CN117025545A - 一种分泌高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分泌高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于生物医药领域。所述杂交瘤细胞株XX10，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45495，保藏时间为2023年03月03日。所述杂交瘤细胞株XX10能够稳定分泌特异性识别HP‑PRRSV的单克隆抗体，可用于特异性针对HP‑PRRSV的竞争ELISA方法建立。基于XX10建立的抗体鉴别诊断试剂盒可以区分HP‑PRRSV和其它类型PRRSV的感染，特异性强、敏感性高，弥补了HP‑PRRSV特异性检测方法的空白。

Description

一种分泌高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗 体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种分泌高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以母猪流产和仔猪呼吸道症状为主要特征的急性传染病。PRRSV包含两个基因型，分别为PRRSV-1和PRRSV-2，PRRSV-1进一步分为subtype 1(subtypeⅠ(Global)),subtype 2(subtypeⅠ(Russia)and subtype II)andsubtype 3(subtypeⅢ))，PRRSV-2进一步分为Lineage1～9，Lineage1进一步分为Lineage1.1～1.9或L1A～1H，Lineage 3进一步分为L3.1～3.5，Lineage 5进一步分为L5.1～5.2，Lineage8进一步分为L8.1～L8.9。目前我国的PRRSV呈现双基因型及多基因亚型并存的局面。为了控制PRRSV对我国养猪业的危害，农业部批准了多款疫苗，包括经典灭活疫苗CH-1a株，经典活疫苗CH-1R株、RespPRRS MLV株、R98株，高致病性活疫苗JXA1-R株、HuN4-F112株、TJM株和GDr180株，以及嵌合疫苗PC株。
目前存在多种PRRSV抗体检测试剂盒，它们主要针对广谱性PRRSV抗体，HP-PRRSV活疫苗在我国广泛应用，然而尚没有特异性检测HP-PRRSV抗体的方法，因此，无法准确区分HP-PRRSV和其它类型PRRSV的感染。
发明内容
本发明的目的是提供一种分泌高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明的XX10杂交瘤细胞株能够稳定分泌特异性识别HP-PRRSV的单克隆抗体，可用于特异性检测HP-PRRSV抗体竞争ELISA方法的建立。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种分泌高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株XX10，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45495，保藏时间为2023年03月03日。
本发明还提供一种由所述的杂交瘤细胞株XX10分泌的抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗体。
本发明还提供一种所述的杂交瘤细胞株XX10或所述的抗体在制备检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的产品中的应用。
进一步地，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒为HP-PRRSV毒株。
本发明还提供一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗体竞争ELISA试剂盒，包括所述的抗体。
进一步地，还包括灭活的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒包被的ELISA板；在ELISA板中，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒为HuN4-F112株，保藏编号为CGMCCNO.2484。
进一步地，所述灭活的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的包被浓度为300ng/μL。
进一步地，还包括辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG、封闭液、洗涤液、稀释液、显色液和终止液。
