CN115895919A

CN115895919A - 一种高毒力、高产孢的蝗绿僵菌菌株及其构建方法

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Publication number: CN115895919A
Application number: CN202310001348.1A
Authority: CN
Inventors: 彭国雄; 夏玉先; 杨曼; 洪耕
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2023-01-03
Filing date: 2023-01-03
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2043-01-03
Also published as: CN115895919B

Abstract

一种高毒力、高产孢的蝗绿僵菌工程菌，所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除转录因子MaLepE基因的工程菌株；所述转录因子MaLepE的cDNA基因序列为SEQ ID NO.18所示。本发明敲除菌株能提前形成附着孢，且膨压增强，再穿透蝗虫体表时的穿透能力增强，比野生型及回复菌株提前穿透蝗虫。特别地，对死后的僵虫进行继续培养4天后，本发明敲除转录因子MaLepE基因后的菌株致死的虫体表面分生孢子的产量增加、较WT提高65.8%，可明显增加蝗绿僵菌的野外二次传播，促进对害虫的持续控制。

Description

一种高毒力、高产孢的蝗绿僵菌菌株及其构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高毒力、高产孢的蝗绿僵菌工程菌株。

背景技术

昆虫病原真菌通过直接穿透昆虫体壁进入血腔，利用昆虫营养生长繁殖，最后导致昆虫死亡。穿透昆虫体壁速度，是影响杀虫真菌毒力的关键因素；昆虫体表产孢影响杀虫真菌持续的作用。蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)为蝗虫专一的虫生真菌，在国内外被广泛用于各种蝗虫的防治。但是，蝗绿僵菌与其他昆虫病原真菌一样，存在杀虫慢，防效低等问题，严重地制约了其广泛应用。选育高毒力和僵虫体表产孢的杀虫真菌菌株成为杀虫真菌研究的热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高毒力、高产孢的蝗绿僵菌工程菌，其特征在于：所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除转录因子MaLepE基因的工程菌株。

上述蝗绿僵菌采用的是蝗绿僵菌CQMa102菌株，该CQMa102菌株保存在中国普通微生物保藏中心，地址为：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC No.0877，保藏日期为2003年01月10日，分类命名为金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae；且也记载在授权公告CN1216144C专利中。MaLepE基因登录号为GeneID:19247873。

上述转录因子MaLepE基因为蝗绿僵菌CQMa102菌株的基因，其开放阅读框ORF基因为SEQ ID NO.18所示。该基因无内含子，序列与其cDNA序列相同。

进一步优选地，上述蝗绿僵菌工程菌中，所敲除的MaLepE基因被由该MaLepE基因的上游同源臂、标记基因以及MaLepE基因的下游同源臂组成的重组基因所代替，上述标记基因可优先采用草铵膦标记Bar基因、其基因序列为SEQ ID NO.19所示。

上述蝗绿僵菌工程菌在制备杀虫剂中的应用。

本发明另一目的在于提供一种杀虫效果好的杀虫菌剂。

一种杀虫菌剂，它的活性成分为高毒力、高产孢的蝗绿僵菌工程菌，所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除转录因子MaLepE基因的工程菌株。

上述蝗绿僵菌采用的是蝗绿僵菌CQMa102菌株，上述敲除的转录因子MaLepE基因为蝗绿僵菌CQMa102菌株的基因，其开放阅读框ORF基因为SEQ ID NO.18所示。

优选地，上述蝗绿僵菌工程菌中，所敲除的MaLepE基因被由该MaLepE基因的上游同源臂、标记基因以及MaLepE基因的下游同源臂组成的重组基因所代替，上述标记基因可优先采用草铵膦标记Bar基因、其基因序列为SEQ ID NO.19所示。

