CN117683802B - 一种通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株及其构建与生产方法 - Google Patents
一种通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株及其构建与生产方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株及其构建与生产方法。本发明通过表达甲基苹果酸合酶基因建立甲基苹果酸途径合成异亮氨酸；通过改造内源N‑乙酰葡糖胺转运***实现菌株对葡萄糖的转运代谢；通过表达支链氨基酸外泌蛋白基因实现异亮氨酸在发酵液中的累积。通过调节辅酶平衡、解除反馈抑制、敲除代谢旁路、采用补料上罐发酵显著提升工程菌株通过甲基苹果酸途径合成异亮氨酸的生产能力。工程菌株以葡萄糖作为唯一碳源，发酵36小时的异亮氨酸产量为857 mg/L，以CO2作为唯一碳源，发酵25天的异亮氨酸产量为105 mg/L。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株及其构建与生产方法。
背景技术
异亮氨酸属于支链氨基酸，是人体必需氨基酸之一。由于不能自主合成，只能靠外源食物获取，因此异亮氨酸的市场需求量十分巨大。异亮氨酸作为蛋白质合成的前体物可直接参与肌肉修复、氧化供能等代谢过程，在食品中补充异亮氨酸可强化营养成分，在肝脏快速转化为葡萄糖防止肌肉损伤，协同促进胰岛素分泌调节血糖，提高食品营养价值。在饲料中补充异亮氨酸添加剂，可调整饲料的氨基酸平衡，降低饲料蛋白质水平，促进低蛋白日粮的应用。异亮氨酸还能作为信号分子参与血糖调节，通过mTOR信号通路调控机体代谢和激素分泌，可促进机体细胞增殖与蛋白合成，增加免疫力；通过调节肠道菌群减少脂质氧化产物，强化机体的氧化应激的耐受力。因此异亮氨酸具有广阔的应用前景。
相较于其他氨基酸，异亮氨酸合成水平相对较低。受限于异亮氨酸分子内的两个手性碳原子，通过化学合成法很难得到构象单一的高纯度异亮氨酸。目前主要通过谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌的微生物发酵法实现高纯度异亮氨酸的工业生产。近些年的研究通过传统的育种和基因工程手段优化生产菌株的代谢通路，将增强底物转运、碳源流向控制、解除反馈抑制等方法逐渐应用于高产菌株的构建之中，使异亮氨酸的发酵产量有所提升。但无论是在谷氨酸棒状杆菌还是在大肠杆菌中，传统的微生物合成异亮氨酸过程均需通过苏氨酸途径。苏氨酸途径中存在六种氨基酸合成旁路以及五种具有反馈调节位点的限速催化酶，复杂的代谢通路和调控网络限制了代谢工程调控苏氨酸途径合成的异亮氨酸的生产效率，依靠传统改造手段难以实现技术突破。因此寻找全新底盘生物，探究异亮氨酸高效合成新策略，才能更进一步提高异亮氨酸的发酵产率，解决异亮氨酸工业生产的瓶颈问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株。
本发明的再一目的是提供一种构建通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株的方法。
本发明的另一个目的是提供一种利用罗尔斯通氏菌工程菌株发酵生产异亮氨酸的方法。
根据本发明的构建通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株的方法，所述构建方法包括以下步骤：
改造野生型罗尔斯通氏菌菌株的内源N-乙酰葡糖胺转运***，实现工程菌株对葡萄糖的利用，其中，所述改造野生型罗尔斯通氏菌菌株的内源N-乙酰葡糖胺转运***的步骤包括：将野生型罗尔斯通氏菌菌株的基于磷酸转移酶***的N-乙酰葡糖胺转运蛋白基因nagE的第793位碱基从G突变为C，突变后的N-乙酰葡糖胺转运蛋白基因nagE的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，并敲除所述N-乙酰葡糖胺转运蛋白的转录调节蛋白基因nagR，所述转录调节蛋白基因nagR的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
表达甲基苹果酸合酶基因cimA与支链氨基酸外泌蛋白基因ygaZ和ygaH，实现罗尔斯通氏菌通过甲基苹果酸途径合成并分泌异亮氨酸，所述甲基苹果酸合酶基因cimA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述支链氨基酸外泌蛋白基因ygaZ的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示，所述支链氨基酸外泌蛋白基因ygaH的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
根据本发明的构建通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株的方法，其中，所述方法进一步包括以下步骤：
敲除罗尔斯通氏菌菌株的内源聚羟基丁酸酯合成基因phaC1、phaA和phaB1，其中，所述聚羟基丁酸酯合成基因phaC1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述聚羟基丁酸酯合成基因phaA的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述聚羟基丁酸酯合成基因phaB1的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
进一步过表达所述甲基苹果酸合酶基因cimA。
根据本发明的构建通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株的方法，其中，所述方法进一步包括以下步骤：
敲除乳酸合成基因ldhA1、ldhA2，并表达NADPH依赖的乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC、NADPH辅酶依赖性的支链氨基转移酶基因ilvE，其中，所述乳酸合成基因ldhA1的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述乳酸合成基因ldhA2的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，所述乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，所述NADPH辅酶依赖性的支链氨基转移酶基因ilvE的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；