进一步地，所述辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG经PBST溶液稀释，稀释倍数为10000倍。
进一步地所述封闭液为1％w/v的BSA溶液。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开了分泌高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株XX10及其竞争ELISA方法的建立。本发明的XX10杂交瘤细胞株能够稳定分泌特异性识别HP-PRRSV的单克隆抗体，可用于特异性针对HP-PRRSV的竞争ELISA方法建立。
本发明的XX10杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可以用于制备竞争法抗体诊断试剂盒，基于XX10建立的抗体鉴别诊断试剂盒可以区分HP-PRRSV和其它类型PRRSV的感染，特异性强、敏感性高，弥补了HP-PRRSV特异性检测方法的空白。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为小鼠免疫效果鉴定；
图2为单克隆抗体亚克隆后的IFA结果；
图3为单克隆抗体XX10与各类型PRRSV的IFA反应结果；
图4为单克隆抗体XX10的纯化结果；
图5为HP-C-ELISA阴阳性样品临界值分析，其中，A：临界值ROC曲线分析，B：临界值交互点分析；
图6为HP-C-ELISA特异性试验结果；
图7为HP-C-ELISA单克隆抗体建立的竞争ELISA方法(A)与市售试剂盒(B)特异性比较；
图8为HP-C-ELISA单克隆抗体建立的竞争ELISA方法(A-B)与市售试剂盒(C-D)敏感性比较。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其它陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其它实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1特异性识别HP-PRRSV的单克隆抗体制备
1材料
1.1病毒、细胞和实验动物
用于免疫的病毒抗原为HuN4-F112株、JXA1-R株和TJM株，JXA1-R株购自广东永顺生物制药股份有限公司；TJM株购自硕腾生物制药有限公司。用于免疫荧光进行单克隆抗体特异性分析的毒株包括：HuN4-F112株(HP-PRRSV，Lineage 8.7)，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.2484。
CH-1R株(经典毒株，Lineage 8.7)、SD-R株(类NADC30 PRRSV，Lineage 1.8)、LNTZJ1341(类NADC34 PRRSV，Lineage 1.5)、HNTZJ1714(类QYYZ PRRSV，Lineage 3.5)、ZD1株(PRRSV-1，subtype 1)由哈尔滨兽医研究所分离鉴定，并已公开在中国专利“CN113801854B分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其应用”中。
RespPRRS MLV株(经典美洲型毒株，Lineage 5.1)活疫苗购自勃林格殷格翰生物药业(中国)有限公司。
用于抗体特异性检测的副猪嗜血杆菌(HPS)、链球菌(SS)、传染性胸膜肺炎(APP)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、***病毒(FMDV)、欧洲型PRRSV ZD-1株、NADC30-like PRRSV SD-R株、WK108株、VR2332-like PRRSV SD192株、NADC34-like PRRSVDZD32-1901株、经典毒株CH-1R株、HP-PRRSV HuN4-F112株阳性血清由哈尔滨兽医研究所提供，并已公开在中国专利“CN113801854B分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其应用”中。JXA1-R株和TJM株阳性血清由JXA1-R株和TJM株免疫双阴性仔猪制备获得。
非洲绿猴肾细胞Marc-145、SP2/0骨髓瘤细胞由哈尔滨兽医研究所猪病综合防控实验室提供，PRRSV-2单克隆抗体1C8已公开在“Characterisation ofnovel linearantigen epitopes on North American-type porcine reproductive and respiratorysyndrome virus M protein”文献中；PRRSV-1单克隆抗体EU1已公开在“欧洲型PRRSV竞争ELISA抗体检测方法的建立及应用”文献中，清洁级雌性BALB/c小鼠购自维通利华公司。
