CN116970545A - 一种生产四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种生产四氢嘧啶的基因工程菌株的构建方法与应用。该菌株从谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组水平出发，异源过表达四氢嘧啶操纵子ectABC、天冬氨酸激酶突变基因lysCT311I及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc，实现了碳通量的高效引流；借助esaI/esaR群体感应***调控高丝氨酸脱氢酶编码基因hom、L‑天冬氨酸‑4‑半醛水解酶编码基因dapA和柠檬酸合酶编码基因gltA表达，动态下调竞争支路代谢通量，平衡了菌体生长和产物生产；过表达本源苏氨酸外排蛋白编码基因thrE，并敲除脯氨酸摄取蛋白编码基因proP，提升了四氢嘧啶的转运效率。所构建菌株经5L发酵罐分批补料发酵40h，四氢嘧啶产量达70.4g/L，转化率为0.25g/g葡萄糖，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种生产四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种生产四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
四氢嘧啶(Ectoine,ECT)又称依克多因，是一种高附加值氨基酸衍生物，首次发现于嗜盐绿外硫红螺菌中。因其优异的渗透压平衡及水分子络合能力，近年来被广泛应用于医疗、化妆品、酶制剂、生物技术等多个领域，在日常生产生活中展现出重要意义。
由于结构的特殊性，化学合成四氢嘧啶所需成本较高，目前四氢嘧啶的生产以生物法为主，具体可以分为全细胞催化法、细菌泌乳法和工程菌发酵法。全细胞催化法由于单次反应效率较低，而多次回用细胞涉及到繁琐的洗菌操作，反应效率也会大打折扣，无法大规模应用。细菌泌乳法因高盐浓度培养基对设备腐蚀性较强，且生产宿主生长速率慢，发酵周期长，产率较低又难以改良，目前已被淘汰。工程菌发酵法，是借助常规工业微生物菌株来异源发酵合成四氢嘧啶的方法，该方法也是目前四氢嘧啶生产的主流方法，近年来研究较多，其核心在于高产菌株，如何选育为难点所在。
谢希贤等(Pathway construction and metabolic engineering forfermentative production of ectoine in Escherichia coli[J].Metabolicengineering,2016,36:10-18.)以大肠杆菌W3110为出发菌株，通过质粒过表达ectABC和lysC*基因，强化ppc基因启动子，敲除thrA和iclR基因等策略进行改造，所获菌株经30h分批补料发酵，四氢嘧啶产量达25.1g/L。饶志明等(High-yield ectoine production inengineered Corynebacterium glutamicum by fine metabolic regulation via plug-in repressor library[J].Bioresource Technology,2022,362:127802.)以一株谷氨酸棒杆菌K02为出发菌株，通过质粒过表达ectABC、lysC*和asd基因，敲除sugR和ldhA基因，下调gltA和dapA基因表达等策略进行改造，所获菌株经72h分批补料发酵，四氢嘧啶产量达45.52g/L。中科欣扬等(CN114806995A)以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，通过质粒过表达ectABC、ask、alk和ndk基因，敲除cgl2753、cgl2392和cgl1654基因等策略进行改造，所获菌株经40h分批补料发酵，四氢嘧啶产量达66.3g/L，该产量为目前已报道最高水平。
以上改造策略涉及到四氢嘧啶合成代谢网络中中心代谢、前体物合成、限速反应和竞争途径等多个方面的改造，但产量距离理论值仍有一定差距，且由于携带质粒，面临生产不稳定性问题，发酵过程中还需添加昂贵的诱导剂，增加生产成本的同时也增加了工艺控制的难度。如何进一步提高产量，降低生产成本，减小控制难度，是四氢嘧啶菌株构建中亟需解决的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种生产四氢嘧啶的基因工程菌株的构建方法，并利用该菌株发酵生产四氢嘧啶。
为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：
第一个方面，提供一种四氢嘧啶生产菌株，所述菌株是以谷氨酸棒状杆菌为起始菌，具有以下特征：(1)lysCT311I基因、ppc基因、thrE基因、ectABC基因簇过表达，(2)hom基因、dapA基因、gltA基因下调表达，(3)proP基因敲除。
在一些优选实施方式中，所述谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
在优选实施方式中，所述lysCT311I基因的过表达通过选自下列任一种方式实现：
a)将内源lysC基因进行T311I突变，并将其启动子替换为组成型启动子；或，
b)在基因组上一个或多个位点***lysCT311I基因；优选地，所述的lysCT311I基因来源于伸长盐单胞菌；或，
c)将lysCT311I基因克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中；优选地，所述的lysCT311I基因来源于伸长盐单胞菌；或，
d)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述ppc基因的过表达方式通过选自下列任一种方式实现：
a)在基因组上一个或多个位点***ppc基因；优选地，所述的ppc基因来源于伸长盐单胞菌；或，
b)将ppc基因克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中；优选地，所述的ppc基因来源于伸长盐单胞菌；或，
c)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述thrE基因的过表达方式通过选自下列任一种方式实现：
a)在基因组上一个或多个位点***thrE基因；优选地，所述的thrE基因来源于谷氨酸棒状杆菌；或，
b)将thrE基因克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中；优选地，所述的thrE基因来源于谷氨酸棒状杆菌；或，
c)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述ectABC基因的过表达方式通过选自下列任一种方式实现：
a)在基因组上一个或多个位点***ectABC基因簇，优选地，所述的ectABC基因来源于伸长盐单胞菌；或，
b)将ectABC基因克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中，优选地，所述的ectABC基因来源于伸长盐单胞菌；或，
c)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述hom基因、dapA基因、gltA基因下调表达通过选自下列任一种方式实现：
a)直接敲除基因中的一段序列，使其无法正常表达出蛋白质；或，
b)替换内源启动子为弱启动子；或，
c)动态下调基因表达；
优选地，所述hom基因、dapA基因、gltA基因下调表达为使用来源于玉米细菌性枯萎病菌的esaI/esaR群体感应***进行动态调控；进一步优选地，所述hom基因、dapA基因、gltA基因下调表达为将玉米细菌性枯萎病菌esaR基因和esaI基因引入谷氨酸棒杆菌中并使其表达；
和/或
所述proP基因敲除通过直接敲除proP基因中的一段序列、和/或缺失和/或添加一个或几个碱基，使proP基因其无法正常表达出蛋白质来实现。
在一种优选实施方式中，所述四氢嘧啶生产菌株是以谷氨酸棒状杆菌为起始菌，并具有以下特征：
(1)在基因组上整合了Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的ectABC基因、Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的lysCT311I突变基因、Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的ppc基因，PapFAB104启动子及其控制的玉米细菌性枯萎病菌esaR基因、PL24启动子及其控制的玉米细菌性枯萎病菌esaI基因，Psod启动子及其控制的谷氨酸棒状杆菌thrE基因；
(2)将谷氨酸棒状杆菌的hom基因、dapA基因和gltA基因的启动子分别替换为玉米细菌性枯萎病菌PesaS启动子；和
(3)敲除谷氨酸棒状杆菌的proP基因。
在优选实施方式中，所述在基因组上整合基因是整合在基因组的假基因位点处。
进一步优选地，所述Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的ectABC基因整合在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的cgl0773假基因位点，所述Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的lysCT311I突变基因整合在cgl0791假基因位点，所述Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的ppc基因整合在cgl1135假基因位点，PapFAB104启动子及其控制的玉米细菌性枯萎病菌esaR基因整合在cgl1517假基因位点，PL24启动子及其控制的玉米细菌性枯萎病菌esaI基因整合在cgl1890假基因位点，Psod启动子及其控制的谷氨酸棒状杆菌thrE基因整合在cgl1895假基因位点。
进一步优选地，所述Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的ectABC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3的第21～2809位所示；
所述Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的lysCT311I突变基因的核苷酸序列如SEQID NO:7的第21～1642位所示；
所述Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的ppc基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10的第21～3025位所示；
所述PapFAB104启动子及其控制的玉米细菌性枯萎病菌esaR基因的核苷酸序列如SEQID NO:13的第21～838位所示；
所述PL24启动子及其控制的玉米细菌性枯萎病菌esaI基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:16的第20～776位所示；
所述Psod启动子及其控制的谷氨酸棒状杆菌thrE基因中，所述Psod启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:29的第21～266位所示，所述谷氨酸棒状杆菌thrE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:28的第1～1470位所示；
所述玉米细菌性枯萎病菌PesaS启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:19的第21～204位所示。
进一步优选地，敲除谷氨酸棒状杆菌的proP基因采用双交换同源重组方式敲除。
第二个方面，提供一种四氢嘧啶生产菌株的构建方法，包括：
以谷氨酸棒状杆菌为起始菌，(1)过表达lysCT311I基因、ppc基因、thrE基因、ectABC基因簇，(2)下调hom基因、dapA基因、gltA基因表达，(3)敲除proP基因；优选地，所述谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032；
优选地，
所述lysCT311I基因的过表达方式选自下列任一种：
a)将内源lysC基因进行T311I突变，并将其启动子替换为组成型启动子；或，
b)在基因组上一个或多个位点***lysCT311I基因；优选地，所述的lysCT311I基因来源于伸长盐单胞菌；或，
c)将lysCT311I基因克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中；优选地，所述的lysCT311I基因来源于伸长盐单胞菌；或，
d)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述ppc基因的过表达方式选自下列任一种：
a)在基因组上一个或多个位点***ppc基因；优选地，所述的ppc基因来源于伸长盐单胞菌；或，
b)将ppc基因克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中；优选地，所述的ppc基因来源于伸长盐单胞菌；或，
c)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述thrE基因的过表达方式选自下列任一种：
a)在基因组上一个或多个位点***thrE基因；优选地，所述的thrE基因来源于谷氨酸棒状杆菌；或，
b)将thrE基因克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中；优选地，所述的thrE基因来源于谷氨酸棒状杆菌；或，
c)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述ectABC基因的过表达方式选自下列任一种：
a)在基因组上一个或多个位点***ectABC基因簇，优选地，所述的ectABC基因来源于伸长盐单胞菌；或，
b)将ectABC基因簇克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中，优选地，所述的ectABC基因来源于伸长盐单胞菌；或，
c)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述下调hom基因、dapA基因、gltA基因表达选自下列任一种：
a)直接敲除基因中的一段序列，使其无法正常表达出蛋白质；或，
b)替换内源启动子为弱启动子；或，
c)动态下调基因表达；
优选地，所述下调hom基因、dapA基因、gltA基因表达为使用来源于玉米细菌性枯萎病菌的esaI/esaR群体感应***进行动态调控；进一步优选地，所述下调hom基因、dapA基因、gltA基因表达为将玉米细菌性枯萎病菌esaR基因和esaI基因引入谷氨酸棒杆菌中并使其表达；
和/或
