CN107475203B

CN107475203B - 一种h7禽流感病毒单克隆抗体及应用

Info

Publication number: CN107475203B
Application number: CN201710592411.8A
Authority: CN
Inventors: 范俊青; 但汉并; 贾慧勤; 周云朵; 韦奇勇; 李盼盼; 董晓辉; 徐高原
Original assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Current assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Priority date: 2017-07-19
Filing date: 2017-07-19
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2037-07-19
Also published as: CN107475203A

Abstract

本发明属于临床免疫学技术领，具体公开了一种H7禽流感病毒单克隆抗体及应用，所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞1H11分泌得到，该杂交瘤细胞已送至CCTCC保藏，保藏编号为：CCTCC NO：C2017112。所述的单克隆抗体效价高，特异性好，并且具有阻断效果，可用于制备H7亚型禽流感阻断ELISA抗体检测试剂盒，利用该试剂盒对待检样品进行测试，与HI试验有98%以上的符合率，相对HI试验，缩短了试验时间，操作步骤更简单。

Description

一种H7禽流感病毒单克隆抗体及应用

技术领域

本发明是属于临床免疫学技术领域，涉及H7禽流感病毒的检测与鉴定技术领域，具体涉及一种H7禽流感病毒单克隆抗体，还涉及一种分泌H7禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，同时还涉及一种H7禽流感病毒单克隆抗体的制备方法，还涉及H7禽流感病毒单克隆抗体在制备检测H7禽流感病毒试剂盒中的应用。

背景技术

禽流感是由禽流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，具有传染性强、传播速度快、抗原易变异等特点。禽流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属，其基因组有8个节段的单股负链 RNA，编码11个已知蛋白。其中，膜蛋白血凝素是区分多种病毒亚型的依据。根据禽流感病毒致病性的不同，可将其分为高致病性禽流感(HPAI)和低致病性禽流感(LPAI)。近年来在世界各地频发的H7亚型禽流感就属于高致病性禽流感。

H7亚型禽流感疫情自2013年出现以来一直没有得到有效的控制。虽然H7N9禽流感病毒还没有进化出人传人的能力，但是禽传人的事例时有发生。2016-2017冬春交接之际我国出现了第五次H7亚型禽流感爆发高峰，这次疫情比以前更为严重，表现为发病时间早和发病率高，并且病毒出现了耐药性突变和毒力增加的现象。针对H7亚型禽流感疫情现状，2017 年6月初农业部办公厅发布在两广地区先行开展H7N9免疫工作，为两广地区及全国高效开展禽流感防控工作提供了坚强的技术保障。

H7亚型禽流感推广免疫之后，就面临免疫后抗体水平的监测。常规的检测禽流感抗体的方法是血凝抑制(HI)试验。HI试验对操作人员的专业素质要求较高，过程繁琐，对结果的判定也有较强的的主观性。因此，研制一种H7亚型禽流感抗体检测试剂盒对我们评价疫苗免疫效果以及及时监测鸡群抗体水平显得极为重要。

目前，关于H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体的应用相继有报道，主要是在胶体金试纸条、间接免疫荧光、免疫组化等方面的应用，而具有阻断效果的单克隆抗体还未见报道。本发明提供一种对H7亚型禽流感病毒抗体有阻断效果的单克隆抗体，具有高灵敏性和特异性。由该单克隆抗体组装的试剂盒与HI试验符合率可达98.9％，为我们进行大规模临场检测提供便利。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度好的抗H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体，该抗体对H7亚型禽流感病毒抗体有阻断效果，所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞1H11分泌得到，该杂交瘤细胞株已于2017年7月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：C2017112，分类命名：杂交瘤细胞株1H11，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了一种抗H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体的应用，利用本发明的抗体可制备H7亚型禽流感阻断ELISA抗体检测试剂盒，用于H7亚型禽流感疫苗免疫效果的评价及鸡群抗体水平的监测。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种分泌抗H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株1H11的获得是利用灭活的H7-AIV抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术建立抗H7-AIV单克隆抗体杂交瘤细胞库获得的。所述的杂交瘤细胞株已于2017年7月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：C2017112，分类命名：杂交瘤细胞株1H11，地址：中国武汉武汉大学。

杂交瘤细胞1H11在RPMI-1640完全培养基中，在含5％CO₂，37℃条件下培养48小时，显微镜下观察，细胞生长良好，呈葡萄串状、集落浑圆透亮，符合杂交瘤细胞的培养特性。

对杂交瘤细胞1H11最高限制代次(F25代)的细胞进行传代稳定性检测，结果每代细胞均能稳定分泌特异性的单克隆抗体，抗体阳性率为100％，并且细胞培养上清的HI抗体效价均在2⁷以上，说明该杂交瘤细胞具有稳定分泌抗体的能力。

