CN101054589A - 对鞘翅目害虫高效的cry8F基因、其表达蛋白及其应用 - Google Patents

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CN101054589A CN 200710090542 CN200710090542A CN101054589A CN 101054589 A CN101054589 A CN 101054589A CN 200710090542 CN200710090542 CN 200710090542 CN 200710090542 A CN200710090542 A CN 200710090542A CN 101054589 A CN101054589 A CN 101054589A
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Abstract

本发明涉及“对鞘翅目害虫高效的cry8F基因、其表达蛋白及其应用”,属生物防治技术领域。使用cry8F基因或/和其编码的蛋白质,对鞘翅目害虫产生高毒力,并可通过应用于转化微生物和植物,使它们表现出对相关害虫的毒性,克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。

Description

对鞘翅目害虫高效的cry8F基因、其表达蛋白及其应用
本申请是专利申请号为:2004100098082的分案申请
原申请的发明名称为:对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株和基因
申请人:中国农业科学院植物保护研究所
技术领域
本发明属于生物防治技术领域。本发明涉及一种对鞘翅目害虫具有活性的苏云金芽孢杆菌菌株,涉及对鞘翅目害虫高毒力的cry8E和cry8F基因的核苷酸序列和分别由其编码的蛋白质的氨基酸序列,涉及协同组合使用cry8E与cry8F基因表达产物。
背景技术
金龟子属于鞘翅目金龟总科(Scarabaeidae),其幼虫(俗称蛴螬,本发明以下也简称为“蛴螬”)是一类重要的世界性分布地下害虫,可危害粮食、棉花、油料作物、蔬菜、糖料作物、烟草、牧草、花卉、草坪草、果树等多种植物。大量调查表明,蛴螬在地下害虫中的危害居首位,其中主要以鳃金龟科和丽金龟科幼虫为主,占总地下害虫量的70-80%以上。据统计每年全国蛴螬发生面积约1亿亩,严重年份曾达3亿2千万亩,产量损失高达20%以上,有些地块甚至绝产。近年发生面积最大、发生量最多的为黄淮海地区,主要危害粮食、油料等作物;其它地区的危害情况也很严重,如危害甘蔗的蛴螬,在广东、广西、云南、四川、福建等地普遍发生;在西藏、青海、甘肃、新疆等西部地区,蛴螬的发生也很严重(魏鸿钧等,《中国地下害虫》,上海:上海科学技术出版社,1989,1-41;王永祥等,“冀中平原区蛴螬种类及综合防治技术”,《河北师范大学学报》(自然科学版),1998,22(2):268-270)。以在我国油料作物中种植面积仅次于油菜居第二位的花生为例。我国的花生产量占世界花生总产量的35%左右,居世界首位,年出口收入达207亿美元,2001年全国花生面积(500万公顷)和总产(1450万吨)均达到历史最高水平。但蛴螬对花生的危害十分严重。为控制蛴螬的危害,一般采用农业、化学、物理等综合防治策略,这虽有一定成效,却难以达到持续控制的效果。因此,寻找新的有效防治方法,已成为当务之急。
在获得对蛴螬高毒力Bt基因的基础上,培育杀蛴螬的转基因植物是一条值得探索的新的防治途径。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种分布极其广泛的***。它在形成芽孢的同时,能产生蛋白性质的伴孢晶体(parasporal crystal),对鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多种昆虫,以及线虫、螨类和原生动物具有特异性的杀虫活性(Schnepf,E.N.et al,Microbiol.And Molecular Biology Review,1998,62:3775-806)。这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)又称δ-内毒素(delta-endotoxin),对人畜无害,不污染环境,因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。
目前人们已经克隆了300多种编码杀虫晶体蛋白的Bt杀虫基因,它们分属141种模式基因。近年国际上cry8类基因的研究动向引人瞩目。研究表明,这类基因对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有杀虫作用。1992年,Ohba等在世界上首次从Bt菌株中筛选出对金龟子幼虫具有特异杀虫活性的新菌株(B.t.subsp.Japonensis BuiBui)(Ohba,M.et al.,Aunique isolate of Bacillus thuringiensis serovar japonensis with a high larvicidal activity specificfor scarabaeid beetles,Letters in Applied Microbiology,1992.14:54-57),1994年Sato等从中克隆出一种新的杀虫基因cry8C(Sato,R.et al,Cloning,heterologous expression,and localization of anovel crystal protein gene from Bacillus thuringiensis serovar japonensis strain buibui toxic toscarabaeid insects,Curr.Microbiol.1994.28:15-19.4)。目前已发现9种基因,编码的蛋白由1160-1210个氨基酸组成,分子量在128-137kDa之间。详细的信息见表1(Asano,S.,Yamanaka,S.and Takeuchi,K.,Protein having insecticidal activity,DNA encoding the protein,and controllingagent and controlling method of noxious organisms,2002,JP 2002045186-A and JP2002045186-A/2))。其中美国Mycogen公司分离的Cry8Aa1和Cry8Ba1对金龟科的多种害虫具有明显的杀虫活性(Tracy E.Michaels,et al.,Bacillus thuringiensis toxins active against scarabpests,1994,USP5554534)。美国从Bt菌株中分离了两种基因cry8Bb1和cry8Bc1基因,发现对西方玉米根叶甲(Western corn rootworm)具有显著的杀虫效果并已用于转基因抗虫玉米的开发(Abad,Andre,R.,Duck Nicholas,B.,Feng,Xiang,Flannagan Ronald,D.,Kahn,Theodore,W.,Sims,Lynne,E.Genes encoding novel proteins with pesticidal activity against coleopterans,2002,WO 02/34774 A2)。在我国,河北省农业科学院植物保护研究所和河北农业大学近年来先后筛选获得多株对黄褐丽金龟(Anomala exoleta)和铜绿丽金龟(A.corpulenta)幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株,室内生测死亡率均达100%(冯书亮等,“一株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株”,《中国生物防治》,2000,16(2):74-78)。
                             表1苏云金芽孢杆菌Cry8类杀虫晶体蛋白
名称 编号 分子量   氨基酸数 Bt菌株 活性 文献出处
Cry8Aa1 U04364 131.00 1157 kumamotoensis scarabs   Tracy,et al,1994
Cry8Ba1 U04365 133.54 1169 kumamotoensis scarab   Tracy,et al,1994
Cry8Bb1 AX543924 136.53 1206 Bt Leptinotarsadecemlineata,Diabrotica virgiferavirgifera,Deiabroticaundecimpunctatahowardi   Abad,et al,2002
Cry8Bc1 AX543926 137.20 1210 Bt Abad,et al,2002
Cry8Ca1 U04366 130.42 1160   japonensisBuibui Anomala cuprea   Sato,et al.1994
  Cry8Da1   AB089299   128.05   1144   Bt galleriae Anomala cuprea   unpublished
Cry8Da2 BD133574 130.51 1167 Bt scarabs   Asano,et al,2002
Cry8Da3 BD133575 130.51 1167 Bt scarabs   Asano,et al,2002
发明内容
