。
在步骤1)中,所述DNA样本库为双链DNA片段组成的DNA样本库,可以为通过提取全基因组DNA,然后将其片段化获得的源自全基因组的DNA样本库;也可以为通过提取mRNA,将其片段化,然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA的方式获得的cDNA样本库。
其中,步骤1)中获取的DNA样本库为源自全基因组的DNA样本库时,其步骤如下:
1.准备基因组DNA样本
1.1 DNA提取
DNA提取,包括新鲜组织,新鲜血液和细胞,固定和石蜡样本,商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳***检测DNA模板质量和浓度。DNA模板260nm吸光率大于0.05以上,吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
1.2 DNA片段化
将3微克高质量的基因组DNA用低TE缓冲液稀释至120微升。按照组织匀浆机使用说明书,将DNA片段化,片段长度为150~200碱基。
DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
1.3 DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析,确认DNA片段长度峰值合理。
2.DNA末端修补
将DNA片段进行末端修复,可以利用Klenow片段、T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行,其中,所述Klenow片段具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’聚合酶活性,但缺少5’-3’外切酶活性。由此,能够方便准确地对DNA片段进行末端修复。为了方便进行后续处理,还可以进一步包括对经过末端修复的DNA片段进行纯化的步骤。
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断,对于DNA 5'突出粘末端补平以及3'突出粘末端打平,产生平末端,用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行,20摄氏度,30分钟。
DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
反应材料 | 体积 |
纯化后DNA样本库 | 50微升 |
磷酸化反应缓冲液 | 10微升 |
脱氧碱基混合物dNTP(每种10mM) | 4微升 |
T4 DNA聚合酶 | 5微升 |
Klenow大肠杆菌聚合酶片段 | 1微升 |
T4多聚核苷酸激酶 | 5微升 |
无核酸酶水 | 总体积补至100微升 |
3.在DNA样本3'末端加上碱基A
在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A,以便获得具有粘性末端A的DNA片段。为了方便准确地将碱基A添加到经过末端修复的DNA片段的3’末端,可以利用Klenow(3’-5’exo-),即具有3’-5’外切酶活性的Klenow,在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A。为了方便地进行后续处理,还可以进一步包括对具有粘性末端A的DNA片段进行纯化的步骤。
反应在PCR扩增仪中进行,37℃,30分钟。
DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
反应材料 | 体积 |
纯化后DNA样本库 | 约30微升 |
10×Klenow大肠杆菌聚合酶缓冲液 | 5微升 |
脱氧碱基dATP(1mM) | 10微升 |
Klenow大肠杆菌聚合酶片段 | 3微升 |
无核酸酶水 | 总体积补至50微升 |
4.在DNA两端加上接头
DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
反应材料 | 体积 |
纯化后DNA样本库 | 约15微升 |
2×T4 DNA连接酶缓冲液 | 5微升 |
DNA两端接头 | 6微升 |
T4 DNA连接酶 | 3微升 |
无核酸酶水 | 总体积补至50微升 |
5.扩增DNA模板
以样本为含微量游离DNA片段的血浆样本为例,由于其包含极其微量的目标游离DNA片段,第一扩增即使得核酸的量能满足芯片/探针杂交捕获的需求。
聚合酶链反应(PCR),在PCR扩增仪中进行。
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环4-6次(DNA样本库),最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
6.扩增后样本库质量检测
使用生物分析仪,进行DNA定性定量分析,并确认纯化后片段长度峰值合理,约200bp。
对于得到的DNA样本库,如果DNA浓度小于150纳克/微升,须将样品经过真空浓缩机低温干燥(低于45℃),再用无核酸酶水溶解至所需浓度。
其中,步骤1)中获取的DNA样本库为cDNA样本库时,其步骤如下:
1.准备cDNA样本
1.1 mRNA提取
mRNA提取,包括新鲜组织,新鲜血液和细胞,固定和石蜡样本,商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳***检测mRNA质量和浓度,吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
1.2 mRNA片段化
采用NEBNext RNA Fragmentation***或者其他商业化公司mRNA片段化试剂盒。
mRNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
1.3用商业化公司cDNA合成试剂盒进行mRNA合成第一链以及第二链cDNA。
cDNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
2.cDNA末端修补
将cDNA片段进行末端修复可以利用Klenow片段、T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行,其中,所述Klenow片段具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’聚合酶活性,但缺少5’-3’外切酶活性。由此,能够方便准确地对DNA片段进行末端修复。为了方便地进行后续处理,还可以进一步包括对经过末端修复的DNA片段进行纯化的步骤。
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断,对于cDNA 5'突出粘末端补平以及3'突出粘末端打平,产生平末端,用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行,20摄氏度,30分钟。
cDNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
反应材料 | 体积 |
纯化后cDNA样本库 | 50微升 |
磷酸化反应缓冲液 | 10微升 |
脱氧碱基混合物dNTP(每种10mM) | 4微升 |
T4 DNA聚合酶 | 5微升 |
Klenow大肠杆菌聚合酶片段 | 1微升 |
T4多聚核苷酸激酶 | 5微升 |
无核酸酶水 | 总体积补至100微升 |
3.在cDNA样本3'末端加上碱基A
在经过末端修复的cDNA片段的3’末端添加碱基A,以便获得具有粘性末端A的DNA片段。为了能够方便准确地将碱基A添加到经过末端修复的DNA片段的3’末端,可以利用Klenow(3’-5’exo-),即具有3’-5’外切酶活性的Klenow,在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A。为了能够方便地进行后续处理,还可以进一步包括对具有粘性末端A的DNA片段进行纯化的步骤。
反应在PCR扩增仪中进行,37℃,30分钟。
cDNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
反应材料 | 体积 |
纯化后cDNA样本库 | 约30微升 |
10×Klenow大肠杆菌聚合酶缓冲液 | 5微升 |
脱氧碱基dATP(1mM) | 10微升 |
Klenow大肠杆菌聚合酶片段 | 3微升 |
无核酸酶水 | 总体积补至50微升 |
3.在cDNA两端加上接头
cDNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
反应材料 | 体积 |
纯化后cDNA样本库 | 约15微升 |
2×T4 DNA连接酶缓冲液 | 5微升 |
DNA两端接头 | 6微升 |
T4 DNA连接酶 | 3微升 |
无核酸酶水 | 总体积补至50微升 |
4.分离出合适长度的cDNA片段
使用电泳凝胶,对照DNA梯度标准,在凝胶上剪切出250-450碱基cDNA片段。
将含有cDNA样本库的凝胶样本过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
5.cDNA片段样本库质量检测
使用生物分析仪,进行cDNA定性定量分析,并确认分离出的cDNA片断长度峰值合理。
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库),最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
6.扩增DNA模板
以样本为含微量游离DNA片段的血浆样本为例,由于其包含极其微量的目标游离DNA片段,第一扩增即使得核酸的量能满足芯片/探针杂交捕获的需求。
聚合酶链反应(PCR),在PCR扩增仪中进行。
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库),最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
7.扩增后cDNA样本库质量检测
使用生物分析仪,进行cDNA定性定量分析,并确认纯化后片段长度峰值合理,约200bp。
对于得到的cDNA样本库,如果cDNA小于30纳克/微升,须将样品经过真空浓缩机低温干燥(低于45℃),再用无核酸酶水溶解至所需浓度。
其中,步骤3)中利用所述检测肺癌相关41基因的探针库对所述DNA样本库进行杂交的方法如下:将cDNA/DNA样本库与杂交缓冲液混合,反应条件为95℃5分钟,之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。然后将该混合物与探针库混合,反应条件为65℃5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中,65℃孵育24小时。
其中,步骤4)中,分离步骤3)的杂交产物,释放经杂交富集的肺癌相关41基因的DNA片段的步骤如下:
1.准备链霉亲和素(Streptavidin-Coated)磁珠
使用Dynabeads链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀,每个样本需要50微升磁珠。
磁珠洗涤:混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液,在混匀仪上混匀,使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠与缓冲液分离纯化,缓冲液弃掉不用。重复三次,每次加入200微升结合缓冲液。
2.分离杂交产物
混合步骤2)的杂交反应混合物和1所述的链霉亲和素磁珠,反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。
