CN112877270B - 一种生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种生产羟基四氢嘧啶基因工程菌的构建及其应用。本发明在基因组上对羟基四氢嘧啶合成途径中的关键基因进行强化，并减弱羟基四氢嘧啶竞争抑制途径，构建羟基四氢嘧啶合成途径，并过表达异柠檬酸脱氢酶编码基因icd以增加前体物α‑酮戊二酸的供应，同时通过esaI/esaR群体感应线路策略对前体物质α‑酮戊二酸的供应进行动态调控，根据细胞密度自动调节α‑酮戊二酸在三羧酸循环中的代谢，得到一株羟基四氢嘧啶高产菌。所构建菌株可以在不添加α‑酮戊二酸的发酵条件下，实现羟基四氢嘧啶的高效合成，且无副产物四氢嘧啶的积累，具有重要的工业应用价值。

Description

一种生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其应用
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种生产羟基四氢嘧啶基因工程菌的构建及其应用。
背景技术：
羟基四氢嘧啶((4S,5S)-5-hydroxy-2-methyl-1,4,5,6-tetrahydropyrimidine-4-carboxylic acid)是四氢嘧啶的羟基化衍生物，被认为是最广泛分布的相容性溶质之一。由于其特殊的生物学特性，使其有别于其他相容性溶质，如其对提高蛋白质和细胞的耐热性的适用性，使之成为经济利益的目标。
羟基四氢嘧啶被用于稳定大分子和整个细胞，稳定体外酶活性，促进体内蛋白质折叠，保护分子和细胞对冻融循环，促进抵抗干燥，氧化和温度应力保护剂。此外，羟基四氢嘧啶还是一种优良的干燥保护剂，具有良好的玻璃化性能。另外，羟基四氢嘧啶稳定基因治疗的逆转录病毒载体，允许逆转录病毒载体的长期储存，是有潜力的基因治疗工具。羟基四氢嘧啶增强抵抗细胞和DNA对电离辐射和紫外线引起的损害，并防止UV诱导的皮肤细胞损伤，这些特性促进了羟基四氢嘧啶在护肤产品的广泛发展。
目前，羟基四氢嘧啶的生产方法主要通过“细菌挤奶”工艺实现，即在高盐浓度下培养伸长嗜盐菌Halomonas elongata，通过不断地提高、降低发酵液的盐浓度，实现羟基四氢嘧啶在高盐浓度下的大量合成，以及低盐浓度下的迅速释放。该工艺设备要求高，能耗高，此外，高盐环境不利于菌体生长，导致生产周期长，目标产物合成效率低，且产物通常是羟基四氢嘧啶与四氢嘧啶的混合物，需要进一步采用色谱分离技术进行产品纯化。因此，羟基四氢嘧啶的产量低、成本高、市场价格十分昂贵。高副产物含量、高成本、低收率的问题严重制约了羟基四氢嘧啶的工业生产与应用，构建高效合成单一产物的基因工程菌株具有十分迫切的需求。
为了获得羟基四氢嘧啶的高效生产菌株，本专利以大肠杆菌W3110为细胞底盘，通过理性设计构建羟基四氢嘧啶的高效合成途径。同时，针对羟基四氢嘧啶合成中存在的α-酮戊二酸供应不足、TCA循环与产物合成不协调等问题，本专利利用esaI/esaR群体感应***构建出一株基于细胞密度自动进行羟基四氢嘧啶合成动态调控的大肠杆菌基因工程菌。所构建菌株可以在不添加α-酮戊二酸的发酵条件下，实现羟基四氢嘧啶的高效合成，且无副产物四氢嘧啶的积累，具有重要的工业应用价值。
发明内容：
针对上述存在问题，本发明目的是提供一种生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，及其构建与应用，并制定了相应的发酵过程控制方案，有良好的工业应用前景。
本发明技术方案概述如下：
本发明提供了一株生产羟基四氢嘧啶的大肠杆菌基因工程菌，在宿主基因组上整合具有木糖诱导型启动子PxylF控制的T7噬菌体的RNA聚合酶；整合单拷贝由PT7启动子控制的伸长盐单胞菌的四氢嘧啶合成酶基因簇ectABC；单拷贝由PT7启动子控制的来自谷氨酸棒杆菌的天冬氨酸激酶突变体基因lysCcgl(G1A,C932T)；双拷贝由PT7启动子控制的来自伸长盐单胞菌的四氢嘧啶羟化酶基因ectD；敲除羟基四氢嘧啶竞争支路代谢相关基因thrA；替换磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc启动子为Ptrc启动子以增加草酰乙酸的供应；引入文献报道的糖代谢转录抑制因子突变mlc*替换原有mlc解除葡萄糖抑制作用，构建羟基四氢嘧啶合成通路；增加异柠檬酸脱氢酶编码基因icd的拷贝数以增加羟基四氢嘧啶所需前体物α-酮戊二酸的供应；整合来自BioFAB库的组成型启动子PBIOFAB启动子控制的转录调节子esaR170V，将α-酮戊二酸分解代谢途径的关键基因α-酮戊二酸脱氢酶基因sucA的原始启动子替换为PesaS启动子，整合合适强度的启动子控制信号分子酰基高丝氨酸内酯合酶基因esaI，进一步增加前体物质α-酮戊二酸的积累。
优选地，控制easI基因的启动子为Pbs1、Pbs2、Pbs3或Pbs4启动子；
更优选地，控制easI基因的启动子为Pbs3启动子；
所述编码基因Pbs3启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.12所示；
所述T7RNA聚合酶基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
所述糖代谢转录抑制因子突变mlc*，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；
所述四氢嘧啶合成酶基因簇ectABC源自伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)DSM2581，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；
所述天冬氨酸激酶突变体基因lysCcgl，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；
所述四氢嘧啶羟化酶基因ectD源自伸长盐单胞菌(H.elongata)DSM 2581，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；
所述异柠檬酸脱氢酶编码基因icd源自大肠杆菌(E.coli)W3110，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；
所述编码基因PBIOFAB启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.7所示；
所述转录调节子esaR170V源自斯图瓦提泛菌(Pantoea stewartii)DC 283，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示；
所述编码基因PesaS启动子源自斯图瓦提泛菌(P.stewartii)DC 283，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示；
所述编码基因Pbs1启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.10所示；
所述编码基因Pbs2启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.11所示；
所述编码基因Pbs4启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.13所示；
所述酰基高丝氨酸内酯合酶基因esaI源自斯图瓦提泛菌(P.stewartii)DC 283，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示。
优选地，所述基因工程菌以大肠杆菌E.coli W3110为出发菌株。
本发明还提供上述生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法，具体如下：
本发明中采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli W3110进行定向改造，具体包括如下步骤：
(1)在lacIZ基因位点上整合由木糖启动子PxylF控制的T7RNA聚合酶(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.1)。
