CN116240222A - 一种密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型e2蛋白基因及其应用 - Google Patents

一种密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型e2蛋白基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施例涉及一种密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因及其应用，属于生物工程领域，所述密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。本发明成功构建获得了一株稳定表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的CHO细胞，该细胞株表达的E2蛋白具有表达量高，免疫原性好，易于纯化和生产的特点。

Description

一种密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因及其 应用
技术领域
本发明涉及兽用生物制品领域，具体为一种密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因、核酸构建体、重组表达载体、表达***细胞、牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白的制备方法、牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白、免疫原性组合物、牛病毒性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法、及它们在制备牛病毒性腹泻病毒的抗原、抗体、亚单位疫苗或检测试剂盒中的应用。
背景技术
牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)又称黏膜病，是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的以腹泻、发热、白细胞减少、口腔及消化道黏膜糜烂坏死、怀孕母牛流产及畸形胎等症状的一种接触性传染病。世界范围内广泛存在，可在牛群中持续存在和传播，严重影响牛的生产性能，导致产奶量下降、乳品质下降、生长迟缓、发育不良等。该病主要感染牛，犊牛更易感，同时也可感染绵羊、山羊、猪、鹿和其他反刍动物。怀孕母牛急性感染时，BVDV可经胎盘传染给胎儿，引起胎儿免疫耐受从而成为持续性感染(Persistently Infected,PI)牛，成为传播BVDV最主要的传染源。该病毒于1946年在纽约州从腹泻牛中首次发现，1957年成功分离，现已呈世界性分布，广泛分布于欧洲，美洲、大洋洲、亚洲、非洲等多个国家和地区。我国于1980年从国外引进的牛流产胎儿中首次发现并分离出中国第一株牛病毒性腹泻病毒，自此对于BVDV的报道日益增多，目前该病在世界范围内普遍存在，给养牛业带来巨大损失。
BVDV属于黄病毒科、瘟病毒属，同属的还有猪瘟病毒、绵羊边界病毒。BVDV为囊膜病毒，病毒粒子大小约40-60nm，基因组为单股正链RNA，基因组全长约12.3-12.5kb左右，包含一个5’非编码区，一个大的开放阅读框和不含polyA尾的3’非编码区。共编码4种结构蛋白(C、E0、E1、E2)和8种非结构蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。根据BVDV基因组5’NTR区差异可将其分为两个基因型，即BVDV-1和BVDV-2，近年来有BVDV-3的报道。根据其在细胞培养过程的病变产生情况，分为两种生物型，即致细胞病变型和非致细胞病变型。E2蛋白为BVDV重要的结构蛋白，含有BVDV主要的抗原决定簇，能诱导中和抗体产生，可有效中和病毒并抑制BVDV的感染，是研制亚单位疫苗的首选。此外，E2蛋白存在多个中和位点，对病毒RNA装配或病毒粒子的组装、以及病毒与受体或感染细胞的相互作用非常重要。
疫苗是预防转染病最有效的工具，欧盟多个国家采用清除持续性感染动物、提高疫苗保护性以及严格的生物安全操作等措施来净化牛病毒性腹泻，效果较为明显。目前牛病毒性腹泻病毒主要以灭活疫苗和弱毒疫苗为主。弱毒疫苗能快速诱导强效且持久的细胞和体液免疫应答，但存在免疫抑制和牛胎儿致病的风险。从安全性考虑，牛养殖业更多采用灭活疫苗进行预防。但灭活疫苗对母牛以及犊牛的保护效果较差，保护性抗体产生慢且副作用较大。目前尚未有一种疫苗能有效控制BVDV的传播且表达量高适合规模化生产的疫苗。因此，仍需要研发一直免疫原性好，临床使用安全、保护性好、产量高适合规模化生产的牛病毒性腹泻疫苗。
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供在于提供一种密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因、核酸构建体、重组表达载体、表达***细胞、牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白的制备方法、牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白、免疫原性组合物、牛病毒性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法、及它们在制备牛病毒性腹泻病毒的抗原、抗体、亚单位疫苗或检测试剂盒中的应用。
本发明成功构建获得了一株稳定表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的CHO细胞，该细胞株表达的E2蛋白具有表达量高，免疫原性好，易于纯化和生产的特点，为更好地预防和控制BVD的发展提供了技术手段。
解决方案
为实现本发明目的，提供如下技术方案：