本发明的又一目的在于提供上述高毒力、高产孢的蝗绿僵菌工程菌的构建方法。

上述构建方法，其特征在于，包括如下步骤进行：

1)pK2-PB-MaLepE重组质粒的构建

根据蝗绿僵菌基因组序列设计PCR引物，扩增出MaLepE蛋白编码基因的上、下游重组臂，并纯化扩增产物，上游同源重组臂为左臂、其基因序列为SEQ ID NO.13所示，下游同源重组臂为右臂、其基因序列为SEQ ID NO.14所示，酶切载体质粒pK2-PB并纯化线性质粒，上游重组臂片段与线性质粒在重组酶中进行一步克隆，重组产物至大肠杆菌感受态DH5α，得到pK2-PB-MaLepE重组质粒。

2)回复载体(pK2-sur-MaLepE)的构建

从蝗绿僵菌基因组中扩增带有MaLepE自身启动子与编码区ORF序列，其基因序列为SEQ ID NO.15所示，与pK2-sur载体使用一步克隆的方法进行连接。3)农杆菌的转化以及与蝗绿僵菌的共培养

将pK2-PB-MaLepE的质粒转化农杆菌后与野生蝗绿僵菌孢子共培养发生同源重组；回复pK2-sur-MaLepE质粒转化农杆菌后与ΔMaLepE蝗绿僵菌孢子共培养发生同源重组。

4)蝗绿僵菌转化子的筛选

经PCR初步验证转化子及Southern blot验证得到蝗绿僵菌MaLepE基因敲除突变株以及回复菌株。

本发明获得的有益效果

本发明提供一种高毒力蝗绿僵菌工程菌株及其构建方法，所述工程菌为蝗绿僵菌CQMa102敲除转录因子MaLepE基因后的工程菌株，MaLepE为新发现的毒力基因，将敲除菌株点滴接种的蝗虫相对于野生型菌株其半致死时间缩短了0.91天；本发明敲除菌株能提前形成附着孢，且膨压增强，再穿透蝗虫体表时的穿透能力增强，比野生型及回复菌株提前穿透蝗虫。特别地，对死后的僵虫进行继续培养4天后，本发明敲除转录因子MaLepE基因后的菌株致死的虫体表面分生孢子的产量增加、较WT提高65.8％，可明显增加蝗绿僵菌的野外二次传播，促进对害虫的持续控制。

附图说明

图1：MaLepE敲除载体和回复载体构建示意图。

图2：MaLepE基因敲除菌株和回复菌株的Southern blot验证结果。

图3：蝗虫体表点滴生物测定试验的蝗虫致死率和半致死时间。

图4：蝗绿僵菌死后培养4d后僵虫的观察及孢子量统计。

图5：各菌株在蝗虫后翅模拟体表穿透过程的实验结果。

具体实施方式

实施例1pK2-PB-MaLepE重组质粒的构建

根据蝗绿僵菌基因组序列设计PCR引物，所述蝗绿僵菌(CQMa102菌株)是由重庆大学杀虫真菌生物农药工程技术研究中心提供，此菌株保存在中国普通微生物保藏中心，其保藏号为CGMCCNo.0877，且也记载在授权公告CN1216144C专利中。

①质粒活化：从-80℃冰箱中取出质粒载体pK2-PB，冰上融化后，用接种环三区划线接种于LK固体培养基(在200mL的LB培养基中加入100μL浓度为100mg/mL的Kana溶液)，放置于37℃培养24h左右；。

②将长出单菌落的平板取出，用无菌接种环挑取单菌落接种于20mL的LK液体培养基(在20mL的LB液体培养基中加入浓度为100mg/mL 10μL的Kana溶液)中，放于37℃摇床进行12h左右培养。

③吸取500mL 50％(v/v)甘油和500mL菌液于灭菌离心管中，涡旋混匀，做好标记，于-80℃冰箱保存。

④提取质粒(TIANGEN快速质粒小提试剂盒)。

1)大肠杆菌在LK液体培养基中振荡培养大约16h，富集3-4mL菌液于离心管中，离心管规格为1.5mL或2.0mL。离心(常温，14,000rpm，2-3min)，弃上清。