(2)构建羟基四氢嘧啶合成通路。首先敲除天冬氨酸激酶基因thrA(Gene ID:945803)减弱羟基四氢嘧啶竞争抑制，替换磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc(GeneID:948457)启动子为Ptrc启动子以增加天冬氨酸前体物草酰乙酸的供应，引入文献(Nakashima N,Tamura T.Anew carbon catabolite repression mutation ofEscherichia coli,mlc*,and its use for producing isobutanol.Journal ofBioscience&Bioengineering,2012,114(1):38-44.)报道的糖代谢转录抑制因子突变mlc*(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.2)替换原有mlc解除葡萄糖抑制作用。同时在假基因位点ybeM(Gene ID:4056041)整合由PT7启动子控制的四氢嘧啶合成酶基因簇ectABC(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.3)；在假基因位点yghX(Gene ID:2847694)整合由PT7启动子控制的文献(Becker J,Zelder O,Hfner S,et al.From zero to hero--design-based systemsmetabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for L-lysineproduction.Metabolic Engineering,2011,13(2):159-168.)报道的天冬氨酸激酶突变体基因lysCcgl(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.4)；在基因位点trpR(Gene ID:948917)和基因位点aceA(Gene ID:948517)整合由PT7启动子控制的四氢嘧啶羟化酶基因ectD(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.5)。
(3)加强前体物质α-酮戊二酸的积累。在假基因位点yeeL(Gene ID:2847764)上整合由自身启动子控制的异柠檬酸脱氢酶编码基因icd(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.6)。
(4)动态调控α-酮戊二酸脱氢酶活性。在假基因位点yjiP(Gene ID:38094982)整合了由PBIOFAB启动子(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.7，编号apFAB104)控制的转录调节子esaR170V(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.8)，将α-酮戊二酸分解代谢途径的关键基因α-酮戊二酸脱氢酶基因sucA(Gene ID:945303)的启动子替换为PesaS启动子(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.9)，在假基因位点yjiT(Gene ID:945056)整合不同强度(Pbs1＜Pbs2＜Pbs3＜Pbs4)的Pbs启动子(核苷酸序列分别为序列表SEQ ID NO.10；序列表SEQ ID NO.11；序列表SEQ ID NO.12；序列表SEQ ID NO.13)控制的信号分子酰基高丝氨酸内酯合酶基因esaI(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.14)，进一步增加前体物质α-酮戊二酸的积累。
本发明还提供了利用上述基因工程菌摇瓶发酵生产羟基四氢嘧啶的方法：
(1)菌株活化：在无菌操作间用接种环取蘸取菌液，在固体斜面活化培养基中密集划线，放置于37℃培养箱中培养10-12h，并转划于活化斜面传代培养10-12h。
(2)种子瓶培养：在无菌操作间用接种环刮取一环菌体，接种到装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，用十二层纱布封口，在35-37℃，180-240r/min的条件下振荡培养10-12h；
(3)发酵培养：将种子液按10-15％接种量接种到发酵培养基中，在35-37℃，180-240r/min的条件下振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.8-7.2，当通过苯酚红指示剂观察到pH没有缓慢降低甚至有所升高，表明菌体缺糖，补加0.5-2mL60％(m/v)葡萄糖溶液，发酵36-48h；
摇瓶发酵36-48h后羟基四氢嘧啶产量达到13-15g/L，生产强度可达0.3-0.45g/(L×h)，而发酵液中完全检测不到四氢嘧啶。
优选的，所述斜面培养基成分为：酵母粉3-10g/L、蛋白胨5-10g/L、NaCl 3-5g/L、牛肉膏5-10g/L、蔗糖0.5-2g/L、琼脂粉15-30g/L，其余为水。
优选的，所述种子培养基成分为：葡萄糖15-25g/L，酵母粉5-10g/L，胰蛋白胨4-6g/L，KH2PO4 1.2-2.4g/L，MgSO4·7H2O 0.5-2.0g/L，FeSO4·7H2O 5-10mg/L，MnSO4·7H2O5-10mg/L，VH 0.2-2mg/L，VB1 0.1-2mg/L，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 6.8-7.2。
优选的，所述发酵培养基成分为：葡萄糖15-30g/L，木糖5-10g/L，酵母粉2-4g/L，胰蛋白胨4-6g/L，KH2PO4 1.2-2.4g/L，MgSO4·7H2O 0.5-2g/L，FeSO4·7H2O 50-100mg/L，MnSO4·7H2O 50-100mg/L，VH 0.2-2mg/L，VB1 0.1-1mg/L，苯酚红指示剂1-3％，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 6.8-7.2。
有益效果：
本发明以E.coli W3110为出发菌株，利用木糖启动子(PxylF)诱导来自T7噬菌体的RNA聚合酶基因，结合T7强启动子***对羟基四氢嘧啶合成途径中的关键基因(ectABC、ectD、lysCcgl等)进行强化，并减弱羟基四氢嘧啶竞争抑制途径，构建羟基四氢嘧啶合成途径，并过表达异柠檬酸脱氢酶编码基因icd以增加前体物α-酮戊二酸的供应，同时通过esaI/esaR群体感应线路策略对合成羟基四氢嘧啶所需的前体物质α-酮戊二酸活性进行动态调控，补充α-酮戊二酸，得到一株羟基四氢嘧啶高产菌。摇瓶发酵36-48h羟基四氢嘧啶产量达到了13-15g/L，生产强度可达0.3-0.45g/(L×h)，发酵液中完全检测不到四氢嘧啶。所构建菌株可以在不添加α-酮戊二酸的发酵条件下，实现羟基四氢嘧啶的高效合成，且无副产物四氢嘧啶的积累，具有重要的工业应用价值。
附图说明：
图1：sucA基因敲除片段构建及电泳验证图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。
图2：esaR170V基因整合片段与yjiP基因敲除片段及电泳验证图。其中：M：1kb DNAmarker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：PBIOFAB-esaR170V基因片段；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
图3：基因工程菌摇瓶发酵产量图。
其中：分别是实施例2中对照菌有无添加α-酮戊二酸(KG)发酵生产羟基四氢嘧啶，以及不同强度(Pbs1、Pbs2、Pbs3、Pbs4)的Pbs启动子控制的esaI/esaR群体感应线路工程菌无添加α-酮戊二酸发酵生产羟基四氢嘧啶。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：E.coli W3110羟基四氢嘧啶基因工程菌的构建
采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对基因进行定向改造。本发明中采用的基因编辑方法参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolic engineering of Escherichiacoli using CRISPR–Cas9 meditated genome editing.Metabolic engineering,2015,31:13-21.)进行。
该方法的具体步骤如下：
(1)pGRB质粒的构建：
使用CRISPR RGEN Tools设计专一性靶序列((PAM:5’-NGG-3’)用于切割靶基因。合成正向引物和反向互补引物后，各取10μL于PCR管中，混合均匀后通过单链DNA通过PCR退火形成双链片段。反应条件：预变性95℃，5min；退火50℃，1min。将得到的DNA片段与通过反向PCR获得的线性化pGRB载体通过同源重组连接，得到pGRB质粒。同源重组所用试剂盒为
Figure GDA0003222044360000061
ⅡOne Step Cloning Kit系列。
(2)用于替换的重叠DNA片段的构建：