本发明的目的是提供对暗黑鳃金龟、椰心叶甲等鞘翅目重要害虫具有高毒力的一种苏云金芽孢杆菌菌株和两种新的cry8E和cry8F模式基因序列,以及一种对暗黑鳃金龟具有明显增效作用的cry8E和cry8F基因组合,以应用于转化微生物和植物,使之表现出对相关害虫的毒性,并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。
本发明的技术方案:
1.对鳃金龟地下害虫有效的Bt菌株185的筛选与鉴定
本发明自行分离了Bt菌株185。土壤采自河北省保定市顺平县苹果园。取0.1-0.2g土样放入装有10ml灭菌水和玻璃珠的试管中,在旋涡振荡器上振荡3分钟,将土粒打碎,然后放于200rpm摇床上振荡10分钟,75℃水浴锅中水浴17分钟,充分将非芽孢菌杀死,待稍静置后,选取10-2、10-3、10-4三个稀释度,分别吸取100ul菌悬液于BP平板上,涂布均匀,于37℃培养三天,挑取似Bt菌落涂片镜检。发现一株含有球形晶体的Bt菌株(见附图1)。
该菌株的培养条件为30℃,普通LB培养基,pH7.0。该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)、苏云金芽孢杆菌种,并已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏日期为2004年11月5日,保藏编号为CGMCC NO.1242。经鉴定,关于该菌株的信息包括:能形成芽孢,同时能形成球形伴孢晶体,SDS-PAGE电泳表明其杀虫晶体蛋白约为130kDa(见附图2);其晶体蛋白在14小时开始表达,而生长曲线表明其14小时已进入停滞期(见附图3),表明该晶体蛋白启动子可能为依赖芽孢形成的;生物学测定表明,该菌株对金龟科地下害虫暗黑鳃金龟具有明显杀虫作用,7天校正死亡率达90%,对椰心叶甲也具有一定的杀虫活性(见表2)。
                表2Bt菌株185的杀虫活性
  7天校正死亡率%   14天校正死亡率%
  暗黑鳃金龟   90   100
  椰心叶甲   22   35
2.菌株185中cry基因鉴定
根据cry8类基因保守区设计了一对通用引物:
S5un8:5-’CGGCAAACTTAGTAGAATGC-3’
S3un8:5-’CTGACTGATTTCCACCATCACG-3。
表3是这些基因与引物的同源序列,表4是用这对引物预测的cry8基因扩增产物,以及酶切片段大小,通过这种PCR-RFLP方法可以分别鉴定出将这些基因。
                    表3引物与cry8各基因的保守区配对情况及配对区在基因上的位置
  基因型   引物S5un8/S3un8与基因的保守区配对情况
  引物S5un8:5`-cggcaaacttagtagaatgc-3` 位置   引物S3un8:5`-gcactaccacctttagtcagtc-3 位置
  cry8Aacry8Bacry8Bbcry8Bccry8Cacry8Da   cggcaaacttagtGgaatgccggcCaacttagtGgaatgccggcaaacttagtGgaatgccggcaaacttagtGgaatgccggcaaacttaAtagaatgcTAAAaaacttagtagaatgc   2101~21202089~21082104~21232116~21352092~21112044~2063   cgtgatggtggaaatcaAtcagcgtgatggtggaaatcaAtcagcgtgatggtggaaacaAAcagcgtgatggtggaaatcaAAcagcgtgatggtgcaaatcagAcagcgtgatggtgCGaatcagTcag   3273~32943261~32823276~32973288~33093282~33033234~3255
注:“N”为不配对碱基。
           表4cry8的PCR扩增产物和限制性酶切长度多态性
  基因型   PCR(S5un8/S3un8)
  产物大小Size(bp)   EcoO109I和DraI酶切结果Digested with EcoO109I and DraI(bp)
  cry8Aacry8Bacry8Bbcry8Bccry8Cacry8Da   119411941194119412121212   197,442,555639,555,639,555639,555197,92,310,613197,92,310,613
用下列PCR反应体系(50μL)鉴定了Bt菌株185:
  10×PCR buffer   5μL
  MgCl2(20mM)  6μL
  dNTP(10mM)  1μL
  引物对(10mM)  1μL/个
  模板  1uL
  Taq聚合酶(5U/μL)  0.5μL
超纯水补至50μL,混匀离心,加石蜡油30μL。
扩增循环:94℃变性1分钟,54℃退火1分钟,72℃延伸4分钟,25个循环,最后72℃延伸10分钟。
结果(见附图4)显示与已知cry8类基因的图谱不同,表明菌株185中可能含有新的cry8杀虫基因。
3.菌株185中cry8E基因的克隆
用PstI和KpnI酶切Bt菌株总DNA,用载体pBluescript SK(+)分别建立了两个DNA片段库,然后用引物S5un8/S3un8(见表3)和PCR方法检测两个DNA库,得到两个阳性克隆pSS3612和pSS162,分别***11kb的pstI片段和2.0kb的KpnI片段(见附图5)。酶切分析pSS3612,7kb的PstI和KpnI双酶切片段含有cry8Ea1的全长基因,用pBluescript SK(+)亚克隆该片段,得到pSS3612-7,同时亚克隆了4kb的KpnI片段中,得到pSS3612-4(见附图6)。将pSS162和pSS3612-7的***序列测序。得到序列SEQ ID NO 1。
4.cry8Ea1基因的序列分析
序列SEQ ID NO 1为pSS3612中PstI和KpnI双酶切片段,序列全长7276bps,分析表明其含有两个较大的开放阅读框,ORF1的位置是3658-7152,ORF2的位置是2799-3377。
ORF1的位置是3658-7152,GC含量为38.03%,编码1164个氨基酸组成的蛋白。经测定,其氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示。同源分析表明该蛋白与Cry8类蛋白具有较高同源性,表5为其同源性数据。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78%,最高只有58.2%(Cry8Bb1),被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Ea1。
                                      表5Cry8蛋白同源比较数据
  Cry8a1   Cry8Ba1   Cry8Bb1   Cry8Bc1   Cry8Da1   Cry8Ca1   Cry8Ea1   Cry8Fa1
  Cry8Aa1   100%
  Cry8Ba1   46.10%   100%
  Cry8Bb1   47.20%   82.10%   100%
  Cry8Bc1   46.10%   83.50%   90.50%   100%
  Cry8Da1   51.30%   26.20%   25.60%   25.50%   100%
  Cry8Ca1   36.70%   21.20%   21.30%   21.00%   63.10%   100%
  Cry8Ea1   26.60%   55.60%   57.00%   58.20%   26.10%   21.00%   100%
  Cry8Fa1   24.40%   42.50%   42.40%   42.10%   24.60%   20.60%   64.80%   100%
本发明进一步分析了Cry8Ea1蛋白的氨基酸组成(见表6,附图7),得知其分子量为131.56kDa,等电点为pH4.735(见附图8)。
                表6Cry8Ea1蛋白的氨基酸组成
  氨基酸   数目   百分比%   氨基酸   数目   百分比%
  Ala(A):   63   5.41   Asn(N):   80   6.87
  Asx(B):   0   0   Pro(P):   52   4.46
  Cys(C):   4   .34   Gln(Q):   61   5.24
  Asp(D):   63   5.41   Arg(R):   62   5.32
  Glu(E):   80   6.87   Ser(S):   93   7.98
  Phe(F):   43   3.69   Thr(T):   87   7.47
  Gly(G):   80   6.87   Val(V):   81   6.95
  His(H):   9   .77   Trp(W):   17   1.46
  Ile(I):   62   5.32   Unk(X):   0   0
  Lys(K):   46   3.95   Tyr(Y):   69   5.92
  Leu(L):   93   7.98   Glx(Z):   0   0
  Met(M):   19   1.63   Total   1164   1164
5.cry8Fa1基因的克隆
对pSS162质粒中***序列进行了分析,片段长2.3kb,具有完整的3’端序列,与cry8Ea1序列完全同源,但5’端差异较大,并且缺少完整的读码框,根据该序列的特异区段设计了1对引物(5-185-KpnI:TTGGTATGGCGTTTCGTTG;和3-185-Kpnl:TATTGCAGGTCCAGGATTCAC),用于克隆该全长基因,将菌株185的质粒DNA用XbaI酶切,与载体pBluescript SK(+)连接,筛选得到***约9Kb外源片段的阳性克隆pSS266(见附图9),进一步酶切分析表明ClaI酶切产生的3.0kb片段含有5’端读码框(见附图10),用pBluescript SK(+)亚克隆得到该片段,阳性克隆命名为pSS266-3,对该片段进行了测序,把得到的序列与pSS162中的***序列进行拼接得到3.9kb片段。