所述敲除proP基因选自直接敲除proP基因中的一段序列、和/或缺失和/或添加一个或几个碱基，使proP基因无法正常表达出蛋白质。
在一种具体实施方式中，所述方法包括：
(1)以谷氨酸棒状杆菌，优选为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032为出发菌株，在其基因组上整合伸长盐单胞菌的ectABC基因、lysCT311I及ppc基因，玉米细菌性枯萎病菌esaR基因和esaI基因，谷氨酸棒状杆菌thrE基因；
(2)将谷氨酸棒状杆菌的hom基因、dapA基因和gltA基因的启动子替换为玉米细菌性枯萎病菌PesaS启动子；
(3)敲除谷氨酸棒状杆菌的proP基因。
在优选实施方式中，步骤(1)包括如下步骤：
(a)将ectABC基因与启动子Ptuf的融合片段Ptuf-ectABC整合在谷氨酸棒状杆菌基因组的cgl0773假基因位点；
所述Ptuf-ectABC如SEQ ID NO:3的第21～2809位所示；
(b)将lysCT311I基因与启动子Ptuf的融合片段Ptuf-lysCT311I整合在cgl0791假基因位点；
所述Ptuf-lysCT311I如SEQ ID NO:7的第21～1642位所示；
(c)将ppc基因与启动子Ptuf的融合片段Ptuf-ppc整合在cgl1135假基因位点；
所述Ptuf-ppc如SEQ ID NO:10的第21～3025位所示；
(d)将esaR与启动子PapFAB104的融合片段PapFAB104-esaR整合在cgl1517假基因位点；
所述PapFAB104-esaR如SEQ ID NO:13的第21～838位所示；
(e)将esaI与启动子PL24的融合片段PL24-esaI整合在cgl1890假基因位点；
所述PL24-esaI如SEQ ID NO:16的第20～776位所示；
(f)将thrE与启动子Psod的融合片段Psod-thrE整合在cgl1895假基因位点；
所述Psod启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:29的第21～266位所示，所述谷氨酸棒状杆菌thrE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:28的第1～1470位所示。
进一步优选地，所述整合通过双交换同源重组方式实现。
在优选实施方式中，步骤(2)中，所述玉米细菌性枯萎病菌PesaS启动子如SEQ IDNO:19的第21～204位所示。
进一步优选地，所述替换通过双交换同源重组方式实现。
在优选实施方式中，步骤(3)中，所述敲除通过双交换同源重组方式实现。
在本发明中，所述双交换同源重组通过pK18mobsacB***质粒介导的基因编辑方法来实现。pK18***质粒介导的基因编辑方法参见学位论文《基于代谢工程选育谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸高产菌》，江南大学，徐建中，2014年。
在优选实施方式中，所述四氢嘧啶生产菌株的构建方法包括：
(1)将质粒pK18-ectABC与谷氨酸棒杆菌ATCC13032进行两轮重组，获得菌株ECT01；其中，质粒pK18-ectABC由0773U、Ptuf-ectABC、0773D、pK18-L四个片段同源重组得到，片段0773U的序列如SEQ ID NO:1所示，片段0773D的序列如SEQ ID NO:2所示，片段Ptuf-ectABC的序列如SEQ ID NO:3所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(2)将质粒pK18-lysC与菌株ECT01进行两轮重组，获得菌株ECT02；其中，质粒pK18-lysC由0791U、Ptuf-lysCT311I、0791D、pK18-L四个片段同源重组得到，片段0791U的序列如SEQ ID NO:5所示，片段0791D的序列如SEQ ID NO:6所示，片段Ptuf-lysCT311I的序列如SEQID NO:7所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(3)将质粒pK18-ppc与菌株ECT02进行两轮重组，获得菌株ECT03；其中，质粒pK18-ppc由1135U、Ptuf-ppc、1135D、pK18-L四个片段同源重组得到，片段1135U的序列如SEQ IDNO:8所示，片段1135D的序列如SEQ ID NO:9所示，片段Ptuf-ppc的序列如SEQ ID NO:10所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(4)将质粒pK18-esaR与菌株ECT03进行两轮重组，获得菌株ECT04；其中，质粒pK18-esaR由1517U、PapFAB104-esaR、1517D、pK18-L四个片段同源重组得到，片段1517U的序列如SEQ ID NO:11所示，片段1517D的序列如SEQ ID NO:12所示，片段PapFAB104-esaR的序列如SEQ ID NO:13所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(5)将质粒pK18-esaI与菌株ECT04进行两轮重组，获得菌株ECT05；其中，质粒pK18-esaI由1890U、PL24-esaI、1890D、pK18-L四个片段同源重组得到，片段1890U的序列如SEQ ID NO:14所示，片段1890D的序列如SEQ ID NO:15所示，片段PL24-esaI的序列如SEQ IDNO:16所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(6)将质粒pK18-MesaS与菌株ECT05进行两轮重组，获得菌株ECT06；其中，质粒pK18-MesaS由PhomU、MPesaS、PhomD、pK18-L四个片段同源重组得到，片段PhomU的序列如SEQID NO:17所示，片段PhomD的序列如SEQ ID NO:18所示，片段MPesaS的序列如SEQ ID NO:19所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(7)将质粒pK18-AesaS与菌株ECT06进行两轮重组，获得菌株ECT07；其中，质粒pK18-AesaS由PdapAU、APesaS、PdapAD、pK18-L四个片段同源重组得到，片段PdapAU的序列如SEQ ID NO:20所示，片段PdapAD的序列如SEQ ID NO:21所示，片段APesaS的序列如SEQ IDNO:22所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(8)将质粒pK18-GesaS与菌株ECT07进行两轮重组，获得菌株ECT07；其中，质粒pK18-GesaS由PgltAU、GPesaS、PgltAD、pK18-L四个片段同源重组得到，片段PgltAU的序列如SEQ ID NO:23所示，片段PgltAD的序列如SEQ ID NO:24所示，片段GPesaS的序列如SEQ IDNO:25所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(9)将质粒pK18-thrE与菌株ECT08进行两轮重组，获得菌株ECT09；其中，质粒pK18-thrE由1895U、Psod、thrE、1895D、pK18-L五个片段同源重组得到，片段1895U的序列如SEQ ID NO:26所示，片段1895D的序列如SEQ ID NO:27所示，片段thrE的序列如SEQ ID NO:28所示，片段Psod的序列如SEQ ID NO:29所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(10)将质粒pK18-proP与菌株ECT09进行两轮重组，获得四氢嘧啶生产菌株；其中，质粒pK18-proP由proPU、proPD和pK18-L三个片段同源重组得到，片段proPU的序列如SEQID NO:30所示，片段proPD的序列如SEQ ID NO:31所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示。
在本方面的另一个实施方式中，提供由本发明的构建方法获得的菌株。
第三个方面，提供本发明的菌株在生产四氢嘧啶中的应用。
第四个方面，提供一种四氢嘧啶的生产方法，包括将本发明的菌株进行发酵。
在优选实施方式中，所述发酵条件为：温度为30℃，pH为7.0，溶氧维持在30-40％之间，残糖浓度在0.5-5g/L。
优选地，发酵时接入的种子液的OD600在10-15左右，接种量为15-20％；
更优选地，种子液的培养包括：
(1)初代活化：取-80℃保藏菌种接种于BHI摇管中，培养12-16h；
(2)二代活化：将初代活化菌液转接于含10-20g/L葡萄糖的BHI种子瓶中，培养12-16h；
(3)种子罐培养：将二代活化菌液全部转接至种子罐中，控制温度为30℃，pH为7.0，溶氧维持在30-40％之间。
培养基配方如下：
BHI培养基：葡萄糖2-4g/L，脑心浸粉17-20g/L，蛋白胨8-12g/L，NaCl 3-7g/L，Na2HPO4 2-4g/L，其余为水，pH 7.2-7.4。
种子罐培养基：葡萄糖10-20g/L，酵母粉1-3g/L，蛋白胨1-3g/L，K2HPO4 3-6g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，FeSO4·7H2O 50-70mg/L，MnSO4·7H2O 15-20mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1-3mg/L其余为水，pH 7.0-7.2。
发酵罐培养基：葡萄糖40-60g/L，酵母粉5-7g/L，蛋白胨5-7g/L，柠檬酸钠2-5g，K2HPO4 3-6g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，FeSO4·7H2O 50-70mg/L，MnSO4·7H2O 15-20mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1-3mg/L其余为水，pH 7.0-7.2。
本发明采用pK18mobsacB***质粒介导的基因编辑方法，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为起始菌，从基因组水平出发进行基因改造，具体包括如下步骤：
(1)打通合成通路。在cgl0773假基因位点整合由Ptuf启动子控制的Halomonaselongata来源的ectABC基因，进一步在cgl0791假基因位点整合由Ptuf启动子控制的Halomonas elongata来源的lysCT311I突变基因，进一步在cgl1135假基因位点整合由Ptuf启动子控制的Halomonas elongata来源的ppc基因。
(2)调控竞争支路。在cgl1517假基因位点整合由PapFAB104启动子控制的Pantoeastewartii subsp.stewartii来源的esaR基因，进一步在cgl1890假基因位点整合由PL24启动子控制的Pantoea stewartii subsp.stewartii来源的esaI基因，进一步将hom、dapA和gltA基因的启动子替换为Pantoea stewartii subsp.stewartii来源的PesaS启动子。
(3)修饰转运***。在cgl1895假基因位点整合由Psod启动子控制的本源thrE基因，进一步敲除proP基因。
本发明的有益效果如下：
从构建策略来看，本发明提供的技术方案涉及到四氢嘧啶合成途径、竞争分支及转运***三个模块的***组合。具体地，借助异源酶系对关键通路进行构建与强化，实现了碳通量的高效引流；借助群体感应***，基于细胞密度自发调节赖氨酸、高丝氨酸和柠檬酸三条竞争支路代谢通量，平衡了菌体生长和产物生产。esaI/esaR是存在于玉米细菌性枯萎病菌中的一种群体感应***，esaR基因编码转录因子EsaR，可与启动子PesaS的转录调控区结合来激活下游基因表达。esaI基因编码信号分子AHL，在高细胞密度下AHLs浓度达到阈值之后，AHLs与转录因子EsaR作用使其无法再结合到转录调控区，由此抑制PesaS下游基因的表达。基于该原理，本文通过敲入稳定表达的esaR基因，并替换hom、dapA、gltA基因的启动子为PesaS，最后敲入esaI基因并进行了一系列启动子和RBS筛选(esaI基因表达越强，AHL越早达到阈值，PesaS下游基因越早被抑制，因此需要对esaI基因的表达进行优化，探寻最适表达强度，构建出一株能够实现前期生长，后期生产的重组菌株)；经过酶挖掘与酶筛选，找到了参与四氢嘧啶摄取和外排的关键蛋白，提升了四氢嘧啶的转运效率，减少了菌体代谢负担。
从生产表型来看，本发明提供的技术方案选用安全菌株谷氨酸棒杆菌为底盘菌株，产品下游应用更加广泛；在基因组水平进行改造，菌株不含质粒且无需诱导，生产稳定性更高，成本更低；非缺陷型，菌株生长迅速，发酵周期较短；上述菌株经5L发酵罐分批补料发酵40h，四氢嘧啶产量可达70.4g/L，转化率为0.25g/g葡萄糖，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
图1为本发明所构建四氢嘧啶工程菌ECT10的代谢原理图。
图2为四氢嘧啶标准品(0.25g/L)的HPLC图谱。
图3为本发明实施例2中HPLC图谱。
图4为本发明所构建四氢嘧啶工程菌ECT10的发酵曲线图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
以下实施例中，如无特别说明，本发明实施例中所涉及的基因编辑方法参照学位论文《基于代谢工程选育谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸高产菌》，江南大学，徐建中，2014年，进行，其他所涉及的分子生物学、基因工程等具体操作手段根据本领域人员容易获得的技术手册、教科书或文献报道均可以实现。
中文名伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)来源的基因均委托擎科生物直接合成，该菌基因组NCBI序列号为FN869568.2。
中文名玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.Stewartia)来源的基因均委托擎科生物直接合成，该菌基因组的NCBI序列号为CP017581.1。
pK18mobsacB购自淼灵质粒平台，产品目录号为P0100。
谷氨酸棒状杆菌ATCC13032购买自CICC官网。
四氢嘧啶产量的测定：
使用岛津DGU-20H5R(C)进行高效液相色谱检测，色谱柱为XBridge Amide(3.5μm,4.6×250mm)；流动相：80％乙腈水溶液；流速：1mL/min；柱温：30℃；波长：214nm；进样体积：10μL。
转化率计算公式为(发酵液中四氢嘧啶浓度*发酵液体积)/消耗的葡萄糖的质量。
在本文中，缩写具有以下含义：
ectABC：四氢嘧啶操纵子基因；
lysCT311I：天冬氨酸激酶突变基因；