2)加入0.15mL溶液P1，枪头吹打重悬菌体。

3)加入0.15mL溶液P2，温和地上下翻转，裂解菌体。

4)加入0.35mL溶液P5，充分混匀后管内出现黄色絮状沉淀。

5)离心(常温，14,000rpm，5min)取上清，转移到吸附柱中(吸附柱放入收集管中)。离心(常温，10,000rpm，30sec)，弃废液。

6)加入0.35mL漂洗液PWT(已加入无水乙醇)于吸附有目的DNA的吸附柱中，离心(常温，10,000rpm，30sec)，弃废液。

7)空离柱子(常温，10,000rpm，30sec)，去除残余漂洗液。敞开吸附柱管盖，室温晾干，挥发残余乙醇。

8)将吸附有目的DNA的吸附柱置于新的离心管中，离心管规格为1.5mL或2.0mL，30-50μL 65℃ddH₂O对吸附膜中的质粒进行洗脱。

9)测浓度，-20℃保存备用。

⑤引物设计

表1蝗绿僵菌MaLepE基因上、下游同源臂片段扩增引物

⑥MaLepE基因上、下游同源臂片段PCR扩增

PCR扩增MaLepE左、右臂片段，上游同源臂为左臂、基因序列为SEQ IDNO.13所示，下游同源臂为右臂，基因序列为SEQ ID NO.14所示。1％琼脂糖凝胶验证目的片段是否正确，利用纯化试剂盒对目的片段进行纯化、回收，用于后续实验。

PCR扩增体系(25μL)：

模板gDNA	1μL
		MaLepE-LF/LR	各1μL
金牌Mix	22μL
		总体系	25μL

TouchDown PCR扩增程序：

⑦对敲除载体质粒pK2-PB左臂进行双酶切(XbaI和HindIII)。

酶切体系(20μL)：

酶切反应条件：37℃培养箱中酶切30-40min，1％琼脂糖凝胶验证载体酶切完全后，利用纯化试剂盒对酶切完全的质粒进行纯化回收。

⑧左臂连接：按照1μL酶切质粒加3μL左臂片段体积比混合，利用Novo Rec重组酶进行连接。所需的酶切质粒和连接片段需经过纯化回收处理。

连接体系和反应条件：

⑨重组质粒的转化：

1)取-80℃冻存的大肠杆菌感受态(BGT1，葆光生物)50μL，加入5μL连接产物，轻轻转动管子使其均匀混合，冰水浴5-10min。

2)42℃热激40sec后立即置于冰上，冰水浴5-10min。

3)加入0.5-0.8mL LB液体培养基，37℃摇床220rpm振荡1h。

4)离心(常温，10,000rpm，3min)，留取50μL左右上清，重悬菌体。

5)吸取菌液涂布于LK(LB固体培养基中添加卡那霉素，工作浓度为50μg/mL)平板上，37℃培养12-16h。

⑩阳性质粒的菌落PCR验证：

待平板长出单菌落，无菌枪头挑取单菌落，放入盛有10μL无菌水的PCR中，制成菌悬液。以菌悬液为模板进行菌落PCR验证，验证转化子是否连接成功。验证正确的阳性转化子，进行摇瓶培养，提取质粒进行下一步操作。

表2左臂验证引物：MaLepE_LF和载体通用引物Pt_R。

PCR扩增体系(25μL)：

TouchDown PCR扩增程序：

EcoRI和EcoRV双酶切已连接上左臂的pK2-PB重组载体质粒。

酶切体系(20μL)：

酶切反应条件：37℃培养箱中酶切30-40min，1％琼脂糖凝胶验证载体是否酶切完全，若酶切完全，利用纯化试剂盒对酶切完全的质粒进行纯化回收。若还没有酶切好，就继续放置在37℃培养箱中酶切。