6.cry8F基因的序列分析
对上述3.9kb的核酸片段进行测序,得到的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。对该序列进行分析表明:该序列含有1个较大的开放阅读框357-3878;GC含量为36.88%;编码1174个氨基酸组成的蛋白(其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示)。进一步的同源分析表明,该蛋白质与Cry8类蛋白有较高的同源性(同源性数据见以上表5)。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78%,最高只有64.8%(Cry8Ea1),该蛋白被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Fa1。
本发明用生物分析软件Bioedit进一步分析了Cry8Fa1蛋白的氨基酸组成,结果见表7和附图11。结果表明,该蛋白的分子量为133.08kDa,等电点为pH4.565(见附图12)。
                     表7Cry8Ea1蛋白的氨基酸组成
  氨基酸   数目   百分比%   氨基酸   数目   百分比%
  Ala(A):   68   5.79   Asn(N):   91   7.75
  Asx(B):   0   0   Pro(P):   54   4.59
  Cys(C):   3   .25   Gln(Q):   60   5.11
  Asp(D):   62   5.28   Arg(R):   60   5.11
  Glu(E):   87   7.41   Ser(S):   82   6.98
  Phe(F):   47   4   Thr(T):   91   7.75
  Gly(G):   68   5.79   Val(V):   79   6.72
  His(H):   12   1.02   Trp(W):   15   1.27
  Ile(I):   72   6.13   Unk(X):   0   0
  Lys(K):   40   3.4   Tyr(Y):   63   5.36
  Leu(L):   102   8.68   Glx(Z):   0   0
  Met(M):   18   1.53   Total   1174   100
7.cry8E和cry8F基因的表达
本发明根据克隆的cry8Ea1和cry8Fa1基因的全长序列,设计了用于表达两种基因的引物,序列如下:
8E1:CGC GGATCC(Bam HI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG
8E2:ACGC GTCGAC(Sal I)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC
8F1:CGC GGATCC(Bam HI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG
8F2:CATTAACTCTGCCCACGGATC T(C)TCTGGTGCAAAGAAGTCCAG
8F3:CTTGACTTCTTTGCACCAGA A(G)GATCCGTGGGCAGTTAATG
8F4:CCG CTCGAG(Xho I)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC
引物8E1和8E2分别引入BamHI和SalI位点,以含全长cry8Ea1的pSS3612质粒DNA为模板,扩增得到全长基因,***Bt表达载体pSXY422b中,转化大肠杆菌SCS110,提取质粒,电击转化Bt无晶体突变株HD-73-中(该突变株来源于中国农业科学院植物保护研究所生物技术实验室,可以向公众提供),得到工程菌BioT8E。
由于cry8Fa1全长基因内存在1个BamHI切点,用重叠引物PCR的方法对这一位点进行了突变,重叠引物8F2和8F3中引入了点突变(划线部分)、引物8F1和8F4分别引入BamHI和XhoI。以含全长cry8Fa1基因的pSS266质粒DNA为模板,分别用8F1和8F2、8F3和8F4扩增得到0.3kb和3.1kb产物,再分别以它们为模板,分别利用引物8F1和8F4扩增得到3.4kb的全长基因,***Bt表达载体pSXY422b中,转化大肠杆菌SCS110,提取质粒,电击转化Bt无晶体突变株HD-73-中,得到工程菌BioT8F。
分别将上述两株工程菌30℃于牛肉膏培养基(蛋白胨5克,牛肉膏3克,葡萄糖10克,水1000mL,121℃,20分钟高压蒸汽灭菌)中培养30小时,取500μL菌液至Eppendorf管中,超声波破碎30秒钟(B.Braun U Labsonic,230V,T间隔=0.5秒);取100μL加入25μL新配0.5N NaOH,25℃作用5分钟;加入65μL 3×样品缓冲液(925μL上样缓冲液+75μL β-巯基乙醇),100℃煮沸5分钟。离心除去沉淀。上样10uL进行SDS-PAGE电泳分析结果(方法参见Sambrook,J.et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.1989)。结果(见附图13)表明,工程菌Biot8E和Biot8F中的cry8Ea1和cry8Fa1基因均获得了表达,表达物的分子量为130kDa左右。
8.Cry8E和Cry8F蛋白的活性测定
将Bt工程菌株接种在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养3天。将受体菌株HD-73-接种在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养4天。将培养物洗下,2倍梯度浓度稀释,将40ml菌悬液加入到200g有均匀粗细土豆丝的细土(紫外线灭菌)中,混匀,使土壤含水量保持在18%-20%。接入暗黑鳃金龟15天龄幼虫20头,以加入清水的处理为空白对照,28℃感染饲养,14天检查死虫数,计算LC50。结果见表8,表明工程菌株对暗黑鳃金龟具有极高的毒杀活性。其表达的Cry8E和Cry8F蛋白均具有杀暗黑鳃金龟幼虫的活性。
        表8Bt工程菌和185菌株对暗黑鳃金龟幼虫的毒力测定
  菌株   LC50(108cfu/ml)   回归方程   R值
  Biot8E   0.5250   Y=5.3841+1.3724X   0.9671
  Biot8F   0.9464   Y=5.0276+1.1515X   0.9918
菌种保藏信息:
菌种名称:芽孢杆菌属、苏云金芽孢杆菌,Bacillus thuringiensis
保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏日期:2004年11月5日
保藏编号:CGMCC NO.1242
附图说明
图1:185菌株芽孢和晶体形态。
图2:185菌株晶体蛋白SDS-PAGE分析。
图3:185菌株生长曲线。
图4:菌株185的PCR-RFLP图谱。其中:
M.DNA分子量标准,1.PCR产物,2.PCR产物酶切。
图5:重组质粒pSS162和pSS3162的PCR扩增产物和酶切分析。
其中:M.λDNA/Eco 130I,1.pSS162 PCR产物,2.pSS3162 PCR产物,3.pBlueScriptSK(+)/KpnI,4.pSS162/KpnI,5.pSS3162/PstI。
图6:pSS3612***片段的亚克隆酶切分析。
其中:M.λDNA/Eco 130I,1.pBlueScript SK(+)/KpnI,2.pSS3162/PstI+KpnI,3.pSS3612/KpnI,4.pSS3162/PstI+KpnI。
图7:Cry8Ea1蛋白的氨基酸组成图。
图8:Cry8Ea1蛋白的滴定曲线。
图9:重组质粒pSS266的PCR扩增产物和酶切分析。其中:
M.λDNA/Eco 130I,1.pSS266 PCR产物,2.pSS162/XbaI,3.pBlueScript SK(+)/XbaI。
图10:重组质粒pSS266的酶切分析。
其中:1.XbaI,2.NotI,3.PstI,4.NdeI,5.ClaI,6.SacI,7.KpnI,M.λDNA/Eco130I。
图11:Cry8Fa1蛋白的氨基酸组成图。
图12:Cry8Fa1蛋白的滴定曲线。
图13:cry8Ea1和cry8Fa1基因在Bt无晶体突变株中的表达。
其中:M.蛋白质分子量标准,1.Biot8E,2.Biot8F,3.Bt 185,4.HD-73-
具体实施方式
以下叙述根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是,本发明的实施例对于本发明只有说明作用,而没有限制作用。
实施例1、对鳃金龟地下害虫有效的Bt菌株185的筛选与鉴定
土壤采自河北省保定市顺平县苹果园。取0.1-0.2g土样放入装有10ml灭菌水和玻璃珠的试管中,在旋涡振荡器上振荡3分钟,将土粒打碎,然后放于200rpm摇床上振荡10分钟,75℃水浴锅中水浴17分钟,充分将非芽孢菌杀死,待稍静置后,选取10-2、10-3、10-4三个稀释度,分别吸取100ul菌悬液于BP平板上,涂布均匀,于37℃培养三天,挑取似Bt菌落涂片镜检。发现一株含有球形晶体的Bt菌株(见附图1)。