ppc：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因；
hom：高丝氨酸脱氢酶编码基因；
dapA：L-天冬氨酸-4-半醛水解酶编码基因；
gltA：柠檬酸合酶编码基因；
thrE：苏氨酸外排蛋白编码基因；
proP：脯氨酸摄取蛋白编码基因；
esaR：启动子PesaS的转录调节子编码基因；
esaI：酰基高丝氨酸内酯合酶基因。
实施例1：四氢嘧啶生产菌ECT10的构建
(1)ectABC基因的敲入
以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，分别以0773-UF/0773-UR和0773-DF/0773-DR为引物，扩增上游同源臂0773U(379bp)(SEQ ID NO:1)(aacagctatgacatgattacTTGGTCCGCTTTGCGCGGGATTATGGTTGGCGTGCGTACGCCATCCCGGTGTTGACGGTCATTACTGTTTGGGTGCTGTTCGACGTGTTTTCTGCCGATCAGCCCGCTAATGGTGCGAGTGGGGAAGCGTCGACAAGCTTATCGACGCCCACCTCCACCCTCCGCGCCGGCCCCGACCCCGCGCAGGCCGAACCGCAAAGCGTTCCGCTGACGGAACTGCCGCCTGGCGGCAGCTACACCGAAACCGGTGCTGGCACTTTCCGCCAGGTCGGCGCTGCTCTTCCTCGCGTGGGCGAGGGGCAGGAACAAACTTTTACGTACGTCATTGAGATTGAGGATGGCGTCAACACGGCCGCTTA)和
下游同源臂0773D(423bp)(SEQ ID NO:2)
(GCATATTTCTGGCGACGAGGACCCGGATCTGCGCATTCAACTGACCTCGCTGA GCACTACGCATGAGTTGTGTGGGAATGACATCGAGATGGAAACGAGCTGTTTCTACTCCGATGGCGGACGCGTCATGATCAACGAATCACGATGGATCCGTGGAGCCGCACCTTTTAAGGGCGATCTGGGCTCTTACCGCCAGTACTTAATCAATCACGAAGTCGGGCACGGCCTCGGCTACGCCGCCCATGATGCCTGCACCGCCCCTGGCGAGCTCGCTCCGATTATGATGCAGCAAACTTTGAGCTTGAATAATTCTGAACTTTTCCGCATCGACCCAGATGAGGTTTACCCCGACGACGACGCCACCTGCGAATTCAACCCATGGCCGTATCCTCGCGGATTTTAGggcactggccgtcgttttac)。
根据伸长盐单胞菌(Halomonas elongate)的基因组序列信息，通过基因合成的方法获得Ptuf-ectABC0基因片段(下述目的片段Ptuf-ectABC的第21～2809位)，再以ect-F/ect-R为引物，扩增得到目的片段Ptuf-ectABC(2829bp)(SEQ ID NO:3)
(GGCGTCAACACGGCCGCTTAAGATCGTTTAGATCCGAAGGAAAACGTCGAAA AGCAATTTGCTTTTCGACGCCCCACCCCGCGCGTTTTAGCGTGTCAGTAGGCGCGTAGGGTAAGTGGGGTAGCGGCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTCAACAGCATTGATTTCGATGTATTTAGCTGGCCGTTACCCTGCGAATGTCCACAGGGTAGCTGGTAGTTTGAAAATCAACGCCGTTGCCCTTAGGATTCAGTAACTGGCACATTTTGTAATGCGCTAGATCTGTGTGCTCAGTCTTCCAGGCTGCTTATCACAGTGAAAGCAAAACCAATTCGTGGCTGCGAAAGTCGTAGCCACCACGAAGTCCAGGAGGAATGAACGCAACCACAGAGCCCTTTACACCCTCCGCCGACCTGGCCAAGCCCAGCGTGGCCGATGCCGTGGTCGGCCATGAGGCCTCACCGCTCTTCATCCGCAAGCCAAGCCCCGATGACGGCTGGGGCATCTACGAGCTGGTCAAGTCCTGTCCGCCTCTCGACGTCAATTCCGCCTACGCCTATCTGTTGCTGGCCACCCAGTTCCGCGATAGCTGCGCCGTGGCGACCAACGAAGAGGGCGAGATCGTCGGCTTCGTTTCCGGCTACGTGAAGAGCAACGCCCCCGATACCTATTTCCTCTGGCAGGTTGCCGTGGGCGAGAAGGCACGTGGCACCGGCCTGGCCCGTCGTCTGGTGGAAGCCGTGATGACACGCCCGGAAATGGCCGAGGTCCACCATCTCGAGACCACTATCACGCCCGACAACCAGGCGTCCTGGGGCTTGTTCCGCCGTCTCGCCGATCGCTGGCAGGCGCCGTTGAACAGCCGCGAATACTTCTCCACCGATCAACTCGGCGGTGAGCATGACCCGGAAAACCTCGTTCGCATCGGCCCGTTCCAGACCGACCAGATCTGAGCCGGGACGCCGCCTGGCCGGCCCGGTACGGGCCGGCAACCCGTCTTTTCGTTTTATCACTTTCCCCCCACAGGAGGTCGCAATGCAGACCCAGATTCTCGAACGCATGGAGTCCGACGTTCGGACCTACTCCCGCTCCTTCCCGGTCGTCTTCACCAAGGCGCGCAATGCCCGCCTGACCGACGAGGAAGGGCGCGAGTACATCGACTTCCTGGCCGGTGCCGGCACCCTGAACTACGGCCACAACAACCCGCACCTCAAGCAGGCGCTGCTCGACTATATCGACAGCGACGGCATCGTCCACGGCCTGGACTTCTGGACTGCGGCCAAGCGCGACTATCTGGAAACCCTGGAAGAGGTGATCCTCAAGCCGCGCGGTCTCGACTACAAGGTGCATCTGCCCGGACCGACTGGCACCAACGCCGTCGAGGCGGCCATTCGCCTGGCCCGGGTCGCCAAGGGGCGCCACAATATCGTCTCCTTCACCAACGGCTTTCATGGCGTCACCATGGGCGCGCTGGCGACCACCGGTAACCGCAAGTTCCGCGAGGCCACCGGTGGCGTGCCGACCCAGGCTGCTTCCTTCATGCCGTTCGATGGCTACCTCGGCAGCAGCACCGACACCCTCGACTACTTCGAGAAGCTGCTCGGCGACAAGTCCGGCGGCCTGGACGTGCCCGCGGCGGTGATCGTCGAGACAGTGCAGGGCGAGGGCGGTATCAATGTCGCCGGCCTGGAGTGGCTCAAGCGCCTCGAGAGCATCTGCCGCGCCAATGACATCCTGCTGATCATCGACGACATCCAGGCGGGCTGCGGCCGGACCGGCAAGTTCTTCAGCTTCGAGCATGCCGGCATCACGCCGGATATCGTGACCAACTCCAAGTCGCTGTCCGGTTACGGCCTGCCGTTCGCTCACGTCCTGATGCGCCCCGAGCTCGACAAGTGGAAGCCCGGTCAGTACAACGGCACCTTCCGCGGCTTCAACCTGGCTTTCGCCACTGCTGCTGCCGCCATGCGCAAGTACTGGAGCGACGACACCTTCGAGCGTGACGTGCAGCGCAAGGCTCGCATCGTCGAGGAACGCTTCGGCAAGATCGCCGCCTGGCTGAGCGAGAACGGCATCGAGGCCTCCGAGCGCGGCCGCGGGCTGATGCGGGGCATCGACGTGGGTTCCGGCGATATCGCCGACAAGATCACCCACCAAGCCTTCGAGAACGGGTTGATCATCGAAACCAGCGGTCAGGACGGCGAAGTGGTCAAGTGCCTGTGCCCGCTGACCATTCCCGACGAAGACCTGGTCGAGGGACTCGACATCCTCGAGACCAGCACCAAGCAGGCCTTTAGCTGATCGCCTGAGGTGCGCCATCGGGCCTGTCCATGGCATCCTGTATCGGTCGGCCGTGCGCGGCCGGCCAGTCATTGATTCACTGGAGAATCGACATGATCGTTCGCAATCTCGAAGAAGCGCGCCAGACCGACCGTCTGGTCACCGCCGAAAACGGCAACTGGGACAGCACCCGCCTGTCGCTGGCCGAAGATGGTGGCAACTGCTCCTTCCACATCACCCGCATCTTCGAGGGTACCGAGACCCACATCCACTATAAGCATCACTTCGAGGCTGTTTATTGCATCGAAGGCGAGGGCGAAGTGGAAACCCTGGCCGATGGCAAGATCTGGCCCATCAAGCCGGGTGACATCTACATCCTCGACCAGCACGACGAGCACCTGCTGCGCGCCAGCAAGACCATGCACCTGGCCTGCGTGTTCACGCCGGGCCTGACCGGCAACGAAGTGCACCGCGAAGACGGTTCCTACGCACCTGCCGACGAAGCCGACGACCAGAAGCCGCTGTAAGCATATTTCTGGCGACGAGG，在该序列中，启动子Ptuf如第21位至第376位所示，ectABC基因如第377位至第2809位所示)。
以质粒pK18mobsacB为模板，pK18-IF/pK18-IR为引物，反向扩增线性载体pK18-L(5662bp)(SEQ ID NO:4)
(ggcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgataagctagcttcacgctgccgcaagcactcagggcgcaagggctgctaaaggaagcggaacacgtagaaagccagtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactccaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgat
ctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcggatgcccgacggcgaggatctcgtcgtga
cccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgct
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ccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgctagaggatcgatcctttttaacccatc
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taaaaatatctcttctgcaaaaggcctggacgtttgggacagctggccattacaaaacgctgacggcactgtcgcaaactatcacggctacca
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gaaaaacgctggccgcgtctttaaagacagcgacaaattcgatgcaaatgattctatcctaaaagaccaaacacaagaatggtcaggttcag
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aagcgaaaggaaacaatgtcgtgattacaagctatatgacaaacagaggattctacgcagacaaacaatcaacgtttgcgccgagcttcctg
ctgaacatcaaaggcaagaaaacatctgttgtcaaagacagcatccttgaacaaggacaattaacagttaacaaataaaaacgcaaaagaaa
atgccgatgggtaccgagcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaagg
ttgggcttcggaatcgttttccgggacgccctcgcggacgtgctcatagtccacgacgcccgtgattttgtagccctggccgacggccagca
ggtaggccgacaggctcatgccggccgccgccgccttttcctcaatcgctcttcgttcgtctggaaggcagtacaccttgataggtgggctgc
ccttcctggttggcttggtttcatcagccatccgcttgccctcatctgttacgccggcggtagccggccagcctcgcagagcaggattcccgtt
gagcaccgccaggtgcgaataagggacagtgaagaaggaacacccgctcgcgggtgggcctacttcacctatcctgcccggctgacgcc
gttggatacaccaaggaaagtctacacgaaccctttggcaaaatcctgtatatcgtgcgaaaaaggatggatataccgaaaaaatcgctataa
tgaccccgaagcagggttatgcagcggaaaagcgctgcttccctgctgttttgtggaatatctaccgactggaaacaggcaaatgcaggaaa
ttactgaactgaggggacaggcgagagacgatgccaaagagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttc
attatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttcccggtatcaacagggacacca
ggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtatttattcggcgcaaagtgcgtcgggtgatgctgccaacttactgatttagtgtatgat
ggtgtttttgaggtgctccagtggcttctgtttctatcagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatg
gtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttcccggtatcaacagggacaccaggattt
atttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtatttattcggcgcaaagtgcgtcgggtgatgctgccaacttactgatttagtgtatgatggtgtt