敲除目的基因所需重组DNA片段为目的基因上游同源臂和下游同源臂两个片段重叠而成。整合目的基因所需重组片段为整合位点基因的上、下游同源臂和目的基因三个片段重叠而成。以待敲除基因或整合目的基因的待整合位点的上、下游序列为模板，设计上、下游同源臂引物，通常使同源臂长度在500bp左右，以待整合基因为模板，设计整合基因的扩增引物。通过PCR的方法分别扩增上下游同源臂和目的基因片段后，再经重叠PCR制备重组片段。
(3)感受态细胞的制备：
在37℃，220rpm条件下，用装有100mL2×YT培养基的三角瓶培养菌体至OD600＝0.4-0.6时进行感受态制备。当细胞内携带pREDCas9质粒时，培养温度调整至32℃，且当菌体OD600＝0.1-0.2时添加0.1M的IPTG。制备过程参照常规标准操作。
(4)pGRB质粒和重组DNA的转化：
将pGRB质粒和重叠DNA片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态细胞中。将经过电转化的菌体复苏培养2h后涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。用上游同源臂的上游引物和下游同源臂的下游引物，或设计专门的鉴定引物，进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子。
(5)质粒的消除：
将得到的阳性重组子接种至含有0.2％L-***糖和奇霉素抗性的LB摇管中，32℃培养12h左右。蘸取菌液在奇霉素抗性LB平板中三区划线，继续培养。用牙签挑取三区平板中单菌落，分别对点到含有奇霉素抗性和氨苄青霉素抗性的LB平板中，继续培养。挑选在奇霉素抗性平板中生长，在氨苄青霉素平板中不生长的菌落即为消除pGRB质粒的重组菌株。将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃培养12h左右。蘸取菌液在无抗平板中三区划线，继续培养。用牙签挑取三区平板中单菌落，分别对点到含有奇霉素抗性和无抗的LB平板中，继续培养。挑选在无抗平板中生长，在奇霉素平板中不生长的单菌落即为消除pREDas9质粒的重组菌株。
菌株构建的具体方法如下：
(1)构建羟基四氢嘧啶合成通路
以大肠杆菌(E.coli W3110)基因组为模板，根据其thrA基因的上、下游序列设计上游同源臂引物thrA-UF、thrA-UR和下游同源臂引物thrA-DF、thrA-DR，先通过PCR得到其上、下游同源臂，再通过重叠PCR的方法获得重叠片段(thrA-U—thrA-D)。通过gRNA搜索工具(http://www.rgenome.net/cas-designer)查找合适的gRNA序列，合成gRNA-thrA-S与gRNA-thrA-A序列，通过PCR退火将两条单链引物互补配对以得到双链gRNA-thrA，将其与pGRB线性化载体同源重组得到pGRB-thrA。将重叠片段和pGRB-thrA电转化至含有pREDCas9载体的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用菌落PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-thrA，最终获得成功敲除thrA的阳性菌株。
以大肠杆菌(E.coli W3110)基因组为模板，根据其ybeM基因的上、下游序列设计上游同源臂引物ybeM-UF、ybeM-UR和下游同源臂引物ybeM-DF、ybeM-DR，以伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)基因组为模板，根据其ectABC基因的序列设计引物，启动子PT7则设计在ybeM基因上游同源臂的下游引物和ectABC基因的上游引物中，先通过PCR得到其上下游同源臂(ybeM-U、ybeM-D)及目的基因(PT7-ectABC)，再通过重叠PCR的方法获得重叠片段(ybeM-U—PT7-ectABC—ybeM-D)。通过gRNA搜索工具(http://www.rgenome.net/cas-designer)查找合适的gRNA序列，合成gRNA-ybeM-S与gRNA-ybeM-A序列，通过PCR退火将两条单链引物互补配对以得到双链gRNA-ybeM，将其与pGRB线性化载体同源重组得到pGRB-ybeM。将重叠片段和pGRB-ybeM电转化至含有pREDCas9载体的成功敲除thrA的阳性转化子感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用菌落PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-ybeM，最终获得成功敲除ybeM基因并整合PT7-ectABC的阳性菌株。
以同样的方法在基因位点lacIZ上整合PxylF-T7RNAP，在假基因位点yghX上整合PT7-lysCcgl、在基因位点trpR和aceA上整合PT7-ectD，在基因位点ppc敲除ppc后整合Ptrc-ppc，用文献报道的突变基因mlc*替换mlc基因。构建并强化羟基四氢嘧啶合成通路获得阳性转化子。
(2)加强前体物质α-酮戊二酸的积累
以大肠杆菌(E.coli W3110)基因组为模板，根据其yeeL基因的上、下游序列设计上游同源臂引物yeeL-UF、yeeL-UR和下游同源臂引物yeeL-DF、yeeL-DR，以大肠杆菌(E.coli W3110)基因组为模板，根据其icd基因的序列设计引物，设计上游同源臂引物icd-F和下游同源臂引物icd-R，先通过PCR得到其上下游同源臂(yeeL-U、yeeL-D)及目的基因(icd)，再通过重叠PCR的方法获得重叠片段(yeeL-U—icd—yeeL-D)。通过gRNA搜索工具(http://www.rgenome.net/cas-designer)查找合适的gRNA序列，合成gRNA-yeeL-S与gRNA-yeeL-A序列，通过PCR退火将两条单链引物互补配对以得到双链gRNA-yeeL，将其与pGRB线性化载体同源重组得到pGRB-yeeL。将重叠片段和pGRB-yeeL电转化至含有pREDCas9载体的步骤(1)获得的阳性转化子感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用菌落PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yeeL，最终获得成功敲除yeeL基因并整合icd的阳性菌株。
(3)动态调控α-酮戊二酸脱氢酶活性
以大肠杆菌(E.coli W3110)基因组为模板，根据其sucA基因的上、下游序列设计上游同源臂引物sucA-UF-1、sucA-UR-1和下游同源臂引物sucA-DF-1、sucA-DR-1，先通过PCR得到其上、下游同源臂，再通过重叠PCR的方法获得重叠片段(sucA-U—sucA-D)。通过gRNA搜索工具(http://www.rgenome.net/cas-designer)查找合适的gRNA序列，合成gRNA-sucA-S与gRNA-sucA-A序列，通过PCR退火将两条单链引物互补配对以得到双链gRNA-sucA，将其与pGRB线性化载体同源重组得到pGRB-sucA。将重叠片段和pGRB-sucA电转化至含有pREDCas9载体的步骤(2)获得的阳性转化子感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用菌落PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-sucA，获得成功敲除sucA的阳性菌株。
sucA基因敲除重叠片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图1。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂637bp；2：下游同源臂525bp；3：重叠片段1119bp；4：原菌对照2531bp；5：阳性菌鉴定片段1119bp。
以大肠杆菌(E.coli W3110)基因组为模板，根据其yjiP基因的上、下游序列设计上游同源臂引物yjiP-UF、yjiP-UR和下游同源臂引物yjiP-DF、yjiP-DR，以大肠杆菌(E.coli W3110)基因组为模板，根据其esaR170V基因的序列设计引物，将来自BioFAB库(apFAB104)的组成型启动子PBioFAB则设计在yjiP基因上游同源臂的下游引物和esaR170V基因的上游引物中，先通过PCR得到其上下游同源臂(yjiP-U、yjiP-D)及目的基因(PBioFAB-esaR170V)，再通过重叠PCR的方法获得重叠片段(yjiP-U—PBioFAB-esaR170V—yjiP-D)。通过gRNA搜索工具(http://www.rgenome.net/cas-designer)查找合适的gRNA序列，合成gRNA-yjiP-S与gRNA-yjiP-A序列，通过PCR退火将两条单链引物互补配对以得到双链gRNA-yjiP，将其与pGRB线性化载体同源重组得到pGRB-yjiP。将重叠片段和pGRB-yjiP电转化至含有pREDCas9载体的上步构建的敲除sucA阳性转化子感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用菌落PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yjiP，获得成功敲除yjiP基因并整合PBioFAB-esaR170V的阳性菌株。
