CN113969249A

CN113969249A - 降解棉酚的枯草芽孢杆菌m-15菌株、菌剂及应用

Info

Publication number: CN113969249A
Application number: CN202111347594.XA
Authority: CN
Inventors: 李佳; 朱宝成; 高同国; 王伟
Original assignee: Heibei Agricultural University
Current assignee: Heibei Agricultural University
Priority date: 2021-11-15
Filing date: 2021-11-15
Publication date: 2022-01-25

Abstract

本发明提供了一种降解棉酚的枯草芽孢杆菌M‑15菌株，所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M‑15，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年09月26日，保藏编号为CGMCC No.23483，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

Description

降解棉酚的枯草芽孢杆菌M-15菌株、菌剂及应用

技术领域

本发明涉及菌株筛选及菌剂制备技术领域，更具体地说是涉及具有降解棉酚功能的枯草芽孢杆菌M-15菌株、菌剂及应用。

背景技术

目前，我国畜牧养殖业的饲料蛋白主要来源于豆粕，随着豆粕价格的上涨，开发其他饼粕类蛋白质饲料资源，是解决我国蛋白质资源短缺的途径之一。

棉粕富含蛋白质，完全脱壳的棉仁制成的棉仁饼、粕粗蛋白质可达40％，与大豆饼的粗蛋白质含量不相上下；不脱壳的棉籽直接榨油生产出的棉籽饼粗纤维含量为16％-20％，粗蛋白质含量20％-30％，棉粕水解后可得到17种氨基酸，是一种具有很大开发潜力的蛋白质饲料资源。但棉粕中的游离棉酚及其它抗营养因子严重影响了它的饲用价值。其中游离棉酚是棉粕中的一种主要抗营养因子，其具有致毒作用的活性羟基、醛基等，直接利用会引起动物中毒，制约了其在畜牧养殖业的应用。

目前常用的棉粕脱毒方法主要有：物理萃取法、热处理法、挤压膨化法、化学处理法及微生物发酵法。使用微生物发酵法对棉籽粕进行脱毒，脱毒效果好.避免化学添加剂法和物理法对棉籽蛋白功能性质的影响，不会对其风味、色泽以及适口性构成损害，还会增加棉籽蛋白的含量，微生物发酵产生的微量营养元素，如氨基酸、维生素，以及纤维素降解生成的葡萄糖等也大大提高了棉籽蛋白的营养性能。

目前报道用于棉粕发酵脱毒菌剂的种类主要集中在霉菌和酵母菌、或以霉菌和酵母菌为主的复合菌种，少数研究提及采用乳酸菌等细菌，但他们其中一部分不属于我国农业部公布的能够用于生产微生态制剂的菌种，且在大规模发酵棉粕进行工业化生产时真菌一般无法使用。棉粕脱毒工艺基本处于实验室脱毒研究阶段，所采用的脱毒工艺往往需蒸煮甚至高压灭菌等环节、多要求恒温培养及无菌环境接种或培养。选用枯草芽孢杆菌——我国农业部公布的能够用于生产微生态制剂的菌种之一用于棉粕脱毒，保证了其安全性，并且芽孢菌株这类抗逆性强，耐高温，耐干燥，在工业生产中具有一定优势。

因此，如何提供一种具有高效脱酚功能的枯草芽孢杆菌菌株，进而将其应用制备成菌剂，去除棉粕中的棉酚，达到解毒的功效是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种降解棉酚的枯草芽孢杆菌M-15菌株，以该菌株制备菌剂，应用于棉酚降解中，具有优异的降解棉酚的效果。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种降解棉酚的枯草芽孢杆菌M-15菌株，所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)M-15，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年09月26日，保藏编号为CGMCC No.23483，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

一种降解棉酚的菌剂，所述菌剂由枯草芽孢杆菌M-15菌株制备而成；所述菌剂用于棉酚降解脱毒，降解率达99.58％。

一种具有降解棉酚功能的菌剂的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)将筛选到的M-15菌株接种到种子培养基中培养，获得斜面种子；

2)取斜面种子接种到NB培养基中进行培养，得培养液；

3)将培养液接种到发酵培养基中，进行发酵，得发酵液；其中，每升所述发酵培养基包括：蔗糖5.0g、氮源10g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaH₂PO₄·H₂O 0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，K₂HPO₄0.5 g，FeCl₃0.2g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4；