一种抗H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体的应用，所述的单抗可用于制备H7亚型禽流感阻断ELISA抗体检测试剂盒，鉴定待测动物样本是否感染H7亚型禽流感病毒或者待检血清中是否含有H7亚型禽流感病毒抗体。

本发明的特点和优点如下：

1.本发明使用的H7-AIV免疫原是购自哈维科的标准抗原，与国家正在进行推广免疫的 H7亚型禽流感疫苗同源，用该抗原制备的单克隆抗体组装的试剂盒评价疫苗免疫效果及监测鸡群抗体水平结果更为准确。

2.本发明从得到的16株分泌抗H7-AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞中，筛选出一株生物特性最好的杂交瘤细胞，用其制备的腹水纯化后对H7-AIV的血凝抑制HI效价为18log2，ELISA效价高达4×10⁵。

3.本发明得到的1H11单抗，是首次得到的H7亚型禽流感病毒有阻断效果的单抗，可用于制备H7亚型禽流感阻断ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒应用阻断ELISA方法检测血清样本中的H7亚型禽流感抗体，提高了检测结果的特异性和敏感性。是用该方法检测了大量鸡血清，并用公式(1-样品OD值/阴性对照OD值)来计算血清阻断率，最终确定：鸡血清的阻断率大于或等于0.6判为阳性，小于0.6判为阴性。本方法与HI试验有98％以上的符合率，相对HI试验，缩短了试验时间，操作步骤更简单。

具体实施方式

本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

杂交瘤细胞株1H11的获得：

单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

动物免疫

取购自哈维科的H7标准抗原一瓶用500μL生理盐水重悬，与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下分点注射8周龄BALB/c小鼠200μL/只；2周、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一次；6周后取相同剂量抗原腹腔注射，不加佐剂；4天后融合。

细胞融合

骨髓瘤细胞的准备选择生长状态良好的SP2/0细胞，密度长至培养瓶底75％时弃上清，以不完全DMEM培养基洗涤一次后，用l0mL不完全DMEM培养基将细胞轻轻吹下。

脾淋巴细胞的准备取加强免疫后4天的小鼠，摘除眼球采血作为阳性血清；颈椎脱臼致死小鼠，置75％酒精中10min，腹部朝上固定在超净台内的解剖板；无菌打开腹腔取出脾脏，用不完全DMEM培养基洗涤，去除多余***和脂肪；随后将脾脏转移到另一个盛有不完全DMEM培养基的平皿中。用研磨棒在细胞筛网上将脾脏磨碎，收集脾细胞悬液。

饲养细胞的制备饲养细胞可在融合前一天晚上制备，方法如下：取一只成熟健康的 ICR小鼠，摘眼球采血作为阴性血清，颈椎脱臼处死；置75％酒精中10min，固定四肢，剪开皮肤使腹膜暴露，用酒精棉球擦拭腹膜；用l0mL注射器，12#针头，吸取10mL HAT 培养基小心注射到腹腔，持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入己准备好的容器中，计数并稀释后加入96孔细胞培养板中。

融合将上述制备的脾细胞与骨髓瘤细胞混合于一支50mL的融合管中，1000g离心10min，弃上清。将融合管置于手掌中，轻轻摩擦底部，使两种细胞充分混匀；在37℃水浴中45s内缓慢加入1mL预热的PEG1500到融合管中，边加边轻轻摇匀；随即在90s内先慢后快滴加30mL 37℃预热的不完全DMEM培养基终止反应，37℃水浴中静置10min， 1000g离心10min；弃上清，用60mL HAT培养基轻轻悬浮沉淀细胞，分装于已铺好饲养细胞的96孔细胞培养板，然后将培养板置37℃6％CO₂培养箱内培养；5d后用新鲜的HAT 培养基进行半换液；10d后用预热的HT培养基换出HAT培养基；观察杂交瘤细胞生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取100μL细胞上清进行抗体检测。

