CN111303254A - 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）抗原检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)抗原检测试剂盒。本发明提供的SARS‑CoV‑2抗原的检测试剂盒利用胶体金双抗体夹心法对SARS‑CoV‑2抗原进行检测，采用两种单克隆抗体与胶体金混合标记，不仅用于SARS‑CoV‑2抗原的检测结果准确，灵敏度高，同时可以显著提高检出率。该检测试剂盒填补了免疫学检测SARS‑CoV‑2的空白，并且不需要检测仪器即可实现现场检测，省时省力，操作灵活。

Description

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原检测试剂盒。
背景技术
自从2019新冠状病毒(SARS-CoV-2)爆发以来，确诊病例和疑似病例均在一端时间内快速增长，但是对于疑似病例的确诊检测目前采用的方式主要为双重荧光PCR法进行检测，在同一份标本中新冠状病毒2个靶标(ORF1ab，N)特异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性才能确诊该标本为阳性，该检测方法费时费力，同时需要集中送样采用特定的仪器进行检测，此外，样本制备过程繁琐耗时，过程中样本极易被污染，导致该方法具有很大的局限性。而现有技术中号称检测SARS-CoV-2抗原的产品，多半是用之前研究其他冠状病毒时的抗体来检测，比如新冠和SARS的同源性很高，可以用SARS的抗体临时救急用一下，但是特异性和灵敏度很难保证，使我国感染的检测准确率降低。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种SARS-CoV-2抗原。
本发明的第二目的在于提供一种抗SARS-CoV-2的抗体。
本发明的第三目的在于提供上述抗体的制备方法。
本发明的第四目的在于提供上述抗原或抗体的应用。
本发明的第五目的在于提供利用双抗体夹心检测SARS-CoV-2抗原的产品。
本发明的第六目的在于提供一种SARS-CoV-2抗原的检测试纸。
本发明的第七目的在于提供上述检测试纸的制备方法。
本发明的第八目的在于提供一种SARS-CoV-2抗原的检测试剂盒。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种SARS-CoV-2抗原，所述抗原为由SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.11中任一种所示氨基酸序列组成的蛋白质。
一种抗SARS-CoV-2的抗体，所述抗体特异性地与上述的抗原结合。
进一步地，所述抗体为单克隆抗体。
一种上述抗体的制备方法，采用由SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.11中任一种所示氨基酸序列组成的蛋白质作为抗原，与佐剂制备免疫原，免疫动物后得到抗体。
优选地，采用由SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.11中任一种所示氨基酸序列组成的蛋白质作为抗原，与佐剂制备免疫原，免疫动物后，待检测抗体效价满足10倍稀释活性在L6以上，再次免疫动物，然后取被免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选阳性克隆、扩增并纯化得到抗体。
进一步地，所述动物为小鼠，优选为BALB/c小鼠；
优选地，佐剂包括弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂；
优选地，免疫动物的步骤包括：采用背部多点注射，利用抗原与弗氏完全佐剂制备的免疫原进行首次免疫，每间隔三周，利用抗原与弗氏不完全佐剂制备的免疫原进行第二次、第三次和第四次免疫；
优选地，首次免疫和再次免疫的抗原量均独立地为40-60μg；
优选地，第二次、第三次和第四次免疫的抗原量均独立地为20-30μg；
优选地，脾细胞与骨髓瘤细胞的细胞个数比例为1×107-1×109：1×107；
优选地，细胞融合采用腹腔巨噬细胞作为饲养细胞；
优选地，阳性克隆的扩增采用腹水制备。
上述抗原或抗体在制备检测SARS-CoV-2抗原检测产品中的应用；
优选地，产品包括试纸或试剂盒。
一种利用双抗体夹心法检测SARS-CoV-2抗原的产品，所用抗体包括上述抗体。
一种SARS-CoV-2抗原的检测试纸，包括底板、样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫，沿待测液体样本流动方向，样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫依次固定于底板上；结合垫负载有金标蛋白，金标蛋白包括上述抗体；包被膜设有检测区和质控区，检测区负载有特异性抗体，质控区负载有羊抗鼠IgG抗体；所述特异性抗体为抗N蛋白特异性抗体、抗S蛋白特异性抗体、抗M蛋白特异性抗体或抗E蛋白特异性抗体；所述N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述M蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示，所述E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；
优选地，金标蛋白包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3分别制备的单克隆抗体；
优选地，特异性多抗为抗N蛋白特异性抗体；
优选地，待检测液体样本包括全血、血清或血浆；
优选地，胶体金的粒径为15-25nm；
优选地，结合垫上，每厘米结合垫上负载有0.8-1.5μg金标蛋白；
优选地，包被膜上，每厘米检测区上负载有1.5-2.5μg特异性抗体；
优选地，包被膜上，每厘米质控区上负载有1.0-1.5μg羊抗兔多抗；
优选地，样品垫经含有0.5-1.5v/v％Tween20、0.4-0.6w/v％PVA和0.1-0.2mg/ml抗RBC抗体的溶液浸泡处理。
一种检测试纸的制备方法，沿待检测液体样本流动方向，将样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫依次固定于底板上；结合垫负载有金标蛋白，金标蛋白包括上述抗体；包被膜设有检测区和质控区，检测区负载有特异性抗体，质控区负载有羊抗鼠IgG抗体；所述特异性抗体为抗N蛋白特异性抗体、抗S蛋白特异性抗体、抗M蛋白特异性抗体或抗E蛋白特异性抗体；所述N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述E蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.14所示；
优选地，金标蛋白的制备方法包括：将胶体金溶液与SEQ ID NO.2制备的抗体混匀反应，得到标记抗体1；将胶体金溶液与SEQ ID NO.3制备的抗体混匀反应，得到标记抗体2；标记抗体1与标记抗体2按照体积比2-4:7混合得到金标蛋白；
优选地，特异性多抗为抗N蛋白特异性抗体；
优选地，胶体金的粒径为15-25nm；
优选地，结合垫上，每厘米结合垫上负载有0.8-1.5μg金标蛋白；
优选地，包被膜上，每厘米检测区上负载有1.5-2.5μg特异性抗体；
优选地，包被膜上，每厘米质控区上负载有1.0-1.5μg羊抗兔多抗；
优选地，包被膜上，检测区和质控区的包被缓冲液均独立地为PBS；
优选地，样品垫经含有0.5-1.5v/v％Tween20、0.4-0.6w/v％PVA和0.1-0.2mg/ml抗RBC抗体的溶液浸泡处理。
一种SARS-CoV-2抗原的检测试剂盒，包括上述检测试纸。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的SARS-CoV-2抗原为由SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.11中任一种所示氨基酸序列组成的蛋白质。由该十种抗原可以得到多种特异性结合抗体，该多种抗体均可用于SARS-CoV-2抗原的检测，其中，发明人经过多次选择和重复验证，筛选得到SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3两种抗原免疫得到的抗体不仅用于SARS-CoV-2抗原的检测结果准确，灵敏度高，同时该两种单克隆抗体也可以混合标记，用于SARS-CoV-2抗原的检测，可以显著提高检出率。本发明提供的抗体可以应用于多种免疫学检测手段，例如胶体金双抗体夹心检测等，填补了免疫学检测SARS-CoV-2的空白，并且实现现场检测，省时省力，操作灵活。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例的技术路线流程图；