1.2主要试剂
融合剂PEG/DMSO(Mw，1450)、HAT盐(50x)、HT盐(50x)、FITC标记的羊抗鼠IgG、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，均购自Sigma公司；HRP标记的羊抗鼠IgG购自索莱宝公司；DMSO购自Ameresco公司；DMEM购自Gibco公司；进口优级胎牛血清(PAA)购自西班牙Nalgene公司；96孔细胞培养板购自加拿大JET Biochemical公司；单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自Southern Biotech公司。
2方法
2.1单克隆抗体制备
2.1.1小鼠免疫
(1)免疫原的制备与纯化
分别将HP-PRRSVHuN4-F112株、JXA1-R株和TJM株接种长满单层的Marc-145细胞，待80％以上细胞出现病变后，取培养细胞的上清液，4℃10000rpm离心50min，收集上清，随后4℃35000rpm超离4h。离心后弃去上清，用PBS将沉淀溶解重悬，PBS重悬沉淀后再次低速离心，收集上清，通过分子筛层析法纯化病毒，再将收集的液体分别进行超滤浓缩，利用BCA蛋白定量试剂盒测其蛋白含量并储存在-80℃中备用。
(2)免疫
取上述纯化后的HP-PRRSV HuN4-F112株、JXA1-R株和TJM株混合作为免疫原，100μg/100μL加等体积弗氏完全佐剂，充分乳化后经腹部皮下注射6周龄雌性BALB/c小鼠；2周后进行第2次免疫，将佐剂改为弗氏不完全佐剂；2周后，以不加佐剂的等量抗原进行第3次免疫。在3免1周后，用EP管采集小鼠尾静脉血，并进行血清分离。利用无菌PBS对小鼠血清进行倍比稀释，IFA荧光法检测免疫情况，并以阴性鼠血清作为阴性对照，以实验室保存PRRSV-2单克隆抗体1C8作为阳性对照，稀释度达到1：5000后仍可见明显荧光的视为免疫成功，可以继续进行加强免疫。为刺激小鼠快速产生强烈免疫反应，于融合前3d进行加强免疫，注射二倍剂量的抗原。
2.1.2细胞融合
(1)骨髓瘤细胞的制备：融合前36～48h，将骨髓瘤细胞扩大培养，使细胞处于对数生长期。融合当天，将准备的3个75T细胞瓶的SP2/0细胞用20mLDMEM吹下后置于50mL离心管，备用。
(2)免疫脾细胞的制备：融合前摘除小鼠眼球采血，收集阳性血清并冻存。脱颈处死后放入75％酒精中消毒5min。将小鼠倒卧在解剖板上，腹腔朝上，固定四肢。用消毒后的剪刀轻轻剪开腹腔，找到小鼠脾脏，用消毒后的镊子缓慢剥离周边组织，将脾脏取出，置于细胞培养皿中，再将四周***完全剥离。
用1mL注射器针头在小鼠脾脏上刺若干小孔，再用注射器吸取20mL DMEM培养基***小鼠脾脏轻轻注射，脾细胞会随DMEM流出。收集流出的DMEM于50mL离心管中备用。
(3)脾细胞与骨髓瘤细胞融合：将SP2/0细胞和上一步准备的脾细胞1500rpm离心4min。离心后分别弃去上清液，再用10mLDMEM将两种细胞重悬并混合均匀，再1500rpm离心4min。取出后弃上清，震荡离心管，将底部细胞荡下，并使两种细胞完全混合。
将上述离心管放入装有37℃蒸馏水的烧杯中，吸取提前预热的PEG 1mL缓慢滴入离心管中(约1min滴完)，整个滴加过程要时刻晃动离心管混匀管中液体，随后静置1.5min。吸取1mL 37℃预热DMEM缓慢滴入管中，1min左右滴完，并不停晃动混匀。再吸取1mL预热DMEM缓慢滴入管中，30s左右滴完，并不停晃动混匀。在后续的2min不断加入预热DMEM并震荡混匀，补齐管中液体至10mL，1500rpm离心4min。用80mL含有10％Clone Easy和20％FBS的DMEM将细胞重悬后铺入4块96孔细胞培养板，每孔200μL，置37℃、5％的CO2培养箱中培养。
2.1.3阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆
在融合后7～10d用显微镜观察96孔板中的细胞，待融合后的细胞在底部长成细胞团，细胞团的大小大约达到每个孔的1/4面积时，进行间接免疫荧光检测。将孵育后的载玻片利用荧光显微镜进行观察，视野中的细胞可见明显绿色荧光即为阳性，记录阳性孔的位置，利用有限稀释法和流式分选进行杂交瘤细胞亚克隆。亚克隆7～10d后，对间接免疫荧光阳性孔再次进行亚克隆，整个过程重复3～4次，当长有杂交瘤细胞的96孔板检测阳性率达到100％时，挑取1个孔进行逐步扩大培养，最后扩大至75T细胞瓶中大量冻存。
2.2单克隆抗体鉴定
2.2.1单克隆抗体的亚类鉴定
将筛选的杂交瘤细胞株用SBA ClonotypingTM System/HRP按试剂盒说明书对其Ig亚类进行鉴定。
2.2.2单克隆抗体的特异性鉴定