然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液,在65℃孵育10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离纯化。
以上步骤重复三次。
3.cDNA/DNA富集样本释放
将磁珠与50微升洗脱缓冲液混合,室温孵化10分钟,每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机,将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的肺癌相关41基因片段cDNA/DNA样本库。
将样本库过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
因杂交捕获会损耗一定量的核酸,为了满足上机测序和质控检测的要求,有时还需要进行第二扩增使捕获下的目标片段满足上机测序和质控检测的要求。本发明的文库构建方法特别适用于总游离核酸不低于10ng或者常规组织基因组DNA不低于1μg的样本的测序文库构建。
将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增,为测序仪器上样做准备。
反应材料 | 体积 |
富集cDNA/DNA样本库 | 约30微升 |
10×高保真DNA聚合酶缓冲液 | 5微升 |
正引物 | 1微升 |
反引物 | 1微升 |
高保真DNA聚合酶 | 1微升 |
无核酸酶水 | 总体积补至50微升 |
PCR条件:置于PCR扩增仪中,98℃预变性30秒,98℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库),最后在72℃延伸5分钟。
其中,步骤4)中利用下一代测序技术检测所述肺癌相关的41基因的突变情况时,可以选用Roche 454、Illumina Hiseq等测序仪器进行测序,测序结果用已有的测序软件分析包进行分析。如使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS,使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增,使每个DNA样本片段在芯片上形成克隆簇,在每条泳道上产生数百万这样的克隆簇,使用Illumina HiSeq2000下一代测序***进行测序,经过QC筛选后,对测序结果使用BWA对所得片段进行序列映射,利用Bioconductor软件映射片段进行突变分析。
下面以一个具体实施例1进行详细说明。
实施例1
一、构建样本库
1.DNA的提取
采用HiPure FFPE DNA Kit(Magen)试剂盒提取样本DNA。
2.DNA片段化
按照DNA破碎仪(Bandelin)使用说明书,将DNA样本片段化,使片段长度为200-500碱基。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63881)将DNA纯化。
3.DNA样本库质量检测
用Bio-Fragment Analyzer进行DNA定性定量分析,确认DNA片段长度峰值合理。
4.DNA末端修复
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断,对于DNA 5'突出粘末端补平以及3'突出粘末端打平,产生平末端。同时利用T4多聚核苷酸激酶对于DNA 5'端磷酸化,用于后续的平端连接。
反应在室温(20~25℃)进行,45分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63881)将DNA纯化。
5.在DNA样本3'末端加上碱基A
反应材料 | 体积 |
纯化后DNA样本库 | 25微升 |
10×NEBuffer2 | 3微升 |
脱氧碱基dATP(NEB,1OmM) | 1微升 |
Klenow大肠杆菌聚合酶片段 | 1微升 |
反应在PCR扩增仪中进行,37℃,45分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63881)将cDNA/DNA纯化。
6.在DNA两端加上接头
反应材料 | 体积 |
纯化后的DNA样本库 | 20微升 |
10×T4 DNA连接酶反应缓冲液(NEB) | 3.5微升 |
DNA两端接头(5uM) | 4微升 |
T4 DNA连接酶(NEB) | 2微升 |
无核酸酶水 | 总体积补至35微升 |
反应在PCR扩增仪中进行,16℃,反应4小时,然后65℃,反应15分钟灭活T4DNA连接酶。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63881)将DNA纯化。
7.扩增6获得的DNA片段样本库
聚合酶链反应(PCR)在PCR扩增仪中进行。
PCR条件:98℃预变性2分钟,98℃变性15秒,56℃退火30秒,72℃延伸15秒,共循环8~10次,最后在72℃延伸5分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63881)将PCR扩增产物纯化。
8.扩增后DNA样本库的质量检测
使用2%琼脂糖凝胶电泳,进行DNA片段大小分析,结果如图1所示,DNA样本库片段大小合理,约300bp。
使用Bio-Fragment Analyzer生物分析仪,进行DNA定性定量分析,并确认纯化后片段长度峰值合理,约300bp。
二、将DNA样本库与探针库杂交
反应材料 | 体积 |
纯化后的DNA样本库 | 10微升 |
Block-L(1mM) | 0.5微升 |
Block-R***(1mM) | 0.5微升 |
human Cot-1 DNA | 5微升 |
探针(5uM) | 1微升 |
2X杂交缓冲液 | 17微升 |
注:***为样品的文库index,应加相对应的index,探针库的探针均进行了生物素化。