以同样的方法在基因位点sucA上整合PesaS-sucA；在假基因位点yjiT(Gene ID:945056)整合由文献报道(Yang S,Liu Q,Zhang Y,et al.Construction andCharacterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology.AcsSynthetic Biology,2017:287)的不同强度(Pbs1＜Pbs2＜Pbs3＜Pbs4)的Pbs启动子控制的信号分子酰基高丝氨酸内酯合酶基因esaI，动态调控α-酮戊二酸脱氢酶活性，最终获得esaI/esaR群体感应线路的阳性菌株。
yjiP位点esaR170V基因整合重叠片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂530bp；2：下游同源臂482bp；3：目的基因839bp；4：重叠片段1780bp；5：原菌对照2055bp；6：阳性菌鉴定片段1780bp。
表1菌株构建过程中所涉及的引物
Figure GDA0003222044360000091
Figure GDA0003222044360000101
Figure GDA0003222044360000111
实施例2：利用实施例1中步骤(2)获得的敲除yeeL基因并整合icd的羟基四氢嘧啶基因工程菌摇瓶发酵生产羟基四氢嘧啶的方法
(1)活化斜面培养：用接种环从-80℃冰箱保菌管中接种1-2环菌种，均匀涂布于斜面培养基中，37℃培养12h，转接到第二代斜面培养基中，37℃培养12h；
(2)种子瓶培养：用接种环将斜面上的菌体接种到装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中用于制备种子液，三角瓶使用十二层纱布封口，在37℃，220r/min的条件下振荡培养12h；
(3)发酵培养：将种子液按10％接种量接种到装有发酵培养基的500mL挡板瓶中，使其终体积为30mL，使用十二层纱布封口，在37℃，180r/min的条件下振荡培养，发酵0h添加0.4mL 55％(m/v)α-酮戊二酸。发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.8-7.2，当通过苯酚红指示剂观察到pH没有缓慢降低甚至有所升高，表明菌体缺糖，补加1mL 60％(m/v)葡萄糖溶液。摇瓶发酵36h后羟基四氢嘧啶产量可达14.68g/L，最高生产强度可达0.41g/(L×h)，羟基四氢嘧啶产量和DCW如图3(Control+KG)所示。
斜面培养基成分为：酵母粉3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 3g/L、牛肉膏5g/L、蔗糖0.5g/L、琼脂粉15g/L，其余为水。
种子培养基成分为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，胰蛋白胨6g/L，KH2PO4 1.2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·7H2O 10mg/L，VH 0.2mg/L，VB11.3mg/L，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 7.0。
发酵培养基成分为：葡萄糖20g/L，木糖10g/L(发酵0h添加)，α-酮戊二酸7.3g/L(发酵0h添加)，酵母粉2g/L，胰蛋白胨4g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O100mg/L，MnSO4·7H2O 100mg/L，VH 0.2mg/L，VB1 0.8mg/L，苯酚红指示剂1-3％，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 7.0。
同时设置不添加α-酮戊二酸的Control组，其余实验条件同上，摇瓶发酵36h后羟基四氢嘧啶产量可达13.06g/L。
实施例3：利用esaI/esaR群体感应线路工程菌摇瓶发酵生产羟基四氢嘧啶的方法
(1)活化斜面培养：用接种环从-80℃冰箱保菌管中接种1-2环菌种，均匀涂布于斜面培养基中，37℃培养12h，转接到第二代斜面培养基中，37℃培养12h；
(2)种子瓶培养：用接种环将斜面上的菌体接种到装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中用于制备种子液，三角瓶使用十二层纱布封口，在37℃，220r/min的条件下振荡培养12h；
(3)发酵培养：将种子液按10％接种量接种到装有发酵培养基的500mL挡板瓶中，使其终体积为30mL，使用十二层纱布封口，在37℃，180r/min的条件下振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.8-7.2，当通过苯酚红指示剂观察到pH没有缓慢降低甚至有所升高，表明菌体缺糖，补加1mL 60％(m/v)葡萄糖溶液。如图3所示，Pbs3启动子控制的esaI/esaR群体感应线路工程菌发酵36h后产量达到14.93g/L，生产强度可达0.41g/(L×h)。在不添加α-酮戊二酸的发酵条件下，实现羟基四氢嘧啶的高效合成，且无副产物四氢嘧啶的积累。
通过实施例3与实施例2的发酵结果对比(图3)，表明群体感应***可有效调控细胞内α-酮戊二酸的下游代谢，使细胞内合成的α-酮戊二酸有效用于羟基四氢嘧啶的合成，从而避免了通过补料方式额外添加，降低了生产成本，减少了操作的复杂性。同时，羟基四氢嘧啶的产量更高，且没有四氢嘧啶副产物积累。
斜面培养基成分为：酵母粉3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 3g/L、牛肉膏5g/L、蔗糖0.5g/L、琼脂粉15g/L，其余为水。
种子培养基成分为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，胰蛋白胨6g/L，KH2PO4 1.2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·7H2O 10mg/L，VH 0.2mg/L，VB11.3mg/L，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 7.0。
发酵培养基成分为：葡萄糖20g/L，木糖10g/L(发酵0h添加)，酵母粉2g/L，胰蛋白胨4g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 100mg/L，MnSO4·7H2O 100mg/L，VH0.2mg/L，VB1 0.8mg/L，苯酚红指示剂1-3％，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 7.0。
实施例4：利用esaI/esaR群体感应线路工程菌摇瓶发酵生产羟基四氢嘧啶的方法
(1)菌株活化：在无菌操作间用接种环取蘸取菌液，在固体斜面活化培养基中密集划线，放置于37℃培养箱中培养10h，并转划于活化斜面传代培养12h。
(2)种子瓶培养：在无菌操作间用接种环刮取一环菌体，接种到装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，用十二层纱布封口，在35℃，200r/min的条件下振荡培养12h；
(3)发酵培养：将种子液按10％接种量接种到发酵培养基中，在35℃，200r/min的条件下振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.8-7.2，当通过苯酚红指示剂观察到pH没有缓慢降低甚至有所升高，表明菌体缺糖，补加0.5mL 60％(m/v)葡萄糖溶液。Pbs3启动子控制的esaI/esaR群体感应线路工程菌摇瓶发酵40h后羟基四氢嘧啶产量达到14.2g/L，生产强度可达0.355g/(L×h)，而发酵液中完全检测不到四氢嘧啶。
斜面培养基成分为：酵母粉3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 3g/L、牛肉膏5g/L、蔗糖0.5g/L、琼脂粉15g/L，其余为水。