将HuN4-F112株(HP-PRRSV，Lineage 8.7)、JXA1-R株(HP-PRRSV，Lineage 8.7)、TJM株(HP-PRRSV，Lineage 8.7)、CH-1R株(经典毒株，Lineage 8.7)、SD-R株(类NADC30PRRSV，Lineage 1.8)、LNTZJ1341(类NADC34 PRRSV，Lineage 1.5)、HNTZJ1714(类QYYZ PRRSV，Lineage 3.5)、RespPRRS MLV株(经典美洲型毒株，Lineage 5.1)、ZD1株(PRRSV-1，subtype 1)接种Marc-145细胞各两孔，在细胞出现10％病变效应(CPE)时，用PBS清洗两遍，再用无水乙醇固定半小时，倒掉无水乙醇后再用PBS清洗两遍。分别加入100μL单克隆抗体1C8/EU1混合上清和2.1.3获得的杂交瘤细胞株分泌的单抗上清，37℃孵育1h后用PBS洗涤3次，加入100μL 1:200稀释的FITC标记羊抗鼠IgG抗体，37℃温育30min，洗涤后在倒置荧光显微镜下观察荧光强度。
2.2.3单克隆抗体的敏感性鉴定
取杂交瘤细胞株细胞的培养上清，用DMEM将细胞培养上清按照2倍倍比稀释后备用。
用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH值9.6)稀释灭活并纯化后的HuN4-F112病毒，加入96孔酶联反应板，100μL/孔，置4℃包被过夜。弃去孔内液体，每孔加入PBST 300μL重复洗涤3次，拍干。每孔加入1％BSA封闭液300μL，置37℃封闭2h。弃去孔内液体，每孔加入PBST 300μL重复洗涤3次，拍干。
每孔加入稀释后的杂交瘤细胞株培养上清液100μL，同时设DMEM为阴性对照，置37℃孵育30min。弃去孔内液体，每孔加入PBST 300μL重复洗涤3次，拍干。每孔加入羊抗鼠IgG酶标抗体(1∶10000倍稀释)100μL，置37℃孵育30min。弃去孔内液体，每孔加入PBST 300μL，重复洗涤3次，拍干。每孔加入TMB底物溶液100μL，置37℃显色(避光孵育)15min。每孔加入终止液50μL，轻微震荡混合均匀后，在波长为450nm用酶标仪读取OD450nm值(应在加入终止液后15min内完成读数)，并记录结果。P/N比值大于2.1(P/N＝被检样品OD450nm值/阴性对照OD450nm值)，判为阳性。
2.2.4特异性识别HP-PRRSV的单克隆抗体纯化
采用辛酸-饱和硫酸铵法对制备的腹水进行纯化，操作步骤简述如下：
(1)取3mL预处理过的腹水加6mL 0.06mol/LPH4.8醋酸缓冲液；腹水中加99μL辛酸室温搅拌30分钟，4℃静置2小时以上；取出11000rpm离心30分钟，弃沉淀；上清用2mol/LNaOH调PH至7.4；
(2)在4℃条件下加入饱和硫酸铵至50％饱和度，冰浴搅拌作用30分钟，4℃静置2小时以上；11000转离心30分钟，弃上清；沉淀溶于5mL 0.1M的PH 7.4的PBS中；
(3)向沉淀悬浮物中边搅拌边加适量饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵溶液中浓度为30％-40％，冰浴搅拌作用30分钟，4℃静止2小时以上；11000转离心30分钟，取沉淀，将沉淀融入2mL0.1M的pH7.4的PBS中；
(4)将沉淀悬浮液装入透析带中，在4℃用0.1M的pH7.4的PBS透析，2小时换液一次，透析2天。透析完成后，回收透析袋中的纯化腹水，紫外分光光度计测定蛋白浓度，用SDS-PAGE进行纯度检测。
再用DEAE-SephadexA-50(GE公司)柱层析进一步纯化单克隆抗体，回收纯化后的单克隆抗体，紫外分光光度计测定蛋白浓度，用SDS-PAGE进行纯度检测。
3结果
3.1特异性针对HP-PRRSV的单克隆抗体筛选
3.1.1免疫效果鉴定
对免疫三次后的小鼠进行尾部采血，1：5000稀释后利用IFA方法进行检测，结果显示，随机选择的三只小鼠均免疫成功可以进行加强免疫及细胞融合(图1)。
3.1.2能够分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选
细胞融合10d后利用IFA方法检测杂交瘤细胞培养液上清，并将阳性孔亚克隆3次，每个亚克隆过程中都要对细胞培养液上清进行IFA检测，直至96孔板均为阳性，成功制备了能够分泌PRRSV特异性抗体的杂交瘤细胞系(图2)，制备单克隆抗体的细胞株命名为鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株XX10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号是：CGMCC No.45495，保藏日期为2023年03月03日。
3.2特异性识别HP-PRRSV单克隆抗体XX10的鉴定
3.2.1单克隆抗体的亚类鉴定
利用抗体亚类鉴定试剂盒对XX10分泌的抗体进行抗体亚类鉴定，鉴定结果显示XX10抗体重链为IgG2a，轻链为K链。