一方面，本发明提供一种密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因，所述密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO.1序列为优化后的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因的基因序列：
catctggattgcaagcccgagtactcctacgctatcgccaagtccgacagaatcggactgcagggcgctgaggatctgaccaccgtgtggaaggattactcccatggcatgaccctggaagataccatggttatcgcctggtgcaaggacggaaagctgacctactacgcccggtgcaccagagagacaagatacctggccatcctgcactctagagccctgcctacctccgtggtgtttaagaagctgttcgaaggccagggccaagaggacaccgtggaaatggacgacaacttcgagttcggcctgtgtccttgcgacgccaagcctattgtgcggggcacctacaacaccacactgctgaatggcccagccttccagatggtctgccctatcggatggaccggcaccgtgtcttgtatgctggccaacagagacaccctggacacagctgtcgtgcggacctacagacggtcccggccatttccatacagacagggctgcatcacccagaaaaccctgggcgaagatctctacgactgcatcctcggcggcaactggacatgtgtgacaggcgatcagctgcagtacaccggcggctctgtgaagtcttgcaagtggtgcggcttcaagttcaagaagtccgagggcctgcctcactaccccatcggcaagtgcagactgaagaacgagacaggctacagattcgtggatggcacctcctgcaacagagaaggcgtggccattgtgcctcagggcctcgtgaagtgcaagatcggcgacacaatcgtgcaagtgatcgccctggataccaagctgggccccatgccttgcaagccttacgagatcatccccagcgagggccccgtggaaaagaccgcctgtaccttcaactacacacggaccctgaagaacaagtacttcgagccccgggactcctacttccagcagtacatgctgaagggcgagtaccagtattggttcgacctggaagtgaccgaccaccacagagactacttcgccgagtctatc.
未优化前的基因序列如SEQ ID NO.2所示(划线部分为密码子优化后去除的序列)：
cacctagactgcaaacctgaatactcatatgccatagccaagagtgatagaattggcctacaaggagctgaagaccttactactgtttggaaggattactcacatggaatgacactggaagacacaatggtcatagcatggtgcaaagatggtaagttaacatattatgcaaggtgcactagggaaaccagatatcttgcaattttgcattcaagagccttaccgaccagtgtggtattcaaaaaacttttcgaggggcaagggcaagaggacacagtcgaaatggatgacaactttgaatttggactctgcccatgcgatgccaaacccatagtaagagggacttacaatacaacactgctaaacggaccagccttccagatggtatgccccataggttggacagggactgtgagctgtatgttagctaatagagacaccctagacacagcagtagtacggacgtatagaaggtccagaccattcccttataggcaaggctgtattacccaaaagaccctgggggaggatctctatgactgtattcttggaggaaactggacttgtgtaactggggaccaactacaatacacaggaggctctgttaaatcttgcaagtggtgtggttttaaattcaaaaaaagtgagggactaccacactaccccattggcaagtgtaggttgaagaacgagactggctacagattcgtggatggtacctcttgcaacagagaaggtgtggccatagtgccacaaggactggtaaagtgtaagataggagacacaattgtacaggtcatagctcttgacaccaaacttgggcctatgccttgcaagccatatgagatcataccaagcgaggggcctgtggaaaagacggcgtgcaccttcaactacacaaggacattgaaaaataaatattttgagcccagagacagttacttccaacaatatatgctaaaaggagagtatcaatactggtttgacctggaggtcactgaccatcatcgggattacttcgccgagtccatattagtggtggtggtagccctccttggtggtagatacgtgctctggttactagtcacatatatggttctatcagaacaaagggcctcaggg
第二方面，提供一种核酸构建体，其包括至少一个拷贝的第一方面所述的密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因。
可选地，还包括位于牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因的5’端的编码信号肽的基因序列和/或Kozak序列；可选地，还包括位于牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因的5’端的Kozak序列和编码信号肽的基因序列，其含有如SEQ ID NO:3所示的序列。
SEQ ID NO:3所示的序列如下：
gccaccatggagaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtccctggctccaccggc.