4)将发酵液在进风温度为130℃、料液比为1:1、进料速率为80kg/h的条件下进行干燥，得具有降解棉酚功能的菌剂。

作为本发明优选的技术方案，步骤1)中，每升所述种子培养基包括：棉酚5.0g，(NH₄)₂SO₄2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaH₂PO₄·H₂O 0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，K₂HPO₄0.5g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。

作为本发明优选的技术方案，步骤2)中，斜面种子在NB培养基中培养的时间为14h。

作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，以10％的接种量将培养液接种到发酵培养基中。

作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，发酵温度为30℃、发酵时间为60h、装液量为120ml/250ml、通气量为1:0.8V/V。

上述枯草芽孢杆菌M-15菌株在制备降解棉酚制剂中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种枯草芽孢杆菌M-15菌株，该菌株可以高效降解棉酚，进而可以制备成菌剂，去除棉粕中的棉酚，达到解毒的功效，脱毒率达99.58％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为部分菌株在pH值4.5条件下的生长状态图；

图2附图为菌株在无机氮利用测定培养基中的生长状态图；

图3附图为标准曲线图；

图4附图为M-15菌株菌体及芽孢形态图；

图5附图为***发育树图；

图6附图为发酵时间和菌体浓度的标准曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了枯草芽孢杆菌M-15菌株的筛选过程、菌剂的制备过程和其降解棉酚的效果。菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年09月26日，保藏编号为CGMCC No.23483，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

实施例1

本实施例提供了一种M-15菌株的筛选过程：

用到的培养基如下：

牛肉膏蛋白胨培养基(NA)：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。

液体牛肉膏蛋白胨培养基(NB)：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，水1000mL，pH 7.2-7.4。

棉酚碳源培养基：棉酚5.0g，(NH₄)₂SO₄2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaH₂PO₄·H₂O0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，K₂HPO₄0.5g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。

棉酚碳源培养液：棉酚5.0g，牛肉膏1.0g，蛋白胨2.0g，(NH₄)₂SO₄2.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，NaH₂PO₄·H₂O 0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，K₂HPO₄0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。

耐酸性测定培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，pH调至4.5；

无机氮利用培养基：(NH₄)₂SO₄0.1％，NH₄NO₃0.3％，葡萄糖5.0％，KH₂PO₄0.15％，MgSO₄0.075％；

固体发酵培养基：主要由棉粕和玉米粉等组成。棉粕与玉米粉按8:2的比例混合均匀。发酵时底物与水再按1:0.8的比例混合。

菌株鉴定培养基：

糖、醇类发酵培养基：(NH₄)₂HPO₄1.0g，KCl 0.2g，MgSO₄0.2g，酵母0.2g，琼脂5-6g，糖或醇类10g，蒸馏水1000mL，溴甲酚紫(0.04％)15mL，pH7.0-7.2。

甲基红(M.R)试验培养基：蛋白胨5.0g，葡萄糖5.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2。

V-P试验培养基：蛋白胨5.0g，葡萄糖5.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2。

淀粉水解培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，可溶性淀粉2.0g，pH 7.2-7.4。

硝酸盐还原试验培养基：KNO₃1.0 g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，牛肉膏3.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.6。

亚硝酸盐还原试验培养基：牛肉膏10.0g，NaNO₂5.0 g，蛋白胨5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.3-7.4。

产氨试验培养基：蛋白胨5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。

脲酶培养基：NaCl 5.0g，KH₂PO₄2.0 g，蛋白胨1.0g，葡萄糖1.0g，酚红(0.2％酚红溶液)6.0mL，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH 6.8-6.9。

吲哚试验培养基：1.0％胰胨水溶液，pH 7.2-7.6。

苯丙氨基酸脱氨酶培养基：NaCl 5.0g，Na₂HPO₄1.0 g，DL-苯丙氨酸2.0g(或L-苯丙氨酸1.0g)，酵母膏3.0g，琼脂12.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

明胶液化试验培养基：蛋白胨5.0g，明胶100-150g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。

脂酶(Tween-80)试验培养基：蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，CaCl₂·7H₂O 0.1g，琼脂9.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.4。