将杂交反应液混匀,置于PCR扩增仪中进行反应,条件为95℃,4分钟,反应完成后立即置于冰上并保持5分钟,之后置于53℃恒温杂交仪中杂交,杂交时间为60小时。
三、得到经杂交富集的肺癌相关41基因的DNA片段
1.准备链霉亲和素磁珠
使用DynabeadsTM M-270Streptavidin(invitrogen)链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀。
磁珠洗涤:取50微升磁珠用Beads Wash Buffer(1M NaCl,10mM Tris-HCl pH8.0,10mM EDTA pH8.0,0.1%Triton X-100)洗涤一次,磁铁吸附去上清,然后悬于50微升BeadsWash Buffer备用。
2.捕获、洗涤和洗脱DNA
捕获:将上述所得磁珠悬浮液加到已经杂交60h的杂交混合物中,在恒温杂交仪中53℃旋转捕获DNA 45分钟,磁场作用下去上清。
洗涤:加150微升Beads Wash Buffer重悬磁珠,磁铁吸附去上清,然后用100微升Beads Wash Buffer在37℃洗涤已捕获DNA的磁珠15分钟,磁铁吸附去上清;加少量Washbuffer I(1X SSC,0.1%SDS)悬浮磁珠,换管至1.5毫升离心管,加Wash buffer I至500微升,在37℃旋转洗涤已捕获DNA的磁珠15分钟;然后磁铁吸附去上清,重复用Wash buffer I洗涤磁珠一次;加少量Wash buffer II(0.1X SSC,0.1%SDS)悬浮磁珠,换管至新的1.5毫升离心管,加Wash buffer II至500微升,53℃旋转洗涤已捕获DNA的磁珠15分钟(注:Washbuffer II洗涤磁珠重复三次,时间分别为15分钟,20分钟,20分钟),然后磁铁吸附去上清;用50微升Washing bufferⅢ(5M Nacl,1M Tris-Hcl pH8.0,0.1%Triton X-100)混合液短暂洗涤磁珠,转管至200微升PCR管,磁铁吸附去上清。
洗脱:用50微升无核酸酶水重悬已捕获DNA的磁珠,悬浮液在PCR仪上95℃反应4分钟,高温下立即吸附磁珠,取上清,此时上清液中即含有富集过的肺癌相关41基因的DNA片段为富集DNA样本库。取一半做PCR试探,另一半备用。
四、PCR扩增、纯化与质量检测
1.将富集的肺癌相关41基因的DNA片段进一步扩增,为测序仪器上样做准备。
反应材料 | 体积 |
富集DNA样本库 | 25微升 |
5X Q5反应缓冲液(NEB) | 10微升 |
10mM dNTPs(NEB) | 1微升 |
Q5超高保真DNA聚合酶 | 1微升 |
正向引物(100uM PE1.0-L) | 0.3微升 |
反向引物(100uM Primer7) | 0.3微升 |
无核酸酶水 | 总体积补至50微升 |
PCR条件:98℃预变性2分钟,98℃变性15秒,56℃退火30秒,72℃延伸15秒,共循环20~22次,最后在72℃延伸5分钟。
2.使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号:A63881)将PCR扩增产物纯化。
3.扩增后富集DNA样本库的质量检测
使用2%琼脂糖凝胶电泳,进行DNA片段大小分析,结果如图2所示,所扩增的富集DNA样本库片段大小合理,200~500bp。
使用Bio-Fragment Analyzer生物分析仪,进行DNA定性定量分析,并确认纯化后片段长度峰值合理,约300bp。
四、采用下一代测序技术检测肺癌相关41基因的突变情况
使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS,使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增,使每个DNA样本片段在芯片上形成克隆簇,在每条泳道上产生数百万这样的克隆簇,使用Illumina HiSeq2000下一代测序***进行测序,经过QC筛选后,对测序结果使用BWA对所得片段进行序列映射,利用Bioconductor软件映射片段进行突变分析。部分区域测序结果图3所示。
采用本发明所述试探针库进行靶向测序,结果显示在靶率获得了极大的提高。当在杂交液中加入能降低非特异性杂交的封闭探针,在靶率由原来的平均54.8%提高到70.0%,如表1所示。另外,由于每个探针可以调节浓度,试剂盒捕获测序的均匀性也较好,100%的区域得到覆盖。在1G的测序通量情况下,99%的区域测序深度超过200倍(见图4)。
表1.捕获在靶率结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所有的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内,如与本发明所述探针库“具有相同功能的探针”也属于本发明的保护范围,其中“具有相同功能的探针”是指原探针或原探针的互补链经过一个或多个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加,且与原探针具有相同杂交捕获功能的探针。
Claims (10)
1.一种检测肺癌相关41基因的探针库,其特征在于,所述探针库包括有肺癌相关41基因捕获探针,所述肺癌相关41基因捕获探针为1464条,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1~1464所示。
2.根据权利要求1所述的检测肺癌相关41基因的探针库,其特征在于,所述肺癌相关41基因捕获探针均采用生物素进行了选择性标记。
3.根据权利要求2所述的检测肺癌相关41基因的探针库,其特征在于,所述探针库还包括有能降低非特异性杂交的封闭探针。
4.根据权利要求3所述的检测肺癌相关41基因的探针库,其特征在于,所述封闭探针为DNA单链探针。