图2为本发明实施例1中效价检测判读显色标准；
图3为本发明实施例4中检测试纸的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明保护一种SARS-CoV-2抗原，为由SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.11中任一种所示氨基酸序列组成的蛋白质。
由该十种抗原可以得到多种特异性结合抗体，该多种抗体均可用于SARS-CoV-2抗原的检测，其中，发明人经过多次选择和重复验证，筛选得到SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3两种抗原免疫得到的抗体不仅用于SARS-CoV-2抗原的检测结果准确，灵敏度高，同时该两种单克隆抗体也可以混合标记，用于SARS-CoV-2抗原的检测，可以显著提高检出率。
本发明还保护一种抗SARS-CoV-2的抗体，该抗体特异性地与本发明抗原结合。
该抗体的免疫活性高，可以高效、快速、灵敏的特异性结合SARS-CoV-2，抗体优选为单克隆抗体。本发明提供的抗原为SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.11共十种，以此抗原分别免疫可以得到多种抗体，该多种抗体均可用于SARS-CoV-2的检测，检测效果好。
本发明还保护上述抗体的制备方法，采用由SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.11中任一种所示氨基酸序列组成的蛋白质作为抗原，与佐剂制备免疫原，免疫动物后得到抗体。进一步地，例如采用由SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.11中任一种所示氨基酸序列组成的蛋白质作为抗原，与佐剂制备免疫原，免疫动物后检测抗体效价满足10倍稀释活性在L6以上后，再次免疫取脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选阳性克隆、扩增并纯化得到抗体。发明人通过对动物免疫、细胞融合、特异性杂交瘤细胞的筛选、单克隆抗体的大量制备的条件进行摸索确定了本发明提供的制备方案，本发明的抗原通过该方法可以大量得到目标抗体。
在优选的实施方式中，动物为小鼠，优选为BALB/c小鼠；佐剂包括弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂；免疫动物的步骤进一步包括：采用背部多点注射，利用抗原与弗氏完全佐剂制备的免疫原进行首次免疫，每间隔三周，利用抗原与弗氏不完全佐剂制备的免疫原进行第二次、第三次和第四次免疫，其中，对于小鼠而言，首次免疫和再次免疫的抗原量均独立地优选为40-60μg，例如可以但不限于为40μg、45μg、50μg、55μg或60μg；第二次、第三次和第四次免疫的抗原量均独立地优选为20-30μg，例如可以但不限于为20μg、25μg或30μg。
在优选的实施方式中，脾细胞与骨髓瘤细胞的细胞比例为1×107-1×109：1×107，进一步地，细胞融合优选采用腹腔巨噬细胞作为饲养细胞；此外，阳性克隆的扩增优选采用腹水制备。
本发明还保护抗原或抗体在制备检测SARS-CoV-2抗原检测产品中的应用。其中，产品可以为试纸或试剂盒等。
本发明还保护一种利用双抗体夹心法检测SARS-CoV-2抗原的产品，该产品所用抗体为本发明提供的抗体。
本发明还保护一种SARS-CoV-2抗原的检测试纸，包括底板、样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫，沿待测液体样本流动方向，样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫依次固定于底板上；结合垫负载有金标蛋白，金标蛋白为本发明提供的抗体；包被膜设有检测区和质控区，检测区负载有特异性抗体，质控区负载有羊抗鼠IgG抗体；特异性抗体为抗N蛋白特异性抗体、抗S蛋白特异性抗体、抗M蛋白特异性抗体或抗E蛋白特异性抗体；N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，M蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示，E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。发明人通过大量的试验条件摸索，利用SARS-CoV-2重组表达的4种蛋白(N，S，M，E)进行免疫，通过不同的包被缓冲液、样品垫处理、胶体金的标记工艺、单抗配对的筛选等调试检测，根据检测结果选择包被原料且选定最适的包被条件。以N、S、M或E蛋白作为免疫原制备得到的多抗作为检测区蛋白，本发明提供的抗体为金标蛋白，利用胶体金双抗体夹心原理，对SARS-CoV-2抗原进行检测，填补了免疫学检测SARS-CoV-2的空白，并且实现现场检测，避免了使用检测仪器省时省力，操作灵活。
在优选的实施方式中，金标蛋白为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3分别制备的单克隆抗体的混合物，将两种抗体混合标记，可以显著提高检出率。发明人通过大量的条件摸索和筛选，确定抗多个蛋白的单抗是最适的金标抗体。通过十字交叉组合检测包被抗体和标记抗体，选出上述两种抗体混合标记为最佳的组合条件。该检测试纸的待检测液体样本可以为全血、血清或血浆；
在优选的实施方式中，胶体金的粒径为15-25nm；结合垫上，每厘米结合垫上优选负载有0.8-1.5μg金标蛋白；包被膜上，每厘米检测区上优选负载有1.5-2.5μg特异性多抗；包被膜上，每厘米质控区上优选负载有1.0-1.5μg羊抗兔多抗；样品垫负载有抗RBC抗体，用于除去待检测液体样本中的红细胞；样品垫经含有0.5-1.5v/v％Tween20和0.4-0.6w/v％PVA的溶液浸泡处理，有利于胶体金的释放。
本发明还保护一种检测试纸的制备方法，沿待检测液体样本流动方向，将样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫依次固定于底板上；结合垫负载有金标蛋白，金标蛋白包括本发明的抗体；包被膜设有检测区和质控区，检测区负载有特异性抗体，质控区负载有羊抗鼠IgG抗体；特异性抗体为抗N蛋白特异性抗体、抗S蛋白特异性抗体、抗M蛋白特异性抗体或抗E蛋白特异性抗体；N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，S蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示，M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
在优选的实施方式中，金标蛋白的制备方法包括：将胶体金溶液与SEQ ID NO.2制备的抗体混匀反应，得到标记抗体1；将胶体金溶液与SEQ ID NO.3制备的抗体混匀反应，得到标记抗体2；标记抗体1与标记抗体2按照体积比2-4:7混合得到金标蛋白。
在优选的实施方式中，胶体金的粒径为15-25nm；结合垫上，每厘米结合垫上优选负载有0.8-1.5μg金标蛋白；包被膜上，每厘米检测区上优选负载有1.5-2.5μg特异性多抗；包被膜上，每厘米质控区上优选负载有1.0-1.5μg羊抗兔多抗；样品垫负载有抗RBC抗体，用于除去待检测液体样本中的红细胞；样品垫经含有0.5-1.5v/v％Tween20和0.4-0.6w/v％PVA的溶液浸泡处理，有利于胶体金的释放。
在优选的实施方式中，包被膜上，检测区和质控区的包被缓冲液均独立地为PBS。发明人经试验研究发现，PBS可以显著提高检测的准确性和灵敏度。