土样来源

来源于保定市某棉花田。

菌株的筛选及鉴定方法

1)土样采集

用接种铲取棉田10-15cm深处土样，风干后，保存于纸袋中。记录采样时间、地点等信息。

2)菌株的分离

取1g土样放入装有9.0mL无菌水的试管中，震荡混匀后于80℃水浴加热20min，取1.0mL进行一系列梯度稀释。分别取10^-4、10^-5、10^-63个稀释梯度的稀释液涂布NA培养基平板，倒置于37℃培养箱中培养48h。挑取不同形态细菌单菌落转接至NA培养基斜面上，37℃恒温培养24h，置于-4℃冰箱保存备用，同时以NA培养基平板划线检查纯度。

3)菌株的预筛

①耐酸性测定

将待测菌株接种于耐酸性测定培养基中培养，观察菌株生长情况。结果见图1；根据菌株其生长情况筛选出232株在pH值为4.5的条件下生长良好的菌株，因为棉粕发酵后期pH值会呈酸性，故只有在酸性条件下生长良好的菌株才能应用于棉粕发酵中并发挥良好作用，因此选取上述232株菌株进行后续实验。部分菌株在pH值4.5条件下的生长状态见图1；

②无机氮利用测定

将待测菌株接种于无机氮利用测定培养基中培养，观察菌株生长情况。菌株生长情况如图2所示：232株供试菌株中有186株菌株可以利用无机氮源正常的生长；

4)棉酚降解菌株的筛选

①棉酚降解菌株的初筛

挑取分离得到的不同形态的单菌落，分别转接到以棉酚为唯一碳源的培养基平板上倒置培养。挑选能够生长的菌株转接至培养基斜面上，37℃恒温培养24h，置于4℃冰箱保存备用。

②棉酚降解菌株的复筛

将初筛得到的菌株接种于含有0.5g棉酚的培养液中培养。培养液离心(5000r/min，4℃)，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，得到除菌的发酵液，测定其中棉酚残留量，计算菌株降解棉酚的降解率，选取优良菌株。

③菌株对棉粕中棉酚实际降解能力的考察

将复筛所得菌株接种固体培养料培养，以国标法(GB/13086-1991)分别测定发酵前后样品中棉酚的含量。考察菌株对棉粕中棉酚的实际降解能力，得到具有高效棉酚降解能力的菌株M-15，降酚降解率99.58％。

5)菌株的形态鉴定

将活化后的菌株划线接种于NA平板上，37℃培养24h，观察菌落形态。菌株M-15在NA培养基上培养24h后的菌落形状呈圆形，乳白色，表面皱褶，粗糙不透明；边缘不整齐，菌落正反面颜色一致，不分泌其它色素。挑取菌株M-15进行革兰氏染色及芽孢染色，在光学显微镜下观察其菌体及芽孢形态。结果见图4；棉酚降解菌株M-15经染色后置于显微镜下观察，菌株M-15菌体细胞长约2.5μm，宽约0.7μm，着色均匀，呈革兰氏阳性。芽孢呈椭圆状，中生，长约1.8μm，宽约0.7μm。

6)基因组DNA的提取及16S rDNA的扩增纯化

采用CTAB法提取菌株的基因组DNA。以琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。以菌株的基因组DNA为模板采用通用引物进行16S rDNA序列的PCR扩增。PCR产物经试剂盒纯化后，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

7)16S rDNA序列分析及***发育树的构建

利用BLAST方式将测定的供试菌株的16S rDNA序列与GenBank中所有已测定的原核生物的16S rDNA序列进行比较，见表1；根据BLAST比较的结果，从GenBank中获得相应菌株16S rDNA序列，构建***发育树，结果见图5；序列对排利用CLUSTAL X program，进化距离的计算利用PHYLIP programpackage中的DANDIST program，进化树的构建利用PHYLIPprogram package中的Neighbor-joing进行，分支模式的重复性利用PHYLIP中的seqboot和consense分析，生成的树利用Treeview

表1菌株M-15与参比菌株的16S rDNA序列相似性

由结果可知，菌株M-15的16S rDNA序列与参比的芽孢杆菌属(Bacillus)相应标准菌株的同源相似度均在97％以上，因此可初步判断菌株M-15属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

