CN112940124B - 靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体，及其制备方法和应用；本发明通过细胞融合和杂交瘤技术，获得的Claudin18.2人源化单克隆抗体能高特异性结合CHO‑Claudin18.2细胞，而几乎不结合CHO‑Claudin18.1细胞，本发明的Claudin18.2的人源化单克隆抗体制备方法步骤简单，获得的Claudin18.2人源化单克隆抗体对表达Claudin18.2阳性肿瘤细胞有良好的ADCC和CDC活性。本发明的Claudin18.2的人源化单克隆抗体特异性高且副作用小，在治疗和/或预防或诊断与Claudin18.2有关的疾病例如肿瘤的应用具有很好前景。

Description

靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于免疫治疗生物医药技术领域，涉及一种靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体，及其制备方法和应用，特别是在治疗和/或预防或诊断与Claudin18.2有关的疾病例如肿瘤的应用。
背景技术
胃癌是一种在世界范围内常见的癌症之一，在发达国家癌症相关的死亡因素中胃癌占第四(男性)和第五(女性)。大多数的胃癌患者在确诊后已经处于晚期阶段。早期胃癌通过胃部切除手术可能被治愈，复发率仍然达到50％。目前为止，晚期胃癌是不可治愈的，经过化疗中位生存期为8-10个月。研究多重化疗方案用于提高响应率和耐受性，然而5年生存率仍然是渺茫的。
Claudin-18(CLDN18)是在人类中由CLDN18基因编码的蛋白质。它属于claudins类别。Claudin-18属于大的claudin蛋白家族，可在上皮细胞中形成紧密的连接链。Claudin-18通过钙独立的细胞粘附活性，在紧密连接特异性清除细胞间隙中起主要作用。
现有数据表明，Claudin18.2作为一个高度特异性的细胞表面分子，在正常的组织中几乎不表达，仅表达在分化的胃粘膜上皮细胞上。在原发性胃癌及其转移后癌症类型中大部分都表达Claudin18.2分子，另外在胰腺癌，食管癌，卵巢癌，肺癌中也常常观察到Claudin18.2被激活表达。Claudin18.2的异常表达改变了紧密连接蛋白的正常结构及功能，从而使细胞极性丢失，并允许营养物质及其他对肿瘤细胞存活和生长的必需因子扩散，在肿瘤细胞的转移和肿瘤细胞的营养供给中起到重要作用。同时，Claudin18.2作为细胞膜表面蛋白，暴露的胞外结构允许抗体的结合，这些特点表明Claudin18.2是一个理想的治疗性单克隆抗体开发的靶点(参见Thorsten Klamp等人，Cancer Research(2011))。
此外，对于Claudin-18而言，具有Claudin18.1和Claudin18.2两个剪接变体，它们的第一胞外结构域之间仅具有八个氨基酸的差异，表达的组织部位也不同。因此在Claudin18.2药物的开发过程中，应注意与Claudin18.1容易引起交叉反应产生副作用这个问题。Claudin18.2在正常组织中的独特表达谱，以及在多种肿瘤中的异常表达情况使其成为了非常有吸引力的抗癌治疗靶标。因此，开发针对Claudin18.2的治疗性抗体具有更大的抗癌潜力、更低的毒性，有更大的最佳用药剂量空间。
发明内容
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明的目的是提供一种具有良好特异性、较高的亲和性和稳定性的靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体。
本发明的另一目的在于提供上述靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体的编码基因。
本发明的又一目的在于提供上述靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体的制备方法。
本发明的又一目的在于提供一种抗肿瘤制剂。
本发明的又一目的在于提供一种诊断检测制剂。
具体来说
靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别在如下HCDR1、HCDR2和HCDR3序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含分别在如下LCDR1、LCDR2和LCDR3序列至少80％同一性的氨基酸序列：
HCDR1的氨基酸序列为GFTFSSFG；
HCDR2的氨基酸序列为ISSGSHTI；
HCDR3的氨基酸序列为FQYGNSFDY；
LCDR1的氨基酸序列为QSLLNSGNQKNY；
LCDR2的氨基酸序列为WAS；
LCDR3的氨基酸序列为QNTYSFPLT；
或
HCDR1的氨基酸序列为GFTFSKFG；
HCDR2的氨基酸序列为FSSGGDY；
HCDR3的氨基酸序列为AKLYYGNSMDS；
LCDR1的氨基酸序列为QSLLNSGNQRNY；
LCDR2的氨基酸序列为WAS；
LCDR3的氨基酸序列为QNAYYYPFT。
上述两组CDR序列具有部分相同特征序列，都可以与Claudin18.2结合，故符合单一性要求。
本发明一方面提供了靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别在如下HCDR1、HCDR2和HCDR3序列中替换、***或缺失1个、2个或3个氨基酸残基的氨基酸序列，所述轻链可变区包含分别在如下LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中替换、***或缺失1个、2个或3个氨基酸残基的氨基酸序列：
HCDR1的氨基酸序列为GFTFSSFG；
HCDR2的氨基酸序列为ISSGSHTI；
HCDR3的氨基酸序列为FQYGNSFDY；
LCDR1的氨基酸序列为QSLLNSGNQKNY；
LCDR2的氨基酸序列为WAS；
LCDR3的氨基酸序列为QNTYSFPLT；
本发明又一方面提供了靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别在如下HCDR1、HCDR2和HCDR3序列中替换、***或缺失1个、2个或3个氨基酸残基的氨基酸序列，所述轻链可变区包含分别在如下LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中替换、***或缺失1个、2个或3个氨基酸残基的氨基酸序列：
HCDR1的氨基酸序列为GFTFSKFG；
HCDR2的氨基酸序列为FSSGGDY；
HCDR3的氨基酸序列为AKLYYGNSMDS；
LCDR1的氨基酸序列为QSLLNSGNQRNY；
LCDR2的氨基酸序列为WAS；
LCDR3的氨基酸序列为QNAYYYPFT。
在一方面，本发明提供了靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别在上述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含分别在上述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列至少80％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述重链可变区包含分别与上述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列具有至少81％-99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述重链可变区包含分别与上述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列具有至少81％-99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别在如下HCDR1、HCDR2和HCDR3序列所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含分别在如下LCDR1、LCDR2和LCDR3序列所示的氨基酸序列：
