CN117229377B - 一种杀虫蛋白及其在防治鳃金龟中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种杀虫蛋白及其在防治鳃金龟中的应用。所述杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
Description
技术领域
本发明涉及生物防治领域，特别涉及一种蛋白在防治鳃金龟中的应用。
背景技术
暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）在国内有广泛分布，其幼虫蛴螬为害作物的块根、块茎，尤其是粮食作物土豆和经济作物花生等，成虫危害杨、榆、桃等树木的叶片，给农林业及城市绿化带来巨大损失。幼虫隐蔽生活在土壤中，给传统的化学防治造成一定的困难。
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）及其伴胞毒蛋白的开发与利用为暗黑鳃金龟幼虫的防治提供了有效手段，相继发现了Cry8E、Cry8F、Cry8H、Cry8G等多类对暗黑鳃金龟有效的Bt毒蛋白。但仍需发现或人工突变获得杀虫活性更好的毒蛋白。
发明内容
本发明之一提供了一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 8所示。
本发明之二提供了一种含有如本发明之一所述的杀虫蛋白的组合物。
本发明之三提供了编码如本发明之一所述的杀虫蛋白的核酸。
在一个具体实施方式中，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No. 7所示。
本发明之四提供了一种微生物，其携带有如本发明之三所述的核酸且能表达如本发明之一所述的杀虫蛋白。
在一个具体实施方式中，所述微生物为大肠杆菌和/或苏云金芽胞杆菌。
在一个具体实施方式中，所述苏云金芽胞杆菌为HD8E-R163H菌株。
本发明之五提供了根据本发明之一中所述的杀虫蛋白、本发明之二中所述的组合物、本发明之三中所述核酸、本发明之四中任意一下所述的微生物中的一种在防治鳃金龟（Holotrichia）中的应用。
在一个具体实施方式中，所述鳃金龟为暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）。
在一个具体实施方式中，所述鳃金龟为暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）的幼虫。
本发明的有益效果：本发明的Cry8Ea1-R163H蛋白对暗黑鳃金龟的杀虫活性有了显著性提高，是其野生型蛋白Cry8Ea1的9.5倍，在实际防治作业中显著降低蛋白使用量，有利于以更低成本来对暗黑鳃金龟进行生物防治。
附图说明
图1显示了蛋白的SDS-PAGE检测结果。
具体实施方式
以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
HD8E菌株由Bt无晶体突变株HD73-转入pSTK-Cry8Ea1质粒得到，其含有Cry8Ea1基因（如SEQ ID No. 1所示），Cry8Ea1基因编码的Cry8Ea1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
实施例1
突变蛋白的克隆与表达
突变蛋白的克隆
设计引物8E-H-F（如SEQ ID No. 3所示）、8E-R（如SEQ ID No. 4所示）、8E-F（如SEQ ID No. 5所示）、8E-H-R（如SEQ ID No. 6所示）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
以8E-H-F和8E-R为引物，以HD8E菌株为模板，进行PCR扩增，扩增得到3009bp的PCR产物，然后将该PCR产物进行胶回收，得到胶回收的PCR产物1。使用BamHI和SalI限制性内切酶将pSTK空载体进行双酶切及胶回收，得到胶回收的酶切产物1。将胶回收的PCR产物1和胶回收的酶切产物1连接，得到阳性重组质粒pSTK-Cry8Ea1-3009。以8E-F和8E-H-R为引物，以HD8E菌株为模板，进行PCR扩增，扩增得到486 bp的PCR产物，然后将该PCR产物进行胶回收，得到胶回收的PCR产物2。使用BamHI将pSTK-Cry8Ea1-3009进行单酶切及胶回收，得到胶回收的酶切产物2。将胶回收的PCR产物2和胶回收的酶切产物2连接，得到阳性重组质粒pSTK-Cry8Ea1-R163H，从而将Cry8Ea1基因第487至489位的AGA突变为CAT，将Cry8Ea1蛋白第163位的R突变为H，突变基因（如SEQ ID No. 7所示）及突变蛋白（如SEQ ID No. 8所示）以Cry8Ea1-R163H表示。
将阳性重组质粒pSTK-Cry8Ea1-R163H转入Bt无晶体突变株HD73-中，筛选出阳性转化子，将阳性转化子命名为HD8E-R163H。
突变蛋白的表达