8)功能菌株的生理生化鉴定

生理生化试验的选择主要根据《常见细菌***鉴定手册》中相应属、种鉴定有关的内容进行。共选取了过氧化氢酶试验，酪素水解试验，硝酸盐还原试验，吲哚试验，V.P试验，甲基红试验，淀粉水解试验，硫化氢产气试验，柠檬酸盐试验，纤维素分解试验，葡萄糖发酵试验，甘露醇发酵试验等13项试验，结果见表2；

表2菌株M-15的生理生化特征

菌株M-15以上生理生化特性与《常见细菌***鉴定手册》中相应属、种鉴定有关的内容进行对照分析。根据对供试菌株M-15的形态观察，初步鉴定菌株M-15属于芽孢杆菌属(Bacillus)；且根据16S rDNA序列分析结果，供试菌株M-15与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的标准菌株DSM 10的16SrDNA序列的同源相似性最高，达100.00％；再结合生理生化试验结果，初步鉴定菌株M-15为一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

实施例2

本实施例提供了一种枯草芽孢杆菌M-15菌株制备得到的菌剂，过程如下：

1)将筛选到的M-15菌株接种到NA培养基中培养，获得斜面种子；；

2)取斜面种子接种到NB培养基中进行培养14h，得培养液；

3)以10％的接种量将培养液接种到发酵培养基中，进行发酵，得发酵液；其中，发酵温度为30℃、发酵时间为60h、装液量为120ml/250ml、通气量为1:0.8V/V；每升所述发酵培养基包括：蔗糖5.0g、氮源10g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaH₂PO₄·H₂O 0.5g，CaCl₂·2H₂O0.1g，K₂HPO₄0.5 g，FeCl₃0.2 g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4；

实施例3

本实施例提供了对菌剂生产过程中培养基、发酵条件、接种量的筛选过程；

用到的培养基：

基本液体发酵培养基：碳源5.0g，氮源10g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaH₂PO₄·H₂O 0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，K₂HPO₄0.5 g，FeCl₃0.2 g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。

发酵设备

1m³种子罐、20m³发酵罐、其它发酵设备。相关20m³发酵罐工艺试验在河北众邦生物技术有限公司进行。

棉粕脱毒芽孢杆菌菌剂的研制

菌株最适种龄的确定

取试验菌株新鲜斜面种子接种NB培养基培养，定时取样，取发酵液稀释10倍，以721分光光度计测定相对菌体浓度(600nm下的光吸收值)。再以发酵时间为横轴、以相对菌体浓度为纵轴绘制曲线见图6和表3；取对数期末期为最适种龄。

表3 M-15菌株的生长曲线

时间(h)	0	2	4	6	8	10	12	14	16	18	20	22	24
														OD<sub>600</sub>	0.033	0.045	0.581	0.869	1.42	1.68	1.95	2.23	2.32	2.35	2.36	2.39	2.35

分析生长曲线得出应在种子液培养14h时接种发酵培养基。

摇瓶发酵产芽孢条件优化

①芽孢测定方法

活菌总数：计数采用平板计数法。

芽孢计数是在80℃水浴加热15min后，采用平板菌落计数法检测芽孢的形成量，芽孢形成率即芽孢形成数与活菌总数的比值。

②摇瓶发酵周期

取新鲜摇瓶种子接种发酵培养基培养，定时取发酵液测定其中芽孢产率，通过芽孢产量和产率来确定适宜的发酵周期。三个平行。

③单因子试验

根据试验需要配制发酵培养基置于250mL三角瓶中，装液量为50mL，单因素改变碳源、氮源等条件。将培养好的液体菌种以6.0％的接种量接种发酵培养基。于200r/min，30℃，摇床培养，取发酵液测定其中芽孢产率。

碳源分别取0.5％的葡萄糖、蔗糖、淀粉与玉米粉。

氮源分别采用1％的蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、黄豆饼粉、尿素、(NH₄)₂SO₄。

无机盐：分别配制含Mg²⁺，Zn²⁺，Cu²⁺，Ca²⁺及Mn²⁺等的发酵培养基进行试验。

④正交试验

采用4因素3水平正交试验表，见表4；使用上述试验所测定出的最适碳源、氮源、无机盐配制不同浓度的发酵培养基，进行发酵培养，具体配方如表所示。取发酵液测定其中芽孢产量及产率。