tttgaggtgctccagtggcttctgtttctatcagggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgacatgattac)。
将0773U、Ptuf-ectABC、0773D、pK18-L四个片段使用诺唯赞多片段同源重组试剂盒进行同源重组，获得重组质粒pK18-ectABC(9123bp)。使用ect-F和ect-R为引物，经菌落PCR验证转化子，如条带为2829bp，则证明重组质粒构建成功。
将质粒pK18-ectABC电转至野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞中，经两轮重组(pK18***质粒介导的基因编辑方法，参见学位论文《基于代谢工程选育谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸高产菌》，江南大学，徐建中，2014年)后，以0773-JF/0773-JR为引物进行菌落验证，如果电泳条带在3657bp左右，则表明筛选到阳性菌，命名为ECT01。
ECT01是在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的cgl0773假基因位点(KEGG数据库可查，下同)整合了由Ptuf启动子控制的伸长盐单胞菌(Halomonas elongate)来源的ectABC基因。
(2)lysCT311I基因的敲入
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，分别以0791-UF/0791-UR和0791-DF/0791-DR为引物，扩增上游同源臂0791U(398bp)(SEQ ID NO:5)(aacagctatgacatgattacATGCGCAGACCGGTCTCACGCCGCGCCATTTTTGCAACATCTGTTTTGGTTGCGGGGGTGAGCATCATGTCACCTTCGGCCAACGCAGCTGAGGCTCCGGCATCGGAATGGGTGAATACGACAGCGATCGTAGATCAAGCGAATGCTCAGTTGTCGCAGTTTGGCGTGAGTCTTGACCGAAGTGCAGCAGAACTTTTTGATGATCAGGCAAACTCCCAAATTGATGCAGCGCTTTCACCGTATGCCGATAAGGTTCCAACCTCTGGCGGCCAGGTAGTCGAGCAAAGTCTTCAGGTTGTGGAGCAGGAAGTTCAAAAGGCACTGCCCAACTATGAAATCCGTACCGATCTGCAATCCCAGGTGATGGGTGCAACTCTA)和下游同源臂0791D(417bp)(SEQ ID NO:6)(CTCCGTGATCGAGTTCGGTTCCAATGCAGAGTTGAGCAATACCTACAACGGTGTCACCGCGAATGCTGTCGGCGGTGGCGTGACTAATGGCCAAGAAGTATGCAAAAACGGAGTTGCTACTGGCTACACCTGTGGTTTGGTGTGGACTGCTGATGAGCGCATGACGATGTCTCAGGTGTGTGCGGGTCGTGGTGATTCGGGTGCTCCGCTGATTGCAGATGGTCGTGTGGTTGGTCTTGTATCTGGTGGTGTAATTCCTGATTACAACCTGGCATGCGCCACTCCGTTGCAGGGACCTTTCTTCATGCCAACGCTGTCAGTGAACATGGATACTGTCCTAACTGATTTGGATTCGCAGGATCTTCCCGGTCGAGGTTTTCAGCCAACTGCTGGATAGggcactggccgtcgttttac)。
以伸长盐单胞菌(Halomonas elongate)基因组为基础，通过基因合成的方法获得Ptuf-lysCT311I0基因片段(下述目的片段Ptuf-lysCT311I的第21～1642位)，再以lysC-F/lysC-R为引物，扩增目的片段Ptuf-lysCT311I(1662bp)(SEQ ID NO:7)
(AGGTGATGGGTGCAACTCTAAGATCGTTTAGATCCGAAGGAAAACGTCGAAAA GCAATTTGCTTTTCGACGCCCCACCCCGCGCGTTTTAGCGTGTCAGTAGGCGCGTAGGGTAAGTGGGGTAGCGGCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTCAACAGCATTGATTTCGATGTATTTAGCTGGCCGTTACCCTGCGAATGTCCACAGGGTAGCTGGTAGTTTGAAAATCAACGCCGTTGCCCTTAGGATTCAGTAACTGGCACATTTTGTAATGCGCTAGATCTGTGTGCTCAGTCTTCCAGGCTGCTTATCACAGTGAAAGCAAAACCAATTCGTGGCTGCGAAAGTCGTAGCCACCACGAAGTCCAGGAGGAATGCAGACCCAGATTCTCGAACGCATGGAGTCCGACGTTCGGACCTACTCCCGCTCCTTCCCGGTCGTCTTCACCAAGGCGCGCAATGCCCGCCTGACCGACGAGGAAGGGCGCGAGTACATCGACTTCCTGGCCGGTGCCGGCACCCTGAACTACGGCCACAACAACCCGCACCTCAAGCAGGCGCTGCTCGACTATATCGACAGCGACGGCATCGTCCACGGCCTGGACTTCTGGACTGCGGCCAAGCGCGACTATCTGGAAACCCTGGAAGAGGTGATCCTCAAGCCGCGCGGTCTCGACTACAAGGTGCATCTGCCCGGACCGACTGGCACCAACGCCGTCGAGGCGGCCATTCGCCTGGCCCGGGTCGCCAAGGGGCGCCACAATATCGTCTCCTTCACCAACGGCTTTCATGGCGTCACCATGGGCGCGCTGGCGACCACCGGTAACCGCAAGTTCCGCGAGGCCACCGGTGGCGTGCCGACCCAGGCTGCTTCCTTCATGCCGTTCGATGGCTACCTCGGCAGCAGCACCGACACCCTCGACTACTTCGAGAAGCTGCTCGGCGACAAGTCCGGCGGCCTGGACGTGCCCGCGGCGGTGATCGTCGAGACAGTGCAGGGCGAGGGCGGTATCAATGTCGCCGGCCTGGAGTGGCTCAAGCGCCTCGAGAGCATCTGCCGCGCCAATGACATCCTGCTGATCATCGACGACATCCAGGCGGGCTGCGGCCGGACCGGCAAGTTCTTCAGCTTCGAGCATGCCGGCATCACGCCGGATATCGTGACCAACTCCAAGTCGCTGTCCGGTTACGGCCTGCCGTTCGCTCACGTCCTGATGCGCCCCGAGCTCGACAAGTGGAAGCCCGGTCAGTACAACGGCACCTTCCGCGGCTTCAACCTGGCTTTCGCCACTGCTGCTGCCGCCATGCGCAAGTACTGGAGCGACGACACCTTCGAGCGTGACGTGCAGCGCAAGGCTCGCATCGTCGAGGAACGCTTCGGCAAGATCGCCGCCTGGCTGAGCGAGAACGGCATCGAGGCCTCCGAGCGCGGCCGCGGGCTGATGCGGGGCATCGACGTGGGTTCCGGCGATATCGCCGACAAGATCACCCACCAAGCCTTCGAGAACGGGTTGATCATCGAAACCAGCGGTCAGGACGGCGAAGTGGTCAAGTGCCTGTGCCCGCTGACCATTCCCGACGAAGACCTGGTCGAGGGACTCGACATCCTCGAGACCAGCACCAAGCAGGCCTTTAGCTGACTCCGTGATCGAGTTCGGTT，在该序列中，启动子Ptuf如第21位至第376位所示，lysCT311I基因如第377位至第1642位所示)。
将0791U、Ptuf-lysCT311I、0791D、上述扩增的线性载体pK18-L四个片段使用诺唯赞多片段同源重组试剂盒进行同源重组，获得重组质粒pK18-lysC(8059bp)。使用lysC-F/lysC-R为引物，经菌落PCR验证转化子，如条带为1662，则证明重组质粒构建正确。
将质粒pK18-lysC电转至ECT01感受态细胞中，同上述方法经两轮重组后，以0791-JF/0791-JR为引物进行菌落验证，如果电泳条带在2486bp左右，则表明筛选到阳性菌，命名为ECT02。
ECT02是在ECT01基础上，进一步在cgl0791假基因位点整合了由Ptuf启动子控制的伸长盐单胞菌(Halomonas elongate)来源的lysCT311I突变基因。
(3)ppc基因的敲入
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，分别以1135-UF/1135-UR和1135-DF/1135-DR为引物，扩增上游同源臂1135U(401bp)(SEQ ID NO:8)
(aacagctatgacatgattacTTGTGGACGCTAGGCTTGTCGGCAGTGTCTTTGGGGGACGTCCCCAGCACAAACCAGATGGAAGGTCATCAGAACATGAGCTTTTTTGAGGACATCGCGGCTGGACTTGATAGTGACGGTATCGAGTCCCGCGTAAACGGCGACACAATGTTCGTTCCGATCACCTCTGACTTGGAAATCCAGTTCGTGGAGATCGATTCCCTCCTACCTGCAGCAAACGTTTATATCGCTGCAGCCAATGTTGATGAAGACGATGATGAGTTCGAGGCAGTTCTCGTTTCGGTGGTGTTCTCTGTTGAGGATGCTGTCGCTGCTGTCGCAAAGCATGTTGCTACTGATCAGGTGGTGACTGTGCTGCGTGATCTACTTGAAGGAACTGAT)和下游同源臂1135D(404bp)(SEQ ID NO:9)
(CCAACCGCAACGGTCAATTTCATCGCGATCGGTGAGTCCTTTGAAGATCTGATTGATCAGGCCATTGAAGAATTGTGGGAATCCGACGGCGACGCAGTTCTATCGGATGAAGATCGCCAACGCATGTTCGCTGATTTGACCTCCGAGTTGGAATTTGTCACTGATGAAGTCCTCGACTTGGGTACCTTCACTGATTTTGATCGACTTTTCGATATCCTTTCCCTCGCCGATGACCAGGCTGAGGATTGGGAAGCACAGCTCGTTCCTTTTGAGGACGAGGAATTTGATGAGCCGGATGTTTATGACCTTTTCGTCGATGACTCTGAAGAAGATGACGACGACCTCGATGATGACGAGGACGATGAGGATGATGACGAAGACTAGggcactggccgtcgttttac)。
以伸长盐单胞菌(Halomonas elongate)基因组为基础，通过基因合成的方法获得Ptuf-ppc0基因片段(下述目的片段Ptuf-ppc的第21～3025位)，再以ppc-F/ppc-R为引物，扩增目的片段Ptuf-ppc(3045bp)(SEQ ID NO:10)
(ATCTACTTGAAGGAACTGATAGATCGTTTAGATCCGAAGGAAAACGTCGAAAAGCAATTTGCTTTTCGACGCCCCACCCCGCGCGTTTTAGCGTGTCAGTAGGCGCGTAGGGTAAGTGGGGTAGCGGCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTCAACAGCATTGATTTCGATGTATTTAGCTGGCCGTTACCCTGCGAATGTCCACAGGGTAGCTGGTAGTTTGAAAATCAACGCCGTTGCCCTTAGGATTCAGTAACTGGCACATTTTGTAATGCGCTAGATCTGTGTGCTCAGTCTTCCAGGCTGCTTATCACAGTGAAAGCAAAACCAATTCGTGGCTGCGAAAGTCGTAGCCACCACGAAGTCCAGGAGGAATGAGTCACGACCTGCACGAATCACTGCGCGACAATGTCCGAATCCTGGGTGACAGCTTGGGGCGCACCATTGCCGATGACCTGGGGCAGGGGTTCGTCGACCGTATCGAGACGATTCGCGGGCTCGCCAAGCGGGGACGCCAGGGGGAAGCCGATGGACGGCGCGAACTGATCGAGTACCTGCGACAGCTGCCCGACAGCGAGCTGCTGCCGGTGACGCGGGCCTTCAACCAGTTCCTCAACCTGGCCAACA
TCGCCGAGCAGCATTATCGCGCGCGTTTCCGCCGGGTCGAGGACTACAAGCCGGGCA
GCCAGCCGGCACTGGGCGAACTGCTCGAACGTGCCCGCGGCGAAGGCCATTCGCCGC
GCAAGCTGGTGGAGAGCCTGGCCAACATGCGTGTGGAACTGGTGCTCACCGCGCATC
CCACCGAGGTCATCCGGCGTACCCTGATCCAGAAATACGACGCCATCGATGATTGCCT
GACGGCCATCGAGTCCTCGGCGGACTATCCCGAGCGTGGTGCCCGGGCCAAGGGACG
CCTGGAAGAGCTGATCGGCCAGGCCTGGCACACCGACGAGATTCGCCACGAGCGACC
TACGCCGGTCGACGAGGCCAAGTGGGGCTTCGCGGTGATCGAGAACTCCCTGTGGCA
GGCGGTACCGGATTTTCATCGCGACCTGGATAACCTGCTGCTCGATACCGCTGGCGAA
CGCTTGCCGCTGGACGCCGCACCGATCCGCTTCGCCTCCTGGATGGGGGGCGATCGC
GACGGCAATCCCAACGTCACCTCCAAGGTGACCCGCGAAGTCCTGTTACTGGGGCGC
TGGATGGCCGCCGATCTTTATCTGCGCGATCTCGATCAGCTCAAGACCGAGCTGTCGA
TGTGGAAGGCCAACAGCGCGCTCAGGGCCGAGGTCGGCGATGTCGCCGAGCCCTATC
GGGAGCTGCTCAAGCGGCTGCTGGCGCGGGTCGAGGCGACCCGGGACTGGGCCAAG
GCCCAGCTCGATGGCAAGAGCTACGATGGTGGCCCGATCATCGAGACCCGGGATCAG
CTCTATGCGCCGTTGTTGACCTGCTATCGCTCGCTCTGCGATGTGGGGCTGGACACCAT
CGCCAATGGCGTGCTGCTCGACACCCTGCGCCGCGTGGCGGTATTCGGCGTGACACT
GACCAAGCTCGACCTGCGCCAGGAGGCCGGGCGCCACGAACAGGTCATGGAAGAGC