种子培养基成分为：葡萄糖15g/L，酵母粉5g/L，胰蛋白胨4g/L，KH2PO4 1.2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，MnSO4·7H2O 5mg/L，VH 1mg/L，VB1 1mg/L，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 6.8。
发酵培养基成分为：葡萄糖15g/L，木糖10g/L，酵母粉2g/L，胰蛋白胨4g/L，KH2PO41.2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 50mg/L，MnSO4·7H2O 50mg/L，VH 0.2mg/L，VB1 0.5mg/L，苯酚红指示剂1-3％，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 7.0。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 一种生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其应用
<130> 1
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2652
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli ）BL21
<400> 1
atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60
ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120
catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180
gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240
atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300
acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360
accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420
atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480
cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540
gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600
tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660
attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720
tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780
ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840
attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900
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gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320
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ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500
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gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620
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attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800
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ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggcttacggg 1920
tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980
tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040
atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100
tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160
aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220
aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280
attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340
aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400
aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460
gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520
gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580
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gcgttcgcgt aa 2652
<210> 2
<211> 1301
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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gaaaatatag ggagtatgcg gtggttgctg aaaaccagcc tgggcacatt gatcaaataa 120
agcagaccaa cgcgggcgcg gtttatcgcc tgattgatca gcttggtcca gtctcgcgta 180
tcgatctttc ccgtctggcg caactggctc ctgccagtat cactaaaatt gtccgtgaga 240
tgctcgaagc acacctggtg caagagctgg aaatcaaaga agcggggaac cgtggccgtc 300
cggcggtggg gctggtggtt gaaactgaag cctggcacta tctttctctg cgcattagtc 360
gcggggagat tttccttgct ctgcgcgatc tgagcagcaa actggtggtg gaagagtcgc 420
aggaactggc gttaaaagat gacttgccat tgctggatcg tattatttcc catatcgatc 480
agttttttat ccgccaccag aaaaaacttg agcgtctaac ttcgattgcc ataaccttgc 540
cgggaattat tgatacggaa aatggtattg tacatcgcat gccgttctac gaggatgtaa 600
aagagatgcc gctcggcgag gcgctggagc agcataccgg cgttccggtt tatattcagc 660
atgatatcag cgcatggacg atggcagagg ccttgtttgg tgcctcacgc ggggcgcgcg 720
atgtgattca ggtggttatc gatcacaacg tgggggcggg cgtcattacc gatggtcatc 780
tgctacacgc aggcagcagt agtctcgtgg aaataggcca cacacaggtc gacccgtatg 840