该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)、苏云金芽孢杆菌种。将该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提交保藏,保藏日期为2004年11月5日,保藏编号为CGMCCNO.1242。经鉴定,关于该菌株的信息包括:能形成芽孢,同时能形成球形伴孢晶体,SDS-PAGE电泳表明其杀虫晶体蛋白约为130kDa(见附图2),其晶体蛋白在14小时开始表达,而生长曲线表明其14小时已进入停滞期(见附图3),表明该晶体蛋白启动子可能为依赖芽孢形成的;生物学测定表明,该菌株对金龟科地下害虫暗黑鳃金龟具有明显杀虫作用,7天校正死亡率达90%,对椰心叶甲也具有一定的杀虫活性。
实施例2、菌株185中cry基因鉴定
根据cry8类基因保守区设计了一对通用引物
S5un8:5-’CGGCAAACTTAGTAGAATGC-3’
S3un8:5-’CTGACTGATTTCCACCATCACG-3。
用下列PCR反应体系(50μL)鉴定了Bt菌株185:
  10×PCR buffer  5μL
  MgCl2(20mM)  6μL
  dNTP(10mM)  1μL
  引物对(10mM)  1μL/个
  模板  1uL
  Taq聚合酶(5U/μL)  0.5μL
超纯水补至50μL,混匀离心,加石蜡油30μL。
扩增循环:94℃变性1分钟,54℃退火1分钟,72℃延伸4分钟,25个循环,最后72℃延伸10分钟。结果(见附图4)显示与已知cry8类基因的图谱不同,表明菌株185中可能含有新的cry8杀虫基因。
实施例3、菌株185中cry8E基因的克隆
用PstI和KpnI酶切Bt菌株总DNA,用载体pBluescript SK(+)分别建立了两个DNA片段库,然后用引物S5un8/S3un8和PCR方法检测两个DNA库,得到两个阳性克隆pSS3612和pSS162,分别***11kb的pstI片段和2.0kb的KpnI片段(见附图5)。酶切分析pSS3612,7kb的PstI和KpnI双酶切片段含有cry8Ea1的全长基因,用pBluescript SK(+)亚克隆该片段,得到pSS3612-7,同时亚克隆了4kb的KpnI片段中,得到pSS3612-4(如附图6)。将pSS162和pSS3612-7的***序列测序,得到序列SEQ ID NO 1。该序列为pSS3612中PstI和KpnI双酶切片段,序列全长7276bps,分析表明其含有两个较大的开放阅读框,ORF1的位置是3658-7152,ORF2的位置是2799-3377。
ORF1的位置是3658-7152,GC含量为38.03%,编码1164个氨基酸组成的蛋白,经测定,其氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示。同源分析表明该蛋白与Cry8类蛋白具有较高同源性(见表5)。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78%,最高只有58.2%(Cry8Bb1),被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Ea1。
本发明进一步分析了Cry8Ea1蛋白的氨基酸组成(见表6和附图7),得知其分子量为131.56kDa,等电点为pH4.735(见附图8)。
实施例4、cry8Fa1基因的克隆
对pSS162质粒中***序列进行了分析,片段长2.3kb,具有完整的3’端序列,与cry8Ea1序列完全同源,但5’端差异较大,并且缺少完整的读码框,根据该序列的特异区段设计了1对引物(5-185-KpnI:TTGGTATGGCGTTTCGTTG;和3-185-Kpnl:TATTGCAGGTCCAGGATTCAC),用于克隆该全长基因,将185质粒DNA用XbaI酶切,与载体pBluescript SK(+)连接,筛选得到***约9Kb外源片段的阳性克隆pSS266(见附图9),进一步酶切分析表明ClaI酶切产生的3.0kb片段含有5’端读码框(见附图10),用pBluescript SK(+)亚克隆得到该片段,阳性克隆命名为pSS266-3,对该片段进行了测序,把得到的序列与pSS162中的***序列进行拼接得到3.9kb片段。对核酸片段进行测序,得到如SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。对该序列进行分析表明:该序列含有1个较大的开放阅读框357-3878;GC含量为36.88%;编码1174个氨基酸组成的蛋白(该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示)。进一步的同源分析表明,该蛋白质与Cry8类蛋白有较高的同源性(见表5)。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78%,最高只有64.8%(Cry8Ea1),该蛋白被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Fa1。
本发明用生物分析软件Bioedit进一步分析了Cry8Fa1蛋白的氨基酸组成(见表7和附图11)。结果表明,该蛋白质的分子量为133.08kDa,等电点为pH4.565(见附图12)。
实施例5、cry8E和cry8F基因的表达
根据克隆的cry8Ea1和cry8Fa1基因的全长序列,设计了用于表达两种基因的引物,序列如下:
8E1:CGC GGATCC(Bam HI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG
8E2:ACGC GTCGAC(Sal I)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC
8F1:CGC GGATCC(Bam HI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG
8F2:CATTAACTCTGCCCACGGATC T(C)TCTGGTGCAAAGAAGTCCAG
8F3:CTTGACTTCTTTGCACCAGA A(G)GATCCGTGGGCAGTTAATG
8F4:CCG CTCGAG(Xho I)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC
引物8E1和8E2分别引入BamHI和SalI位点,以含全长cry8Ea1的pSS3612质粒DNA为模板,扩增得到全长基因,***Bt表达载体pSXY422b中,转化大肠杆菌SCS110,提取质粒,电击转化Bt无晶体突变株HD-73-中,得到工程菌BioT8E。
由于cry8Fa1全长基因内存在1个BamHI切点,用重叠引物PCR的方法对这一位点进行了突变,重叠引物8F2和8F3中引入了点突变(划线部分)、引物8F1和8F4分别引入BamHI和XhoI。以含全长cry8Fa1基因的pSS266质粒DNA为模板,分别用8F1和8F2、8F3和8F4扩增得到0.3kb和3.1kb产物,再分别以它们为模板,分别利用引物8F1和8F4扩增得到3.4kb的全长基因,***Bt表达载体pSXY422b中,转化大肠杆菌SCS110,提取质粒,电击转化Bt无晶体突变株HD-73-中,得到工程菌BioT8F。
分别将上述两株工程菌30℃于牛肉膏培养基中培养30小时,取500μL菌液至Eppendorf管中,超声波破碎30秒钟(B.Braun U Labsonic,230V,T间隔=0.5秒);取100μL加入25μL新配0.5NNaOH,25℃作用5分钟;加入65μL 3×样品缓冲液(925μL上样缓冲液+75μL β-巯基乙醇),100℃煮沸5分钟。离心除去沉淀。上样10uL进行SDS-PAGE电泳分析结果。结果(见附图13)表明,工程菌Biot8E和Biot8F中的cry8Ea1和cry8Fa1基因均获得了表达,表达物的分子量为130kDa左右。
实施例6、Cry8E和Cry8F蛋白的活性测定
将Bt工程菌株接种在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养3天。将受体菌株HD-73-接种在普通细菌琼脂克氏瓶培养基上培养4天。将培养物洗下,2倍梯度浓度稀释,将40ml菌悬液加入到200g有均匀粗细土豆丝的细土(紫外线灭菌)中,混匀,使土壤含水量保持在18%-20%。接入暗黑鳃金龟15天龄幼虫20头,以加入清水的处理为空白对照,28℃感染饲养,14天检查死虫数,计算LC50。结果(见表8)表明工程菌株对暗黑鳃金龟具有极高的毒杀活性。其表达的Cry8E和Cry8F蛋白均具有杀暗黑鳃金龟幼虫的活性。
附:本发明所涉及的DNA序列和蛋白质序列
SEQ ID NO 1(cry8Ea1基因的核苷酸序列):
ctgcagaata gacacggata cgatcgcctt cacataaatg ctgaaatctt cttctagaca  60
PstI
ttcttgtgtc acctcatttt ttgtttttaa actacagtat gttatatgca aaagaagggg    120
tagaggattg ggccttttac tacaaaaata caaaaacata cttatgattg catatggaga    180
tgtcaaagtg catgcattaa aaatggatta gaaatgattt caaataggca aaagcctatt    240
ccaatgaaga aagattgaca taggctattg tatatagaag aaggtaacga ggaacatact    300
gttagggtac acctaacata gaagtatgct tgtttgaagc atgtacatct tgaaatacca    360
gtagaaatat gggggaacat gttattttaa taattggtaa aatcttttgt tagaaggtga    420