TCACCGACGGGCTGGGGCTCGGCCACTACCGCGAGTGGGATGAAGAACAGCGCCAG
GAATTCCTGCTTGCCGAACTGGCCTCGCGCCGTCCCCTGATTCCCCGGCGCTGGGAGT
GTTCCGCCGAGAGCCGCGAGGTGCTCGATACCTTCCAGGTAGCGGCCGGCGAACATG
CCGAGGCGCTCGGCACTTACATCATCTCGATGGCCGCGCAGCCCTCGGACGTACTGGC
CGTGGCGCTGTTGATGAAGGAGGTCGGCGGTGATGCCAGGCTGCCCATCGCGCCGCT
GTTCGAGACTCTCGACGATCTCAATCGGGCGGGGGATGTCATCGACCGTCTGCTGGCG
CTGCCCGGCTACCGCGAACTGACGGGCGACCGCCAGGAAGTGATGATCGGCTACTCG
GACTCGGCCAAGGACGCCGGCCAACTGGCGGCTGCCTGGGCCCAGTATCGCGCCCAG
GAGGCCCTGGTCGAGGTATGTCGGCACCACGGCGTCTACCTGACGCTGTTCCACGGT
CGGGGCGGCACCGTGGGGCGTGGCGGTGGCCCGGCCCACGCCGCCATTCTCTCGCAG
CCTCCCGGCTCGGTGAACGGCAGCCTGAGGGTGACCGAACAGGGTGAGATGATCCGC
TTCAAGTTCGGTCAGCCCGAGATCGCCCTGCGTTCCATGGAGATCTATGCCTGCGCGG
TCCTGGAAGCCTCGCTGCTGCCGCCGCCCACTCCGGAACCGGCCTGGCGGGAAGAGA
TGGATCGTCTGGCGGAAGTGGCGCATGGCACCTATGTGAGCGTGGTGCGCGAGGACC
CCGACTTCGTGCCCTATTTCCGTTCGGTGACGCCCGAGAGTGCCCTGGGACGCTTGCC
GCTCGGCTCGCGGCCGGCCAAGCGTCGCCAGGATGGTGGCGTGGAGACGCTGCGGG
CGATTCCCTGGATCTTCGCCTGGACCCAGACTCGCCTGATGCTGCCGGCATGGCTGGG
CAGCGGCGAGGCCTTCGCGAAACGTCTGGAAGACGAGGGTGGTCTGGAGGTGCTTC
GCGACATGCGCGATCGCTGGCCCTTCTTCGGCACCTATCTGGAAATGCTGGAGATGTT
GCTCGCCAAGGCCGATGTCAGCATTGCCGCCTATTACGAGCACCGCCTGGTGGACGA
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将1135U、Ptuf-ppc、1135D、上述扩增的线性载体pK18-L四个片段使用诺唯赞多片段同源重组试剂盒进行同源重组，获得重组质粒pK18-ppc(9432bp)。以ppc-F/ppc-R为引物，经菌落PCR验证转化子，如条带为3045bp，则证明重组质粒构建正确。将质粒pK18-ppc电转至ECT02感受态细胞中，经上述方法的两轮重组后，以1135-JF/1135-JR为引物进行菌落验证，如果电泳条带在3851bp左右，则表明筛选到阳性菌，命名为ECT03。
ECT03是ECT02基础上进一步在cgl1135假基因位点整合了由Ptuf启动子控制的伸长盐单胞菌(Halomonas elongate)来源的ppc基因。
(4)esaR基因的敲入
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，分别以1517-UF/1517-UR和1517-DF/1517-DR为引物，扩增游上同源臂1517U(417bp)(SEQ ID NO:11)(aacagctatgacatgattacGTGTCCCGTTTGCTTCCCGCCACAGCTTTGCTGGCCTCAACTGCACTTCTTTTAAGTGCATGTACGCAAGGGGTAACGGACTCCCCGGATATGGGCAAGGCAACTCCCGCTGTCTCCCCCGCAGCAAGCAACCCGGATGGCCAAGTAATTGAGTTCGGCAACATCACTGACATGGAAGTCACTGATGGTGACATCCTCGGTGTACGCACCGAAGACGCACTCGCTATTGGTACAGTCTCCGACTTCGAAGCGGGTAGCCAGGTGGAACTGGACGTCGATAAGCAATGCGGCGACCTGACCGCAACCGGCGGCACTTTCGTGCTCCCCTGCGCCGATGGCGTTTATTTGATTGATGCCAAGGACCCGGATCTGGATGAGTTGCGTGCAACTGACAAGC)和下游同源臂1517D(389bp)(SEQ ID NO:12)(CTTCGCGTGGGACTCGGCGTTGGTCAAATGGCTGGTGGCGAAGACGGCCTGCTGGTGGTCTCTGATGAAATGGGTGGCCAAATTGCCATCTACAACGCTGATGATGTCATCCGACTTCAAATGACCGCCCCCACCGACGAGAACCCATGGGCCGTTGCCTGGGATTCTTCCAACGCGCTCGCCTGGATCACCTCACTGACCGAAAACACCCTGGTCGGATACAAAATCTCTGAAGGCGTGCCTGAGGAAGAACAGCGCTTAAACACCATCGCAGACGCGCAAAACCTCGTGGTATTAAGCGATTCCACCCTCGTCGTAGCATCCGCAACCGGCGACGGCATCCAAATCATCGACAACCCAGCATCTTAAggcactggccgtcgttttac)。
以玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.Stewartia)基因组为基础，通过基因合成的方法获得PapFAB104-esaR0基因片段(下述目标片段PapFAB104-esaR的第21～838位)，再以esaR-F/esaR-R为引物，扩增目的片段PapFAB104-esaR(858bp)(SEQ ID NO:13)(GTTGCGTGCAACTGACAAGCTCGACATAAAGTCTAACCTATAGGATACTTACAGCCATCAATTCATTAAAGAGGAGAAAGGATCCATGTTTTCTTTTTTCCTTGAAAATCAAACAATAACGGATACGCTTCAGACTTACATACAGAGAAAGTTATCTCCGCTGGGTAGTCCGGATTACGCTTACACTGTTGTGAGCAAAAAAAATCCTTCAAATGTTCTGATTATTTCCAGTTATCCTGACGAATGGATTAGGTTATACCGCGCTAACAACTTTCAGCTGACCGATCCGGTTATTCTCACGGCCTTTAAACGCACCTCGCCGTTTGCCTGGGATGAGAATATTACGCTGATGTCCGACCTGCGGTTCACCAAAATTTTCTCTTTATCCAAGCAATACAACATCGTTAACGGCTTTACCTATGTCCTGCATGACCACATGAACAACCTTGCTCTGTTGTCCGTGATCATTAAAGGCAACGATCAGACTGCGCTGGAGCAACGCCTTGCTGCCGAACAGGGCACGATGCAGATGCTGCTGATTGATTTTAACGAGCAGATGTACCGCCTGGCCGGTACCGAAGGCGAGCGAGCCCCGGCGTTAAATCAGAGCGCGGACAAAACGATATTTTCCTCGCGTGAAAATGAGGTGTTGTACTGGGCGAGTATGGGCAAAACCTATGCTGAGATTGCCGCTATTACGGGCATTTCTGTGAGTACCGTGAAGTTTCACATCAAGAATGTGGTCGTGAAACTGGGCGTCAGTAACGCCCGACAGGCTATCAGACTGGGTGTAGAACTGGATCTTATCAGACCGGCAGCGTCAGCGGCCAGGTAGTGACTTCGCGTGGGACTCGGCGT，在该序列中，PapFAB104启动子如第21位至第85位所示，esaR基因如第86位至第838位所示)。
将1517U、PapFAB104-esaR、1517D、上述扩增的线性载体pK18-L四个片段使用诺唯赞多片段同源重组试剂盒进行同源重组，获得重组质粒pK18-esaR(7246bp)。以esaR-F/esaR-R为引物，经菌落PCR验证转化子，如条带为858bp，则证明重组质粒构建正确。
将质粒pK18-esaR电转至ECT03感受态细胞中，经上述方法的两轮重组后，以1517-JF/1517-JR为引物进行菌落验证，如果电泳条带在1661bp左右，则表明筛选到阳性菌，命名为ECT04。
ECT04是在ECT03基础上，进一步在cgl1517假基因位点整合了由PapFAB104启动子控制的玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartia)来源的esaR基因。
(5)esaI基因的敲入
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，分别以1890-UF/1890-UR和1890-DF/1890-DR为引物，扩增上游同源臂1890U(753bp)(SEQ ID NO:14)(aacagctatgacatgattacATGCGTTCAGATGTTATCGAGTTACCGGAGGGGGTAAGCAAGGAGAAAGCTGACCAGCTAGAAGTTGCGGAAGCGCGACTTAACGAGGGTGCACGACTGATGGCAACCACCGGGTGTGAGGTTATGTGGCCAACGGGCTTCTCAGTTTGTGGCCGAATTCTTGACACCTATCGCCAGGTTGGAGGTCAGTTGTCATGGCTTGGGCCACCGAAGTCAAACGAGTTGACCAATCCCGACGGTGTTGGCAAAAGAAGTGAATTTTTTGGTGGAGCCATCTATTGGCACCCAGACACAGGCGCTTATGCAGTGACCTTGGACGGTTTGCGACAGTGGGGGACCTTGAACTGGGAATCAGGGCCATTGGGGTACCCAACCTCTGGTCCGATGGATACAAACTATCCCCTTACTCAGCGACAGACTTTTCAAGGTGGTGACAACTACTACAACCCATTGACTGGCGGTGCTGTGTGGGGCGATATTAAACAGCGCTACGAAGAACTTGGCGGCTCGAATCATGCCATTGGCATCCCGATCACTAATGAGCTACCTAGCGGTACTGAGTATTTTTACAATAATTTCTCCAATGGAACAATTTCGTGGCGAAATGATCGTCAGACACGGTTTATGTATTTGGCTACGCAGCGGGTGTGGGATGCGTTGGGTCGGGAGACGGGTCGTTTAGGTTTTCCTGAAGCAGATGAAACACCTGAGGTTTCTGGTCTATTCCATGTGG)和下游同源臂1890D(567bp)(SEQ ID NO:15)(TGCACAATACGTGGATTGCAAGAATCTTCCCGATTTAGATGAGCAGAGAAAAACTGAAAACAACATTGAAAAGAATGGTGGCCCGATCAAAAAAGAGTATAGTTCGCGAGGTTTCCCCACCGAGTTCAGATTTGTGGTGAGAAAAGGGCATTATGACCGTTACAGGAATGAAGGCTGGGGATATTTAAAAAACTATTGCAAACACAACTTCGCCAACCACGCTATGGCTGAGGCCGTAGTAGATAAAGCGGTGATTGATTATGGCTCATCGCCAGGAACCAGCTATTACAAGTTCGAGAAAACGGTGTACTTTCTAGATTGCAGAACTTATACATTCAATAAGAACTCAGGATGTAAAGAAATGCACGCTCCGCAATGGGTGACTATTATTTACAATCCTCATACTTTCACTGGAGCAAATTCGAACAGACCCAAGGGGGTAATTTCAGCATGGTGTAATTCAACCCCACCTGGTGGAATCGAACACGAGCCGGAAATTTCCCAATGTCCTGATCATGTGAATCTTTATAATAAGCTTCGCATATGAggcactggccgtcgttttac)。
以玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.Stewartia)基因组为基础，通过基因合成的方法获得PL24-esaI0基因片段(下述目的片段PL24-esaI的第20～776位)，再以esaI-F/esaI-R为引物，扩增目的片段PL24-esaI(796bp)(SEQ ID NO:16)(TTCTGGTCTATTCCATGTGGTTGCCTCTTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAGGG CCCAAGTTCACTTAAAAAGGAGATCAACAATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAACATCTTAATCATGCGAGGGATGGTTTCTAATGCTTGAACTGTTTGACGTCAGTTACGAAGAACTGCAAACCACCCGTTCAGAAGAACTTTATAAACTTCGCAAGAAAACATTTAGCGATCGTCTGGGATGGGAAGTCATTTGCAGTCAGGGAATGGAGTCCGATGAATTTGATGGGCCCGGTACACGTTATATTCTGGGAATCTGCGAAGGACAATTAGTGTGCAGCGTACGTTTTACCAGCCTCGATCGTCCCAACATGATCACGCACACTTTTCAGCACTGCTTCAGTGATGTCACCCTGCCCGCCTATGGTACCGAATCCAGCCGTTTTTTTGTCGACAAAGCCCGCGCACGTGCGCTGTTAGGTGAGCACTACCCTATCAGCCAGGTCCTGTTTTTAGCGATGGTGAACTGGGCGCAAAATAATGCCTACGGCAATATCTATACGATTGTCAGCCGCGCGATGTTGAAAATTCTCACTCGCTCTGGCTGGCAAATCAAAGTCATTAAAGAGGCTTTCCTGACCGAAAAGGAACGTATCTATTTGCTGACGCTGCCAGCAGGTCAGGATGACAAGCAGCAACTCGGTGGTGATGTGGTGTCACGTACGGGCTGTCCGCCCGTCGCAGTCACTACCTGGCCGCTGACGCTGCCGGTCTGATAATGCACAATACGTGGATTGCA，在该序列中，PL24启动子如第20位至第140位所示，esaI基因如第141位至第776位所示)。
将1890U、PL24-esaI、1890D、线性载体pK18-L四个片段使用诺唯赞多片段同源重组试剂盒进行同源重组，获得重组质粒pK18-esaI(7698bp)。以esaI-F/esaI-R为引物，经菌落PCR验证转化子，如条带为858bp，则证明重组质粒构建正确。