表4正交试验设计(培养基)

碳源I(％)	氮源(％)	无机盐(％)	无机盐II(％)
				0.1	1	0.02	0.02
0.1	2	0.05	0.05
				0.1	5	0.1	0.1
0.2	1	0.05	0.1
				0.2	2	0.1	0.02
0.2	5	0.02	0.05
				0.5	1	0.1	0.05
0.5	2	0.02	0.1
				0.5	5	0.05	0.02

采用4因素4水平正交试验，使用上述试验所测定出的最适发酵培养基，在不同发酵条件下进行发酵培养，具体发酵条件如表5所示。取发酵液测定其中芽孢产量及产率。

表5正交试验设计(培养条件)

根据极差分析培养基中四种优化成份对芽孢产率的影响主次为A>C>D>B。碳源对芽孢产率的影响最大，在四因素中是影响产芽孢最关键的因素，之后依次为无机盐Ⅰ、无机盐Ⅱ、氮源。确定菌株M-15产芽孢的最适培养基为：蔗糖5.0g，蛋白胨10.0g，MnSO₄·H₂O0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaH₂PO₄·H₂O 0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，K₂HPO40.5 g，FeCl₃0.2 g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。

以发酵时间，接种量，pH值，装液量为优化对象，采用优化后的培养基配方配制成发酵培养基进行发酵。确定了菌株M-15产芽孢培养条件的最佳组合为A₂B₄C₃D₄，即pH为7.2，装液量为120mL，发酵时间为60h，接种量为10％。极差分析四种培养条件对芽孢产率的影响主次为：pH对发酵液中芽孢产率的影响最大，是影响优化最关键的因素，即控制好pH值使之处于最优水平较之其它三因素降解棉酚的效果更好，之后为接种量和装液量，再次为发酵时间。

综上所述，菌株M-15的最适种龄为14h；最适培养基：蔗糖5.0g，蛋白胨10.0g，MnSO₄·H₂O 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaH₂PO₄·H₂O 0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，K₂HPO₄0.5 g，FeCl₃0.2 g，蒸馏水1000mL。培养条件：接种量10％，发酵时间60h，发酵温度30℃，装液量120mL/250mL，pH 7.2。在此条件下发酵，芽孢产率达到96.9％。芽孢杆菌20m³发酵罐发酵生产及发酵液浓缩和菌体干燥工艺参数优化

根据摇瓶发酵优化得到的培养基及培养条件，摸索确定菌株M-15的20m³发酵罐发酵生产中发酵培养基组成及发酵过程控制相关参数(接种量、培养温度、供氧及发酵终点判断等)，重点摸索M-15的20m³发酵罐发酵生产中通气量参数及发酵液浓缩和菌体干燥工艺中相关参数。

①通气量对发酵产芽孢的影响

在发酵过程中，由种后通气量1:0.4V/V·min开始，到发酵结束分段调节通气量到不同大小，其余条件不变，比较通气量对发酵周期、发酵液菌体浓度及芽孢比率的影响，以确定最佳通气量参数；见表6；

表6通气量对菌株P-52发酵产芽孢的影响

由表6可知，通气量越大，芽孢比率和芽孢浓度越高，因此，理论上最佳通气量参数应为1:1.2V/V·min，但通气量增大，发酵液蒸发量也会增大，因此，每罐批所得芽孢总量并不一定与通气量参数呈正相关，根据表中数据，在通气量1:0.6V/V·min时，发酵所得芽孢总量明显少于其它三组，通气量在1:0.8V/V·min以上时每罐批所得芽孢总量则相差不大。因此发酵过程通气量保持在1:0.8V/V·min以上即可。

②发酵液离心浓缩参数的确定

碟片式离心机转速固定，为7300r/min，发酵液进料流速分别采用0.3、0.5、0.7、0.9、1.0m³/h，测定其芽孢收率，根据测定结果，确定最佳进料流速参数；结果见表7；