aggcgtatga gacaacaaag agtatgtgag tgtaacaatt gtaggaaaaa gggtgagaag    480
aatcatcttt gtcaatatat aaaacgtggg gattgtatat gggtcagttc ctttggaagc    540
aagttacaaa agagtggtat tttcctgtta ataaaagatt cttttttatt atggtttgat    600
gaaaaacatc aattaaatca aaccagtcta caggggatcc atattgaaaa aagacaataa    660
atgaagaagg agtctcattg ttaacgaagt gtgtacatct atcatgtaca catcgtaagt    720
cgtatgttct acctgtatct ggtaggaaag aattgtcgca tgtgcaaggc gtatatacac    780
aaacatgttt tgttatattt ttgaataatt tgaaaataaa tatgttataa ttaatatact    840
ttcgtgtgtt ttttttgcga aatccctaga aagtatcgta aaaagtccct aacaattttg    900
tgaactgaac ccaaaaaatt agacaaatat attaagcagc tactaaggat tgaactctgt    960
attgcacggg ggacaatcct tttagttttg ttttaattct tttgtgattg tagtaatgaa    1020
tataagtttc tagttcttgc ttaaattgtt ccatactttc aaactcttta agataaagta    1080
attcagactt taataagcca aagaaatttt ccatgactgc attatctaag caatttccct    1140
tacgggacat actttggata acgttatgtt ttttaagcga ctgatgatat tgtcgcattt    1200
gataatgcca accttgatcc gagtgtaaaa taggagtttc cttatcattc aaacattgaa    1260
acgccttatt taacatttta gaaacaaggg aataggcagg tctatgttct atattgtaag    1320
ctataatttc tccgttatat aagtcttaaa tgggtgatag atatagtttt ttaccatgta    1380
agtggaactc cgtcacatct gttacccatt tctcgtttgg ttttgatgcg tgaaaattac    1440
gttttaaaat attaggagcg aatttcccga cagtcccttt atatgaacga tattttttta    1500
atcgaacaag acattttaat cccaggatat tcattaaacg tcgaacggtt ttatgattta    1560
atgcatggcc tcgattacgt aattccaatg taatacgacg ataaccatac ctcccaaaat    1620
tctcactaaa aatctcttta attaattctt taactttctt atatttatct ggacgtttcg    1680
cttgtttcat ccagtaataa tacgtactac gagcgatatt agcgactttc acaaggtcaa    1740
cgaccttata tttatgcctt aattcataaa tcaattgcgc tttgtcttgg tctgtgatgt    1800
tttcttcttt tgaactaagg cattcaactt ttttaaatag tcattttcca tacgcagacg    1860
ttcattctct gcttgtagcg cttctataga accttcaaga aatacttcgt tttgttttaa    1920
atgttgtagc ttagcttttt ctttggccat ggttagacgc ccctttttct ttgattttag    1980
ggcatctaat ccttctgttt cataagctac tttccatttt cggagtgttt cgcaagaagg    2040
aatattaaaa aaagcagctg tttctctcag agatgtccca ttttcattca tataatgaat    2100
tacatctagt ttatactcga gagggtaagt tgtatagcgt ttttcaaacg ccttttcccc    2160
tgaaaattca aaccgtttaa tccattgata aagttctcta ggatgaaccc ctatagaatt    2220
agcaatggtt tttccgcctt ccgtaccttc tagatatcgt tttactgctt gtattttatc    2280
ttttgaagaa aatttagcca taaaaaatgc acctccaatt gttaattatg tgtctaacaa    2340
ttggggtgca cttcattgtt ggggactttt gtatgttcct ttttagacat tcttttaagt    2400
tctttatata gaaagactga agaaagcaga ataagaagtc catcccctga ttcatgagaa    2460
ccgaaaaatt catgatgcac tggatgccaa atatttagat acatttccta ttgatattct    2520
acgagattga attgatgtaa tgttgttccc ttttggtcaa actgaccaat ggcgatagct    2580
ctccttgcat gagtacttct caaacttcca ttacacattg tattccccat cttttttatg    2640
tatatctttt ggggaaaatc gtaatttctg cttatgatga caagatttta ctaaaataag    2700
aagagtggaa tattttactc tatgtcaaac aaaaaagcaa tatatgttta aacgcgaaaa    2760
taatcatcat atcaacaatg cccggtacat aaagatag
Figure A20071009054200151
gggggattt ttcgaaatga    2820
                                   ORF2→
ttcgaaaagg ctccattgat tcgataggag gtgcacagaa aaaaatggaa gaacaatatg    2880
catcgcaaga tcagtcagat gtagaaggtt tcaagcggaa gaaaaaacat accattccct    2940
ttcaatgtat ggtttctatt ccaacagggt ttcaaattca aaaaccgaat acaccaaaac    3000
ttgtttatga tgtaagccat ttatctatgg taaaagagat gtgtaaacga gtgattgacg    3060
tagaggattg tgggcaagtc gaaatcgatt tacatgtctt aaaaatcaaa ggtgtcttac    3120
cctttattgt gaacgtttcc attgagccgc ttagtatgga acatgtgtat accacaagtg    3180
gtagagacac atccctattt ttaagttgtc aagaaaccgt atatgtggat catattttaa    3240
aatatagtgt cgatcatgtc ccgtattatg tgattgatgg tcatcatatt ctagtacgtg    3300
atgtcgtgat aaagttgttg gaagaaaacc cgcaaacggc tcaaatatca ggtgtttttt    3360
attttgatta tgca ttt caatagaaac aaaaacgttc tcttatacgg cattcccaaa    3420
               End codon
agcatcgcca ccttttttat catacaatag ttcgttctaa gaagagccgt aatatttttc    3480
tatctaacag gaattttatc atctacagaa gaatattctt atcatggtaa tgaggagagg    3540
gattgaaagt caaaagatta cctgatttgt catgtaagaa aaaggaatcg atcgtacagg    3600
aaagtcaaaa gaaagtgtaa aaattttata tcttgtgtat gtata
Figure A20071009054200153
aaaatag
Figure A20071009054200154
    3660
                                                  RBS  ORF1→
agtccaaata atcaaaatga atatgaaatt atagatatgg caccttctac atctgtatcc    3720
aatgattcta acagataccc ttttgcgagt gatccaacaa atgcattaca aaatatgaat    3780