杂交瘤细胞的筛选

以购自哈维科的H7标准抗原为检测抗原，采用间接ELISA和HI试验两种方法来筛选阳性克隆。

用方阵试验法确定检测抗原(本实施例所用抗原是购自哈维科的H7标准抗原为检测抗原)包被浓度，将标准抗原用包被缓冲液做梯度稀释，每行作一稀释度，100μL/孔包被酶标板，37℃包被2h；用PBST洗3遍，每次5min，拍干；加10％PBS稀释的小牛血清 200μL/孔封闭，4℃封闭过夜，同上洗3遍；加入梯度稀释的阳性血清100μL/孔，37℃孵育1h，同上洗3遍；加入工作浓度(1：10000稀释)的羊抗鼠HRP-IgG 50μL/孔，37℃孵育1h，同上洗3遍；加入TMB显色液50μL/孔，37℃作用10～15min；加入2M H₂SO₄ 50 μL/孔终止反应。测定OD₄₅₀读值。按方阵确定好的抗原浓度1:100包被酶标板，-20℃保存备用。检测杂交瘤细胞上清的ELISA方法同上。免疫小鼠血清按方阵确定的浓度稀释后作为筛选时的阳性对照，做饲养细胞的ICR小鼠血清作为阴性对照，同时设立空白调零孔。 HI试验筛选方法：该方法针对禽流感病毒H7亚型血凝素，筛选阳性的杂交瘤细胞进行克隆。将检出的阳性孔进行亚克隆(采用有限稀释法对ELISA检测为阳性的杂交瘤细胞进行克隆化)，直到细胞株分泌的抗体能够稳定地与H7亚型禽流感病毒液发生特异性反应为止。经3 次亚克隆共得到1株阳性的杂交瘤细胞系，命名为1H11。

该杂交瘤细胞株已于2017年7月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：C2017112，分类命名：杂交瘤细胞株1H11，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

腹水的制备及效价测定：

取10周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，0.5mL/只；1周后腹腔注射用PBS稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞1H11，5×10⁵个/只；待小鼠腹部明显***时，用16#针头从腹腔采集腹水，2500g离心10min，去除脂肪组织，吸取上清，-70℃保存备用。

单抗特性的鉴定：

腹水效价测定采用间接ELISA和HI试验两种方法检测腹水效价，结果如下：

亚类鉴定按单克隆抗体亚类试剂盒说明书介绍的方法进行，结果显示单抗1H11为 IgG₁亚类。

实施例3：

杂交瘤细胞1H11稳定性鉴定

将所获得的杂交瘤细胞株1H11连续传代15代，用HI试验测定其细胞上清的效价，结果显示该细胞株能稳定分泌抗体，并且细胞培养上清的HI抗体效价均在2⁷以上。

实施例4：

1H11单抗特异性鉴定

取1H11杂交瘤细胞上清，采用HI试验和间接ELISA两种方法对禽流感病毒H7亚型血凝抑制试验抗原(H7-AIAg)、禽流感病毒H1亚型血凝抑制试验抗原(H1-AIAg)、禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原(H5-AIAg)、禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原 (H9-AIAg)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡产蛋下降综合征病毒 (EDS-76)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)进行交叉试验，鉴定单抗的特异性。

结果显示：无论是采用ELISA方法还是HI试验，单抗1H11仅对H7亚型毒株(即上述的H7亚型血凝抑制试验抗原吗)具有良好的反应性，对H7亚型禽流感病毒以外的其他任何病毒均无反应，说明该株单抗为抗H7亚型禽流感的特异性单抗。

实施例5：

抗H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体的纯化

实施例2制备的单抗腹水采用Protein G亲和层析方法进行纯化，Protein G纯化方法如下：轻柔颠倒装有Protein G亲和树脂的容器数次以混合树脂使其完全悬浮。将适量Protein G 树脂装入层析柱中，加入5mL的结合缓冲液平衡柱子。使用相同或者更多体积的结合缓冲液稀释单抗腹水，上样。上样后用10ml结合缓冲液洗柱子。结合缓冲液流尽后，用10mL 的洗脱缓冲液洗脱抗体，收集洗脱产物。洗脱过程中实时检测洗脱液的pH值，及时用1M Tris-Cl(pH 8.5)中和洗脱液，使含洗脱产物的洗脱液的pH为7.4。洗脱液装入透析袋，使用0.01M的Tris-Cl缓冲液(pH 7.4)4℃透析过夜，中途换液2～3次。透析后单抗浓度为11.2mg/ml。纯化前的腹水有8ml，纯化后共得到150mg单抗，相当于每毫升腹水含有18毫克左右的单抗，这表明本发明筛选出的杂交瘤细胞株很强的单抗分泌能力。

用ELISA和HI试验两种方法检测纯化后的腹水效价，HI效价可达到2¹⁸，ELISA效价表明抗体稀释到1：400000倍时仍为阳性，表明该抗体具有灵敏度高的特点。

实施例6：

一种抗H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体在制备的H7亚型禽流感阻断ELISA抗体检测试剂盒中应用：

1.酶标板的制备

通过方阵法确定H7亚型血凝抑制试验抗原(购自哈维科的H7亚型血凝抑制试验抗原) 的包被浓度为1:160，在2-8℃包被14小时。弃去包被液，加入0.5％牛血清白蛋白(BSA)作为封闭液37℃封闭2小时。弃去封闭液，自然风干后抽真空包装成成品试剂盒酶标板。