HCDR1的氨基酸序列为GFTFSSFG；
HCDR2的氨基酸序列为ISSGSHTI；
HCDR3的氨基酸序列为FQYGNSFDY；
LCDR1的氨基酸序列为QSLLNSGNQKNY；
LCDR2的氨基酸序列为WAS；
LCDR3的氨基酸序列为QNTYSFPLT；
又一个实施方案中，本发明提供了靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别在如下HCDR1、HCDR2和HCDR3序列所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含分别在如下LCDR1、LCDR2和LCDR3序列所示的氨基酸序列：
HCDR1的氨基酸序列为GFTFSKFG；
HCDR2的氨基酸序列为FSSGGDY；
HCDR3的氨基酸序列为AKLYYGNSMDS；
LCDR1的氨基酸序列为QSLLNSGNQRNY；
LCDR2的氨基酸序列为WAS；
LCDR3的氨基酸序列为QNAYYYPFT。
在一个实施方案中，所述重链可变区氨基酸序列选自：SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20或SEQ ID NO.21。
在一个实施方案中，所述轻链可变区氨基酸序列选自：SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24。
在一个实施方案中，所述靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段，其重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
所述重链可变区为SEQ ID NO.15以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.17；
所述重链可变区为SEQ ID NO.15以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.18；
所述重链可变区为SEQ ID NO.16以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.17；
所述重链可变区为SEQ ID NO.16以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.18；
所述重链可变区为SEQ ID NO.19以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.22；
所述重链可变区为SEQ ID NO.19以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.23；
所述重链可变区为SEQ ID NO.19以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.24；
所述重链可变区为SEQ ID NO.20以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.22；
所述重链可变区为SEQ ID NO.20以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.23；
所述重链可变区为SEQ ID NO.20以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.24；
所述重链可变区为SEQ ID NO.21以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.22；
所述重链可变区为SEQ ID NO.21以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.23；或
所述重链可变区为SEQ ID NO.21以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.24。
在一个优选的实施方案中，所述靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段，其重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
所述重链可变区为SEQ ID NO.16以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.17；
所述重链可变区为SEQ ID NO.16以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.18；
所述重链可变区为SEQ ID NO.20以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.22；或
所述重链可变区为SEQ ID NO.21以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.23。
在一个更优选的实施方案中，所述靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段，其重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
所述重链可变区为SEQ ID NO.20以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.22；或
所述重链可变区为SEQ ID NO.21以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.23。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，其编码本发明的靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段。
在一个实施方案中，多核苷酸包含编码本发明所述靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体的重链可变区的重链编码序列，和编码本发明所述靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体的轻链可变区的轻链编码序列。
在另一方面，本发明提供了表达载体，包含所述的多核苷酸。
在另一方面，本发明提供了宿主细胞，其包含所述表达载体。
在一个实施方案中，所述宿主细胞为293F细胞。
在另一方面，本发明提供所述靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段、所述多核苷酸、所述表达载体或所述宿主细胞在制备用于抗Claudin18.2阳性肿瘤的药物中的用途。
在另一方面，本发明提供了所述靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段、所述多核苷酸、所述表达载体或所述宿主细胞在制备用于***的用途。
在另一方面，本发明提供了所述靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段、所述多核苷酸、所述表达载体或所述宿主细胞在制备用于***。
在另一方面，本发明提供了抗肿瘤药物组合物，其包含有效量的所述靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段，和药学上可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了一种诊断试剂盒或试剂盒，其包含有效量的所述靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段，所述诊断试剂或试剂盒用于体外(例如细胞或组织)或体内(例如人或动物模型)诊断与Claudin18.2相关的疾病(例如肿瘤或病毒感染，例如Claudin18.2高表达的病毒感染或Claudin18.2高表达的肿瘤)。