右臂连接：将中酶切并纯化好的线性重组载体与纯化好的右臂片段，按照上述方法进行连接转化，其连接产物为带有Bar基因抗性的pK2-PB-MaLepE。

阳性转化子的菌落PCR验证：验证方法和步骤参照左臂PCR验证方法。

表3右臂验证引物MaLepE_RR和Bar_F

PCR扩增体系(25μL)：

PCR扩增程序和之前左臂一样。验证成功的阳性转化子提取质粒备用。

化学转化根癌农杆菌

化学转化法根据上海维地的农杆菌感受态说明书，进行操作。注意农杆菌感受态可以先握在手心融化后置冰上，涂布时只需要取50.0μL涂布在平板上即可。培养条件为28℃。详见实施例3。原理如图1所示。

实施例2回复载体(pK2-sur-MaLepE-egfp)的构建

设计回复引物MaLepE_CP_LF/MaLepE_CP_LR(分别在上下游引物5′添加18bp及19bp的载体接头识别序列)，扩增出ATG上游1788bp至终止密码子TGA的所有序列。以WT基因组为模板扩增回复目的片段，扩增的目的片段进行琼脂糖凝胶(1％)检测，纯化试剂盒对目的片段纯化回收。MaLepE基因自身启动子与编码区ORF基因序列为SEQ ID NO.15所示。

表4蝗绿僵菌MaLepE基因启动子及开放阅读框扩增引物

PCR扩增体系(25μL)：

PCR扩增程序：

②使用HindIII和BamHI两个酶切pK2-sur载体，连接目的片段至pK2-sur载体，酶切、连接方法及步骤如下：

酶切体系(20μL)：

酶切反应条件：37℃培养箱中酶切30-40min，1％琼脂糖凝胶验证载体是否酶切完全，若酶切完全，利用纯化试剂盒对酶切完全的质粒进行纯化回收。将回复片段和酶切后载体用NovoRec重组酶(Novoprotein，美国)连接，连接产物为pK2-sur-MaAL。

连接体系：

NovoRec重组酶	1μl
		载体pK2-sur酶切产物	3μl
MaLepE回复片段	5μl
		NovoRec10×重组缓冲液	1μl
终体积	10μl

样品混匀，37℃处理40min，将连接产物转化大肠杆菌，通过菌落PCR及酶切验证得到pK2-sur-MaLepE-egfp阳性转化子，提取质粒备用。构建方法如下图1所示。EGFP_VR和引物MaLepE_CP_LF，PCR验证转化子是否连接成功。PCR扩增体系和PCR扩增程序见上一步。验证正确后，就可以获得的正确的回复阳性转化子。

表5回复序列验证引物

实施例3农杆菌的转化以及与蝗绿僵菌的共培养

(1)化学转化农杆菌

将5μl pK2-PB-MaLepE-L/R的质粒置于50μL农杆菌(博大泰克生物公司购买)感受态中，冰浴5min，液氮内冻5min，37℃水浴锅中处理5min,然后在冰上放置5min后加入600μlLB液体培养基于28℃，220rpm摇床培养3h，取5μL涂布于LK培养基，菌落培养基，菌落PCR验证出阳性转化子。

(2)农杆菌与蝗绿僵菌共培养

①将验证成功的农杆菌阳性菌落接种于20mL LK液体培养基(LB液体培养基中添加卡那霉素，工作浓度为50μg/mL)中，于恒温振荡培养箱振荡(28℃，220rpm)培养18-20h，直至吸光值OD₆₆₀为0.6-1.0。