ggaaacgctg ttattgcggg aatcacggct gcctcgaaac catcgccagc gtggacagta 900
ttcttgagct ggcacagctg cgtcttaatc aatccatgag ctcgatgtta catggacaac 960
cgttaaccgt ggactcattg tgtcaggcgg cattgcgcgg cgatctactg gcaaaagaca 1020
tcattaccgg ggtgggcgcg catgtcgggc gcattcttgc catcatggtg aatttattta 1080
acccacaaaa aatactgatt ggctcaccgt taagtaaagc ggcagatatc ctcttcccgg 1140
tcatctcaga cagcatccgt cagcaggccc ttcctgcgta tagtcagcac atcagcgttg 1200
agagtactca gttttctaac cagggcacga tggcaggcgc tgcactggta aaagacgcga 1260
tgtataacgg ttctttgttg attcgtctgt tgcagggtta a 1301
<210> 3
<211> 2433
<212> DNA
<213> 伸长盐单胞菌（Halomonas elongata）DSM 2581
<400> 3
atgaacgcaa ccacagagcc ctttacaccc tccgccgacc tggccaagcc cagcgtggcc 60
gatgccgtgg tcggccatga ggcctcaccg ctcttcatcc gcaagccaag ccccgatgac 120
ggctggggca tctacgagct ggtcaagtcc tgtccgcctc tcgacgtcaa ttccgcctac 180
gcctatctgt tgctggccac ccagttccgc gatagctgcg ccgtggcgac caacgaagag 240
ggcgagatcg tcggcttcgt ttccggctac gtgaagagca acgcccccga tacctatttc 300
ctctggcagg ttgccgtggg cgagaaggca cgtggcaccg gcctggcccg tcgtctggtg 360
gaagccgtga tgacacgccc ggaaatggcc gaggtccacc atctcgagac cactatcacg 420
cccgacaacc aggcgtcctg gggcttgttc cgccgtctcg ccgatcgctg gcaggcgccg 480
ttgaacagcc gcgaatactt ctccaccgat caactcggcg gtgagcatga cccggaaaac 540
ctcgttcgca tcggcccgtt ccagaccgac cagatctgag ccgggacgcc gcctggccgg 600
cccggtacgg gccggcaacc cgtcttttcg ttttatcact ttccccccac aggaggtcgc 660
aatgcagacc cagattctcg aacgcatgga gtccgacgtt cggacctact cccgctcctt 720
cccggtcgtc ttcaccaagg cgcgcaatgc ccgcctgacc gacgaggaag ggcgcgagta 780
catcgacttc ctggccggtg ccggcaccct gaactacggc cacaacaacc cgcacctcaa 840
gcaggcgctg ctcgactata tcgacagcga cggcatcgtc cacggcctgg acttctggac 900
tgcggccaag cgcgactatc tggaaaccct ggaagaggtg atcctcaagc cgcgcggtct 960
cgactacaag gtgcatctgc ccggaccgac tggcaccaac gccgtcgagg cggccattcg 1020
cctggcccgg gtcgccaagg ggcgccacaa tatcgtctcc ttcaccaacg gctttcatgg 1080
cgtcaccatg ggcgcgctgg cgaccaccgg taaccgcaag ttccgcgagg ccaccggtgg 1140
cgtgccgacc caggctgctt ccttcatgcc gttcgatggc tacctcggca gcagcaccga 1200
caccctcgac tacttcgaga agctgctcgg cgacaagtcc ggcggcctgg acgtgcccgc 1260
ggcggtgatc gtcgagacag tgcagggcga gggcggtatc aatgtcgccg gcctggagtg 1320
gctcaagcgc ctcgagagca tctgccgcgc caatgacatc ctgctgatca tcgacgacat 1380
ccaggcgggc tgcggccgga ccggcaagtt cttcagcttc gagcatgccg gcatcacgcc 1440
ggatatcgtg accaactcca agtcgctgtc cggttacggc ctgccgttcg ctcacgtcct 1500
gatgcgcccc gagctcgaca agtggaagcc cggtcagtac aacggcacct tccgcggctt 1560
caacctggct ttcgccactg ctgctgccgc catgcgcaag tactggagcg acgacacctt 1620
cgagcgtgac gtgcagcgca aggctcgcat cgtcgaggaa cgcttcggca agatcgccgc 1680
ctggctgagc gagaacggca tcgaggcctc cgagcgcggc cgcgggctga tgcggggcat 1740
cgacgtgggt tccggcgata tcgccgacaa gatcacccac caagccttcg agaacgggtt 1800
gatcatcgaa accagcggtc aggacggcga agtggtcaag tgcctgtgcc cgctgaccat 1860
tcccgacgaa gacctggtcg agggactcga catcctcgag accagcacca agcaggcctt 1920
tagctgatcg cctgaggtgc gccatcgggc ctgtccatgg catcctgtat cggtcggccg 1980
tgcgcggccg gccagtcatt gattcactgg agaatcgaca tgatcgttcg caatctcgaa 2040
gaagcgcgcc agaccgaccg tctggtcacc gccgaaaacg gcaactggga cagcacccgc 2100
ctgtcgctgg ccgaagatgg tggcaactgc tccttccaca tcacccgcat cttcgagggt 2160
accgagaccc acatccacta taagcatcac ttcgaggctg tttattgcat cgaaggcgag 2220
ggcgaagtgg aaaccctggc cgatggcaag atctggccca tcaagccggg tgacatctac 2280
atcctcgacc agcacgacga gcacctgctg cgcgccagca agaccatgca cctggcctgc 2340
gtgttcacgc cgggcctgac cggcaacgaa gtgcaccgcg aagacggttc ctacgcacct 2400
gccgacgaag ccgacgacca gaagccgctg taa 2433
<210> 4
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc atcttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
<210> 5
<211> 999
<212> DNA
<213> 伸长盐单胞菌（H. elongata） DSM 2581
<400> 5
atgtcagtgc agacatcgtc caaccgaccg ctgccacaag cgaacctgca tatcgccacg 60
gagacacccg aggccgacag ccggatccgt agcgcgccgc gtccggggca ggatccctat 120
ccgacccgac tgagcgagcc gctggatctt ccctggctca atcgccgcga gccggtggtc 180