在另一方面，本发明提供了一种制备所述靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段的方法，包括：
(1)对鼠源抗体进行人源化，获得所述靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段的重链和轻链的可变区编码序列；
(2)用所述可变区编码序列进行重组抗体生产，获得功能性所述靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段。
一种制备靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体的方法，将包含上述编码基因的重组表达载体转染感受态细胞，并进行培养得到靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体。
本发明技术人员通过以下方法获得了靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体：
1)用重组表达人Claudin18.2的免疫小鼠，获得针对人Claudin18.2的免疫反应；
2)取步骤1)中小鼠的脾脏细胞进行融合，并对获得的杂交瘤细胞进行筛选，获得特异性识别人Claudin18.2的阳性母克隆；
3)对步骤2)中获得的阳性母克隆进行亚克隆，获得稳定的杂交瘤细胞株；
4)用步骤3)中获得的杂交瘤细胞株进行测序，获得抗体轻链和重链的可变区编码序列。
5)根据上述结果，挑选最优鼠单克隆抗体进行人源化，得到人源化抗体序列。
本发明所述的人源化单克隆抗体能够特异性结合人Claudin18.2，并且能够大幅度降低鼠单克隆抗体的免疫原性。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
作用原理
本发明先是经过筛选获得鼠源的单克隆抗体，该抗体与具有高亲和性、高特异性，但由于是鼠源，在实际临床上使用时，会引起人的免疫反应，故人源化是非常必要的。本发明对鼠源单克隆抗体进行人源化的修饰，获得一系列的Claudin18.2人源化单克隆抗体，其中大多数抗体对Claudin18.2具有高亲和性、高特异性，对表达Claudin18.2阳性肿瘤细胞有良好的ADCC和CDC效应。因此本发明提供的靶向Claudin18.2人源化单克隆抗体，可通过识别肿瘤细胞表面的Claudin18.2抗原实现肿瘤免疫治疗的目的。
有益效果
本发明通过细胞融合和杂交瘤技术，获得的Claudin18.2人源化单克隆抗体能高特异性结合CHO-Claudin18.2细胞，而几乎不结合CHO-Claudin18.1细胞，本发明的Claudin18.2的人源化单克隆抗体制备方法步骤简单，获得的Claudin18.2人源化单克隆抗体对表达Claudin18.2阳性肿瘤细胞有良好的ADCC和CDC活性。本发明的Claudin18.2的人源化单克隆抗体特异性高且副作用小，在治疗和/或预防或诊断与Claudin18.2有关的疾病例如肿瘤的应用具有很好前景。
附图说明
图1显示实施案例3中免疫后的鼠血清效价检测结果。图1A显示免疫小鼠与CHO-Claudin18.2的结合情况；图1B显示免疫小鼠与CHO细胞的结合情况。
图2显示实施案例5中杂交瘤克隆亲和力流式检测结果。图2A为杂交瘤克隆与CHO-Claudin18.2细胞的结合情况，图2B为杂交瘤克隆与CHO-Claudin18.1细胞的结合情况，图2C为杂交瘤克隆与CHO细胞的结合情况。
图3显示实施案例6中杂交瘤亚克隆与CHO-Claudin18.2细胞的结合情况。
图4显示实施案例6中杂交瘤亚克隆与CHO-Claudin18.1细胞的结合情况。
图5显示实施案例8中嵌合抗体表达载体示意图。
图6显示实施案例8中嵌合抗体流式验证结果，图6A为杂交瘤克隆与CHO-Claudin18.2细胞的结合情况，图6B为杂交瘤克隆与CHO-Claudin18.1细胞的结合情况，图6C为杂交瘤克隆与CHO细胞的结合情况。
图7显示实施案例11中1-C4-2-F8-G6杂交瘤克隆和其人源化抗体表达流式检测结果。
图8显示实施案例11中7-C5-1-C10-1-G7杂交瘤克隆和其人源化抗体表达流式检测结果。
图9显示实施案例12中人源化单克隆抗体的亲和力及特异性检测结果，图9A为人源化单克隆抗体的亲和力检测结果，图9B为人源化单克隆抗体的特异性检测结果。
图10显示实施案例13中人源化单克隆抗体检测不同肿瘤细胞上人Claudin18.2抗原表达的情况。
图11显示实施案例14中荧光素酶标记测定人源化单克隆抗体体外ADCC的活性。
图12显示实施案例15中荧光素酶标记测定人源化单克隆抗体体外CDC的活性。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，发现特异性结合Claudin18.2的抗体，这些抗体可以应用于制备各种靶向性抗肿瘤药物以及诊断肿瘤的药物。在此基础上完成了本发明。
本文采用的科学技术名词具有与本领域技术人员常规理解的相同或相似的含义。为便于理解本发明，一些术语定义如下。
本文中的术语“Claudin18.2”，由184个氨基酸残基组成的III型跨膜蛋白(NCBIReference Sequence:NP_001183.2)。在实施例中，Claudin18.2是指人Claudin18.2。
本文中的术语“抗体”指免疫***的抗原结合蛋白。如本文提到的术语“抗体”包括具有抗原结合区域的完整的全长抗体及其中“抗原结合部分”或“抗原结合区域”保留的其任何片段、或其单链例如单链可变片段(scFv)。天然抗体指包含通过二硫键互联的至少两条重(H)链和两条轻(L)链或其抗原结合片段的糖蛋白。术语“抗体”还包括抗体(特别是本文所述抗体)的所有重组形式，例如在原核细胞中表达的抗体，未糖基化的抗体以及与抗原结合的抗体片段和下文所诉的衍生物。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。VH和VL可进一步细分为称为互补性决定区(CDR)的高变区，他们散布在称为构架区(FR)的更保守区域中。每条VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫***的多种细胞(如效应细胞)和经典补体***的第一成分(C1q)。
抗体片断包括但不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，包括Fab’和Fab’-SH，(ii)VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由单个可变区组成的dAb片段(Ward等，1989，Nature 341：544-546)；(v)F(ab’)2片段，包含2个连接的Fab片段的二价片段；(vi)单链Fv分子抗原结合位点；(vii)双特异性单链Fv二聚体；(viii)“二体”或“三体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段；和(ix)与相同或不同抗体遗传融合的scFv。
本文中的术语“Fc”或“Fc区”包括包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域以外的抗体恒定区的多肽。因而，Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，和IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，和这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3和在Cγ1和Cγ2之间的铰链。虽然Fc区的边界可以改变，但人IgG重链Fc区通常定义为在其羧基端包含残基C226或P230，其中编号是根据Kabat的EU索引。对于人IgG1，Fc在本文定义为包含残基P232至其羧基端，其中编号是根据Kabat中的EU索引。Fc可以指分离的该区域，或者位于Fc多肽，例如抗体，环境中的该区域。上述“铰链”包括包含在抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。结构上，IgG CH1结构域中止于EU220位，IgG CH2结构域始于残基EU237位。因而，对于IgG，本文中抗体铰链定义为包括221(IgG1的D221)至231(IgG1的A231)位，其中编号是根据Kabat的EU索引。