和/或，还包括位于牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因的3’端的编码标签的基因序列；可选地，所述标签选自Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签、SUMO标签中的至少一种；优选地标签为His标签(His标签如SEQ ID NO:5所示的序列：caccatcaccatcatcac)。
可选地，所述核酸构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示：
Figure BDA0004027183270000041
第三方面，提供一种第二方面所述的核酸构建体的重组表达载体；优选地，所述重组表达载体采用pCEP4载体。
第四方面，提供一种第三方面所述的重组载体的表达***细胞；优选地，所述表达***细胞为哺乳动物细胞；进一步优选地，所述哺乳动物细胞为CHO-B10细胞(指含有第三方面所述的重组载体(简称B10)的CHO细胞)。
第五方面，提供一种制备牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白的方法，包括如下步骤：采用第四方面所述的表达***细胞进行表达，表达后收集细胞上清，纯化得到牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白。
第六方面，提供一种具有免疫原性的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白，可选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，可选地，其由第五方面所述的方法制备得到的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白。
SEQ ID NO:7的氨基酸序列由SEQ ID NO:1序列编码，SEQ ID NO:7的氨基酸序列如下：
HLDCKPEYSYAIAKSDRIGLQGAEDLTTVWKDYSHGMTLEDTMVIAWCKDGKLTYYARCTRETRYLAILHSRALPTSVVFKKLFEGQGQEDTVEMDDNFEFGLCPCDAKPIVRGTYNTTLLNGPAFQMVCPIGWTGTVSCMLANRDTLDTAVVRTYRRSRPFPYRQGCITQKTLGEDLYDCILGGNWTCVTGDQLQYTGGSVKSCKWCGFKFKKSEGLPHYPIGKCRLKNETGYRFVDGTSCNREGVAIVPQGLVKCKIGDTIVQVIALDTKLGPMPCKPYEIIPSEGPVEKTACTFNYTRTLKNKYFEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLEVTDHHRDYFAESI.
第七方面，提供一种免疫原性组合物，其包含第一方面所述的密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因、或第二方面所述的核酸构建体、或第三方面所述的重组表达载体、或第四方面所述的表达***细胞、或第五方面所述的方法制备得到的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白、或第六方面所述的具有免疫原性的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂；
可选地，所述佐剂包括605佐剂，可选地，纯化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白与佐剂605的重量比为1：(0.8～1.5)。
进一步地，所述免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式。
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂。
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂。
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
第八方面，提供一种牛病毒性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法，包括采用第五方面所述的方法制备得到的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白或第六方面所述的具有免疫原性的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白，加入加入药学上可用的疫苗佐剂，
可选地，所述佐剂包括605佐剂，可选地，纯化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白与佐剂605的重量比为1：(0.8～1.5)。
