CN117247876A

CN117247876A - 一种降解羽毛的菌株及其应用

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Publication number: CN117247876A
Application number: CN202311521665.2A
Authority: CN
Inventors: 姜伟; 努尔阿丽耶·阿卜力米提; 温佳琦; 王慧
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2023-11-15
Filing date: 2023-11-15
Publication date: 2023-12-19
Anticipated expiration: 2043-11-15
Also published as: CN117247876B

Abstract

本发明涉一种可降解羽毛的菌株，属于微生物技术领域。该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NA16。本发明的菌株是从废弃的养鸡场土壤中分离获得的，其可72小时内高效降解50 g/L的天然羽毛，降解率高达99.3%，含有17种氨基酸，总氨基酸含量为7599 mg/L，并可用作饲料添加物或农田灌溉的氨基酸和多肽，实现生物质资源的综合利用，同时减少家禽养殖对环境的污染。由于该菌降解能力强，发酵周期短，最大程度地保持了蛋白质、多肽及氨基酸成分，可以提高作为饲料添加物的营养价值和利用率。

Description

一种降解羽毛的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种能够高效降解羽毛的菌株及其应用。

背景技术

在自然界中，角蛋白废物通过半胱氨酸二硫键、氢键和疏水相互作用高度交联，导致角蛋白结构稳定，难于被动物消化水解利用，从而导致绝大禽类羽毛被丢弃，处理不当会造成环境污染和疾病传播的同时也造成了蛋白质资源的极大浪费。

目前对羽毛的生物处理主要集中在角蛋白酶的异源表达及其酶学性质的研究，而研究表明单一角蛋白酶的方法并不能完全降解羽毛。通过微生物法处理羽毛能够大大提高羽毛的营养价值，但现用于羽毛降解的菌株普遍降解效率偏低，其中大多数利用还原剂，并且在液体发酵中需要很长时间才能降解低含量的羽毛。低羽毛含量的液体发酵对于工业规模的加工是不切实际的。

发明内容

本发明利用废弃羽毛产角蛋白酶的菌株进行筛选和优化降解条件，获得了一种利用微生物高效降解大量羽毛废弃物的菌株，其能快速地降解大量完整羽毛，得到可利用的氨基酸，降解效率高，避免了大部分氨基酸的损失，提高了羽毛降解产物的可吸收利用性。

一方面，本发明提供了一种降解羽毛的菌株，所述菌株的分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)；进一步的，本发明降解羽毛的菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) NA16，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.28470，保藏日期为2023年9月19日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

另一方面，本发明还提供了上述菌株在降解羽毛中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种降解羽毛的方法，所述方法包括利用上述菌株对羽毛进行处理的步骤。

另一方面，本发明还提供了一种对上述菌株进行发酵的方法，所述方法包括利用培养基对上述菌株进行培养的步骤。

在一个实施方式中，所述培养基的成分包括羽毛、蔗糖、酵母粉、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和硫酸镁。

在一个实施方式中，所述培养基中羽毛的含量为10g/L-100g/L，优选，50g/L；蔗糖的含量为10g/L-50g/L，优选，20g/L；酵母粉的含量为2g/L-10g/L，优选，5g/L；磷酸氢二钠的含量为0.5g/L-2g/L，优选，1g/L；磷酸二氢钾的含量为0.5g/L-2g/L，优选，1g/L；硫酸镁的含量为0.2g/L-1g/L，优选，0.5g/L；所述培养基的pH为5.0-7.5，优选，6.5。

在一个实施方式中，所述培养的温度为25-40℃，优选，37℃。

在一个实施方式中，所述培养的转速为100-400rpm，优选，200rpm。

在一个实施方式中，所述培养的时间为24-144h，例如，36-96h。

在一个实施方式中，所述羽毛为来自禽类的羽毛。

在一个实施方式中，所述禽类为家禽，例如，鸡、鸭、鹅、鸽子等。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一株高效降解羽毛的芽孢杆菌，所述菌株的分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，具体的，所述菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) NA16，保藏编号为CGMCC No.28470，该菌株于2023年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

该菌株是发明人从废弃的养鸡场土壤中分离得到的一株芽孢杆菌。

本发明可降解羽毛的菌株是利用以脱脂牛奶/酪蛋白平板上分离，经过纯化、基础培养中降解羽毛情况筛选出的一株高效降解羽毛的菌株。

经过16S rDNA扩增和序列对比分析鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) NA16。

上述贝莱斯芽孢杆菌菌株的筛选方法，包括如下步骤：

(1)羽毛处理：家禽活宰点收集到的羽毛经流水冲洗干净，60℃烘干4天，备用；

(2)初筛：将不同稀释比例的土壤样品涂布于脱脂牛奶/酪蛋白的平板上，30-37℃培养12～24小时，将长势旺盛且水解圈较大的菌反复划线分离，直至挑取到单菌落；

(3)复筛：将步骤(2)中得到的单菌落接种于种子培养基LB培养基，30-37℃、200rpm培养12～36小时，得到种子液，将种子液转接于基础培养基中，30～37℃、200rpm培养12～48小时，4000rpm离心7min得到发酵上清液，并测定蛋白酶和角蛋白酶的酶活。