本文中使用的术语“亲本抗体”或“亲本免疫球蛋白”包括未修饰的抗体，所述抗体之后经修饰产生变体。所述亲本抗体可以使天然存在的抗体，或者天然存在的抗体的变体或改造版本。亲本抗体可以指抗体本身，包含所述亲本抗体的组合物，或其编码氨基酸序列。本文中使用的术语“亲本抗体”或“亲本免疫球蛋白”包括之后经修饰产生人源化抗体的鼠抗体或嵌合抗体。
本文中使用的术语“变体抗体”或“抗体变体”包括由于相比亲本的至少一个氨基酸修饰，而不同于亲本抗体序列的抗体序列。本文中的变体抗体序列优选的具有与亲本抗体序列至少约80％，最优选至少约90％，更优选至少约95％的氨基酸序列同一性。抗体变体可以指抗体本身，包含所述亲本抗体的组合物，或编码其地氨基酸序列。
本文中使用的术语“变体”包括由于相比亲本的至少一个氨基酸修饰，而不同于亲本抗体序列的抗体序列。在具体的实施方式中，本文中的变体抗体序列具有与亲本抗体序列至少约80％、优选至少约90％、更优选至少约95％、更优选至少约97％、更优选至少约98％、最优选至少约99％的氨基酸序列同一性。抗体变体可以指抗体本身，包含所述亲本抗体的组合物，或编码其地氨基酸序列。术语“氨基酸修饰”包括氨基酸取代、添加和/或缺失，“氨基酸取代”意指用另一种氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。例如，取代R94K指94位的精氨酸被赖氨酸替换，本文中使用的“氨基酸***”意指在亲本多肽序列中的特定位置添加氨基酸。文中使用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。
本文中使用的术语“保守修饰”或“保守序列修饰”意指不显着影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、***和缺失。可通过本领域已知的标准技术将修饰导入本发明的抗体中，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守的氨基酸取代是用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括含碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的急性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因而，可以用其他相同侧链家族的氨基酸残基替换本发明抗体的CDR区中或框架区中的一个或多个氨基酸残基，并可以测试所改变的抗体(变体抗体)保留的功能。
本发明中讨论的所有免疫球蛋白重链恒定区位置，都根据Kabat的EU索引编号(Kabat等，1991，sequences ofproteins ofimmunological interest，第5版，UnitedStates Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda，通过引用全文整合)。“Kabat的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号，如Edelman等人，1969，Biochemistry 63:78-85所述。
本文中使用的术语“抗原决定部位”又称抗原表位，可以由Claudin18.2蛋白序列的连续序列组成，也可以由Claudin18.2蛋白序列不连续的三维结构组成。
本发明的抗体或其变体可以被应用于制备各种靶向性抗肿瘤药物以及诊断肿瘤的药物，特别是应用于制备靶向Claudin18.2的免疫效应细胞。
本发明涉及一种具有功能性的靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义相同。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1：抗原制备
根据Claudin18.2序列信息，密码子优化后基因合成，亚克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-GFP中，获得pShuttle-CMV-Claudin18.2穿梭质粒后，与腺病毒骨架质粒pAD-Backbone通过体外重组，获得重组腺病毒质粒。
将重组腺病毒载体进行纯化，纯化后使用LVTransm转染试剂转染至293A细胞中，制备腺病毒种子。以种子病毒为基础，进行大规模扩增，纯化获得腺病毒，使用Anti-Hexon抗体进行滴度进行测定。
实施例2：小鼠免疫
所有小鼠饲养于屏障***中，使用灭菌颗粒饲料和高压灭菌饮用水进行饲养。取8只Balb/c小鼠(SPF级)用耳标标记，并按经典的免疫流程，使用纯化的重组腺病毒，按照1×107pfu/只小鼠用量，通过肌肉注射进行小鼠免疫。
表1 Claudin18.2重组腺病毒动物免疫方案
Figure BDA0003019225020000121
Figure BDA0003019225020000131
实施例3：免疫后的鼠血清效价检测
1、从笼子内取出小鼠，使用75％的医用酒精棉球对小鼠的尾部消毒，使用采血针在小鼠的尾部刺出一个小的创口；
2、使用毛细玻璃采血管收集血滴；
3、采集血液后，使用干的无菌棉球轻轻压迫采血点止血后，将小鼠还至笼内稍作观察；
4、将收集有血液样本的离心管置于37℃培养箱内放置1小时；然后将血液样本转移至4℃过夜。
5、将血清从血块中分离，并转移至一个新的无菌离心管中，4℃、10000g离心10min；
6、将血清按照1:1000进行稀释，分别与CHO-Claudin18.2细胞以及对照细胞CHO进行FACS检测。
免疫后的鼠血清效价检测结果如图1所示，其中图1A显示了8只免疫小鼠与CHO-Claudin18.2细胞的结合情况；图1B显示了8只免疫小鼠与CHO细胞的结合情况。结果显示免疫小鼠均可以结合天然Claudin18.2蛋白，选择80和82号小鼠进行后续细胞融合实验。
图中NC：PBS。
实施例4：杂交瘤融合和筛选
1、取免疫效价检测最好的小鼠颈部脱臼处死，无菌条件下获得小鼠脾脏，制备B细胞单细胞悬液，并以1∶1的比例与非分泌性SP2/0骨髓瘤细胞混合，使用BTX细胞电融合仪进行细胞融合。
2、电融合后，所有细胞立即悬浮在完全培养基(DMEM，20％FBS和HAT)中，并接种至96孔板中。
3、融合后约10天改为HT培养基，培养两天后，取上清检测特异性抗体。
4、从96孔板的每个孔中取出120uL培养基上清，同时向每个孔内补充新鲜的HT培养基。将取出的培养基上清与预包被目的抗原的ELISA孔板进行孵育，按照标准的ELISA操作步骤进行鉴定。
选择O.D值较高的孔进行亚克隆，每轮亚克隆结束后，均参照相同的步骤进行ELISA鉴定，直至单克隆形成。
实施例5：杂交瘤克隆亲和力流式检测
1、从液氮中复苏CHO-Claudin18.1和CHO-Claudin18.2细胞株，使用F12K、10％FBS完全培养基调整细胞状态至对数生长期。
2、分别将CHO-Claudin18.1和CHO-Claudin18.2细胞株分为若干份，每份细胞的数量为3×105个细胞，分别使用100ul杂交瘤上清孵育靶细胞，充分混匀后，室温孵育1小时。
3、800g室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次。
4、加入PE标记的Anti-mouse IgG(1:1000)，充分混匀后，室温避光孵育30分钟；
5、800g室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；
6、使用200uL PBS重悬细胞，通过流式细胞式读取荧光强度，进行融合克隆效价的复检。