tataaagagt atttaagaat gtctgaggga tatgatagtg aatattctgg ctcacctgaa    3840
gtgcttatta gtgagcgaga tgcggttaag acagcaatca gtttggtagg tactatatta    3900
ggaaaattag gagttccatt ggtaggaccg attgtgagcc tatatagtac acttattgat    3960
gttttgtggc caggtggaaa gagtcaatgg gaaattttta tggaacaagt agaagcactt    4020
attaatcaaa aaatagcaga atacgcaagg gctaaggcac ttgcagaatt agaagggtta    4080
ggaaataact atcaattata tttaacagca cttgaagaat ggcaggaaaa tccaagcagt    4140
acaagagtct tacgtgatgt tcggaatcga tttgaaatcc ttgatagctt atttacacaa    4200
tatatgcctt cttttcgggt aacaggttat gaagtaccat tactttcagt atatgcgcaa    4260
gcagctaacc ttcatttatt gttattaaag gacgcttcta tttttggaga agaatggggg    4320
ttctctacaa ccgctattaa taactattat aatcgtcaaa tgagtcttat cgcgcaatat    4380
tctgatcatt gtgtacaatg gtatagaact gggttagatc gattaaaagg atcgaatgct    4440
aaacaatggg ttgaatataa ccgcttccga agagaaatga cattatcggt gttagatatt    4500
atgacattat ttccaatgta tgacatgcgc acgtacccaa tggaaacaaa agcacaacta    4560
acaagggaag tatatacaga tccaattggt gccataggag cgcaaggttc ttggtatgac    4620
tcagcacctt ctttcaatac tctggaaagt acttttataa gaggaaagca tctatttgat    4680
tttataacta gactctctat atatacaggg cgaagctcat tcagtgctag taattactta    4740
aaaaaatgga tagggcatca aatatcctct caacctatag gcggcagtat acaaactcaa    4800
acctatggca ctacgagtgg cagttctgtt attgctacgc agcaaattgg ctttacaggt    4860
tttgacgttt ataagacttt atcaacagcg ggggttctgt ttgcttatac ttcgaaatat    4920
tatggcgtat ctaaagttgt ttttgatgcg atatatcctg acaacaagta taaaacaaca    4980
tttacctata atcctggatc tgaaggtatt ggagcgcaag aaaaggattc agaagttgaa    5040
ttgccaccag aaacattaga tcaacccaat tatgaggcgt atagccatag attgaattat    5100
gttacattta ttagaaatcc agatgtacca gtattttctt ggacacatcg gagtgcggat    5160
cgtacgaata cagtttattc agataaaatc actcaaatac cagttgtaaa ggccagtgac    5220
ggccctaaac cttccgctaa cgaagttgga cactatcttg gtggagatcc aatatcattt    5280
aactcttctg gtagcactgg agtgataagg ttaaatataa attcaccatt atcccaaaaa    5340
taccgtgtga gaattcgcta ttgctcttca gttgattttg acttagatgt agttcgtgga    5400
ggcactactg taaataatgg tagatttaac aaaagcgcgc ctaacgtcgg atggcaaagt    5460
ttgaagtatg aaaattttaa atttgcaagc ttttctacac cttttacatt taatcaagct    5520
caagatacat taaaaataag tgtaaggaat tttagttcaa tcgtaggagg cagcgtagtt    5580
tatatagacc gaatcgagct catcccagta aatgcaacat atgaggcaga acaagattta    5640
gattcggcaa agaaagcagt gaataccttg tttacgaata caaaagatgg tttacgacca    5700
ggggtaacgg attatgaagt gaatcaagcg gcaaacttag tggaatgcct atcggatgat    5760
ttgtatccaa atgaaaaacg cttgttattt gatgcagtga aagaggcaaa acgactcagc    5820
gaggcacgta acttactaca agatccagat ttccaagaga taaatggaga aaatggatgg    5880
accgcaagta caggaattga ggttgtagaa ggagatgctc tatttaaagg gcgttatcta    5940
cgcctaccag gtgcgagaga aatggataca gaaacgtatc caacgtatct gtatcaaaaa    6000
gtagaggaag gtgtattaaa accatacaca agatatagat tgagagggtt tgtcggaagc    6060
agtcaaggct tggaaatttc cacaattcgt catcagacga accgaattgt aaaaaatgtt    6120
ccagatgatt tattaccaga tgtacctcct gtaaactctg atggtagaat caatcgatgc    6180
agcgaacaaa agtatgtgaa tagccgttta gaaggagaaa gaggattacc aaatgggaat    6240
cgttctgctg aagcgcatga attctctctc cctattgata taggagagct ggattacaat    6300
gaaaatgcag gaatatgggt tggatttaag attacggacc cagagggata tgcaacactc    6360
ggtaaccttg aattggtaga agagggacca ttgtcaggag acgcactaga acgcctgcaa    6420
agagaagaac aacagtggaa gcttcaaatg acaaaaagac gtgaagagac ggatagaaaa    6480
tatacggcag caaaacaagc ggtagatcgt ttatatgcag attaccaaga tcaacaattg    6540
aatccaaacg tagaaattac ggatattact gcggcccaaa acctgataca gtccattcct    6600
tatgtatata atgaaatgtt cccagaaata caagggatga actatacgaa gtacacagag    6660
ttaacaaatc gactccaaca agcgtggggt ttgtatgatc aacgaaacgc cataccaaat    6720
ggtgatttcc gaaatgaatt aagtaattgg aatacaacat ctggtgtaaa tgtacaacaa    6780
atcaacaata cgtctgtctt agtcatgcca aactgggatg ggcaagtttc gcaacagttt    6840
acagttcaac cgaatcaaag atatgtatta cgagttactg caagaaaaga aggggtaggg    6900
aatgggtatg tgagtatccg tgatggtgga aatcaaacag aaacgcttac gtttagtgca    6960
agcgattata acacagatag tgtgtataat acgcaagtgt cgaatacaaa tggtttgtac    7020
aatgagcaaa caggatatac cacaaaaaca gtgacattca tcccatatac agatcaagtg    7080
tggattgaga tgagcgagac cgaaggtatg ttctatatag aaagtgtcga attgattgtt    7140
gacgtagag
Figure A20071009054200161
tggtagta cccctccaga tacaggtttc atctggaggg gtttttttct    7200
        End codon