步骤(3)中所述的种子液LB培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、NaCl 10g/L。

步骤(3)中所述的基础培养基的配制：羽毛粉10g，蒸馏水定容至1000mL。

羽毛降解条件的优化方法，包括如下步骤：

(1)种子液培养：将NA16菌株接种于种子培养基中，培养，得到种子液；

(2)发酵：将步骤(1)中得到的种子液接种于羽毛基础培养基中，发酵，得到发酵物，测定不同碳源、氮源、C/N比、pH和羽毛粉浓度对蛋白酶和角蛋白酶的酶活的影响，并找出适合的培养基。

其中，步骤(1)中种子液制备：蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、NaCl 10g/L。

步骤(1)中种子液制备条件为：搅拌转速为200rpm，温度为30～38℃，培养12～48h；优选地，搅拌转速为200rpm，温度为37℃，培养12h，接种量10％，搅拌转速为200r/min，温度为37℃。

步骤(2)中羽毛基础培养基：羽毛10g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 1g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH自然。

其中，步骤(2)中不同碳源 (葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖; 0～0.5%w/v)、氮源 (酵母粉、蛋白胨、牛肉提取物、胰蛋白胨、尿素、氯化铵； 0～0.5% w/v)、碳源浓度(0～5% w/v)、C/N比例 (8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、2:1、0、1:2、1:4、1:6)、pH (3.0～10.0)和羽毛粉浓度 (0～10% w/v)。

NA16菌株在降解羽毛中的应用。

所述的NA16菌株在降解羽毛中的应用，方法优选包括如下步骤：

(1)种子液培养：将芽孢杆菌菌株接种于种子培养基中，培养，得到种子液；

(2)发酵：将步骤(1)中得到的种子液接种于优化后的羽毛培养基中，搅拌均匀，发酵，得到发酵物，测定发酵液中的蛋白酶、角蛋白酶酶活和氨基酸含量，并计算剩余的鸡毛含量，烘干并降解前后的SEM和形态观察。

步骤(1)中所述的种子培养基的配制：称取10.0g蛋白胨、5.0g酵母提取物和10.0g氯化钠，蒸馏水定容至1000mL。

步骤(1)中所述的培养的条件为30～42℃、150～250rpm培养15～30h；优选为37℃、200rpm培养12h。

步骤(2)中所述的优化后的羽毛培养基的配制：羽毛(完整的鸡毛)50g/L，蔗糖20g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH6.5。

有益效果：

1.本发明所述的菌种筛选方法中，初筛时，将土壤样品制成的悬液直接涂布于脱脂牛奶/酪蛋白的培养基中，提高了筛选效率；在复筛时以羽毛为唯一碳氮源的基础培养基，很好地起到了筛选作用，使非目标微生物得到有效淘汰，并找出了适合的培养条件。

2.本发明通过大量筛选获得了一株能够高效降解天然羽毛的贝莱斯芽孢杆菌NA16菌株，该菌株能够在72小时内完全降解50g/L天然羽毛(包括羽轴)，羽毛角蛋白降解率可达99.3％，降解时不需对羽毛进行特殊处理，具有极高的应用价值。

3.本发明的降解羽毛后的氨基酸组成几乎无损失，降解第3天时总氨基酸含量高达7599 mg/L，必需氨基酸苯丙氨酸浓度最高(1050±1.90mg/L)，其次是缬氨酸(960±1.04mg/L)、谷氨酸(950±3.00mg/L)、半胱氨酸(770±7.71mg/L)和亮氨酸(730±4.76mg/L)等17种氨基酸，水解羽毛废弃物在饲料添加和氨基酸生产方面具有很强的应用潜力。

4.与昂贵的豆粕(通常用作饲料级膳食蛋白质来源)相比，将大量废弃羽毛进行了重新利用“变废为宝”，使羽毛中的营养成分被充分利用，不仅能有效地解决饲料蛋白的不足，同时也可以减轻环境污染，这证明了蛋白水解物作为低成本动物饲料补充物的价值。