②取灭菌的离心管，离心管规格为1.5mL或2.0mL，富集6mL菌液，离心(常温，14,000rpm，1min)，弃上清。

③加入1mL NIM液体培养基(含有200μM乙酰丁香酮)，重悬菌体，测定吸光值A₆₆₀。

④根据公式A＝[(0.15×10)/A₆₆₀]mL，计算出A值。A值即为10mL NIM液体培养基(含有200μM乙酰丁香酮)中所需要的初始菌液体积。

⑤恒温振荡培养箱振荡(28℃，220rpm)避光培养6-8h，直至吸光值A₆₆₀为0.5-0.7。

⑥刮取WT/ΔMaLepE菌株的分生孢子，用NIM液体培养基(含有200μM乙酰丁香酮)配制孢子悬浮液(1×10⁶个孢子/mL)。

⑦按照下列比例混匀

农杆菌菌液	0.5mL
		<![CDATA[绿僵菌孢悬液(2.5×10<sup>6</sup>个/mL)]]>	0.5mL
Total	1.0mL

⑧吸取0.1mL混合菌液涂布于铺有灭菌转化膜的NIM固体培养基上(含有200μM乙酰丁香酮)，28℃培养箱倒置培养48h(注意避光)。

⑨避光培养48h后，将转化膜转至查氏培养基平板上(含80μg/mL PPT和200mg/mL头孢)。

⑩28℃培养箱中倒置培养至长出单菌落，培养时间一般为7-10d。

灭菌枪头挑取单菌落之字形划线于新的查氏培养基上(含80μg/mLPPT和200mg/mL头孢)，进行扩大培养，培养时间为3-5d。微量提取基因组及转化子初步筛选。

(筛选敲除菌株应用WT菌株配制孢悬液，筛选回复菌株应用ΔMaLepE菌株配制孢悬液。)

实施例4蝗绿僵菌转化子的筛选

(1)蝗绿僵菌敲除转化子的初步验证

在筛选的敲除菌株中，MaLepE基因被筛选基因Bar基因所替换，筛选基因能够在含有除草剂(PPT)的培养基上进行生长。因此，利用查氏培养基(含80μg/mL PPT和200mg/mL头孢)对敲除菌株的阳性转化子进行初步筛选。

①挑取敲除菌株转化子

1)培养7-10d后，转化膜上长出颜色偏深的单菌落，无菌枪头挑取单菌落，之字形划线接种于查氏固体培养基(含80μg/mL PPT和200mg/mL头孢)上。

2)28℃恒温培养箱中培养3-4d，吸取0.5mL的1/4SDAY液体培养基于1.5mL离心管中，用灭菌的黄枪头刮取少量菌体接种于离心管中。平板上与离心管应做好标记并一一对应，便于后续验证。

3)恒温振荡培养箱中(28℃，220rpm)振荡培养3d。

②微量提取敲除菌株转化子的基因组

1)离心(常温，14,000rpm，5min)，弃上清。

2)菌体进行液氮速冻，立即使用研磨杵将管中菌体研磨至白色粉末状。

3)离心管中加入0.4mL裂解液(Lysis Buffer)，小心取出研磨杵，37℃温浴10-15min，裂解菌体。裂解途中摇晃样品管子1-2次，保证样品裂解充分。

4)每管样品中加入0.15mL醋酸钾溶液，上下颠倒混匀。

5)样品冰浴10-15min，离心(常温，14,000rpm，10min)；

6)吸取0.4mL上清液于新的离心管中，加入0.4mL异丙醇，混合均匀，冰浴30min以上。转移完毕后做好标记，切勿弄混。

7)离心(常温，14,000rpm，10min)，弃上清后可见离心管底部有少量白色沉淀，即为DNA。

8)加入1mL浓度为70％-75％的乙醇，离心(常温，14,000rpm，5min)，弃上清。

9)离心管敞口倒扣于干净滤纸上，待残余乙醇充分挥发后，加入20-25μL 65℃灭菌双蒸水，溶解后保存在于-20℃冰箱中，用于转化子初步筛选的模板。

③阳性菌株转化子的PCR验证

敲除菌株转化子验证引物为：MaLepE_VF和Pt_R。PCR扩增体系(25μL)：

表6敲除菌株转化子验证引物

扩增体系(25μL)：

T3 Mix	22.0μL
		MaLepE_VF	1.0μL
Pt_R	1.0μL
		模板(转化子的基因组)	1.0μL
总体系	25.0μL

PCR扩增程序：

(2)蝗绿僵菌回复转化子的初步验证

MaLepE的回复转化子进行初步筛选：在MaLepE的回复菌株中，筛选基因氯嘧磺隆(Sur)的抗性，能够在含有氯嘧磺隆(Sur)的培养基上进行正常生长。因此，可以加入400μL90mg/mL Sur和400μL 200mg/mL头孢在查氏固体培养基(200mL)中，对回复菌株的阳性转化子进行初步筛选。