本发明最后提供SARS-CoV-2抗原的检测试剂盒，该试剂盒包括本发明的检测试纸。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明的技术路线如图1所示，进而给出如下实施例方案。
实施例1单克隆抗体的制备过程
动物免疫
①抗原制备。
制备单克隆抗体的免疫抗原，本实施例的筛选抗原如下10种：N1抗原(SEQ IDNO.2)、N2抗原(SEQ ID NO.4)、N3抗原(SEQ ID NO.3)、N4抗原(SEQ ID NO.5)、S1抗原(SEQID NO.6)、S2抗原(SEQ ID NO.7)、S3抗原(SEQ ID NO.8)、M1抗原(SEQ ID NO.9)、M2抗原(SEQ ID NO.10)、E抗原(SEQ ID NO.11)。
②免疫动物的选择。
根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠作为免疫动物。因为，供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠。小鼠，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。
③免疫方案的确定。
根据抗原的特异性选择合适的免疫方案。对于可溶性抗原的免疫原性弱，要加佐剂，常用佐剂为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，制备成油包水的状态。
④免疫。
第一次免疫抗原50μg/只小鼠，抗原与弗氏完全佐剂等体积混合，制备成油包水的状态，小鼠背部多点注射，每只小鼠注射0.3ml，间隔三周。
第二次免疫抗原25μg/只小鼠，抗原与弗氏不佐剂等体积混合，制备成油包水的状态，小鼠背部多点注射，每只小鼠注射0.3ml，间隔三周。
第三次免疫抗原25μg/只小鼠，抗原与弗氏不佐剂等体积混合，制备成油包水的状态，小鼠背部多点注射，每只小鼠注射0.3ml，间隔三周。
第四次免疫抗原25μg/只小鼠，抗原与弗氏不佐剂等体积混合，制备成油包水的状态，小鼠背部多点注射，每只小鼠注射0.3ml。一周后取血检测活性。
⑤检测结果。
10倍稀释活性在L6以上(参照标准如图2所示)，加强免疫，抗原50μg，腹腔注射，三天后取脾脏融合。
细胞融合
小鼠腹腔巨噬细胞的准备
①用6-10周龄的BALB/c小鼠。
②拉颈处死，浸泡于75％的酒精，消毒3min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。用吸管注入6ml不含小牛血清的1640培养液，反复冲洗，吸出冲洗液。
③放入10ml离心管，1200rpm离心5min。
④用20％小牛血清的1640培养液混悬，调整细胞数为1×105/ml。加入96孔板，100μl/孔。放入37℃、5％CO2培养箱。
骨髓瘤细胞的准备
①于融合前48-36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养。
②融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。
③1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。
④加入30ml不含小牛血清的1640培养液，离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不含小牛血清的1640培养液，混匀。
⑤取骨髓瘤细胞悬液，加0.4％台酚蓝染液作活细胞计数后备用。
脾细胞的准备
①取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不含小牛血清的1640培养液的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围***。
②置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。使脾细胞进入平皿中的不含小牛血清的1640培养液。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。通常每只小鼠1×108-2.5×108个脾细胞。
细胞融合
①将1×108脾细胞与1×107骨髓瘤细胞SP2/0混合于1支50ml融合管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。
②1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。
③在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀。
④用1ml吸管在30s内加入预热的50％PEG 1ml，边加边轻轻搅拌。
⑤吸入吸管静置1min。
⑥加入预热的不完全培养液，终止PEG作用，连续每2min内分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，10ml。
⑦800rpm，5分钟；弃去上清。
⑧加入5ml含20％小牛血清1640HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含20％小牛血清1640HAT培养基80-90ml。分装96孔细胞培养板，每孔100μl，然后将培养板置37℃，5％CO2培养箱内培养。
⑨6天后用含20％小牛血清1640HAT培养基半换液。
⑩经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
特异性杂交瘤细胞的选择
①吸出100μl细胞上清到96孔板，***抗体金标条检测，阳性多克隆进行亚克隆。克隆化的方法是有限稀释法。制备小鼠腹腔巨噬为饲养细胞。
②制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20％血清的HAT培养基稀释至每毫升含5、10和20个细胞3种不同的稀释度。
③按每毫升加入5×104-1×105细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。
④每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每孔量为100μl。
⑤37℃、5％CO2培养6天，在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体金标检测。
⑥冻存细胞。
⑦细胞覆盖率至80％时，就可分瓶扩增。将细胞培养瓶从37℃、5％CO2培养箱中取出，将细胞培养瓶放于超净工作台中。用无菌的弯管轻轻吹打细胞二十次。将吹打下的细胞以1瓶传6瓶的比例，传到110cm2培养瓶中(每瓶约5ml)。随后在每个培养瓶中补加25ml10％含小牛血清的1640培养液。封口(培养瓶盖不要太紧带上扣即可，这样可以保证培养瓶与培养箱中的CO2相通)后，放入37℃、5％CO2培养箱静置培养。
⑧扩增后6个培养瓶内细胞长至培养瓶底面积的80％时，用无菌的弯管轻轻吹打细胞二十次，收集培养瓶中培养的细胞，把细胞悬液转移至50ml离心管中，离心1500转/min，5min。弃上清液，加入不含小牛血清的1640培养液计数细胞，调整细胞浓度为1.2×106/ml。
⑨同一时间内只能收集一种细胞，收集的单克隆抗体细胞必须在3小时内注射小鼠。
单克隆抗体的大量制备(腹水制备):
①老鼠致敏：石蜡油用前需高压灭菌，液体石蜡致敏F1小鼠，小鼠6～8周，体重达到22-24g，每只小鼠腹腔注射体积0.2ml/只。7-15天可用于细胞接种。
②注射细胞：收集的单克隆细胞细胞注射于老鼠腹腔1ml/只,注射器具需无菌。7-15天可见老鼠状态不活跃并且老鼠的腹腔肿大。同一时间只能进行一种小鼠腹腔细胞注射，不同种类的小鼠腹水生产应在不同的房间进行，避免小鼠串笼造成交叉污染。
③腹水采集：定期观察已接种小鼠的生长情况，腹腔圆鼓，状态不佳时及时抽取腹水，合并低速离心1500转/min，10min。收集500ml装一瓶，混匀后取1ml作为腹水检测样本，放-20℃冷冻保存。同一时间只能进行一种腹水的收集、离心、装瓶、冻存，严禁在同一时间进行两种及以上腹水的收集工作。腹水的采集应在注射细胞后15天以内采集，待纯化。
实施例2多克隆抗体的制备
免疫
抗原选自N蛋白(SEQ ID NO.1)、S蛋白(SEQ ID NO.12)、M蛋白(SEQ ID NO.13)和E蛋白(SEQ ID NO.14)，分别制备多抗。