3.2.2单抗XX10特异性检测
单抗XX10特异性检测结果显示，单抗XX10与美洲型PRRSV毒株CH-1R株(经典毒株，Lineage 8.7)、SD-R株(类NADC30 PRRSV，Lineage 1.8)、RespPRRS MLV株(经典北美型毒株，Lineage 5.1)、LNTZJ1341株(类NADC34 PRRSV，Lineage 1.5)、HNTZJ1714株(类QYYZPRRSV，Lineage 3.5)和欧洲型毒株ZD-1株均不反应，与HP-PRRSV HuN4-F112株(HP-PRRSV，Lineage 8.7)、JXA1-R株(HP-PRRSV，Lineage 8.7)、TJM株(HP-PRRSV，Lineage 8.7)均反应良好(图3)。表明单抗XX10仅与HP-PRRS毒株反应，而不与其它类型PRRS毒株反应。
3.2.3单抗XX10敏感性检测
利用DMEM对收取的XX10细胞培养上清进行2倍倍比稀释，利用2.2.3描述的方法，最终鉴定出XX10在1：256倍时P/N仍高于2.1，因此XX10具有较高的敏感性。
3.2.4HP-PRRSV单克隆抗体XX10
经过纯化后的抗体利用紫外分光光度计对其蛋白浓度进行检测，结果为2.16mg/mL，经SDS-PAGE电泳检测显示，单抗XX10获得较好的纯化，基本去除腹水中的杂蛋白，单克隆抗体的重链和轻链条带清晰(图4)。
实施例2特异性鉴定HP-PRRSV抗体竞争ELISA方法的建立
1、HP-PRRSV抗体竞争ELISA方法的建立
(1)抗原包被：以每孔300ng的纯化灭活HuN4-F112病毒包被ELISA板，4℃过夜。
(2)封闭：取出包被好的ELISA板，PBST洗涤3次，拍干；加入300μL/孔封闭液，置37℃恒温培养箱孵育2h。从温箱中取出封闭好的ELISA板，PBST洗涤3次，拍干。
(3)待检血清及一抗孵育：将待检血清与XX10单克隆抗体(实施例1制备)1：1混合后加入ELISA板，每孔加入100μL，同时设阳性血清和阴性血清做对照，37℃恒温培养箱孵育30min，PBST洗涤3次，拍干。
(4)二抗孵育：将HRP-羊抗鼠IgG用PBST做10000倍稀释，每孔加入100μL，37℃恒温培养箱孵育30min，PBST洗涤3次，拍干。
(5)底物显色：加入底物TMB进行显色，每孔加入100μL TMB，置37℃恒温培养箱避光作用15min。
(6)终止反应：每孔加入50μL 2M H2SO4进行终止，酶标仪450nm处测量吸光度A值(OD450nm值)。
(7)计算血清抑制率：血清抑制率(％)＝(阴性对照OD450nm值-待检血清OD450nm值)/阴性对照OD450nm值×100％。
2、HP-C-ELISA与市售试剂盒的比较
(1)特异性比较
利用HP-C-ELISA方法检测副猪嗜血杆菌(HPS)、链球菌(SS)、传染性胸膜肺炎(APP)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、***病毒(FMDV)、欧洲型PRRSV ZD-1株、NADC30-like PRRSV SD-R株、WK108株、VR2332-like PRRSV SD192株、NADC34-like PRRSVDZD32-1901株、经典毒株CH-1R株、HP-PRRSVHuN4-F112株、JXA1-R株和TJM株的阳性血清，判定HP-C-ELISA的特异性。
(2)敏感性比较
将2份PRRSV-2HuN4-F112株免疫后的血清分别进行2倍倍比稀释，用HP-C-ELISA与IDEXX PRRS X3抗体检测试剂盒分别进行检测，比较HP-C-ELISA与市售试剂盒的敏感性。
3、结果
3.1包被抗原的制备
分子筛纯化后的HuN4-F112全病毒(已灭活)经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其浓度为300ng/μL。
3.2HP-C-ELISA方法的建立及反应条件的确定
经方阵滴定法建立的HP-C-ELISA方法的最佳反应条件见表1。
表1HP-C-ELISA检测方法反应条件优化
3.3HP-C-ELISA临界值的确定
按优化后的HP-C-ELISA方法检测156份阴性血清和130份HP-PRRSV阳性血清，MedCalcv15.8软件分析结果显示，临界值为45％，敏感性为96.9％，特异性为97.4％(图5)。因此，当血清样品的PI≥45％时，判定结果为阳性，当血清样品的PI<45％时，判定为阴性。
3.4HP-C-ELISA特异性试验结果