5.根据权利要求4所述的检测肺癌相关41基因的探针库,其特征在于,所述封闭探针为2574条,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1465~4038所示。
6.一种检测肺癌相关41基因的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括有权利要求1至5任一项所述的检测肺癌相关41基因的探针库。
7.权利要求1至5任一项所述检测肺癌相关41基因的探针库在下一代测序技术中分析肺癌相关41基因突变情况的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述应用包括如下步骤:
1)获得受试者的DNA样本库;
2)利用权利要求1至5任一项所述检测肺癌相关41基因的探针与所述DNA样本库进行杂交;
3)分离步骤2)的杂交产物,然后释放经杂交富集的肺癌相关41基因的DNA片段;
4)检测所述肺癌相关41基因的突变情况:采用下一代测序技术,对所述步骤3)中富集到的肺癌相关41基因的DNA片段进行测序,从而检测所述肺癌相关41基因的突变情况;
其中,所述步骤1)中的DNA样本库为双链DNA片段组成的DNA样本库,可通过提取全基因组DNA,然后将其片段化获得;或者通过提取mRNA,将其片段化,然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA的方式获得。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述步骤1)中的DNA样本库中的DNA片段的长度为100~1000bp。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述步骤1)中的DNA样本库中的DNA片段长度为140~300bp。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113481299A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-10-08 | 苏州京脉生物科技有限公司 | 用于肺癌检测的靶向测序panel、试剂盒及获得靶向测序panel的方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106047998A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-10-26 | 深圳市海普洛斯生物科技有限公司 | 一种肺癌基因的检测方法及应用 |
CN107475370A (zh) * | 2017-07-13 | 2017-12-15 | 天津脉络医学检验有限公司 | 用于肺癌诊断的基因群和试剂盒及诊断方法 |
CN108148910A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-06-12 | 广东省人民医院(广东省医学科学院) | 一种肺癌相关的285基因靶向捕获测序试剂盒及其应用 |
CN108504738A (zh) * | 2018-04-27 | 2018-09-07 | 郑州科蒂亚生物技术有限公司 | 一种***癌检测探针序列及其应用 |
CN109022567A (zh) * | 2018-08-06 | 2018-12-18 | 北京艾克伦医疗科技有限公司 | 用于鉴定肺结节和/或肺癌状态的试剂盒及其应用 |
CN110438223A (zh) * | 2018-05-03 | 2019-11-12 | 同济大学苏州研究院 | 检测Kras基因点突变的引物、探针及其试剂盒与检测方法 |
-
2020
- 2020-03-11 CN CN202010167873.7A patent/CN111748621A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106047998A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-10-26 | 深圳市海普洛斯生物科技有限公司 | 一种肺癌基因的检测方法及应用 |
CN107475370A (zh) * | 2017-07-13 | 2017-12-15 | 天津脉络医学检验有限公司 | 用于肺癌诊断的基因群和试剂盒及诊断方法 |
CN108148910A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-06-12 | 广东省人民医院(广东省医学科学院) | 一种肺癌相关的285基因靶向捕获测序试剂盒及其应用 |
CN108504738A (zh) * | 2018-04-27 | 2018-09-07 | 郑州科蒂亚生物技术有限公司 | 一种***癌检测探针序列及其应用 |
CN110438223A (zh) * | 2018-05-03 | 2019-11-12 | 同济大学苏州研究院 | 检测Kras基因点突变的引物、探针及其试剂盒与检测方法 |
CN109022567A (zh) * | 2018-08-06 | 2018-12-18 | 北京艾克伦医疗科技有限公司 | 用于鉴定肺结节和/或肺癌状态的试剂盒及其应用 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113481299A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-10-08 | 苏州京脉生物科技有限公司 | 用于肺癌检测的靶向测序panel、试剂盒及获得靶向测序panel的方法 |
CN113481299B (zh) * | 2021-06-30 | 2022-05-10 | 苏州京脉生物科技有限公司 | 用于肺癌检测的靶向测序panel、试剂盒及获得靶向测序panel的方法 |
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