aagggagagg aggccgatgg gccgctctcg gccgcgcagc tcgatacctt cgagcgccag 240
ggcttcatct tcgagccgga cttcctgaaa ggcgaggaac tcgaggcgtt gcgccacgaa 300
ctcaacgccc tgctggcccg ggatgacttc cgcggacgag acttcgccat caccgagccg 360
cagggcaacg agatccgctc gctgttcgcg gtgcactacc tgtcgcgagt cttcagccgc 420
ctggccaacg acgaacgcct gatgggtcgc gcccggcaga ttctcggcgg cgagccctat 480
gtccatcagt cgcgcatcaa ctacaagccc ggcttcgagg gcaagggctt caattggcat 540
tccgattttg aaacctggca cgccgaggat ggcatgcccg ccatgcatgc ggtgagtgcg 600
tccatcgtgc tgaccgacaa ccacaccttc aacgggccgc tgatgctggt gcccggctca 660
caccgggtat tcgtgccgtg cctgggtgaa acgccggagg atcatcaccg gcagtcgctc 720
aagacccagg aattcggcgt gccgagccgc caggcgctgc gcgagttgat cgaccgacat 780
ggtatcgaag cgcccaccgg cgcggcgggt ggcctgctgc tgttcgactg caataccctg 840
cacggctcca acgccaacat gtcgccggat ccgcgcagca acgccttttt cgtctacaac 900
cgtcgtgaca accgctgcgt cgaaccttat gcggcctcca agcgccgccc gcgcttcctg 960
gcccacgagc cggatgaggc gtggtcgccg gatggctga 999
<210> 6
<211> 1251
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli ）W3110
<400> 6
atggaaagta aagtagttgt tccggcacaa ggcaagaaga tcaccctgca aaacggcaaa 60
ctcaacgttc ctgaaaatcc gattatccct tacattgaag gtgatggaat cggtgtagat 120
gtaaccccag ccatgctgaa agtggtcgac gctgcagtcg agaaagccta taaaggcgag 180
cgtaaaatct cctggatgga aatttacacc ggtgaaaaat ccacacaggt ttatggtcag 240
gacgtctggc tgcctgctga aactcttgat ctgattcgtg aatatcgcgt tgccattaaa 300
ggtccgctga ccactccggt tggtggcggt attcgctctc tgaacgttgc cctgcgccag 360
gaactggatc tctacatctg cctgcgtccg gtacgttact atcagggcac tccaagcccg 420
gttaaacacc ctgaactgac cgatatggtt atcttccgtg aaaactcgga agacatttat 480
gcgggtatcg aatggaaagc agactctgcc gacgccgaga aagtgattaa attcctgcgt 540
gaagagatgg gggtgaagaa aattcgcttc ccggaacatt gtggtatcgg tattaagccg 600
tgttcggaag aaggcaccaa acgtctggtt cgtgcagcga tcgaatacgc aattgctaac 660
gatcgtgact ctgtgactct ggtgcacaaa ggcaacatca tgaagttcac cgaaggagcg 720
tttaaagact ggggctacca gctggcgcgt gaagagtttg gcggtgaact gatcgacggt 780
ggcccgtggc tgaaagttaa aaacccgaac actggcaaag agatcgtcat taaagacgtg 840
attgctgatg cattcctgca acagatcctg ctgcgtccgg ctgaatatga tgttatcgcc 900
tgtatgaacc tgaacggtga ctacatttct gacgccctgg cagcgcaggt tggcggtatc 960
ggtatcgccc ctggtgcaaa catcggtgac gaatgcgccc tgtttgaagc cacccacggt 1020
actgcgccga aatatgccgg tcaggacaaa gtaaatcctg gctctattat tctctccgct 1080
gagatgatgc tgcgccacat gggttggacc gaagcggctg acttaattgt taaaggtatg 1140
gaaggcgcaa tcaacgcgaa aaccgtaacc tatgacttcg agcgtctgat ggatggcgct 1200
aaactgctga aatgttcaga gtttggtgac gcgatcatcg aaaacatgta a 1251
<210> 7
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tcgacataaa gtctaaccta taggatactt acagccatca attcattaaa gaggagaaag 60
gatcc 65
<210> 8
<211> 753
<212> DNA
<213> 斯图瓦提泛菌（Pantoea stewartia ）DC 283
<400> 8
atgttttctt ttttccttga aaatcaaaca ataacggata cgcttcagac ttacatacag 60
agaaagttat ctccgctggg tagtccggat tacgcttaca ctgttgtgag caaaaaaaat 120
ccttcaaatg ttctgattat ttccagttat cctgacgaat ggattaggtt ataccgcgct 180
aacaactttc agctgaccga tccggttatt ctcacggcct ttaaacgcac ctcgccgttt 240
gcctgggatg agaatattac gctgatgtcc gacctgcggt tcaccaaaat tttctcttta 300
tccaagcaat acaacatcgt taacggcttt acctatgtcc tgcatgacca catgaacaac 360
cttgctctgt tgtccgtgat cattaaaggc aacgatcaga ctgcgctgga gcaacgcctt 420
gctgccgaac agggcacgat gcagatgctg ctgattgatt ttaacgagca gatgtaccgc 480
ctggccggta ccgaaggcga gcgagccccg gcgttaaatc agagcgcgga caaaacgata 540
ttttcctcgc gtgaaaatga ggtgttgtac tgggcgagta tgggcaaaac ctatgctgag 600
attgccgcta ttacgggcat ttctgtgagt accgtgaagt ttcacatcaa gaatgtggtc 660
gtgaaactgg gcgtcagtaa cgcccgacag gctatcagac tgggtgtaga actggatctt 720
atcagaccgg cagcgtcagc ggccaggtag tga 753
<210> 9
<211> 184
<212> DNA
<213> 斯图瓦提泛菌（P. stewartia ）DC 283
<400> 9
gctcacaaca gtgtaagcgt atccgttatt gtttgatttt caaggaaaaa agaaaacatt 60
caggctccat gctgcttctt ttacttaacg tggacttaac ctgcactata gtacaggcaa 120
gatgatactt aagagtaact tacaatgaat cattcagagg ttacaatggc ttcagttgtt 180