gaaaaagggc ctttttgtag agaagaatcc gattatttta ttacgattat atattttgtg    7260
gatagatcat  ggtacc                                                  7276
            KpnI
SEQ ID NO 2(Cry8Ea1蛋白的氨基酸序列):
MSPNNQNEYE IIDMAPSTSV SNDSNRYPFA SDPTNALQNM NYKEYLRMSE GYDSEYSGSP    60
EVLISERDAV KTAISLVGTI LGKLGVPLVG PIVSLYSTLI DVLWPGGKSQ WEIFMEQVEA    120
LINQKIAEYA RAKALAELEG LGNNYQLYLT ALEEWQENPS STRVLRDVRN RFEILDSLFT    180
QYMPSFRVTG YEVPLLSVYA QAANLHLLLL KDASIFGEEW GFSTTAINNY YNRQMSLIAQ    240
YSDHCVQWYR TGLDRLKGSN AKQWVEYNRF RREMTLSVLD IMTLFPMYDM RTYPMETKAQ    300
LTREVYTDPI GAIGAQGSWY DSAPSFNTLE STFIRGKHLF DFITRLSIYT GRSSFSASNY    360
LKKWIGHQIS SQPIGGSIQT QTYGTTSGSS VIATQQIGFT GFDVYKTLST AGVLFAYTSK    420
YYGVSKVVFD AIYPDNKYKT TFTYNPGSEG IGAQEKDSEV ELPPETLDQP NYEAYSHRLN    480
YVTFIRNPDV PVFSWTHRSA DRTNTVYSDK ITQIPVVKAS DGPKPSANEV GHYLGGDPIS    540
FNSSGSTGVI RLNINSPLSQ KYRVRIRYCS SVDFDLDVVR GGTTVNNGRF NKSAPNVGWQ    600
SLKYENFKFA SFSTPFTFNQ AQDTLKISVR NFSSIVGGSV VYIDRIELIP VNATYEAEQD    660
LDSAKKAVNT LFTNTKDGLR PGVTDYEVNQ AANLVECLSD DLYPNEKRLL FDAVKEAKRL    720
SEARNLLQDP DFQEINGENG WTASTGIEVV EGDALFKGRY LRLPGAREMD TETYPTYLYQ    780
KVEEGVLKPY TRYRLRGFVG SSQGLEISTI RHQTNRIVKN VPDDLLPDVP PVNSDGRINR    840
CSEQKYVNSR LEGERGLPNG NRSAEAHEFS LPIDIGELDY NENAGIWVGF KITDPEGYAT    900
LGNLELVEEG PLSGDALERL QREEQQWKLQ MTKRREETDR KYTAAKQAVD RLYADYQDQQ    960
LNPNVEITDI TAAQNLIQSI PYVYNEMFPE IQGMNYTKYT ELTNRLQQAW GLYDQRNAIP    1020
NGDFRNELSN WNTTSGVNVQ QINNTSVLVM PNWDGQVSQQ FTVQPNQRYV LRVTARKEGV    1080
GNGYVSIRDG GNQTETLTFS ASDYNTDSVY NTQVSNTNGL YNEQTGYTTK TVTFIPYTDQ    1140
VWIEMSETEG MFYIESVELI VDVE                                           1164
SEQ ID NO 3(cry8Fa1基因的核苷酸序列):
atcgataaag ggaatggaag acaactcgca aatggctcaa atatcgggtg ttttttattt    60
tgattatgca taattacaat gaaaacaaaa agaattcatt tgtatagtat tcccagaaat    120
atcgtgacat cgtttatcat acaataattc gttctaagaa gagccggatt atttttcaat    180
ctaacaggaa ttttattgtc tacagaagaa tattcttatc acggtaatga ggagagggag    240
tgaaaatcaa aagagtacct gatttgtcat gtaagaacaa aagaaatcga tcgtacagga    300
aagtcaaaag aaagtgtaaa aaattttata tcttttgtat gtata
Figure A20071009054200171
aaaatag     360
                                                  RBS  ORF→
agtccaaata atcaaaatga atatgaaatt atagatatgg caccttctac atctgtaacc    420
aatgattcta acagataccc ttttgcgaat gagcccacaa atgcattaca aaatatgaat    480
tataaggatt atttaagaat gtctgaggga tattctcctg aatatttaac aagcctaagt    540
ccttacagcc agtttggcac agttgataag atcatcagta ttattagtct attgaatagt    600
gctgcaggta ttcctggtct tgattttttt actggattgc tgcaatttat tcttgacttc    660
tttgcaccag aggatccgtg ggcagagtta atggaactag tggaacaact catagatcaa    720
aaaataacag ttgctacaag agaaaaggcg ctcgcagaat taagaggact gataaatgga    780
taccttgtat atcagcaatc attagaaagt tggctggaaa atccaaatgc tacaagagct    840
agtatagttc gagaacaata tgtcgcttta gaacttgatt ttgttacttc gatttcatct    900
tttgcgatag ctggacagga agtaccgtta ttagccgtgt acgcacaagc tgctaattta    960
catttgttat tattgagaga tgtgtcaata tttggagaag aatggggatt aacagtaaat    1020
gaggttaata ccttctatat tcgtcaaatg acttatacaa ctgagtatag tgattattgt    1080
gtaagaattt ataatactgg cttaaataaa ttaaaaggat ctagtgcatc tagttgggtt    1140
gattataatc gctttcgtag agaaatgaac ttactagtac tagatattat tgcgttattt    1200
ccaaactatg atgttcgtag gtatccaatg gaaacaacaa cggaattaac aagagtagtt    1260
tacactgatc caattgtgtt tgacgaaagg aagggggtgg cgtcgactca tagttggacg    1320
gcgattgcac catctttctc aagtatagaa tctctaactc gacgaccagg attatttaca    1380
tggttagatc aactaactat tttttcgaaa cgcatatcgc aacctagtgt atttataaat    1440
agttgggcgg ggcataagat tagcaccttt agaacacaaa aaacagatat actcataaat    1500
accacccatg gagatactaa taatcctata aaagaatttg tagtagatac caaaaaagta    1560
gaagatattt atcaaacgat agcataccca catgcagtag caaatgaagt attctattta    1620
ttcggtgtcc caaaagttga ttttaatatg gtacctgcag gtggctctgc aaactctgca    1680
cacaccctca ttttttctga tagtacggga gggagactgg aaagtattac gaagaactca    1740
gaagcagaat tacctccaac agagtcatta tcagatacac ctcaaccaaa ccaagtaact    1800
tattctcaca gattagatta tgctacaata attaaagcaa ataaaagtta tggaagtggg    1860
tatattccat tattaggttg gacccatcgg agtgtagatc gtaataatac aatttatccg    1920
aataaaatca ctcaaatacc agcagtaaaa gctttctcat atactgaatc atttaatgta    1980
aatgttattg caggtccagg attcacagga ggagatttaa taagtttagg tcatttagag    2040
aatatttata tgaaattaaa cgttccaaat cctcaaaaat tccgtgttcg tattcgttat    2100