第一次免疫，取抗原与福氏完全佐剂按体积1:1混合，漩涡搅拌器搅拌，制备成油包水的佐剂，每只豚鼠皮下免疫多点注射2ml。每只豚鼠0.5mg抗原。
第二次免疫，第一次免疫3周后，取抗原与福氏不完全佐剂按体积1:1混合，漩涡搅拌器搅拌，制备成油包水的佐剂，每只豚鼠皮下免疫多点注射2ml，每只豚鼠0.25mg抗原。
第三次免疫，第二次免疫3周后，取抗原与福氏不完全佐剂按体积1:1混合，漩涡搅拌器搅拌，制备成油包水的佐剂，每只豚鼠皮下免疫多点注射2ml，每只豚鼠0.25mg抗原。
血清采集
检测三次免疫一周后静脉取血，金标检测效价，效价达到L6～L7，静脉抽血，血放4度冰箱过夜，第二天，离心，收集血清，离心9500转/分，离心20分钟，血清放-20度冰箱保存，待纯化。
实施例3抗体纯化
(1)硫酸铵沉淀
采集的腹水或者血清缓慢滴加等体积的饱和(NH4)2SO4。全部完成后，室温继续搅拌2h，2～8℃静置12～16h。
次日，样品15,000g，4℃，离心20min。取出离心杯，拧开杯盖，注意观察，将离心沉淀位置靠近掌心(倾倒时离心物向上)，缓慢但连续将离心上清倒出至废液桶中，上清全部倒出后，离心杯继续倒置3～5s，控干液体。
以每升培养上清使用50ml PBS计算，量取PBS，均分至离心杯中，用吸管吹吸1min，将离心的沉淀充分溶解。
再次以15,000g，4℃，离心20min。取出离心杯，拧开杯盖，注意观察，将离心沉淀位置靠近掌心(倾倒时离心物向上)，缓慢但连续将离心上清倒出至干净容器中，即为ProteinA柱层析上样。
(2)Protein A亲和层析纯化
装柱：
可使用已经装好的层析柱，其中使用的Protein A层析填料体积不应小于上样样品的体积的1/20，柱高10cm～12cm。填料应固定抗体项目使用，反复使用不能超过10次。
平衡。
装填好后的Protein A层析柱，以PBS缓冲液充分平衡。连通并开启在线紫外检测器，选择280nm波长，0.2A档位。使用线性流速60cm/h。检测器数值平稳后，将基线归零，进样。
上样：
平衡完成后，以线性流速60cm/h进样，当紫外检测器读数上升至15时开始收集穿透液，记录穿透液最高吸收峰值。进样结束后，以PBS缓冲液冲洗管路及层析柱中残余样品，当紫外检测器读数下降至15时停止收集穿透液，直至检测器基线平稳。
洗脱：
以0.1mol/L Gly缓冲液(pH2.4)洗脱结合的抗体。线性流速60cm/h，当紫外检测器读数上升至15时开始收集洗脱峰，观察数值变化，记录最高峰值，当紫外检测器读数下降至15时停止收集。
中和：
洗脱样品滴加1mol/L Tris调整pH至6.0～6.5。
过滤：
洗脱样品以0.45μm水系滤膜过滤，量筒测定过滤后样品体积，混匀。以PBS为空白对照，将1体积样品用24倍体积PBS稀释后，测定A280，计算蛋白浓度。蛋白浓度的计算方法为C＝A280×样本稀释倍数/1.36。用PBS将洗脱样品精确稀释至5mg/ml。加入万分之二浓度的Proclin-300防腐。盛装容器外标记日期，密封暂存于2～8℃。
实施例4抗体的筛选
原料活性的筛选方法
对上述抗体分别进行包被，即用包被缓冲液(10mM pH7.2的PBS)把特异抗体稀释到10-20μg/ml分别进行包被。标记特异抗体到直径15-25nm胶体金上，调金溶液PH值6-7，抗体浓度10-20μg/ml，20％BSA封闭，离心后用TB9溶液重悬至原体积的1/10，再用DOA复溶液复溶抗体，将标记好的胶体金溶液均匀涂布在玻璃纤维素膜(1200玻纤)上烘干待用。将包被的特异抗体和标记后的特异抗体，进行十字交叉法进行检测其原料的活性。结果如下表所示：
Figure BDA0002388284280000111
从上表可以看出：原料筛选N1+N、N3+N活性高无本底，N1+S/M/E活性高有本底，N3+S/M/E也是活性高有本底。
包被缓冲液的筛选方法
对包被膜的包被缓冲液进行对比实验，分别采用PBS(10mM pH7.2的PBS)、CB(50mMPh9.6的PBS)和TBS(20mM pH8.0的PBS)三种缓冲液对上述包被活性高的抗N蛋白特异性抗体按照1.5mg/ml-2.0mg/ml进行包被，检测活性结果如下表所示：
Figure BDA0002388284280000121
从上表可以看出：缓冲液的筛选在CB(50mM Ph9.6的PBS)中活性低，TBS(20mMpH8.0的PBS)与PBS(10mM pH7.2的PBS)活性相近，但PBS(10mM pH7.2的PBS)更好些。
混合标记比例的确定方法
分别对N1和N3单独标记，然后对标记抗体N1与标记抗体N3按照不同比例进行混合，再用DOA复溶液复溶抗体，将标记好的胶体金溶液均匀涂布在玻璃纤维素膜(1200玻纤)上烘干待用。检测活性结果如下表所示：
Figure BDA0002388284280000122
从上表可以看出，N1/N3的最佳比例在1/3-1/2之间。
实施例5试剂盒的制备
试剂盒的主要成分
Figure BDA0002388284280000123
Figure BDA0002388284280000131
硝酸纤维素膜、包被液购自英科新创(厦门)科技有限公司。新型冠状病毒特异抗体(单抗、多抗)、羊抗鼠IgG均自产北京新创生物工程有限公司。
硝酸纤维素膜的制备方法
用包被缓冲液(10mM pH7.2的PBS)把羊抗鼠IgG抗体按照1.5mg/ml-2.0mg/ml包被在NC膜的对照线上、抗N蛋白特异多抗按照1.5mg/ml-2.0mg/ml包被在NC膜的检测线上，NC膜置于干燥间(温度24±4℃、湿度﹤25％)干燥(1-2h)。储存：干燥完的NC膜装入铝箔袋封中，加入干燥剂，抽真空包装后中4～30℃储存。
样品垫的制备方法
在样垫上进行去除全血中红细胞的处理：加入抗RBC的；促进胶体金的释放：加入1％Tween20+0.5％PVA。
胶体金标记抗N蛋白特异单抗N1与N3混合标记的制备方法
1)标记抗体N1到直径15-25nm胶体金上，调金溶液PH值6-7，抗体浓度15-20μg/ml，20％BSA封闭，离心后用TB9溶液重悬至原体积的1/10；
2)标记抗体N3到直径15-25nm胶体金上，调金溶液PH值7-8，抗体浓度10-20μg/ml，20％BSA封闭，离心后用TB9溶液重悬至原体积的1/10；
3)标记抗体N1与标记抗体N3按照比例3:7进行混合；
4)再用原体积9/10的DOA复溶液，复溶抗体。
5)将标记好的胶体金溶液均匀涂布在玻璃纤维素膜(1200玻纤)上，42ml/张。
6)将金垫用冻干机冻干或烘干。
7)干燥完的金垫装入铝箔袋封中，加入干燥剂，抽真空包装后中4～30℃储存。
胶体金试纸条的组装
将样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫沿待检测液体样本流动方向，依次固定于底板上，得到检测试纸，结构示意图如图3所示。
试剂盒的检测方法
1)编号：将试纸取出，粘贴于不干胶记录纸上相应位置，水平放置并做好标记。
2)加样：用加样器或一次性采血管吸取60μl新鲜全血(或血清、血浆)，缓慢滴加于试纸箭头下方的垫片上或试卡的加样孔(所配一次性采血管容量为80ul)。
3)判读：为防止弱阳标本的漏检，请于加样后10分钟观察并记录结果。
试验结果的解释
1)阳性：试纸在检测线和对照线位置出现两条紫红线。
2)阴性：试纸只在对照线位置出现一条紫红线。
3)失效：试纸未出现紫红线或仅在检测线出现一条***线。
实施例6试剂盒性能检测
根据实施例5中的试剂盒的检测方法来进行以下实验的检测：
(1)特异性的实验：
阴性样本的检测：检测1000例普通临床血的检测，检测结果都为阴性。
阳性样本的检测：经湖北省疾控中心确证的新型冠状病毒感染血清500例，我们试剂盒检出453例，即检出率为90.6％。
(2)稳定性实验：
将随机抽取同批生产好的待检试剂盒分成2份，1份置于4℃冰箱中，另1份置于37℃恒温箱中6天后取出放入4℃冰箱中平衡过夜，用阳性关键质控品进行稳定性检测。
判读方法：检测线显色的强弱，判读从L0-L10，具体见图2。
结果判定：37℃放置6天试剂盒对灵敏度的判读与初检4℃放置的试剂盒的灵敏度一致，显色越一致稳定性越好。
试剂盒稳定性检测结果
试剂盒储存条件 初检4℃放置试剂盒 37℃放置6天 37℃活性残存率
阳性关键质控品 L4 L4 100％
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京新创生物工程有限公司