第九方面，一种第一方面所述的密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因、或第二方面所述的核酸构建体、或第三方面所述的重组表达载体、或第四方面所述的表达***细胞、或第五方面所述的方法制备得到的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白、或第七方面所述的免疫原性组合物、或第八方面所述的制备方法制备的牛病毒性腹泻病毒亚单位疫苗在制备牛病毒性腹泻病毒的抗原、抗体或亚单位疫苗或检测试剂盒中的应用。
有益效果
(1)本发明可高效稳定的表达牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白，制备预防牛病毒性腹泻1型病的疫苗制剂，减少牛病毒性腹泻1型病(BVDV-1)对养牛业造成的损失。
(2)本发明通过E2蛋白基因序列进行碱基修饰和优化，使蛋白的免疫原性更好。通过与专利的605佐剂混合配制疫苗，更增强了疫苗的免疫效果。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1是本发明实施例1中表达载体pCEP4-E2(优化后)双酶切电泳图结果；M为DL10000 marker；1为双酶切的pCEP4-E2(优化后)；
图2是本发明实施例1中1.5的CHO-B10细胞摇瓶发酵后的纯化样品的SDS-PAGE电泳结果。其中，泳道M：Protein marker；泳道1：培养基样；泳道2：流出样；泳道3：清洗样；泳道4：洗脱样。
图3是本发明实施例2中1.3的疫苗免疫后抗体检测结果。其中，优化后疫苗组为密码子优化后疫苗组，优化前疫苗组为密码子优化后前疫苗组，专利疫苗组为对照专利疫苗组，对照组为健康易感牛。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
本发明涉及的质粒与菌种均为市售产品。
下述实施方案中，605佐剂为北京华夏兴洋生物科技有限公司申请的专利佐剂(专利公开号CN103083659A)，并且已经应用到疫苗的研究和生产中，利用605佐剂研发注册的新兽药制品牛曼氏杆菌灭活疫苗和牛传染性鼻气管炎灭活疫苗已经获得国家新兽药注册证书。
下述实施方案中，BVDV-1SD病毒株由北京生泰尔科技股份有限公司分离获得，为常规BVDV-1病毒，普通公众可通过中国兽医微生物菌种保藏管理中心公共渠道购买获得。
质粒pCEP4购自武汉淼灵生物科技有限公司。
本发明涉及的细胞CHO细胞购自默克生物。
本发明涉及的主要试剂：病毒DNA/RNA提取试剂盒、one-step RT-PCR kit试剂盒购于北京全式金生物科技有限公司；DL2000Marker、DL10000Marker、胶回收试剂盒购于takara宝生物工程(大连)有限公司；去内毒素质粒提取试剂盒购于QIAGEN公司；去内毒素质粒提取试剂盒购于Promega公司；Kpn I和Not I限制性内切酶，购于takara宝生物工程(大连)有限公司；T4 DNA连接酶购于北京全式金生物科技有限公司；
Figure BDA0004027183270000072
LTX转染试剂、潮霉素B购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；牛病毒性腹泻抗体检测试剂盒购自IDEXX；605佐剂由北京生泰尔科技股份有限公司提供；CD CHO培养基壹生科(深圳)有限公司；搅拌式生物反应器(5L)购自广州齐志生物工程设备有限公司。
实施例1稳定表达BVDV-1E2蛋白CHO细胞系的建立
1.1BVDV E2蛋白基因的合成
通过对牛病毒性腹泻病毒1型SD毒株E2基因(以下简称“E2基因”)核苷酸序列进行密码子优化，密码子优化后E2基因序列如SEQ ID NO:1，密码子优化前E2基因序列如SEQ IDNO:2所示。
在上述SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示的序列的5’端分别修饰如SEQ ID NO:3所示
Figure BDA0004027183270000071
的Kozak序列(波浪线标记的序列)和编码信号肽的序列(加粗的序列)，及Kpn I酶切位点(ggtacc)，在3’端分别修饰如SEQ ID NO.5所示的His标签序列(caccatcaccatcatcac)，及终止密码子(tga)和Not I酶切位点(gcggccgc)，密码子优化后E2基因序列经修饰后的序列如SEQ ID NO:4所示，密码子优化前的E2基因序列经修饰后的序列如SEQ ID NO:6所示。SEQ ID NO:4、6序列委托通用生物(安徽)股份有限公司完成。
1.2pCEP4-BVDV1-E2重组转移载体的构建及鉴定