①微量提取回复转化子的基因组

②阳性菌株的PCR验证

利用PCR技术验证回复转化子，验证引物MaLepE_CP-LF和EGFP_VR。

PCR扩增体系(25μL)：

PCR扩增程序：

(3)Southern blot验证MaAL敲除和回复转化子

①分析MaLepE、Bar基因序列的酶切位点，选HindⅢ及CalI消化基因组。根据HindⅢ酶切位点至左臂右端序列，基因序列为SEQ ID NO.16所示，设计探针引物MaLepE_TF/MaLepE_TR。扩增探针，电泳检测正确后对探针进行纯化回收和标记(取5μg探针，98℃处理10min，4℃处理10min，按Southern杂交试剂盒的说明标记探针)，再次纯化标记后的探针用于杂交实验。

获得探针序列如SEQ ID NO.17所示。

②HindⅢ及CalI双酶切体系如下(50μL)：

放置37℃恒温箱中反应，电泳验证结果，当酶切至基因组呈现出无明显主带，同时从上至下弥散状态，然后添加5μL 10×Loading Buffer终止酶切反应。

③制作1％的琼脂糖凝胶，注意，不添加GoldView I型核酸染料。然后依次点样，对照为8-10μL DNA Marker IV，先用高电压180V电泳5min左右，让样品全部进入凝胶中，防止样品扩散。然后低电压80V电泳4-5h使样品，蓝色的loading位置跑至整块胶的2/3位置处。注意，整个跑胶过程在都在冰上进行。

④在凝胶电泳成像***下，根据Marker的位置，确定WT，ΔMaLepE菌株酶切条带所在位置，把多余的凝胶切除。在凝胶右上角切一下，以此来区分胶的正反面。

⑤DNA预变性处理

1)蒸馏水冲洗凝胶2-3次；

2)弃蒸馏水，加变性液浸没凝胶，室温低速振荡30min，重复一次；

3)弃变性液，加蒸馏水浸没凝胶，室温低速振荡10min，重复一次；

4)弃蒸馏水，加中和液浸没凝胶，室温低速振荡15min，重复一次；

5)弃中和液，加20×SSC浸没凝胶，室温低速振荡10min，重复一次。

⑥DNA转膜和固定

1)裁剪1张均大于凝胶长度和宽度的定性滤纸，4-5张与凝胶长度和宽度相同的滤纸，1张与凝胶长度和宽度相同的尼龙膜；若干与胶水大小相同的吸水纸。滤纸尼和龙膜均需要在20×SSC溶液中浸泡30min以上。

2)将玻璃板放在装有20×SSC溶液的容器上，裁剪与玻璃板大小相同的定性滤纸，滤纸放在玻璃板上且两端要浸入溶液中，再放置比凝胶均大的滤纸，玻璃棒反复挤压滤纸驱赶气泡。