表7不同进料速率对芽孢收率的影响

流量(m<sup>3</sup>/h)	芽孢收率(％)
		0.3	95.7
0.5	91.5
		0.7	83.4
0.9	79.2
		1.0	77.8

根据采用不同发酵液进料流速参数进行发酵液离心浓缩，所得芽孢收率结果见表7，酵液进料速率参数与芽孢收率呈反相关，且影响较大。这是因为流量过大会导致料液在离心机内停留时间过短而随上清液逃离离心机，从而影响了芽孢收率，然而实际生产中流量过小会直接减少单位时间内发酵液处理量，使生产效率降低，因此综合考虑，确定流量以0.5m³/h为宜。

③闪蒸干燥工艺参数的确定，菌粉干燥选择闪蒸干燥工艺；选择小麦麸皮粉作为吸附菌液载体，研究以麸皮粉细度、麸皮和浓缩液比例(简称料液比)、进风温度、进料速率做L₉(3⁴)正交试验，见表8。测定干燥后菌粉含水量和芽孢存活率，以确定最佳闪蒸干燥工艺参数，结果如表9；

表8闪蒸干燥工艺参数正交试验设计

表9闪蒸干燥工艺参数正交试验结果

根据表12数据，以菌粉含水量为指标，闪蒸干燥工艺参数应为：进风温度145℃，料液比2:1，进料速率80kg/h，麸皮粉细度60目最佳，以菌粉芽孢存活率为指标，闪蒸干燥工艺参数应为：进风温度130℃，料液比2:1，进料速率60kg/h，麸皮粉细度80目最佳其中进风温度和料液比两项参数对干燥后菌粉的含水量和芽孢存活率影响最大，进料速率影响次之，麸皮细度参数影响较小。

然而在实际生产中要综合考虑生产效率、能耗以及产品质量等多方面因素，因此确定闪蒸干燥工艺参数为：进风温度130℃、料液比1:1、进料速率80kg/h、麸皮粉细度60目。该组合在正交试验中没有，所以以该组合各项参数进行试验验证，结果证实以此工艺参数所得干燥菌粉质量较好，芽孢含量达5.16×10¹¹CFU/g以上，含水量为3.02％，芽孢存活率88.6％。以此工艺参数制成的菌剂含菌量达2.80×10¹⁰CFU/g。

综合以上试验结果，确定了菌株M-15菌剂的生产工艺，20m³罐发酵水平高达9.36×10⁹CFU/mL，芽孢产率90％以上；采用连续流离心和闪蒸干燥联用的后处理工艺，制备的干燥菌粉芽孢含量达5.16×10¹¹CFU/g以上，芽孢存活率81.07％，加辅料配制成的菌剂活菌数达2.80×10¹⁰CFU/g。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种降解棉酚的枯草芽孢杆菌M-15菌株，其特征在于，所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M-15，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年09月26日，保藏编号为CGMCC No.23483，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

2.一种降解棉酚的菌剂，其特征在于，所述菌剂由枯草芽孢杆菌M-15菌株制备而成；所述菌剂用于棉酚降解脱毒，降解率达99.58％。

3.权利要求2所述的一种降解棉酚的菌剂的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

2)取斜面种子接种到NB培养基中进行培养，得培养液；

3)将培养液接种到发酵培养基中，进行发酵，得发酵液；其中，每升所述发酵培养基包括：蔗糖5.0g、氮源10g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaH₂PO₄·H₂O 0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，K₂HPO₄0.5g，FeCl₃ 0.2g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4；

4.根据权利要求3所述的一种降解棉酚的菌剂的制备方法，其特征在于，步骤1)中，每升所述种子培养基包括：棉酚5.0g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaH₂PO₄·H₂O 0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，K₂HPO₄ 0.5g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。

5.根据权利要求3所述的一种降解棉酚的菌剂的制备方法，其特征在于，步骤2)中，斜面种子在NB培养基中培养的时间为14h。

6.根据权利要求3所述的一种降解棉酚的菌剂的制备方法，其特征在于，步骤3)中，以10％的接种量将培养液接种到发酵培养基中。

7.根据权利要求3所述的一种降解棉酚的菌剂的制备方法，其特征在于，步骤3)中，发酵温度为30℃、发酵时间为60h、装液量为120ml/250ml、通气量为1:0.8V/V。

8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌M-15菌株在棉粕发酵中的应用。