杂交瘤克隆亲和力流式检测如图2所示，图2A为杂交瘤克隆与CHO-Claudin18.2细胞的结合情况，图2B为杂交瘤克隆与CHO-Claudin18.1细胞的结合情况，图2C为杂交瘤克隆与CHO细胞的结合情况，选择只与CHO-Claudin18.2细胞结合的克隆进行亚克隆。
注：图中R2-NC：PBS对照组，R2-PC为1:1000稀释的免疫血清对照组。
实施例6：杂交瘤克隆亚克隆亲和力流式检测
1、收集生长状态良好的杂交瘤细胞株，制成单细胞悬液。
2、使用血球计数板进行计数，并取100个细胞，稀释至10ml。
3、取96孔板，每孔加入100ul细胞悬液，最终将体积补充至200ul。
4、置于37℃培养箱，并做好标记。
5、连续培养3天后，在显微镜下挑选单克隆。
6、培养至第7天，更换新鲜培养基。
7、培养至第8天，使用FACS检测，选择流式结合与阳性免疫血清(1:1000)一致的孔，进行再次亚克隆。
杂交瘤亚克隆亲和力流式检测结果如图3、图4所示，图3为杂交瘤亚克隆与CHO-Claudin18.2细胞的结合情况，图4为杂交瘤亚克隆与CHO-Claudin18.1细胞的结合情况。根据检测结果共获得7个特异性识别18.2的阳性抗体，进行杂交瘤测序。
注：图中R2-NC：PBS对照组，R2-PC为1:1000稀释的免疫血清对照组。
实施例7：杂交瘤测序
1、取2×106个最终筛选获得的杂交瘤细胞，使用Trizol进行裂解，参照标准方法提取杂交瘤细胞的总RNA。
2、使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为多核苷酸样品后，使用杂交瘤测序引物采用PCR法将抗体的重链和轻链可变区扩增出来，然后进行TA克隆，将PCR获得的片段亚克隆至pMD-19T载体中。蓝白斑筛选后，每条链分别挑取10个克隆进行测序，并对最终获取的抗体序列进行分析。
测序后，得到鼠源抗人Claudin18.2抗体序列，如下表所示：
表2 鼠源抗人Claudin18.2抗体重链互补区序列信息：
Figure BDA0003019225020000151
Figure BDA0003019225020000161
表3 鼠源抗人Claudin18.2抗体轻链互补区序列信息：
Figure BDA0003019225020000162
实施例8：抗体表达载体构建和验证
根据杂交瘤测序获得的抗体重链可变区亚克隆至pcDNA3.1-IgG1Fc表达载体(载体示意图如图5B所示)，轻链可变区亚克隆至pcDNA3.1-IgKc表达载体(载体示意图如图5A所示)。将构建好的轻链和重链表达载体瞬时共转293F细胞(无血清培养)，转染72小时后，收集表达的上清进行FACS。
嵌合抗体流式验证结果如图6所示，图6A为7种杂交瘤克隆及形成的杂交瘤亚克隆与CHO-Claudin18.2细胞的结合情况，其中所述的R2-NC无结合，编号为12-H9-2-D9-C2杂交瘤克隆无结合，其他杂交瘤克隆结合率为89％以上。图6B为7种杂交瘤克隆及形成的杂交瘤亚克隆与CHO-Claudin18.1细胞的结合情况，其中所有杂交瘤克隆无结合。图6C为3种杂交瘤克隆与CHO细胞的结合情况，其中3种杂交瘤克隆与CHO细胞无结合。其中，1-C4-2-F8-G6和7-C5-1-C10-1-G7杂交瘤克隆与Claudin18.2的结合较强。
实施例9：人源化抗体序列设计
将1-C4-2-F8-G6和7-C5-1-C10-1-G7的抗体重链和轻链的氨基酸序列信息进行人源化设计，保留原始抗体的CDR区序列不变，根据germline alignment的结果以及抗体结构模拟的结果，重链和轻链分别选择不同的人源抗体模版，并在人源化之后的框架区进行back mutation，设计以下候选的靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体序列。
表3 靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体序列
Figure BDA0003019225020000171
注：表中重链或轻链中可变区(CDR)序列不变，但框架区(FR)进行人源化
实施例10：人源化抗体基因合成及表达载体构建
将上述设计的人源化单链抗体片段分别进行基因合成，重链亚克隆至pcDNA3.1-IgG1Fc表达载体，轻链可变区亚克隆至pcDNA3.1-IgKc表达载体。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备无内毒素质粒。
实施例11：人源化单克隆抗体表达检测
1、将转染试剂LVTransm及单链抗体表达载体室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取0.5mL PBS至24孔板的一个孔，分别加入2ug重链和4ug轻链，移液枪上下吹打充分混匀后，加入18uL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
2、将上述DNA/LVTransm复合物加入到1.5mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130rpm培养6～8小时后，加入1mL新鲜的293F培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。
3、连续培养3天后，离心收集培养基上清，进行流式检测。
人源化单克隆抗体表达流式检测结果如图7、图8所示，图7为1-C4-2-F8-G6杂交瘤克隆与其人源化抗体表达流式检测结果，图8为7-C5-1-C10-1-G7杂交瘤克隆与人源化抗体表达流式检测结果。
注：图中R2-NC：PBS对照组。
实施例12：人源化单克隆抗体的亲和力及特异性流式检测
1、从液氮中复苏CHO-Claudin18.1及CHO-Claudin18.2重组细胞株，使用F12K、10％FBS完全培养基调整细胞状态至对数生长期。
2、将两种细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为5×105个细胞，使用100uL PBS重悬细胞，分别加入不同浓度人源化抗体，充分混匀后，室温孵育半小时。
3、800g室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次；
4、加入0.5uL PE标记的Anti-human IgG(eBioscience，A11013)，充分混匀后，室温避光孵育30min；
5、800g室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；
6、使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析。
其中，人源化单克隆抗体EC50的检测结果如下表所示：
表4 人源化单克隆抗体的EC50检测结果
Figure BDA0003019225020000181
Figure BDA0003019225020000191
其中C4-2-F8-G6 Chimeric为1-C4-2-F8-G6的CDR区和人IgG的Fc嵌合形成的，7-C5-1-C10-1-G7 Chimeric同样方式形成，目的在于验证人IgG的Fc和人源化单克隆抗体对亲和力影响。
人源化单克隆抗体的亲和力及特异性检测结果如图9所示，图9A为人源化单克隆抗体的亲和力检测结果。图9B为人源化单克隆抗体的特异性检测结果，人源化单克隆抗体和阳性对照均具有很高的特异性；并且人源化后对抗体亲和力是有影响的，某些人源化可以降低亲和力，但有些增加亲和力，除了C4-2-F8-G6VH2-VL1的亲和力过低外，其他亲和力与阳性对照差异不大，特别是7-C5-1-C10-1-G7 VH2-VL1的亲和力超过阳性对照IMAB362和AB011(序列分别参考CN112138171A专利和Hua Jiang等人，Journal of the NationalCancer Institute(2019)，构建方法见实施案例8)
实施例13：人源化单克隆抗体检测不同肿瘤细胞上人Claudin18.2抗原表达情况