将质粒pK18-esaI电转至ECT04感受态细胞中，经上述方法的两轮重组后，以1890-JF/1890-JR为引物进行菌落验证，如果电泳条带在2128bp左右，则表明筛选到阳性菌，命名为ECT05。
ECT05是在ECT04基础上，进一步在cgl1890假基因位点整合了由PL24启动子控制的玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartia)来源的esaI基因。
(6)hom基因启动子的替换
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，分别以Phom-UF/Phom-UR和Phom-DF/Phom-DR为引物，扩增上游同源臂PhomU(365bp)(SEQ ID NO:17)(aacagctatgacatgattacGAGGGGAACTTGATCAGAGGAATACACCATGGAGCCGATGTCAGAGGCGACTGCGGGCAGATCCTTTTGAAGCTGTTTCACAATTTCTTTGCCCAGTTCGCGGCGGATCTGGAACCACTTTTGCATGCGATCGTCGTCAGAGTGGTTCATGTGAAAAATACACTCACCATCTCAATGGTCATGGTGAAGGCCTGTACTGGCTGCGACAGCATGGAACTCAGTGCAATGGCTGTAAGGCCTGCACCAACAATGATTGAGCGAAGCTCCAAAATGTCCTCCCCGGGTTGATATTAGATTTCATAAATATACTAAAAATCTTGAGAGTTTTTCCGTTGAAAACTAAAA)和下游同源臂PhomD(420bp)(SEQ IDNO:18)(ATGACCTCAGCATCTGCCCCAAGCTTTAACCCCGGCAAGGGTCCCGGCTCAGCAGTCGGAATTGCCCTTTTAGGATTCGGAACAGTCGGCACTGAGGTGATGCGTCTGATGACCGAGTACGGTGATGAACTTGCGCACCGCATTGGTGGCCCACTGGAGGTTCGTGGCATTGCTGTTTCTGATATCTCAAAGCCACGTGAAGGCGTTGCACCTGAGCTGCTCACTGAGGACGCTTTTGCACTCATCGAGCGCGAGGATGTTGACATCGTCGTTGAGGTTATCGGCGGCATTGAGTACCCACGTGAGGTAGTTCTCGCAGCTCTGAAGGCCGGCAAGTCTGTTGTTACCGCCAATAAGGCTCTTGTTGCAGCTCACTCTGCTGAGCTTGCTGATGCAGCGGggcactggccgtcgttttac)。
以玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.Stewartia)基因组为基础，通过基因合成的方法获得PesaS基因片段(下述目的片段MPesaS的第21～204位)，再以MesaS-F/MesaS-R为引物，扩增目的片段MPesaS(224bp)(SEQ ID NO:19)(TTTTCCGTTGAAAACTAAAAGCTCACAACAGTGTAAGCGTATCCGTTATTGTTTGATTTTCAAGGAAAAAAGAAAACATTCAGGCTCCATGCTGCTTCTTTTACTTAACGTGGACTTAACCTGCACTATAGTACAGGCAAGATGATACTTAAGAGTAACTTACAATGAATCATTCAGAGGTTACAATGGCTTCAGTTGTTTAGCATGACCTCAGCATCTGCCCC，在该序列中，PesaS启动子如第21位至第204位所示)。
将PhomU、MPesaS、PhomD、线性载体pK18-L四个片段使用诺唯赞多片段同源重组试剂盒进行同源重组，获得重组质粒pK18-MesaS(6591bp)。以MesaS-F/MesaS-R为引物，经菌落PCR验证转化子，如条带为224bp，则证明重组质粒构建正确。
将质粒pK18-MesaS电转至ECT05感受态细胞中，经上述方法的两轮重组后，以Phom-JF/Phom-JR为引物进行菌落验证，如果电泳条带在1033bp左右，则表明筛选到阳性菌，命名为ECT06。
ECT06是在ECT05基础上，进一步将谷氨酸棒杆菌ATCC13032的hom基因的启动子替换为玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartia)来源的PesaS启动子。
(7)dapA基因启动子的替换
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，分别以PdapA-UF/PdapA-UR和PdapA-DF/PdapA-DR为引物，扩增上游同源臂PdapAU(406bp)(SEQ ID NO:20)(aacagctatgacatgattacATGAAGATCCGCAGTTGCGTGAACTTTTCATGCACGCCATGGATGAGTCTCGGTTCGCTTTCAATGAGCTGCTTAATGCGCTGGAAGAAAAACTTGGCGATGAACCGAATGCACTTTTAAGGAAAAAGCAGGCTCGTCAAGCAGCTCGCGCTGTGCTGCCCAACGCTACAGAGTCCAGAATCGTGGTGTCTGGAAACTTCCGCACCTGGAGGCATTTCATTGGCATGCGAGCCAGTGAACATGCAGACGTCGAAATCCGCGAAGTAGCGGTAGAATGTTTAAGAAAGCTGCAGGTAGCAGCGCCAACTGTTTTCGGTGATTTTGAGATTGAAACTTTGGCAGACGGATCGCAAATGGCAACAAGCCCGTATGTCATGGACTTTTAA)和下游同源臂PdapAD(400bp)(SEQ ID NO:21)(ATGAGCACAGGTTTAACAGCTAAGACCGGAGTAGAGCACTTCGGCACCGTTGGAGTAGCAATGGTTACTCCATTCACGGAATCCGGAGACATCGATATCGCTGCTGGCCGCGAAGTCGCGGCTTATTTGGTTGATAAGGGCTTGGATTCTTTGGTTCTCGCGGGCACCACTGGTGAATCCCCAACGACAACCGCCGCTGAAAAACTAGAACTGCTCAAGGCCGTTCGTGAGGAAGTTGGGGATCGGGCGAAGCTCATCGCCGGTGTCGGAACCAACAACACGCGGACATCTGTGGAACTTGCGGAAGCTGCTGCTTCTGCTGGCGCAGACGGCCTTTTAGTTGTAACTCCTTATTACTCCAAGCCGAGCCAAGAGGGATTggcactggccgtcgttttac)。
以PesaS基因片段为模板，以AesaS-F/AesaS-R为引物，扩增目的片段APesaS(224bp)(SEQ ID NO:22)
(CGTATGTCATGGACTTTTAAGCTCACAACAGTGTAAGCGTATCCGTTATTGTTTGATTTTCAAGGAAAAAAGAAAACATTCAGGCTCCATGCTGCTTCTTTTACTTAACGTGGACTTAACCTGCACTATAGTACAGGCAAGATGATACTTAAGAGTAACTTACAATGAATCATTCAGAGGTTACAATGGCTTCAGTTGTTTAGCATGAGCACAGGTTTAACAGC，在该序列中，APesaS启动子如第20位至第204位所示)。
将PdapAU、APesaS、PdapAD、线性载体pK18-L四个片段使用诺唯赞多片段同源重组试剂盒进行同源重组，获得重组质粒pK18-AesaS(5719bp)。以AesaS-F/AesaS-R为引物，经菌落PCR验证转化子，如条带为224bp，则证明重组质粒构建正确。
将质粒pK18-AesaS电转至ECT06感受态细胞中，经两轮重组后，以PdapA-JF/PdapA-JR为引物进行菌落验证，如果电泳条带在1037bp左右，则表明筛选到阳性菌，命名为ECT07。
ECT07是在ECT06基础上，进一步将dapA基因的启动子替换为玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartia)来源的PesaS启动子。
(8)gltA基因启动子的替换
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，分别以PgltA-UF/PgltA-UR和PgltA-DF/PgltA-DR为引物，扩增上游同源臂PgltAU(409bp)(SEQ ID NO:23)(aacagctatgacatgattacTTTTTACTGCCGGCTGACGGTGTGAGGTACCGATGACGGATGCGGATCCGTCGACAATAGCCTGAATCTGTTCTGGTCGAACCTTGGAAGGTCCGCAGCCGAAACGGCCGTCGCCAGGGATGAACTCAGAGGGCAGGGTGGGGAAGTCGGTCATGTCTTCGGGCAACTTTCTGCGCTTGGAAGTAAAAGGGCCAGGGATCGTTAACGATCTGACCCAACAACTATAACCCTGAAGCTGTCAGTTCCTAGCACCCTAGATTCTTCACGCAGTCTCCCAAACGATGAAAAACGCCCAAAACTGGCGACACCGAACTATTGAAAACGCGGGGATTAGTTGACCAGCCACCAATTTGGGGGTAGCTCAAAGTTTTGCAAAGTTTTCAATTTCT)和下游同源臂PgltAD(400bp)(SEQ ID NO:24)(ATGTTTGAAAGGGATATCGTGGCTACTGATAACAACAAGGCTGTCCTGCACTACCCCGGTGGCGAGTTCGAAATGGACATCATCGAGGCTTCTGAGGGTAACAACGGTGTTGTCCTGGGCAAGATGCTGTCTGAGACTGGACTGATCACTTTTGACCCAGGTTATGTGAGCACTGGCTCCACCGAGTCGAAGATCACCTACATCGATGGCGATGCGGGAATCCTGCGTTACCGCGGCTATGACATCGCTGATCTGGCTGAGAATGCCACCTTCAACGAGGTTTCTTACCTACTTATCAACGGTGAGCTACCAACCCCAGATGAGCTTCACAAGTTTAACGACGAGATTCGCCACCACACCCTTCTGGACGAGGACTTCAAggcactggccgtcgttttac)。
以PesaS基因片段为模板，GesaS-F/GesaS-R为引物，扩增目的片段GPesaS(224bp)(SEQ ID NO:25)
(TTGCAAAGTTTTCAATTTCTGCTCACAACAGTGTAAGCGTATCCGTTATTGTTTGATTTTCAAGGAAAAAAGAAAACATTCAGGCTCCATGCTGCTTCTTTTACTTAACGTGGACTTAACCTGCACTATAGTACAGGCAAGATGATACTTAAGAGTAACTTACAATGAATCATTCAGAGGTTACAATGGCTTCAGTTGTTTAGCATGTTTGAAAGGGATATCGT，在该序列中，GPesaS启动子如第21位至第204位所示)。
将PgltAU、GPesaS、PgltAD、线性载体pK18-L四个片段使用诺唯赞多片段同源重组试剂盒进行同源重组，获得重组质粒pK18-GesaS(6642bp)。以GesaS-F/GesaS-R为引物，经菌落PCR验证转化子，如条带为224bp，则证明重组质粒构建正确。
将质粒pK18-GesaS电转至ECT07感受态细胞中，经上述方法两轮重组后，以PgltA-JF/PgltA-JR为引物进行菌落验证，如果电泳条带在1198bp左右，则表明筛选到阳性菌，命名为ECT08。
ECT08是在ECT07基础上，进一步将gltA基因的启动子替换为玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartia)来源的PesaS启动子。
(9)thrE基因的敲入
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，分别以1895-UF/1895-UR、1895-DF/1895-DR和thrE-F/thrE-R为引物，扩增上游同源臂1895U(177bp)(SEQ ID NO:26)
(aacagctatgacatgattacATGTCTTCATTCACACGTCGTCTCCCTGTCACCGCAGTTACTGCAGTACTTGCCTCGTCCACCCTTCTCGCTGCGGCAACACCTGCTTCAGTTAAATGCGTGCACCCTCACTCAGAACACGTGGGCCCATTGCATGTTTATGGATCTAGTGAAAACT)、下游同源臂1895D(192bp)(SEQ ID NO:27)(TGATGTGTGCGGGAAGATTGATTTCGGAACCCATTGGGAAGGCACTGGAATCCACACTGGCCAGTTTGGGTTATTTAATGTTAAGTATGCAGACAATAAGTTTTTCGTTGTCACCATTGATGATGCCGGCCTAGGCTCCTCCGACCAGAACCCCACTGGCACCTTTGGATAAggcactggccgtcgttttac)和目的片段thrE(1490bp)(SEQ ID NO:28)(ATGTTGAGTTTTGCGACCCTTCGTGGCCGCATTTCAACAGTTGACGCTGCAAAAGCCGCACCTCCGCCATCGCCACTAGCCCCGATTGATCTCACTGACCATAGTCAAGTGGCCGGTGTGATGAATTTGGCTGCGAGAATTGGCGATATTTTGCTTTCTTCAGGTACGTCAAATAGTGACACCAAGGTACAAGTTCGAGCAGTGACCTCTGCGTACGGTTTGTACTACACGCACGTGGATATCACGTTGAATACGATCACCATCTTCACCAACATCGGTGTGGAGAGGAAGATGCCGGTCAACGTGTTTCATGTTGTAGGCAAGTTGGACACCAACTTCTCCAAACTGTCTGAGGTTGACCGTTTGATCCGTTCCATTCAGGCTGGTGCGACCCCGCCTGAGGTTGCCGAGAAAATCCTGGACGAGTTGGAGCAATCCCCTGCGTCTTATGGTTTCCCTGTTGCGTTGCTTGGCTGGGCAATGATGGGTGGTGCTGTTGCTGTGCTGTTGGGTGGTGGATGGCAGGTTTCCCTAATTGCTTTTATTACCGCGTTCACGATCATTGCCACGACGTCATTTTTGGGAAAGAAGGGTTTGCCTACTTTCTTCCAAAATGTTGTTGGTGGTTTTATTGCCACGCTGCCTGCATCGATTGCTTATTCTTTGGCGTTGCAATTTGGTCTTGAGATCAAACCGAGCCAGATCATCGCATCTGGAATTGTTGTGCTGTTGGCAGGTTTGACACTCGTGCAATCTCTGCAGGACGGCATCACGGGCGCTCCGGTGACAGCAAGTGCACGATTTTTCGAAACACTCCTGTTTACCGGCGGCATTGTTGCTGGCGTGGGTTTGGGCATTCAGCTTTCTGAAATCTTGCATGTCATGTTGCCTGCCATGGAGTCCGCTGCAGCACCTAATTATTCGTCTACATTCGCCCGCATTATCGCTGGTGGCGTCACCGCAGCGGCCTTCGCAGTGGGTTGTTACGCGGAGTGGTCCTCGGTGATTATTGCGGGGCTTACTGCGCTGATGGGTTCTGCGTTTTATTACCTCTTCGTTGTTTATTTAGGCCCCGTCTCTGCCGCTGCGATTGCTGCAACAGCAGTTGGTTTCACTGGTGGTTTGCTTGCCCGTCGATTCTTGATTCCACCGTTGATTGTGGCGATTGCCGGCATCACACCAATGCTTCCAGGTCTAGCAATTTACCGCGGAATGTACGCCACCCTGAATGATCAAACACTCATGGGTTTCACCAACATTGCGGTTGCTTTAGCCACTGCTTCATCACTTGCCGCTGGCGTGGTTTTGGGTGAGTGGATTGCCCGCAGGCTACGTCGTCCACCACGCTTCAACCCATACCGTGCATTTACCAAGGCGAATGAGTTCTCCTTCCAGGAGGAAGCTGAGCAGAATCAGCGCCGGCAGAGAAAACGTCCAAAGACTAATCAGAGATTCGGTAATAAAAGGTAATGATGTGTGCGGGAAGATTG，在该序列中thrE基因如第1位至第1470位所示)。