3)凝胶放置在滤纸上，胶孔一面向下贴于滤纸，放置尼龙膜后，玻璃棒反复滚动驱赶气泡。凝胶周围塑料片封闭，防止吸收纸在胶水下接触滤纸而形成短路。

4)在尼龙膜上放置4-5张滤纸，滤纸与凝胶的长度和宽度相同，玻璃棒反复滚动驱赶气泡。

5)滤纸上面放置适量吸水纸，然后压上重物，为确保转膜效率，转膜途中对湿透的吸水纸进行更换。

6)DNA转膜24h后，取走吸水纸和滤纸，尼龙膜正面朝上放入2×SSC溶液中，室温低速振荡10min。

7)弃2×SSC溶液，将尼龙膜夹在两张新的滤纸之间，120℃烘箱中干燥30min。

⑦标记探针

取500ng变性的(98℃，10min)探针，冰浴10min，加入2μL 1号液，补足水至10μL，并在37℃温箱中孵育过夜，-20℃冰箱中保存备用。

⑧预杂交和杂交

1)预杂交：在干净的杂交瓶中放入尼龙膜(DNA面朝上)，加入10mL左右7号杂交液，杂交炉中预杂交2h，杂交炉温度为40℃，转速为8-15rpm。

2)杂交：向杂交瓶中加入10μL变性探针(加入前需再次进行变性)，与7号杂交液混合均匀，杂交条件同预杂交，杂交时间为20-24h。

⑨洗膜和显色

1)洗膜：回收杂交液(-20℃冰箱中保存备用)，杂交瓶中加入适量体积洗涤缓冲液2，15min，8-15rpm，65℃，重复两次。

2)弃1)中的溶液，加50mL左右的洗涤缓冲液3于杂交瓶中，65℃，8-15rpm，15min，重复两次。

3)平衡：将尼龙膜置于培养皿中，加洗涤缓冲液浸没尼龙膜，室温低速振荡15min；

4)封闭：弃洗涤缓冲液，加封闭缓冲液浸没尼龙膜，室温低速振荡30min；

5)加二抗：弃封闭缓冲液，加抗体溶液浸没尼龙膜，室温低速振荡30min；

6)洗涤：弃二抗，加入洗涤缓冲液浸没尼龙膜，室温低速振荡30min，重复一次；

7)检测平衡：弃洗涤缓冲液，加检测缓冲液浸没尼龙膜，室温低速振荡5min。

8)显色：弃检测缓冲液，加入10mL左右的显色液，膜正面朝上，室温条件下避光孵育2-4h。待膜上出现清晰的目的条带后，拍照保存。结果如图2所示。

实施例5蝗虫生物测定实验

选择东亚飞蝗蜕皮24-36小时体重一致5龄幼虫为试虫，用石蜡油配制WT、ΔMaLepE、CP菌株的孢子悬浮液1×10⁷个/mL，充分涡旋震荡混匀后，取5μL点滴在蝗虫的背甲上，放在生测室中，记录温度为25～29℃，湿度为50％-90％。间隔12h清理笼子粪便，投喂新鲜的玉米叶；从培养至第3d开始每间隔12h统计一次蝗虫的死亡数至每笼蝗虫完全死亡，以点滴5μL石蜡油作为阴性对照组(CK组)，每个菌株作三组重复，每组25头蝗虫；重复三次。

从体表点滴的结果中我们发现敲除MaLepE基因后，菌株的毒力增强。通过进一步分析各菌株半致死时间，结果如图3所示，ΔMaLepE菌株的半致死时间LT₅₀为5.09d，较WT(6.00d)菌株缩短了0.91d，差异极显著(P<0.01)，说明敲除该基因后导致蝗绿僵菌的毒力增强。

选择同一时间死亡的蝗虫，转入28℃培养箱进行保湿培养，继续培养4d后发现，ΔMaLepE菌株在死亡僵虫体表产孢明显高于WT、CP。将整个僵虫菌剪碎放于50ml的0.5‰吐温-80中涡旋，使孢子分散均匀，以血球计数板进行统计，重复3次。结果发现，在第4d时，僵虫体WT、CP产孢量没有显著差异，ΔMaLepE菌株在僵虫上的产孢量显著增多，较WT提高65.8％(图4)，说明该基因敲除该基因后在自然环境中的扩散数量提高，增加传播能力。同时、采用我们之前申报的专利CN109182153A的敲除AFR基因的绿僵菌工程菌和CN114196556A的敲除MaAL基因的绿僵菌工程菌株，通过上述相同方法验证，结果发现：在第4d时，敲除AFR基因的绿僵菌工程菌在僵虫上的产孢量下降了99.99％，差异极显著(p<0.01)，几乎不产孢；敲除MaAL基因的绿僵菌工程菌株在培养基上产孢量(生产成本)与WT相比有所提高、但其在僵虫上的产孢量(田间害虫控制效果)与WT没有明显变化。可见，本发明敲除MaLepE基因的工程菌株在田间扩散与持续害虫控制的效果显著提高。