收集用于检测的表达Claudin18.2的人胃癌细胞MKN-28-18.2和N87-18.2、表达Claudin18.1的人肾上皮细胞293T-18.1、人胃癌细胞NUGC-4和阴性对照细胞，用PBS清洗3次。计数调整细胞密度为2×105cells/100μL，分别取100ul作为对照组和实验组。实验组按1:50稀释比在细胞悬液中加入一抗(人源化单克隆抗体)，4℃避光孵育1小时。孵育结束后，实验组用PBS清洗细胞3次，对照组和实验组同时按照说明书中的稀释比添加山羊抗小鼠IgG二抗，4℃孵育1小时。最后用PBS清洗细胞3次，用FACS BD Calibur读取信号。检测如图10所示：人源化单克隆抗体与表达Claudin18.2的人胃癌细胞MKN-28-18.2和N87-18.2结合力强而与表达Claudin18.1的人肾上皮细胞293T几乎不结合，同时与人胃癌细胞NUGC-4有一定的结合，说明人源化单克隆抗体具有良好的特异性。
实施例14：荧光素酶标记测定人源化抗体体外ADCC活性
使用Jurkat-NFAT-Luciferase-CD16效应细胞与CHO-Claudin18.2靶细胞株进行共培养，靶细胞为1×105，效靶比为5:1，同时分别加入不同浓度的2个人源化抗体(7-C5-1-C10-1-G7-VH2-VL1、7-C5-1-C10-1-G7-VH3-VL2)、1个嵌合抗体(7-C5-1-C10-1-G7-Chimeric)和科济生物AB011、安斯泰来IMAB362的阳性对照抗体(0，0.000001，0.00001，0.0001，0.001，0.01，0.1μg/ml)，每组2个复孔。效靶细胞共培养18h后，加入20ul的One-Glo试剂，检测荧光素酶活性，并计算EC50值。人源化抗体体外ADCC活性检测结果如图11所示：人源化抗体与嵌合抗体EC50一致，其中7-C5-1-C10-1-G7 VH3-VL2 ADCC效应较强。虽然本实施例采用两种人源化抗体实验，但根据抗原抗体亲和原理可知其他人源化抗体对上述靶细胞具有类似ADCC活性。
Figure BDA0003019225020000201
实施例15：荧光素酶标记测定人源化抗体体外CDC活性
取CHO-Claudin18.2细胞，接种细胞量为4×104个，接入96孔板，共90ul，分别加入不同浓度的2个人源化抗体(7-C5-1-C10-1-G7-VH2-VL1、7-C5-1-C10-1-G7-VH3-VL2)、1个嵌合抗体(7-C5-1-C10-1-G7-Chimeric)和科济生物AB011、安斯泰来IMAB362的阳性对照抗体(0，0.000001，0.00001，0.0001，0.001，0.01，0.1，1，10，100μg/ml)100ul，同时将10ul人补体血清加入对应孔中。共培养18h后，加入50ulCellCounting-Lite 3D试剂，通过检测发光值的变化反应靶细胞的裂解，并计算EC50值。人源化抗体体外CDC活性检测结果如图12所示：7-C5-1-C10-1-G7 VH3-VL2 CDC效应与嵌合抗体一致。虽然本实施例采用两种人源化抗体实验，但根据抗原抗体亲和原理，可知其他人源化抗体对上述靶细胞具有类似CDC活性。
Figure BDA0003019225020000211
总之，本发明所构建靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体或其功能片段，可以应用于治疗和/或预防或诊断与Claudin18.2有关的疾病，例如肿瘤的应用等。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京凯地医疗技术有限公司
<120> 靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体及其制备方法和应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 12-H9-2-D9-C2 鼠源抗体重链可变区序列(2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Val Met Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Phe Asn Tyr Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Thr Leu Thr Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ala
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<211> 115
<212> PRT
<213> 12-H9-2-D9-C2 鼠源抗体轻链可变区序列(2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Arg Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Trp Ser
20 25 30
Val Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Gly Ala Ser Ile Arg Glu Ser Trp Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Asn Val His Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Leu His
85 90 95
Asn His Gly Ser Phe Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Glu Leu Lys
115
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 7-C5-1-C10-1-G7 鼠源抗体重链可变区序列(2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)
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Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Ile Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Phe Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
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Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
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Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
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Asn
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Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser His Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gln Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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Glu Lys Val Thr Val Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
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Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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65 70 75 80