附图说明

图1是依据16S rDNA序列构建的菌株NA16与其他20株菌株的***发育树图。

图2a-图2f是NA16优化羽毛培养基的结果图；其中，图2a：碳源；图2b：氮源；图2c：蔗糖浓度；图2d：碳氮比；图2e：pH值；图2f：羽毛粉浓度。

图3是本发明的菌株NA16对天然鸡羽毛的水解结果图；其中，CK为对照；正面和底面为天然鸡羽毛经过菌株NA16发酵处理72小时的水解结果图。

图4是本发明的菌株NA16对降解天然羽毛的扫描电镜照片图（经过72小时的水解）；其中，CK为对照。

图5是本发明的菌株NA16对鸡羽毛降解过程中酶活的研究。

图6是本发明的菌株NA16对氨基酸含量的研究。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式对本发明的实施方案进行详细描述，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，但并不意味着本发明上述主体的范围仅限于以下实施案例。凡基于本发明的上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

种子培养基(LB)：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，121℃处理30min。

脱脂牛奶培养基：脱脂牛奶20g/L，琼脂粉20g/L，115℃处理30min。

酪蛋白培养基：3g/L的酪蛋白添加到LB培养基中，琼脂粉20g/L，121℃处理30min。

基础培养基：10g/L羽毛粉，121℃处理30 min。

羽毛基础培养基：羽毛粉10g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 1g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，pH自然，121℃处理30 min。

蛋白酶酶活的测定：用20mM磷酸缓冲液(pH7.5)配制的2%酪蛋白作为底物，将适当稀释的酶液500μL和500μL底物添加到1.5mL离心管中，50℃处理10min，添加0.4M 三氯乙酸(TCA) 1mL终止反应。将混合物12000 rpm离心 5min后，取500μL上清液，分别加入2.5 mL0.4M Na₂CO₃溶液和500μL福林-酚试剂，在50℃水浴10min，以TCA失活的酶溶液作为对照，在波长680nm 处测定分光光度。蛋白酶活定义为每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位(U)，每个样品进行三次重复测定。

角蛋白酶酶活的测定方法：用50mM Tris-HCl缓冲液 (pH9.0) 配制的2%可溶性角蛋白作为底物，将适当稀释的酶液200μL和300μL底物添加到1.5 mL离心管中，50℃水浴10min，添加500μL 10%(w/v) TCA终止反应。将混合物12000rpm离心5min后，取500μL上清液，分别加入2.5mL 0.5M Na₂CO₃溶液和200μL福林-酚试剂，在50℃水浴10min，以TCA失活的酶溶液作为对照，在波长680nm处测定分光光度。角蛋白酶活定义为每分钟水解角蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位(U)，每个样品进行三次重复测定。

氨基酸含量测定：将降解过程中所取的水解液样品在4000rpm下离心7min，用0.22μm的纤维素滤膜过滤，滤液备用；水解过程中释放的游离氨基酸通过使用液相色谱(1200系列***；Agilent Technologies，美国)和氨基酸分析仪(Hitachi L-8900，日本)对不同时间取样的鸡毛水解液进行氨基酸分析。

实施例1：芽孢杆菌NA16的筛选和分子鉴定

以废弃的养鸡场土壤为样品，通过初筛、复筛、获得纯培养、初步测定羽毛降解能力、分子鉴定、和菌种保藏等步骤，得到高效羽毛降解菌株，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) NA16，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.28470，保藏日期为2023年9月19日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

NA16具体的筛选步骤如下：

(1)初筛：

从废弃的养鸡场土壤中采集样品，不同比例稀释的样品涂布于脱脂牛奶/酪蛋白固体培养基中，37℃培养12～24h。将平板上长势旺盛且水解圈较大的菌进行反复划线接种于LB培养基中，得到水解角蛋白能力较强的若干菌株。

(2)复筛：

将初筛所获得的若干水解角蛋白能力较强的菌株进行基础培养基复筛，分别将其接种于5mL的种子培养基中，37℃、200rpm培养12h，将种子液转接于装有50mL基础培养基的250mL锥形瓶中，接种量为10％(v/v)，37℃、200rpm培养24h。将发酵液4000rpm离心7min得到发酵上清液，并测定蛋白酶和角蛋白酶的酶活，选取降解率最高者，作为高效降解羽毛菌株。综合上述分析，筛选了一株能高效降解鸡毛的菌株NA16。

分子水平鉴定：

(1)基因组的提取与测序

将羽毛降解菌株NA16接种于LB液体培养液中，37℃培养12h，收集菌体。使用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行基因组DNA抽提，具体步骤见该试剂盒说明书。随后将PCR样品送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

(2)***发育树构建

将测序获得的NA16菌株16S rDNA序列在GeneBank上进行序列比对，随后下载相似性较高的模式菌株序列，使用MEGA7.0对该菌株进行初步的***发育树构建。