tagc 184
<210> 10
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggcgcgccct aatttgacag tagaattagc atgtgatata ataaaataat ttttactacc 60
caagcttata aaagagcact gttgggcgtg agtggaggcg ccggaggagg aaaaa 115
<210> 11
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggcgcgccgt agattgacac cctctgtagc atgtgatata ataaatttta tattctaccc 60
aagcttataa aagagcactg ttgggcgtga gtggaggcgc cggaggagga aaaa 114
<210> 12
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggcgcgccgt tagttgacac ttagcctagc atgtgatata attatgttat ttatctaccc 60
aagcttataa aagagcactg ttgggcgtga gtggaggcgc cggaggagga aaaa 114
<210> 13
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggcgcgcccc tccttgacac tgaatttagc atgtgatata attaacttaa tattctaccc 60
aagcttataa aagagcactg ttgggcgtga gtggaggcgc cggaggagga aaaa 114
<210> 14
<211> 698
<212> DNA
<213> 斯图瓦提泛菌（P. stewartia） DC 283
<400> 14
aagcttgtaa aatcagtgca ggataaccgc gagggccgca gtaactttta agaggaaatg 60
gaatgcttga actgtttgac gtcagttacg aagaactgca aaccacccgt tcagaagaac 120
tttataaact tcgcaagaaa acatttagcg atcgtctggg atgggaagtc atttgcagtc 180
agggaatgga gtccgatgaa tttgatgggc ccggtacacg ttatattctg ggaatctgcg 240
aaggacaatt agtgtgcagc gtacgtttta ccagcctcga tcgtcccaac atgatcacgc 300
acacttttca gcactgcttc agtgatgtca ccctgcccgc ctatggtacc gaatccagcc 360
gtttttttgt cgacaaagcc cgcgcacgtg cgctgttagg tgagcactac cctatcagcc 420
aggtcctgtt tttagcgatg gtgaactggg cgcaaaataa tgcctacggc aatatctata 480
cgattgtcag ccgcgcgatg ttgaaaattc tcactcgctc tggctggcaa atcaaagtca 540
ttaaagaggc tttcctgacc gaaaaggaac gtatctattt gctgacgctg ccagcaggtc 600
aggatgacaa gcagcaactc ggtggtgatg tggtgtcacg tacgggctgt ccgcccgtcg 660
cagtcactac ctggccgctg acgctgccgg tctgataa 698

Claims (6)

1.一株生产羟基四氢嘧啶的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，是在宿主基因组上整合木糖诱导型启动子PxylF控制的T7噬菌体的RNA聚合酶；整合单拷贝由PT7启动子控制的四氢嘧啶合成酶基因簇ectABC；整合单拷贝由PT7启动子控制的天冬氨酸激酶基因lysC cgl ；整合双拷贝由PT7启动子控制的四氢嘧啶羟化酶基因ectD；敲除羟基四氢嘧啶竞争支路代谢相关基因thrA；替换磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc启动子为Ptrc启动子；糖代谢转录抑制因子突变体mlc*替换原有mlc；整合单拷贝异柠檬酸脱氢酶编码基因icd；整合PBIOFAB启动子控制的转录调节子esaR170V；将α-酮戊二酸脱氢酶基因sucA的原始启动子替换为PesaS启动子；整合信号分子酰基高丝氨酸内酯合酶基因esaI获得的；
所述T7噬菌体的RNA聚合酶，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示；
所述糖代谢转录抑制因子突变体mlc*，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示；
所述四氢嘧啶合成酶基因簇ectABC，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 3所示；
所述天冬氨酸激酶基因lysC cgl ，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 4所示；
所述四氢嘧啶羟化酶基因ectD，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 5所示；
所述异柠檬酸脱氢酶编码基因icd，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 6所示；
所述PBIOFAB启动子，核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO. 7所示；
所述转录调节子esaR170V，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 8所示；
所述PesaS启动子，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 9所示；
所述酰基高丝氨酸内酯合酶基因esaI，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 14所示。
2.如权利要求1所述的一株生产羟基四氢嘧啶的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，esaI基因的启动子为Pbs1、Pbs2、Pbs3或Pbs4启动子；
所述Pbs1启动子，核苷酸序列为序列表 SEQ ID NO. 10所示；
所述Pbs2启动子，核苷酸序列为序列表 SEQ ID NO. 11所示；
所述Pbs3启动子，核苷酸序列为序列表 SEQ ID NO. 12所示；
所述Pbs4启动子，核苷酸序列为序列表 SEQ ID NO. 13所示。
3.如权利要求1所述的一株生产羟基四氢嘧啶的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大肠杆菌E. coli W3110为宿主菌株。
4.权利要求1-3任一所述工程菌在生产羟基四氢嘧啶中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵生产羟基四氢嘧啶的方法，具体如下：
将种子液按10-15%接种量接种到发酵培养基中，在35-37℃，180-240 r/min的条件下振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.8-7.2，当通过苯酚红指示剂观察到pH没有缓慢降低甚至有所升高，表明菌体缺糖，补加0.5-2mL 60%葡萄糖溶液，发酵36-48h。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，发酵培养基成分为：葡萄糖15-30 g/L，木糖5-10 g/L，酵母粉2-4 g/L，胰蛋白胨4-6 g/L，KH2PO4 1.2-2.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.5-2 g/L，FeSO4·7H2O 50-100 mg/L，MnSO4·7H2O 50-100 mg/L，VH 0.2-2 mg/L，VB1 0.1-1 mg/L，苯酚红指示剂1-3%，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 6.8-7.2。
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