将上述合成的密码子优化前、后的E2基因(SEQ ID NO:4、6)和pCEP4载体分别使用Kpn I和Not I进行双酶切，胶回收获取纯化后的线性载体pCEP4与密码子优化前、后的E2基因，用T4 DNA连接酶进行连接，并将连接好的重组质粒命名为pCEP4-E2(优化后)、pCEP4-E2(优化前)。连接完成后转化E.coli DH5α感受态细胞，37℃培养12～18h。挑取培养板上的单克隆接种于含氨苄青霉素(Amp+)的LB培养基，37℃震荡培养10～14小时，取培养菌液为模板进行菌液PCR鉴定，初步筛选出阳性克隆。提取质粒后，将pCEP4-E2(优化后)、pCEP4-E2(优化前)分别使用Kpn I和Not I进行双酶切，pCEP4-E2(优化后)的双酶切结果见图1。将筛选出来的阳性菌液送至生工进行测序，分析测序结果。
筛选到的阳性菌进行扩大培养后，按照Promega无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒DNA。对质粒进行酶切线性化后回收。
1.3重组质粒转染CHO细胞及稳定表达BVDV-1E2蛋白CHO细胞的筛选
1.3.2细胞转染及筛选
CHO细胞密度达到约80％后，根据转染试剂的说明用线性化重组质粒(pCEP4-E2(优化后)、pCEP4-E2(优化前))转染CHO细胞。培养48h后，将其置于含潮霉素(200μg/ml)的选择培养基中，进行加压筛选培养。3-4天后，收集细胞，按有限稀释法传代于96孔板中继续培养，待抗性克隆长至足够大，挑取单克隆集落，进行扩大培养。继续进行药物筛选，直到获得稳定表达的转基因细胞株，含有优化密码子的E2基因的CHO细胞命名为CHO-B10细胞，含有优化前密码子的E2基因的CHO细胞命名为CHO-B10’细胞。
1.4细胞摇瓶发酵
将CHO-B10、CHO-B10’细胞分别以5×105个/ml接种于125mL细胞摇瓶，置37℃，5％CO2恒温摇床进行培养，每隔24h取样，进行蛋白表达情况监测，至培养11天，收获。
1.5蛋白纯化
将装好的Ni-NTA亲合树脂使用结合缓冲液冲洗10个柱体积，待平衡后备用。将待纯化样品加入到平衡好的色谱柱中。用咪唑浓度为40mM的漂洗液漂洗结合树脂，10倍柱体积漂洗，用咪唑浓度为300mM的洗脱液洗脱结合树脂，5～6倍柱体积洗脱，收集洗脱液，CHO-B10细胞表达液的SDS-PAGE电泳结果如图2所示，结果表明该方式能较好地获得纯化蛋白。
1.6蛋白浓度和纯度测定
采用SDS-PAGE法检测纯度，优化后蛋白纯度均在75％以上；采用BCA法测定蛋白浓度，优化前、优化后蛋白浓度见表1，说明密码子优化后蛋白表达量显著提高，提高了至少3～5倍。
表1优化前后抗原表达量比较(μg/ml)
Figure BDA0004027183270000091
1.7CHO细胞表达稳定性检验
将密码子优化后表达牛病毒性腹泻E2蛋白的CHO细胞进行常规传代至20代，分别取F5、F10、F15、F20代细胞进行摇瓶发酵，检测蛋白浓度。结果显示，F5、F10、F15、F20代细胞蛋白浓度分别为188μg/ml、192μg/ml、209μg/ml、189μg/ml，经20代传代培养该CHO细胞仍能稳定表达。
实施例2疫苗制备与免疫试验
1.1牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白的制备
在CHO细胞密度达到2～3×106cells/ml时，通过调整pH、溶氧量确定反应器工艺参数进行蛋白的表达，以转速6000～8000r/min离心30分钟，收取上清液即为蛋白抗原液。将蛋白以亲和层析的方法过NI-NTA纯化柱纯化，纯化完成后利用切向流过滤***脱盐。
采用密码子优化后的E2蛋白基因获得的1型E2蛋白，命名为“密码子优化后E2蛋白”。
采用密码子优化前的E2蛋白基因获得的1型E2蛋白，命名为“密码子优化前E2蛋白”。
1.2配苗
将检验合格的牛病毒性腹泻病毒1型蛋白抗原与605佐剂按照1:1比例混合，同时加入制霉菌素溶液，使其最终浓度不超过30μg/ml，以100～300r/min混合搅拌，充分混合均匀即可。
获得如下两种疫苗：
采用密码子优化后的E2蛋白基因获得的1型E2蛋白，命名为“密码子优化后E2蛋白疫苗”。
采用密码子优化前的E2蛋白基因获得的1型E2蛋白，命名为“密码子优化前E2蛋白疫苗”。
同时采用现有技术中(专利申请号：201611208261.8)的方法制备得到对照专利疫苗。
1.3免疫效果评价
用2～6月龄的健康易感牛(BVDV抗原抗体阴性)20头。免疫组3组，分别为本发明密码子优化前疫苗组(对应密码子优化前E2蛋白疫苗)、密码子优化后疫苗组(对应密码子优化后E2蛋白疫苗)、及对照专利疫苗组(对应专利申请号：201611208261.8方法制备的疫苗)，同时设置对照组牛5头(健康易感牛)。免疫组牛每头颈部肌肉注射疫苗2.0ml，免疫后21日以相同方法和剂量加强免疫1次，二免后14日，连同对照牛5头，采血并使用IDEXX试剂盒测定抗体效价，同时进行攻毒保护试验(攻毒采用BVDV-1SD病毒株)。结果如图3和表2所示，本发明组抗体效价(抗体S/P值)和攻毒保护率均高于对照专利组，尤其是攻毒保护率明显优于对照专利组。
表2各组牛免疫前后抗体效价和免疫后攻毒保护率
Figure BDA0004027183270000101