利用该HP-C-ELISA方法检测副猪嗜血杆菌(HPS)、链球菌(SS)、传染性胸膜肺炎(APP)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、***病毒(FMDV)、欧洲型PRRSV ZD-1株、NADC30-like PRRSV SD-R株和WK108株、VR2332-like PRRSV SD192株、NADC34-like PRRSV DZD32-1901株、经典毒株CH-1R株、HP-PRRSV HuN4-F112株、JXA1-R株和TJM株的阳性血清，结果显示该方法仅能与HP-PRRSV阳性血清特异性竞争包被抗原，其它美洲型各谱系毒株及常见猪病毒和细菌阳性血清PI值均远低于临界值(图6)。
3.5HP-C-ELISA重复性试验结果
利用建立的HP-C-ELISA方法，进行重复性试验，结果显示批内和批间重复试验变异系数均小于5％(表2)，表明该方法具有较好的重复性。
表2HP-C-ELISA方法批内和批间重复性实验(n＝5)
3.6HP-C-ELISA与市售试剂盒的比较
3.6.1HP-C-ELISA与市售试剂盒特异性比较
利用本发明建立的HP-C-ELISA方法与IDEXX PRRSV ELISA抗体试剂盒进行比较，美洲型PRRSV SD-R株(类NADC30 PRRSV，Lineage 1.8)、VR2332-like PRRSV SD192株(L5.1)、NADC34-like PRRSV DZD32-1901株(L1.5)、经典毒株CH-1R株(L8.7)和HP-PRRSVHuN4-F112株(L8.7)动物实验阳性血清各5份进行检测，结果表明，本发明建立的HP-C-ELISA可以特异性检测HP-PRRSV抗体(图7)。
3.6.2HP-C-ELISA与市售试剂盒敏感性比较
将2份PRRSV-2HuN4-F112株免疫后的血清分别进行2倍倍比稀释，用HP-C-ELISA与IDEXX市售试剂盒分别进行检测，比较HP-C-ELISA与市售试剂盒的敏感性。结果显示2份PRRSVHuN4-F112阳性血清稀释倍数为1:8和1:16时抑制率仍大于临界值；IDEXX PRRS X3抗体检测试剂盒也分别能检出最高8倍和16倍稀释的2份PRRSV HuN4-F112阳性血清(图8)，以上结果表明本发明建立的HP-C-ELISA方法具与市售间接ELISA试剂盒相仿的敏感性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种分泌高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株XX10，其特征在于，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45495，保藏时间为2023年03月03日。
2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株XX10分泌的抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体。
3.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株XX10或如权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒为HP-PRRSV毒株。
5.一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗体竞争ELISA试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的抗体竞争ELISA试剂盒，其特征在于，还包括灭活的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒包被的ELISA板；在ELISA板中，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒为HuN4-F112株，保藏编号为CGMCC NO.2484。
7.根据权利要求6所述的抗体竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述灭活的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的包被浓度为300ng/μL。
8.根据权利要求6所述的抗体竞争ELISA试剂盒，其特征在于，还包括辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG、封闭液、洗涤液、稀释液、显色液和终止液。
9.根据权利要求7所述的抗体竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG经PBST溶液稀释，稀释倍数为10000倍。
10.根据权利要求7所述的抗体竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述封闭液为1％w/v的BSA溶液。
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