（1）挑单菌落：挑取HD8E-R163H单菌落于5 mL含有终浓度为50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，30°C、220 rpm振荡培养12小时，得到活化菌液；
（2）按1%体积将活化菌液接种于装有300 mL 1/2 LB液体培养基（含50 μg/mL卡那霉素）的1 L三角瓶中，在30°C下以220 rpm振荡培养至镜检观察约有80%菌体裂解时停止培养，得到发酵液；
（3）将发酵液以6,500 ×g低温离心15分钟，去除第一上清液，收集第一沉淀；
（4）用预冷的1 M NaCl洗涤第一沉淀1次，8,000×g低温离心15分钟，去除第二上清液，得到第二沉淀；
（5）再用预冷的灭菌水将第二沉淀洗涤1至2次，洗涤过程中充分混匀，洗涤后离心，去除第三上清液，得到第三沉淀；
（6）用pH 9.5的50 mM NaCO3水溶液将第三沉淀悬浮，4℃，静置12小时以将晶体蛋白溶解在NaCO3水溶液，得到蛋白溶解悬浮液；
（7）将蛋白溶解悬浮液以8,000×g低温离心10 min，收获待测上清液；
（8）以上述（1）至（7）相同的操作提取HD8E的蛋白，最后收获Cry8Ea1蛋白上清液；
（9）将待测上清液和Cry8Ea1蛋白上清液进行SDS-PAGE检测，结果见图1。
根据图1的结果可知，Cry8Ea1-R163H在HD73-中表达成功。
实施例2
杀虫活性测定
挑取HD8E-R163H菌株单菌落加入1 mL 含有卡那霉素（50 μg/ml）LB液体培养基中28℃，200 rpm培养12 h活化，得到活化菌液，将活化菌液以1%体积加入到100 mL 含有卡那霉素（50 μg/ml）LB液体培养基中，在28℃下以200 rpm振荡培养。48 h后检测伴胞晶体裂解情况，待50%裂解时，收获培养液以用来制作胞晶悬液。具体如下：将培养液12000 rpm离心，弃去上清，将沉淀用无菌水重悬，制得HD8E-R163H胞晶悬液。
以上述相同的操作制得HD8E胞晶悬液。
将土壤121°C高温灭菌30 min以用于杀虫活性测试。
测量并计算两种胞晶悬液的CFU，确定最高浓度胞晶悬液使用体积，5倍梯度稀释HD8E-R163H和HD8E的胞晶悬液，以使各浓度的胞晶悬液与60 g土混合后终浓度为2.1875×108CFU/g土、0.4375×108CFU/g土、0.0875×108CFU/g土、 0.0175×108CFU/g土和 0.0035×108CFU/g土。制备得到胡萝卜丝，将胡萝卜丝用清水冲洗，晾至表面无水分。将胡萝卜丝浸入各浓度下的胞晶悬液中，20 min后取出胡萝卜丝并均匀放于6孔生测板中，每孔约4至5条，将剩余菌液拌于60 g土中。将拌好的土均匀分装至相应浓度下的6孔生测板中，每个孔内接入1头初孵3日龄暗黑鳃金龟的幼虫，放至于温度为26°C，光照为L:D=16:8的培养箱中饲养。每个重复24头，设3个重复。以无菌水作为阴性对照。7天后调查死、活虫数，计算平均死亡率、校正死亡率，然后利用PoloPlus软件计算致死中浓度（LC50）。
结果HD8E-R163H的LC50为1.43×106CFU/g土，置信区间为5.1×105至2.94×106CFU/ g土；HD8E的LC50为1.358×107CFU/g土，置信区间为3.31×106至6.294×107CFU/g土。根据两者的LC50可知，在对Cry8Ea1蛋白进行R163H突变后，突变蛋白Cry8Ea1-R163H的杀虫活性是野生型蛋白Cry8Ea1的9.5倍，说明突变蛋白Cry8Ea1-R163H比野生型蛋白Cry8Ea1的杀虫活性有显著性提高。
Claims (9)
1. 一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 8所示。
2.一种含有如权利要求1所述的杀虫蛋白的组合物。
3.编码如权利要求1所述的杀虫蛋白的核酸。
4. 根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No. 7所示。
5.一种微生物，其携带有如权利要求3或4所述的核酸且能表达如权利要求1所述的杀虫蛋白，所述微生物为大肠杆菌和/或苏云金芽胞杆菌。
6.根据权利要求5所述的微生物，其特征在于，所述苏云金芽胞杆菌为HD8E-R163H菌株。
7.根据权利要求1所述的杀虫蛋白、权利要求2所述的组合物、权利要求5或6所述的微生物中的一种在防治鳃金龟（Holotrichia）中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述鳃金龟为暗黑鳃金龟（Holotrichiaparallela）。
9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述鳃金龟为暗黑鳃金龟（Holotrichiaparallela）的幼虫。
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| GR01 | Patent grant | ||
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