将NA16菌株16S rDNA序列与GeneBank中相关序列进行BLAST相似性分析，以其他20株菌株采用MEGA7.0软件以邻接法构建***发育树(如图1所示)。结果表明，NA16属于芽孢杆菌属(Bacillus)，与芽孢杆菌Bacillus velezensisAASB-21(LC634434)的序列同源性高达89％，且***进化树处于同一分支。上述分析结果，NA16菌株属于芽孢杆菌属，命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）NA16(ON303627)，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.28470，保藏日期为2023年9月19日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

实施例2：降解羽毛基础培养基的优化

(1)种子液：将NA16菌株的单菌落接种于5mL的种子培养基中，37℃、200rpm培养12h，得到种子液；

(2)发酵：将步骤(1)中得到的种子液按10％接种量转接于50mL的羽毛基础培养基中，37℃、200rpm培养24h，测定不同碳源、氮源、碳氮比、pH和羽毛粉浓度对蛋白酶和角蛋白酶的酶活的影响，每个进行三次重复。具体的步骤如下：

其中，步骤(2)中不同碳源 (CK、葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖；0.5% w/v，CK为不加碳源)、氮源 (CK、酵母粉、蛋白胨、牛肉提取物、胰蛋白胨、尿素、氯化铵；0.5%w/v，CK为不加氮源)。结果发现，蔗糖和酵母粉作为碳氮源时，酶活比对照的提高了将近4倍(图2a，图2b)，因此选为最适的碳氮源。

碳源(蔗糖)浓度(0-5% w/v；0、0.5、1、2、2.5、3、3.5、4、5%)、C/N比例 (8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、2:1、0、1:2、1:4、1:6)、pH (3.0～10.0；3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0) 和羽毛粉浓度(0～10% w/v)。

pH(3.0～10.0)的配制方法：50mM的Gly-HCl(pH2.0～5.0)、醋酸钠缓冲液(pH5.0～6.0)、磷酸缓冲液(pH6.0～7.0)、Tris-HCl(pH7.0～9.0)。

结果发现，蔗糖浓度、C/N和pH为2%、4:1和6.5时酶活最高(图2c，图2d，图2e)；当羽毛粉浓度为5～10%时，NA16能有效地降解鸡毛粉并且酶活较高(图2f)，因此综合考虑，羽毛粉的最适浓度为5%。

因此，优选羽毛培养基为羽毛50g/L、蔗糖20g/L、酵母粉5g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 1g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH6.5。

实施例3：NA16菌株大量羽毛降解能力的评估

种子液培养基配制和制备方法同实施例2。

羽毛培养基：羽毛（鸡羽毛）50g/L、蔗糖20g/L、酵母粉5g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 1g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH6.5，121℃ 高压灭菌处理30min。

将5mL NA16菌株的种子液接种于装有50mL完整的羽毛培养基(250mL锥形瓶)中，37℃、200rpm培养3天。通过肉眼和SEM观察羽毛3天的降解情况，计算羽毛的降解率，并测定蛋白酶、角蛋白酶酶活及氨基酸含量。

每隔24h，通过扫描电镜(SEM)观察羽毛的整体降解过程和结构变化(图3和图4)。如图3所示，NA16发酵前24h，羽毛剩余率从100%下降到53%。到48h，小枝和几乎所有倒刺都被破坏(如图4所示)，只留下少量残余轴，残余率降至25%，蛋白酶和角蛋酶活性及蛋白含量分别高达1058 U/mL, 288 U/mL和0.224 mg/mL (如图5所示)。72h时，整个羽毛结构几乎完全降解(如图3和图5所示)，剩余率降至0.7%，降解效率为99.3%。

在本研究中，NA16发酵72h，羽毛的小枝和轴被完全降解。

在NA16对羽毛的水解过程中，每隔24小时对氨基酸组成和水解产物样品浓度的变化进行评估。72 h水解产物的总氨基酸浓度为7599mg/L(图6)。72h时，必需氨基酸苯丙氨酸的浓度最高(1050±1.90mg/L)，其次是缬氨酸(960±1.04mg/L)、谷氨酸(950±3.00mg/L)、半胱氨酸(770±7.71mg/L)和亮氨酸(730±4.76mg/L)(图6)。

以上所述，仅为本发明已探索的并取得良好效果的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种降解羽毛的菌株，所述菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) NA16，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.28470。

2.权利要求1所述的菌株在降解羽毛中的应用。

3.一种降解羽毛的方法，其特征在于，所述方法包括权利要求1所述的菌株对羽毛进行处理的步骤。

4.一种对权利要求1所述的菌株进行发酵的方法，所述方法包括利用培养基对权利要求1所述的菌株进行培养的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基的成分包括羽毛、蔗糖、酵母粉、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和硫酸镁。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为25-40℃。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养的转速为100-400rpm。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养的时间为24-144h。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基的pH为5.0-7.5。

10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述羽毛为来自禽类的羽毛。