<120> 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）抗原检测试剂盒
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Ala Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
<210> 2
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys
100
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp
1 5 10 15
Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln
20 25 30
Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys
35 40 45
Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala
50 55 60
Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln
65 70 75 80
Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala
85 90 95
Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly
100 105 110
<210> 4
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly
1 5 10 15
Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp
20 25 30
Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr
35 40 45
Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly
50 55 60
Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn
85 90 95
Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg
100 105
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp
1 5 10 15
Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln
20 25 30
Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys
35 40 45
Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala
50 55 60
Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln
65 70 75 80
Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala
85 90 95
Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly
100 105 110
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp
1 5 10 15
Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln
20 25 30
Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys
35 40 45
Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala
50 55 60
Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln
65 70 75 80
Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala
85 90 95
Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly
100 105 110
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp
1 5 10 15
Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln
20 25 30
Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys
35 40 45
Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala
50 55 60
Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln
65 70 75 80
Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala
85 90 95
Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly
100 105 110
<210> 8
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly
1 5 10 15
Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val
20 25 30
Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr
35 40 45
Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu
50 55 60
Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn
65 70 75 80
Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr
85
<210> 9
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Thr Trp Ile
20 25 30
Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile
35 40 45
Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys
50 55 60
Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly Ile
65 70 75 80
Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe
85 90 95
Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe
100 105 110
Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu His Gly Thr Ile
115 120 125
<210> 10
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Met Asn Val Pro Leu His Gly Thr Ile Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu
1 5 10 15
Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile Leu Arg Gly His Leu Arg Ile
20 25 30
Ala Gly His His Leu Gly Arg Cys Asp Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu
35 40 45
Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala
50 55 60
Ser Gln Arg Val Ala Gly Asp Ser Gly Phe Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr
65 70 75 80
Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp His Ser Ser Ser Ser Asp
85 90 95
Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln
100
<210> 11
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser
1 5 10 15
Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala
20 25 30
Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn
35 40 45
Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn
50 55 60
Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val
65 70 75
<210> 12
<211> 1301
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser
20 25 30
Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr
35 40 45
Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg
50 55 60
Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser
65 70 75 80
Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr
85 90 95
Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe
100 105 110
Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr
115 120 125
Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr
130 135 140
Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe
145 150 155 160
Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu
165 170 175
Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser
180 185 190
Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn
195 200 205
Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr
210 215 220
Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe
225 230 235 240
Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr
245 250 255
Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly
260 265 270
Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly
275 280 285
Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr
290 295 300
Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys
305 310 315 320
Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser
325 330 335
Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile
340 345 350
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
355 360 365
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
370 375 380
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
385 390 395 400
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
405 410 415
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
420 425 430
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
435 440 445
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
450 455 460
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
465 470 475 480
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
485 490 495
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
500 505 510
Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
515 520 525
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
530 535 540
Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn
545 550 555 560
Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn
565 570 575
Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr
580 585 590
Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr
595 600 605
Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr
610 615 620
Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val
625 630 635 640
Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr
645 650 655
Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly
660 665 670
Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala
675 680 685
Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala
690 695 700
Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly
705 710 715 720
Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr
725 730 735
Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr
740 745 750
Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu
755 760 765
Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn
770 775 780
Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu
785 790 795 800
Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp
805 810 815
Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro
820 825 830
Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu
835 840 845
Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile
850 855 860
Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val
865 870 875 880
Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala
885 890 895
Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala
900 905 910
Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly
915 920 925
Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala
930 935 940
Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser
945 950 955 960
Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala
965 970 975
Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala
980 985 990
Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu
995 1000 1005
Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser
1010 1015 1020
Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile
1025 1030 1035
Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val
1040 1045 1050
Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His
1055 1060 1065
Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu
1070 1075 1080
His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala
1085 1090 1095
Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly
1100 1105 1110
Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn
1115 1120 1125
Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser
1130 1135 1140
Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr
1145 1150 1155
Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp
1160 1165 1170
Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1175 1180 1185
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile
1190 1195 1200
Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile
1205 1210 1215
Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro
1220 1225 1230
Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val
1235 1240 1245
Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu
1265 1270 1275
Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1280 1285 1290
Leu Glu His His His His His His
1295 1300
<210> 13
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Thr Trp Ile
20 25 30
Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile
35 40 45
Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys
50 55 60
Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly Ile
65 70 75 80
Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe
85 90 95
Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe
100 105 110
Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu His Gly Thr Ile
115 120 125
Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile
130 135 140
Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His Leu Gly Arg Cys Asp
145 150 155 160
Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu
165 170 175
Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Ala Gly Asp Ser Gly
180 185 190
Phe Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr
195 200 205
Asp His Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln
210 215 220
<210> 14
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser
1 5 10 15
Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala
20 25 30
Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn
35 40 45
Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn
50 55 60
Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Ala Ser Gly Gly Gly Ser Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly
85 90 95
Thr Leu Ile Val Asn Ser Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe
100 105 110
Leu Leu Val Thr Leu Ala Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr
115 120 125
Cys Cys Asn Ile Val Asn Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val
130 135 140
Tyr Ser Arg Val Lys Asn Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu
145 150 155 160
Val Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly Gly Ser Met Tyr Ser Phe
165 170 175
Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser Val Leu Leu Phe
180 185 190
Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala Ile Leu Thr Ala
195 200 205
Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn Val Ser Leu Val
210 215 220
Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn Leu Asn Ser Ser
225 230 235 240
Arg Val Pro Asp Leu Leu Val
245

Claims (10)

1.一种SARS-CoV-2抗原，其特征在于，所述抗原为由SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.11中任一种所示氨基酸序列组成的蛋白质。
2.一种抗SARS-CoV-2的抗体，其特征在于，所述抗体特异性地与权利要求1所述的抗原结合。
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
4.一种权利要求2或3所述的抗体的制备方法，其特征在于，采用由SEQ ID NO.2-SEQID NO.11中任一种所示氨基酸序列组成的蛋白质作为抗原，与佐剂制备免疫原，免疫动物后得到抗体。
5.根据权利要求4所述的抗体的制备方法，其特征在于，采用由SEQ ID NO.2-SEQ IDNO.11中任一种所示氨基酸序列组成的蛋白质作为抗原，与佐剂制备免疫原，免疫动物后，待检测抗体效价满足10倍稀释活性在L6以上，再次免疫动物，然后取被免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选阳性克隆、扩增并纯化得到抗体；
优选地，所述动物为小鼠，优选为BALB/c小鼠；
优选地，佐剂包括弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂；
优选地，免疫动物的步骤包括：采用背部多点注射，利用抗原与弗氏完全佐剂制备的免疫原进行首次免疫，每间隔三周，利用抗原与弗氏不完全佐剂制备的免疫原进行第二次、第三次和第四次免疫；
优选地，首次免疫和再次免疫的抗原量均独立地为40-60μg；
优选地，第二次、第三次和第四次免疫的抗原量均独立地为20-30μg；
优选地，脾细胞与骨髓瘤细胞的细胞个数比例为1×107-1×109：1×107；
优选地，细胞融合采用腹腔巨噬细胞作为饲养细胞；
优选地，阳性克隆的扩增采用腹水制备。
6.权利要求1所述的抗原或权利要求2或3所述的抗体在制备检测SARS-CoV-2抗原检测产品中的应用；
优选地，产品包括试纸或试剂盒。
7.一种利用双抗体夹心法检测SARS-CoV-2抗原的产品，其特征在于，所用抗体包括权利要求2或3所述的抗体。
8.一种SARS-CoV-2抗原的检测试纸，其特征在于，包括底板、样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫，沿待测液体样本流动方向，样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫依次固定于底板上；结合垫负载有金标蛋白，金标蛋白包括权利要求2或3所述的抗体；包被膜设有检测区和质控区，检测区负载有特异性抗体，质控区负载有羊抗鼠IgG抗体；所述特异性抗体为抗N蛋白特异性抗体、抗S蛋白特异性抗体、抗M蛋白特异性抗体或抗E蛋白特异性抗体；所述N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；
优选地，金标蛋白包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3分别制备的单克隆抗体；
优选地，特异性多抗为抗N蛋白特异性抗体；
优选地，待检测液体样本包括全血、血清或血浆；
优选地，胶体金的粒径为15-25nm；
优选地，结合垫上，每平方厘米结合垫上负载有0.8-1.5μg金标蛋白；
优选地，包被膜上，每厘米检测区上负载有1.5-2.5μg特异性抗体；
优选地，包被膜上，每厘米质控区上负载有1.0-1.5μg羊抗兔多抗；
优选地，样品垫经含有0.5-1.5v/v％Tween20、0.4-0.6w/v％PVA和0.1-0.2mg/ml抗RBC抗体的溶液浸泡处理。
9.一种权利要求8所述的检测试纸的制备方法，其特征在于，沿待检测液体样本流动方向，将样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫依次固定于底板上；结合垫负载有金标蛋白，金标蛋白包括权利要求2或3所述的抗体；包被膜设有检测区和质控区，检测区负载有特异性抗体，质控区负载有羊抗鼠IgG抗体；所述特异性抗体为抗N蛋白特异性抗体、抗S蛋白特异性抗体、抗M蛋白特异性抗体或抗E蛋白特异性抗体；所述N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述M蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示，所述E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；
优选地，金标蛋白的制备方法包括：将胶体金溶液与SEQ ID NO.2制备的抗体混匀反应，得到标记抗体1；将胶体金溶液与SEQ ID NO.3制备的抗体混匀反应，得到标记抗体2；标记抗体1与标记抗体2按体积比2-4:7混合得到金标蛋白；
优选地，特异性多抗为抗N蛋白特异性抗体；
优选地，胶体金的粒径为15-25nm；
优选地，结合垫上，每厘米结合垫上负载有0.8-1.5μg金标蛋白；
优选地，包被膜上，每厘米检测区上负载有1.5-2.5μg特异性抗体；
优选地，包被膜上，每厘米质控区上负载有1.0-1.5μg羊抗兔多抗；
优选地，包被膜上，检测区和质控区的包被缓冲液均独立地为PBS；
优选地，样品垫经含有0.5-1.5v/v％Tween20、0.4-0.6w/v％PVA和0.1-0.2mg/ml抗RBC抗体的溶液浸泡处理。
10.一种SARS-CoV-2抗原的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述的检测试纸。
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