2.试剂盒其他组分的配制

样品稀释液：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，Tween-200.5ml, 用去离子水定容至1000ml(pH＝7.4)；

酶标抗体的制备：将10mgHRP溶于2ml注射水中，呈棕红色，加入1ml浓度0.06M/LNaIO₄，呈草绿色，4℃30min，加入0.16M/L乙二醇1ml终止反应，室温避光30min，溶液变成棕黄色，加入实施例5制备的浓度为11.2mg/ml的1H11抗体1ml，0.05M PH＝9.5CB 中4℃透析过夜。吸出加5mg/ml NaBH4 0.4ml,4℃2h,加入等体积饱和硫酸铵，4℃30min， 10000r/min5min,然后用2ml 20mM PH＝7.4PB重悬透析，收获酶标抗体4.5ml，加入等体积甘油，-20℃保存备用。按方阵法确定酶标抗体的工作浓度，浓度是0.02mg/ml。

底物液A：Na₂HPO₄·12H₂O 14.60g，柠檬酸9.33g，30％的双氧水2ml，加去离子水溶解并定容至1000ml，调pH至5.0～5.4，分装，10ml/瓶。

底物液B：四甲基联苯胺(TMB)20.00mg、无水乙醇10.00ml，加去离子水溶解定容至1000ml，分装成10ml/瓶。

终止液：2.5ml氢氟酸(HF)加到900ml去离子水中，定容至1000ml，分装，10ml/ 瓶。

20倍浓缩洗涤液：NaCl 160g，KCl 4g，Na₂HPO4·12H₂O 58g，KH₂PO₄ 4g，Tween-2010ml, 用去离子水定容至1000ml(pH＝7.4)。

阳性对照：将购自哈维科的H7亚型禽流感标准阳性血清按比例稀释后作为阳性对照。

阴性对照：SPF鸡血清按比例稀释后作为阴性对照。

3.具体使用步骤如下：

样品处理取鸡全血，待血液凝固后4000转/分钟离心10分钟，收集上清。也可采集血液，待凝固后自然析出血清，要求血清清亮，无溶血。

洗涤液配制使用前，将浓缩的洗涤液从试剂盒中取出，平衡至室温(20～25℃)，并摇动，使沉淀溶解(最好在37℃水浴中加热5～10分钟)，然后用蒸馏水作20倍稀释(例如：每两块板用30ml的20倍浓缩洗涤液加上570ml蒸馏水)，混匀，稀释好的洗涤液在2～ 8℃可以存放7日。

样品初步稀释将待检血清样品在血清稀释板中按1:50的比例稀释(例如：在血清稀释板中先加入196μl样品稀释液，再加4μl待检血清)，注意不能稀释对照。不同的样品要注意换吸头。样品在稀释过程中要充分混匀。

【操作步骤】

1取抗原包被板(根据样品多少，可拆开分次使用)，用稀释好的洗涤液洗板1次(200μl/ 孔)后拍干。在抗原包被板中加入100μl稀释好的血清样品，对照血清直接取100μl加入到抗原包被板孔中。对照血清各设2孔，待检样品设1孔，轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置 37℃下温育30分钟。

2弃去孔中的液体，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，静置3分钟后，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干，共计洗涤3次。

3每孔加酶标抗体100μl，置37℃下温育30分钟。

4弃去孔中的液体，洗涤5次，方法同2。

5每孔先加入底物液A 50μl，再加入底物液B 50μl，混匀，置室温(20～25℃)下避光显色10分钟。

6每孔加终止液50μl，混匀后测定结果。

【结果判定】

在酶标仪上测各孔的OD_630nm值。试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD_630nm值应＞0.5，阳性对照孔平均OD_630nm值应＜0.5。

S为样品孔OD_630nm值，N为阴性对照孔平均OD_630nm值，计算样品样品阻断率(1-S/N)值。

若阻断率＞0.6时判为阳性；若阻断率≤0.6时判为阴性。

(三)H7亚型禽流感抗体阻断ELISA检测试剂盒与HI试验的对比

申请人用H7亚型禽流感抗体阻断ELISA检测试剂盒和HI试验两种方法同时检测356 份采自临床的鸡血清，对比试验结果，计算符合率。阳性符合率为100％，阴性符合率为97.8％，总符合率为98.9％，说明该试剂盒与HI试验符合率良好，适合在基层大规模检测中推广应用。

Claims

1.一株分离的杂交瘤细胞，所述的杂交瘤细胞为杂交瘤细胞1H11，保藏编号为：CCTCCNO：C2017112。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞或权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测H7禽流感病毒试剂盒中的应用。

4.权利要求1所述的杂交瘤细胞或权利要求2所述的单克隆抗体在制备H7亚型禽流感阻断ELISA抗体检测试剂盒中的应用。