以上结果表明，本发明制备的疫苗的免疫后的攻毒保护率优于现有的对照专利疫苗组，虽然密码子优化后去掉了部分氨基酸序列，但免疫原性仍然维持在较高水平。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因，其特征在于，所述密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种核酸构建体，其包括至少一个拷贝的权利要求1所述的密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因；
可选地，还包括位于牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因的5’端的编码信号肽的基因序列和/或Kozak序列；可选地，还包括位于牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因的5’端的Kozak序列和编码信号肽的基因序列，其含有如SEQ ID NO:3所示的序列；
和/或，还包括位于牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因的3’端的编码标签的基因序列；可选地，所述标签选自Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签、SUMO标签中的至少一种；优选地标签为His标签；
可选地，所述核酸构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.一种权利要求2所述的核酸构建体的重组表达载体；优选地，所述重组表达载体采用pCEP4载体。
4.一种包括权利要求3所述的重组载体的表达***细胞；优选地，所述表达***细胞为哺乳动物细胞；进一步优选地，所述哺乳动物细胞为CHO-B10细胞。
5.一种制备牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用权利要求4所述的表达***细胞进行表达，表达后收集细胞上清，纯化得到牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白。
6.一种具有免疫原性的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白，可选地，其氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示，可选地，其由权利要求5所述的方法制备得到。
7.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1所述的密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因、或权利要求2所述的核酸构建体、或权利要求3所述的重组表达载体、或权利要求4所述的表达***细胞、或权利要求5所述的方法制备得到的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白、或权利要求6所述的具有免疫原性的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂；
可选地，所述佐剂包括605佐剂，可选地，纯化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白与佐剂605的重量比为1∶(0.8～1.5)。
8.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
9.一种牛病毒性腹泻病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括采用权利要求5所述的方法制备得到的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白或权利要求6所述的具有免疫原性的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白，加入加入药学上可用的疫苗佐剂，
可选地，所述佐剂包括605佐剂，可选地，纯化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白与佐剂605的重量比为1：(0.8～1.5)。
10.一种权利要求1所述的密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白基因、或权利要求2所述的核酸构建体、或权利要求3所述的重组表达载体、或权利要求4所述的表达***细胞、或权利要求5所述的方法制备得到的牛病毒性腹泻病毒1型E2蛋白、或权利要求7或8所述的免疫原性组合物、或权利要求9的制备方法制备的牛病毒性腹泻病毒亚单位疫苗在制备牛病毒性腹泻病毒的抗原、抗体、亚单位疫苗或检测试剂盒中的应用。
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