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Lys
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Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Arg Pro Ser Gln
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Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Ser Gly Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile His Tyr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Arg Phe Phe
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Asp Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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Ile Ser Ser Met Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
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Lys
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Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
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Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Gly Gly Ile Trp Ala Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
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Asp Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Thr Ala Gly
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Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Gly
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Lys
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Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Pro Val Ala Pro Leu Gln
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Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
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Gly Val Gln Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
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Val Thr Val Ser Ala
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<211> 113
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<213> R9-4-A4-D12-F8 鼠源抗体轻链可变区序列(2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Val Gly
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Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
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Gly Asn Leu Lys Ser Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Lys
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Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
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Val Ile His Trp Val Ser Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
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Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
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Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser His Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Phe Gln Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
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<400> 16
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser His Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Phe Gln Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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Leu Val Thr Val Ser Ser
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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
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Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
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Thr Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
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Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 1-C4-2-F8-G6-VL2 人源化抗体轻链可变区序列(2 Ambystoma lateralex Ambystoma jeffersonianum)
<400> 18
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Thr Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 118
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<213> 7-C5-1-C10-1-G7-VH1 人源化抗体重链可变区序列(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 19
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Phe Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Tyr Tyr Gly Asn Ser Met Asp Ser Trp Ser Gln Gly Leu
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
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<210> 20
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<212> PRT
<213> 7-C5-1-C10-1-G7-VH2 人源化抗体重链可变区序列(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Phe Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 118
<212> PRT
<213> 7-C5-1-C10-1-G7-VH3 人源化抗体重链可变区序列(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 21
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
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Ala Thr Phe Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
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<212> PRT
<213> 7-C5-1-C10-1-G7-VL1 人源化抗体轻链可变区序列(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 22
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
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Lys
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<211> 113
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<213> 7-C5-1-C10-1-G7-VL2 人源化抗体轻链可变区序列(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 23
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
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Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
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Ala Tyr Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
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Lys
<210> 24
<211> 113
<212> PRT
<213> 7-C5-1-C10-1-G7-VL3 人源化抗体轻链可变区序列(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 24
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Ala Tyr Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys

Claims (8)

1.靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，所述重链和轻链可变区所包含的6个CDR序列为：
HCDR1的氨基酸序列为GFTFSSFG；
HCDR2的氨基酸序列为ISSGSHTI；
HCDR3的氨基酸序列为FQYGNSFDY；
LCDR1的氨基酸序列为QSLLNSGNQKNY；
LCDR2的氨基酸序列为WAS；
LCDR3的氨基酸序列为QNTYSFPLT；
或HCDR1的氨基酸序列为GFTFSKFG；
HCDR2的氨基酸序列为FSSGGDY；
HCDR3的氨基酸序列为AKLYYGNSMDS；
LCDR1的氨基酸序列为QSLLNSGNQRNY；
LCDR2的氨基酸序列为WAS；
LCDR3的氨基酸序列为QNAYYYPFT。
2.根据权利要求1所述的一种靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体，其特征在于，人源化单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区为以下组合任意一种：
所述重链可变区为SEQ ID NO.15以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.17；
所述重链可变区为SEQ ID NO.16以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.18；
所述重链可变区为SEQ ID NO.19以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.22；
所述重链可变区为SEQ ID NO.20以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.23；
所述重链可变区为SEQ ID NO.21以及所述轻链可变区为SEQ ID NO.24。
3.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1或 2所述的一种靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体。
4.一种表达载体，其包含权利要求3所述的核酸分子。
5.一种宿主细胞，其包含权利要求4所述的表达载体。
6.如权利要求1或权利要求2所述的靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备用于抗Claudin18.2阳性肿瘤药物中的应用。
7.一种药物组合物，其特征在于，其包含权利要求1或2所述的靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体和药学上可接受的辅料。
8.一种诊断试剂盒，其特性在于，其含有权利要求1或2所述的靶向Claudin18.2的人源化单克隆抗体。
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