gctgctagta caacttcgta tttgcaaata actgggctat ctaatttagc tcagtctgat    2160
cgtttcgaac agacgtattc taatgaaaat gaaaacaatt tgatgtttga aaattttcaa    2220
tatgtagaac ttagaaatat tttttcggta gatgctccat tagaaaatca tcaagtaagt    2280
atacaaaatt atcaaggtaa tggttttgtt attatagacc gaatcgaatt catcccagta    2340
aatgcaacat atgaggcaga acaagattta gattcggcaa agaaagcagt gaataccttg    2400
tttacgaata caaaagatgg tttacgacca ggggtaacgg attatgaagt gaatcaagcg    2460
gcaaacttag tggaatgcct atcggatgat ttgtatccaa atgaaaaacg cttgttattt    2520
gatgcagtga aagaggcaaa acgactcagc gaggcacgta acttactaca agatccagat    2580
ttccaagaga taaatggaga aaatggatgg accgcaagta caggaattga ggttgtagaa    2640
ggagatgctc tatttaaagg gcgttatcta cgcctaccag gtgcgagaga aatggataca    2700
gaaacgtatc caacgtatct gtatcaaaaa gtagaggaag gtgtattaaa accatacaca    2760
agatatagat tgagagggtt tgtcggaagc agtcaaggct tggaaatttc cacaattcgt    2820
catcagacga accgaattgt aaaaaatgtt ccagatgatt tattaccaga tgtacctcct    2880
gtaaactctg atggtagaat caatcgatgc agcgaacaaa agtatgtgaa tagccgttta    2940
gaaggagaaa gaggattacc aaatgggaat cgttctgctg aagcgcatga attctctctc    3000
cctattgata taggagagct ggattacaat gaaaatgcag gaatatgggt tggatttaag    3060
attacggacc cagagggata tgcaacactc ggtaaccttg aattggtaga agagggacca    3120
ttgtcaggag acgcactaga acgcctgcaa agagaagaac aacagtggaa gcttcaaatg    3180
acaaaaagac gtgaagagac ggatagaaaa tatacggcag caaaacaagc ggtagatcgt    3240
ttatatgcag attaccaaga tcaacaattg aatccaaacg tagaaattac ggatattact    3300
gcggcccaaa acctgataca gtccattcct tatgtatata atgaaatgtt cccagaaata    3360
caagggatga actatacgaa gtacacagag ttaacaaatc gactccaaca agcgtggggt    3420
ttgtatgatc aacgaaacgc cataccaaat ggtgatttcc gaaatgaatt aagtaattgg    3480
aatacaacat ctggtgtaaa tgtacaacaa atcaacaata cgtctgtctt agtcatgcca    3540
aactgggatg ggcaagtttc gcaacagttt acagttcaac cgaatcaaag atatgtatta    3600
cgagttactg caagaaaaga aggggtaggg aatgggtatg tgagtatccg tgatggtgga    3660
aatcaaacag aaacgcttac gtttagtgca agcgattata acacagatag tgtgtataat    3720
acgcaagtgt cgaatacaaa tggtttgtac aatgagcaaa caggatatac cacaaaaaca    3780
gtgacattca tcccatatac agatcaagtg tggattgaga tgagcgagac cgaaggtatg    3840
ttctatatag aaagtgtcga attgattgtt gacg
Figure A20071009054200181
agt aatggtagta cccctccaga    3900
                                 End codon
tacaggtttc atctggaggg gtttttttct gaaaaagggc ctttttgtag agaagaatcc    3960
gattatttta ttacgattat atattttgtg gatagatcat ggtacc                   4006
SEQ ID NO 4(Cry8Fa1蛋白的氨基酸序列):
MSPNNQNEYE IIDMAPSTSV TNDSNRYPFA NEPTNALQNM NYKDYLRMSE GYSPEYLTSL    60
SPYSQFGTVD KIISIISLLN SAAGIPGLDF FTGLLQFILD FFAPEDPWAE LMELVEQLID    120
QKITVATREK ALAELRGLIN GYLVYQQSLE SWLENPNATR ASIVREQYVA LELDFVTSIS    180
SFAIAGQEVP LLAVYAQAAN LHLLLLRDVS IFGEEWGLTV NEVNTFYIRQ MTYTTEYSDY    240
CVRIYNTGLN KLKGSSASSW VDYNRFRREM NLLVLDIIAL FPNYDVRRYP METTTELTRV    300
VYTDPIVFDE RKGVASTHSW TAIAPSFSSI ESLTRRPGLF TWLDQLTIFS KRISQPSVFI    360
NSWAGHKIST FRTQKTDILI NTTHGDTNNP IKEFVVDTKK VEDIYQTIAY PHAVANEVFY    420
LFGVPKVDFN MVPAGGSANS AHTLIFSDST GGRLESITKN SEAELPPTES LSDTPQPNQV    480
TYSHRLDYAT IIKANKSYGS GYIPLLGWTH RSVDRNNTIY PNKITQIPAV KAFSYTESFN    540
VNVIAGPGFT GGDLISLGHL ENIYMKLNVP NPQKFRVRIR YAASTTSYLQ ITGLSNLAQS    600
DRFEQTYSNE NENNLMFENF QYVELRNIFS VDAPLENHQV SIQNYQGNGF VIIDRIEFIP    660
VNATYEAEQD LDSAKKAVNT LFTNTKDGLR PGVTDYEVNQ AANLVECLSD DLYPNEKRLL    720
FDAVKEAKRL SEARNLLQDP DFQEINGENG WTASTGIEVV EGDALFKGRY LRLPGAREMD    780
TETYPTYLYQ KVEEGVLKPY TRYRLRGFVG SSQGLEISTI RHQTNRIVKN VPDDLLPDVP    840
PVNSDGRINR CSEQKYVNSR LEGERGLPNG NRSAEAHEFS LPIDIGELDY NENAGIWVGF    900
KITDPEGYAT LGNLELVEEG PLSGDALERL QREEQQWKLQ MTKRREETDR KYTAAKQAVD    960
RLYADYQDQQ LNPNVEITDI TAAQNLIQSI PYVYNEMFPE IQGMNYTKYT ELTNRLQQAW    1020
GLYDQRNAIP NGDFRNELSN WNTTSGVNVQ QINNTSVLVM PNWDGQVSQQ FTVQPNQRYV    1080
LRVTARKEGV GNGYVSIRDG GNQTETLTFS ASDYNTDSVY NTQVSNTNGL YNEQTGYTTK    1140
TVTFIPYTDQ VWIEMSETEG MFYIESVELI VDVE                                1174

Claims (5)

1.cry8F基因,其特征是:该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
2.一种cry8Fal蛋白,其特征是该蛋白是由权利要求1的基因所编码,且其氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
3.权利要求1所述的cry8F基因在杀害鞘翅目害虫中的应用。
4.权利要求3所述的应用,是将cry8F基因转入植物或微生物中使其产生对鞘翅目害虫的毒性。
5.权利要求3所述的应用,是将cry8F基因表达的cry8Fal蛋白用于杀虫剂中。
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