蝗绿僵菌在蝗虫后翅穿透实验：

用无菌的石蜡油配制WT、ΔMaLepE、CP菌株的孢子悬浮液1×10⁷个/mL，涡旋混匀；将洗净灭菌后的蝗虫后翅平铺在1/4SDAY培养基上并接种2μL各菌株的孢悬液，待晾干后，倒置放入到28℃的恒温培养箱中，于24h、28h分别取出揭开，揭下翅膀后继续培养5d后观察菌落生长，以在1/4SDAY培养基上上直接生长6d的各菌株菌落为对照(CK)。

结果如图5所示，通过模拟体壁穿透过程，进一步验证MaLepE通过影响体表穿透过程影响毒力。结果发现，在24h时ΔMaLepE菌株能穿透翅膀在平板上生长，而WT、CP菌株还未能穿透；在28h时WT、CP能穿透翅膀进行生长，但相比于ΔMaLepE菌株，菌落明显减小。因此，结果说明了ΔMaLepE相较于WT、CP能更早的穿透蝗虫体表进入到体内发挥作用(图5)。

Claims

1.一种高毒力、高产孢的蝗绿僵菌工程菌，其特征在于：所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除转录因子MaLepE基因的工程菌株；所述转录因子MaLepE的开放阅读框ORF基因为SEQID NO.18所示。

2.如权利要求1所述高毒力、高产孢的蝗绿僵菌工程菌，其特征在于：所述蝗绿僵菌为CQMa102菌株，其保存在中国普通微生物保藏中心、保藏号为CGMCC No. 0877。

3.如权利要求1或2所述高毒力、高产孢的蝗绿僵菌工程菌，其特征在于：所述敲除的MaLepE基因被由该MaLepE基因的上游同源臂、标记基因以及MaLepE基因的下游同源臂组成的重组基因所代替；所述标记基因优先采用草铵膦标记Bar基因、其基因序列为SEQ IDNO.19所示。

4.如权利要求1-3任一项所述蝗绿僵菌工程菌在制备杀虫剂中的应用。

5.一种杀虫菌剂，其特征在于：它的活性成分为高毒力、高产孢的蝗绿僵菌工程菌，所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌CQMa102菌株敲除转录因子MaLepE基因的工程菌株；所述敲除的转录因子MaLepE的开放阅读框ORF基因为SEQ ID NO.18所示。

6.如权利要求5所述的杀虫菌剂，其特征在于：所述蝗绿僵菌工程菌中，所敲除的MaLepE基因被由该MaLepE基因的上游同源臂、标记基因以及MaLepE基因的下游同源臂组成的重组基因所代替。

7. 如权利要求1或2所述高毒力、高产孢的蝗绿僵菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤进行：

（1）pK2-PB-MaLepE重组质粒的构建

根据蝗绿僵菌基因组序列设计PCR引物，扩增出MaLepE蛋白编码基因的上、下游重组臂，并纯化扩增产物，上游同源重组臂为左臂、其基因序列为SEQ ID NO.13所示，下游同源重组臂为右臂、其基因序列为SEQ ID NO.14所示，酶切载体质粒pK2-PB并纯化线性质粒，上游重组臂片段与线性质粒在重组酶中进行一步克隆，重组产物至大肠杆菌感受态DH5α，得到pK2-PB- MaLepE重组质粒；

（2）回复载体（pK2-sur-MaLepE）的构建

从蝗绿僵菌基因组中扩增带有MaLepE自身启动子与编码区ORF序列，其基因序列为SEQ ID NO.15所示，与pK2-sur载体使用一步克隆的方法进行连接；

（3）农杆菌的转化以及与蝗绿僵菌的共培养

将pK2-PB-MaLepE的质粒转化农杆菌后与野生蝗绿僵菌孢子共培养发生同源重组；回复pK2-sur-MaLepE质粒转化农杆菌后与ΔMaLepE蝗绿僵菌孢子共培养发生同源重组；

（4）蝗绿僵菌转化子的筛选