通过基因合成的方法获得谷氨酸棒状杆菌的Psod-0基因片段(下述目的片段Psod的第21～266位)，再以sod-F/sod-R为引物，扩增目的片段Psod(286bp)(SEQ ID NO:29)(TTATGGATCTAGTGAAAACTAACAGGAATGTTCCTTTCGAAAATTGAGGAAGCCTTA TGCCCTTCAACCCTACTTAGCTGCCAATTATTCCGGGCTTGTGACCCACTACCCGATAAATAGGTCGGCTGAAAAATTTCGTTGCAATATCAACAAAAAGGCCTATCATTGGGAAGTGTCGCACCAAGTACTTTTGCGAAGCGCCATCTGACGGATTTTCAAAAGATGTATATGCTCGGTGCGGAAACCTACGAAAGGATTTTTTACCCATGTTGAGTTTTGCGACCCT，在该序列中，Psod启动子如第21位至第266位所示)。
将1895U、Psod、thrE、1895D、pK18-L五个片段使用诺唯赞多片段同源重组试剂盒进行同源重组，获得重组质粒pK18-thrE(7707bp)。以sod-F、thrE-R为引物，经菌落PCR验证转化子，如条带为1756bp，则证明重组质粒构建正确。
将质粒pK18-thrE电转至ECT08感受态细胞中，经上述方法两轮重组后，以1895-JF/1895-JR为引物进行菌落验证，如果电泳条带在2023bp左右，则表明筛选到阳性菌，命名为ECT09。
ECT09是在ECT08基础上，进一步在cgl1895假基因位点整合由Psod启动子控制的本源thrE基因。即，ECT09基因组上含有两个拷贝的thrE基因。
(10)proP基因的敲除
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，分别以proP-UF/proP-UR和proP-DF/proP-DR为引物，扩增上游同源臂proPU(572bp)(SEQ ID NO:30)(aacagctatgacatgattacGAGGGTGACTCAAAGGCATAAAGTTGCCCATTTCGGTGCCCTCCACGGCACCGAAAACAGTAACTTTCCCAAGAAAAATATAAGAAAACTTCCCCACACAGGCCGTGAAGAGCCTGAATTTATTGATTTTTCAGACAGATCTGGAAATGTGACCAATTTGTAACCCACCCCCGCTCACCTGCATGAGTGTGGGGTCTTTTTGCATTCTTCCAGCTCCCAGACTTGAAAACGATCTGACTTTTCACCCCGAACCTTACTAAGGTCGATTCATGTTGAAAAGAGAGGTGGTGTTTTCACTTCCCTTTTATAGGCAAAGCTTTAAGGAGTCTTACAGGAAGAAGTTAACACCGCCCAGGGGTGCGTTGGATGATGATCATCTACAAACAAACATTCCGTTATGCACTCATAAGATATGACGAGAGGTTTTACTCGTGAGCCCGATTCGCTCAAAAAAGAAAATCAAGAACGAACCAAGACTAACAGTCGATGACGTCAACGTTGTTCCCCCAAAGAAGATCCGTCCGGCCATTAAAGGCACTGTGGTGGGTAACT)和下游同源臂proPD(592bp)(SEQ ID NO:31)(AGGCACTGTGGTGGGTAACTAGGACGAGGATCCAAATATTGATCTTTCCCATATGCCGTTTCCTGATGAGGAAAACGTAGGTGCTGAAAAGCAAAACGCATAACCGTAAAGCCCGCTGCAAGGCGGGCTTTTTTGGTGGCCGGGGGAGTCGAAAAGTGCTTATCGACGAGTGCTGCGTCGGTTTATGAGATGCTTTTGTAGTCCGCTAGACGAAGCATTCCAAGAGGTAGACCGGTGTCGGTTGGGAACCAGACCTGATCCGTTGTTGCAGTGATTTCCACGTGGGTGTCGAGGTAGCCTATCCAATCATTGTCACCATCAGCGGGGATGTATCGGCCGAGGCTGACTTCGGAAATGGTACGAGTCTGAGGGTCTGTAGCTGCGTTTCGTGCTGTGATTTCAATTGGGGAATCAAGGACCAGTACGAGATAGAGATCAGTGGCAGGCTCACCATTGGGAGTTCGTTCACCTCGCATGAGTTCGCCGGCGGTCTGCATCGTTACTACACCAGAGAAGTAGTGCAGGTTTGACGCAGGCTGTTGAACGGGAGTTGGGGCTGCTTGTTGAATGTTggcactggccgtcgttttac)。
将proPU、proPD和线性载体pK18-L三个片段使用诺唯赞多片段同源重组试剂盒进行同源重组，获得重组质粒pK18-proP(6766bp)。
将质粒pK18-proP电转至ECT09感受态细胞中，经上述方法的两轮重组后，以proP-JF/proP-JR为引物进行菌落验证，如果电泳条带在597bp左右，则表明筛选到阳性菌，命名为ECT10，即，四氢嘧啶生产菌株。
ECT10是在ECT09的基础上，进一步敲除了proP基因。
实施例1所涉及的引物序列见下表：
/>
/>
/>
实施例2：四氢嘧啶生产菌ECT10的发酵
培养基配方：
BHI培养基：葡萄糖2g/L，脑心浸粉17.5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，Na2HPO42.5g/L，其余为水，pH 7.2。
种子罐培养基：葡萄糖15g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨2g/L，K2HPO4 5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，FeSO4·7H2O 60mg/L，MnSO4·7H2O 20mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2mg/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
发酵罐培养基：葡萄糖50g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，柠檬酸钠2g，K2HPO4 4g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，FeSO4·7H2O 60mg/L，MnSO4·7H2O 20mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2mg/L其余为水，pH 7.0-7.2。
(1)初代活化：取-80℃保藏的ECT10接种于装有BHI培养基的摇管中，30℃、220rpm培养12h。
(2)二代活化：将初代活化得到的菌液按照10％比例转接于含10g/L葡萄糖的BHI种子罐培养基的种子瓶中，30℃、220rpm培养12h。
(3)种子罐培养：将二代活化得到的菌液按照10％比例转接至含种子罐培养基的种子罐中，控制温度为30℃，pH为7.0(通过流加氨水，发酵罐自动检测并控制pH值)，溶氧维持在30-40％之间，培养约8小时转接发酵。
(4)发酵罐培养：当种子OD600在15左右时，按照15-20％(体积比)的接种量将种子接种至发酵罐中，发酵过程中控制温度为30℃，pH为7.0，溶氧维持在30-40％之间，残糖浓度在0.5-5g/L，发酵培养44h。
所构建菌株经5L发酵罐分批补料发酵40h时，四氢嘧啶产量达70.4g/L，转化率为0.25g/g葡萄糖。
四氢嘧啶标准品的HPLC图谱如图2所示，四氢嘧啶标准品的出峰时间为13.756min。
将本实施例的发酵液进行离心处理，将上清液使用90％乙腈水稀释后，进行高效液相色谱检测，得到的色谱图如图3所示，图3表明四氢嘧啶的出峰时间为13.764min。
ECT10的发酵曲线图如图4所示，发酵前期菌种生长迅速，16h时OD600达到最高水平；四氢嘧啶在4h左右开始积累，发酵40h时达最高产量70.4g/L，经计算糖转化率为0.25g/g葡萄糖。

Claims (10)

1.一种四氢嘧啶生产菌株，其特征在于，所述菌株是以谷氨酸棒状杆菌为起始菌，具有以下特征：(1)lysCT311I基因、ppc基因、thrE基因、ectABC基因簇过表达，(2)hom基因、dapA基因、gltA基因下调表达，(3)proP基因敲除。
2.根据权利要求1所述的四氢嘧啶生产菌株，其中，
所述lysCT311I基因的过表达通过选自下列任一种方式实现：
a)将内源lysC基因进行T311I突变，并将其启动子替换为组成型启动子；或，
b)在基因组上一个或多个位点***lysCT311I基因；优选地，所述的lysCT311I基因来源于伸长盐单胞菌；或，
c)将lysCT311I基因克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中；优选地，所述的lysCT311I基因来源于伸长盐单胞菌；或，
d)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述ppc基因的过表达通过选自下列任一种方式实现：
a)在基因组上一个或多个位点***ppc基因；优选地，所述的ppc基因来源于伸长盐单胞菌；或，
b)将ppc基因克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中；优选地，所述的ppc基因来源于伸长盐单胞菌；或，
c)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述thrE基因的过表达通过选自下列任一种方式实现：
a)在基因组上一个或多个位点***thrE基因；优选地，所述的thrE基因来源于谷氨酸棒状杆菌；或，
b)将thrE基因克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中；优选地，所述的thrE基因来源于谷氨酸棒状杆菌；或，
c)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述ectABC基因的过表达通过选自下列任一种方式实现：
a)在基因组上一个或多个位点***ectABC基因簇，优选地，所述的ectABC基因来源于伸长盐单胞菌；或，
b)将ectABC基因簇克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中，优选地，所述的ectABC基因来源于伸长盐单胞菌；或，
c)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述hom基因、dapA基因、gltA基因下调表达通过选自下列任一种方式实现：
a)直接敲除基因中的一段序列，使其无法正常表达出蛋白质；或，
b)替换内源启动子为弱启动子；或，
c)动态下调基因表达；
优选地，所述hom基因、dapA基因、gltA基因下调表达为使用来源于玉米细菌性枯萎病菌的esaI/esaR群体感应***进行动态调控；进一步优选地，所述hom基因、dapA基因、gltA基因下调表达为将玉米细菌性枯萎病菌esaR基因和esaI基因引入谷氨酸棒杆菌中并使其表达；
和/或
所述proP基因敲除通过直接敲除proP基因中的一段序列、和/或缺失和/或添加一个或几个碱基，使proP基因无法正常表达出蛋白质来实现；
优选地，所述谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
3.根据权利要求1或2所述的四氢嘧啶生产菌株，其中，所述菌株是以谷氨酸棒状杆菌为起始菌，并具有以下特征：
(1)在基因组上整合了Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的ectABC基因、Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的lysCT311I突变基因、Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的ppc基因，PapFAB104启动子及其控制的玉米细菌性枯萎病菌esaR基因、PL24启动子及其控制的玉米细菌性枯萎病菌esaI基因，Psod启动子及其控制的谷氨酸棒状杆菌thrE基因；
(2)将谷氨酸棒状杆菌的hom基因、dapA基因和gltA基因的启动子分别替换为玉米细菌性枯萎病菌PesaS启动子；和
(3)敲除谷氨酸棒状杆菌的proP基因；
优选地，所述在基因组上整合基因是整合在基因组的假基因位点处；
优选地，所述Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的ectABC基因整合在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的cgl0773假基因位点，所述Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的lysCT311I突变基因整合在cgl0791假基因位点，所述Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的ppc基因整合在cgl1135假基因位点，PapFAB104启动子及其控制的玉米细菌性枯萎病菌esaR基因整合在cgl1517假基因位点，PL24启动子及其控制的玉米细菌性枯萎病菌esaI基因整合在cgl1890假基因位点，Psod启动子及其控制的谷氨酸棒状杆菌thrE基因整合在cgl1895假基因位点。
4.根据权利要求3所述的菌株，其中，所述Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的ectABC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3的第21～2809位所示；
所述Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的lysCT311I突变基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:7的第21～1642位所示；
所述Ptuf启动子及其控制的伸长盐单胞菌的ppc基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10的第21～3025位所示；
所述PapFAB104启动子及其控制的玉米细菌性枯萎病菌esaR基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:13的第21～838位所示；
所述PL24启动子及其控制的玉米细菌性枯萎病菌esaI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:16的第20～776位所示；
所述Psod启动子及其控制的谷氨酸棒状杆菌thrE基因中，所述Psod启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:29的第21～266位所示，所述谷氨酸棒状杆菌thrE基因的核苷酸序列如SEQID NO:28的第1～1470位所示；
所述玉米细菌性枯萎病菌PesaS启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:19的第21～204位所示；
优选地，敲除谷氨酸棒状杆菌的proP基因采用双交换同源重组方式敲除。
5.一种四氢嘧啶生产菌株的构建方法，包括：
以谷氨酸棒状杆菌为起始菌，(1)过表达lysCT311I基因、ppc基因、thrE基因、ectABC基因簇，(2)下调hom基因、dapA基因、gltA基因表达，(3)敲除proP基因；
优选地，所述谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032；
优选地，
所述lysCT311I基因的过表达方式选自下列任一种：
a)将内源lysC基因进行T311I突变，并将其启动子替换为组成型启动子；或，
b)在基因组上一个或多个位点***lysCT311I基因；优选地，所述的lysCT311I基因来源于伸长盐单胞菌；或，
c)将lysCT311I基因克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中；优选地，所述的lysCT311I基因来源于伸长盐单胞菌；或，
d)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述ppc基因的过表达方式选自下列任一种：
a)在基因组上一个或多个位点***ppc基因；优选地，所述的ppc基因来源于伸长盐单胞菌；或，
b)将ppc基因克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中；优选地，所述的ppc基因来源于伸长盐单胞菌；或，
c)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述thrE基因的过表达方式选自下列任一种：
a)在基因组上一个或多个位点***thrE基因；优选地，所述的thrE基因来源于谷氨酸棒状杆菌；或，
b)将thrE基因克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中；优选地，所述的thrE基因来源于谷氨酸棒状杆菌；或，
c)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述ectABC基因的过表达方式选自下列任一种：
a)在基因组上一个或多个位点***ectABC基因簇，优选地，所述的ectABC基因来源于伸长盐单胞菌；或，
b)将ectABC基因簇克隆在质粒上并转化入谷氨酸棒状杆菌中，优选地，所述的ectABC基因来源于伸长盐单胞菌；或，
c)将该基因的其他突变型以基因组敲入或质粒形式在谷氨酸棒状杆菌中表达；
和/或
所述下调hom基因、dapA基因、gltA基因表达选自下列任一种：
a)直接敲除基因中的一段序列，使其无法正常表达出蛋白质；或，
b)替换内源启动子为弱启动子；或，
c)动态下调基因表达；
优选地，所述下调hom基因、dapA基因、gltA基因表达为使用来源于玉米细菌性枯萎病菌的esaI/esaR群体感应***进行动态调控；进一步优选地，所述下调hom基因、dapA基因、gltA基因表达为将玉米细菌性枯萎病菌esaR基因和esaI基因引入谷氨酸棒杆菌中并使其表达；
和/或
所述敲除proP基因选自直接敲除proP基因中的一段序列、和/或缺失和/或添加一个或几个碱基，使proP基因无法正常表达出蛋白质；
更优选地，所述方法包括：(1)以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，在其基因组上整合伸长盐单胞菌的ectABC基因、lysCT311I及ppc基因，玉米细菌性枯萎病菌esaR基因和esaI基因，谷氨酸棒状杆菌thrE基因；
(2)将谷氨酸棒状杆菌的hom基因、dapA基因和gltA基因的启动子替换为玉米细菌性枯萎病菌PesaS启动子；
(3)敲除谷氨酸棒状杆菌的proP基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤(1)包括如下步骤：
(a)将ectABC基因与启动子Ptuf的融合片段Ptuf-ectABC整合在谷氨酸棒状杆菌基因组的cgl0773假基因位点；
所述Ptuf-ectABC如SEQ ID NO:3的第21～2809位所示；
(b)将lysCT311I基因与启动子Ptuf的融合片段Ptuf-lysCT311I整合在cgl0791假基因位点；
所述Ptuf-lysCT311I如SEQ ID NO:7的第21～1642位所示；
(c)将ppc基因与启动子Ptuf的融合片段Ptuf-ppc整合在cgl1135假基因位点；
所述Ptuf-ppc如SEQ ID NO:10的第21～3025位所示；
(d)将esaR与启动子PapFAB104的融合片段PapFAB104-esaR整合在cgl1517假基因位点；
所述PapFAB104-esaR如SEQ ID NO:13的第21～838位所示；
(e)将esaI与启动子PL24的融合片段PL24-esaI整合在cgl1890假基因位点；
所述PL24-esaI如SEQ ID NO:16的第20～776位所示；
(f)将thrE与启动子Psod的融合片段Psod-thrE整合在cgl1895假基因位点；
所述Psod启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:29的第21～266位所示，所述谷氨酸棒状杆菌thrE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:28的第1～1470位所示；
优选地，所述整合通过双交换同源重组方式实现；
优选地，步骤(2)中，所述PesaS启动子如SEQ ID NO:19的第21～204位所示；优选地，所述替换通过双交换同源重组方式实现；优选地，步骤(3)中，所述敲除通过双交换同源重组方式实现。
7.根据权利要求5或6所述的方法，包括：
(1)将质粒pK18-ectABC与谷氨酸棒杆菌ATCC13032进行两轮重组，获得菌株ECT01；其中，质粒pK18-ectABC由0773U、Ptuf-ectABC、0773D、pK18-L四个片段同源重组得到，片段0773U的序列如SEQ ID NO:1所示，片段0773D的序列如SEQ ID NO:2所示，片段Ptuf-ectABC的序列如SEQ ID NO:3所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(2)将质粒pK18-lysC与菌株ECT01进行两轮重组，获得菌株ECT02；其中，质粒pK18-lysC由0791U、Ptuf-lysCT311I、0791D、pK18-L四个片段同源重组得到，片段0791U的序列如SEQID NO:5所示，片段0791D的序列如SEQ ID NO:6所示，片段Ptuf-lysCT311I的序列如SEQ IDNO:7所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(3)将质粒pK18-ppc与菌株ECT02进行两轮重组，获得菌株ECT03；其中，质粒pK18-ppc由1135U、Ptuf-ppc、1135D、pK18-L四个片段同源重组得到，片段1135U的序列如SEQ ID NO:8所示，片段1135D的序列如SEQ ID NO:9所示，片段Ptuf-ppc的序列如SEQ ID NO:10所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(4)将质粒pK18-esaR与菌株ECT03进行两轮重组，获得菌株ECT04；其中，质粒pK18-esaR由1517U、PapFAB104-esaR、1517D、pK18-L四个片段同源重组得到，片段1517U的序列如SEQID NO:11所示，片段1517D的序列如SEQ ID NO:12所示，片段PapFAB104-esaR的序列如SEQ IDNO:13所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(5)将质粒pK18-esaI与菌株ECT04进行两轮重组，获得菌株ECT05；其中，质粒pK18-esaI由1890U、PL24-esaI、1890D、pK18-L四个片段同源重组得到，片段1890U的序列如SEQ IDNO:14所示，片段1890D的序列如SEQ ID NO:15所示，片段PL24-esaI的序列如SEQ ID NO:16所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(6)将质粒pK18-MesaS与菌株ECT05进行两轮重组，获得菌株ECT06；其中，质粒pK18-MesaS由PhomU、MPesaS、PhomD、pK18-L四个片段同源重组得到，片段PhomU的序列如SEQ IDNO:17所示，片段PhomD的序列如SEQ ID NO:18所示，片段MPesaS的序列如SEQ ID NO:19所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(7)将质粒pK18-AesaS与菌株ECT06进行两轮重组，获得菌株ECT07；其中，质粒pK18-AesaS由PdapAU、APesaS、PdapAD、pK18-L四个片段同源重组得到，片段PdapAU的序列如SEQID NO:20所示，片段PdapAD的序列如SEQ ID NO:21所示，片段APesaS的序列如SEQ ID NO:22所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(8)将质粒pK18-GesaS与菌株ECT07进行两轮重组，获得菌株ECT07；其中，质粒pK18-GesaS由PgltAU、GPesaS、PgltAD、pK18-L四个片段同源重组得到，片段PgltAU的序列如SEQID NO:23所示，片段PgltAD的序列如SEQ ID NO:24所示，片段GPesaS的序列如SEQ ID NO:25所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(9)将质粒pK18-thrE与菌株ECT08进行两轮重组，获得菌株ECT09；其中，质粒pK18-thrE由1895U、Psod、thrE、1895D、pK18-L五个片段同源重组得到，片段1895U的序列如SEQ IDNO:26所示，片段1895D的序列如SEQ ID NO:27所示，片段thrE的序列如SEQ ID NO:28所示，片段Psod的序列如SEQ ID NO:29所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示；
(10)将质粒pK18-proP与菌株ECT09进行两轮重组，获得四氢嘧啶生产菌株；其中，质粒pK18-proP由proPU、proPD和pK18-L三个片段同源重组得到，片段proPU的序列如SEQ IDNO:30所示，片段proPD的序列如SEQ ID NO:31所示，片段pK18-L序列如SEQ ID NO:4所示。
8.根据权利要求5～7任一项所述的方法获得的菌株。
9.权利要求1～4或8任一项所述的菌株在生产四氢嘧啶中的应用。
10.一种四氢嘧啶的生产方法，包括将权利要求1～3或8任一项所述的菌株进行发酵；
优选地，所述发酵条件为：温度为30℃，pH为7.0，溶氧维持在30-40％之间，残糖浓度在0.5-5g/L；
优选地，发酵时接入的种子液的OD600在10-15左右，接种量为15-20％；
更优选地，种子液的培养包括：
(1)初代活化：取-80℃保藏菌种接种于BHI摇管中，培养12-16h；
(2)二代活化：将初代活化菌液转接于含10-20g/L葡萄糖的BHI种子瓶中，培养12-16h；
(3)种子罐培养：将二代活化菌液全部转接至种子罐中，控制温度为30℃，pH为7.0，溶氧维持在30-40％之间；
优选地，培养基配方为：
BHI培养基：葡萄糖2-4g/L，脑心浸粉17-20g/L，蛋白胨8-12g/L，NaCl 3-7g/L，Na2HPO42-4g/L，其余为水，pH 7.2-7.4；
种子罐培养基：葡萄糖10-20g/L，酵母粉1-3g/L，蛋白胨1-3g/L，K2HPO4 3-6g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，FeSO4·7H2O 50-70mg/L，MnSO4·7H2O 15-20mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1-3mg/L其余为水，pH 7.0-7.2；
发酵罐培养基：葡萄糖40-60g/L，酵母粉5-7g/L，蛋白胨5-7g/L，柠檬酸钠2-5g，K2HPO43-6g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，FeSO4·7H2O 50-70mg/L，MnSO4·7H2O 15-20mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1-3mg/L其余为水，pH 7.0-7.2。
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