敲除乳酸合成基因ldh，并表达失去反馈调节位点的乙酰羟酸合酶基因ilvB、ilvN，所述乳酸合成基因ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述乙酰羟酸合酶基因ilvB的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，所述乙酰羟酸合酶基因ilvN的核苷酸序列如SEQID NO：15所示。
根据本发明的通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株，所述罗尔斯通氏菌工程菌株为具有以下改造特征的野生型罗尔斯通氏菌菌株：
具有核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的突变后的N-乙酰葡糖胺转运蛋白基因nagE；
内源N-乙酰葡糖胺转运蛋白的转录调节蛋白基因nagR被敲除，所述转录调节蛋白基因nagR的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
具有外源甲基苹果酸合酶基因cimA与支链氨基酸外泌蛋白基因ygaZ和ygaH，其中，所述甲基苹果酸合酶基因cimA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述支链氨基酸外泌蛋白基因ygaZ的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述支链氨基酸外泌蛋白基因ygaH的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
根据本发明的通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株，其中，所述罗尔斯通氏菌工程菌株进一步具有以下改造特征：
内源聚羟基丁酸酯合成基因phaC1、phaA和phaB1被敲除，其中，所述聚羟基丁酸酯合成基因phaC1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述聚羟基丁酸酯合成基因phaA的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述聚羟基丁酸酯合成基因phaB1的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
具有过表达的所述甲基苹果酸合酶基因cimA。
根据本发明的通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株，其中，所述罗尔斯通氏菌工程菌株进一步具有以下改造特征：
内源乳酸合成基因ldhA1、ldhA2被敲除，并表达NADPH依赖的乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC、NADPH辅酶依赖性的支链氨基转移酶基因ilvE，其中，所述乳酸合成基因ldhA1、 ldhA2的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，所述NADPH辅酶依赖性的支链氨基转移酶基因ilvE的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；
内源乳酸合成基因ldh被敲除，并表达失去反馈调节位点的乙酰羟酸合酶基因ilvB、ilvN，所述乳酸合成基因ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述乙酰羟酸合酶基因ilvB的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，所述乙酰羟酸合酶基因ilvN的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；
过表达所述cimA基因的罗尔斯通氏菌。
罗尔斯通氏菌有三个乳酸脱氢酶基因，分别为ldh、ldhA1、ldhA2，其中ldhA1和ldhA2在罗尔斯通氏菌基因组上相邻，两者相隔仅680 bp，且两者的DNA序列完全一致。
根据本发明的通过甲基苹果酸途径发酵生产异亮氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：使用上述通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株在培养基中发酵，获得异亮氨酸。
根据本发明的通过甲基苹果酸途径发酵生产异亮氨酸的方法，其中，培养基的配方为15.14 g/L Na2HPO4·12H2O，3 g/L KH2PO4，5 g/L (NH4)2SO4，300 mg/L NaHCO3，80 mg/L MgSO4·7H2O，10 mg/L 柠檬酸铁，2 mg/L CaCl2，1.2 mg/L NiSO4·7H2O，1 mg/L CaSO4，1mg/L ZnSO4·7H2O，0.6 mg/L CoCl2·6H2O，0.6 mg/L H3BO3，0.44 mg/L MnSO4·H2O，0.4mg/L Na2MoO4·2H2O，0.4 mg/L CuSO4·5H2O。
根据本发明的通过甲基苹果酸途径发酵生产异亮氨酸的方法，其中，利用葡萄糖作为唯一碳源进行异养发酵，葡萄糖的初始浓度为30 g/L，当初始葡萄糖消耗完毕后，通过蠕动泵补料控制葡萄糖浓度低于15 g/L，其中所述补料为500 g/L葡萄糖。
根据本发明的通过甲基苹果酸途径发酵生产异亮氨酸的方法，其中利用CO2作为唯一碳源在封闭容器内进行自养发酵，封闭容器内每24小时置换新鲜混合气体，其中所述混合气体的成分及比例为H2：O2：CO2=8：1：1。
本发明首次将甲基苹果酸途径应用于代谢工程改造中，利用罗尔斯通氏菌工程菌株的碳代谢特点，实现以葡萄糖或CO2作为唯一碳源生物合成异亮氨酸的过程。进一步利用调节辅酶平衡、解除反馈抑制、敲除代谢旁路、采用补料上罐发酵等方法显著提升工程菌株通过甲基苹果酸途径合成异亮氨酸的生产能力，葡萄糖异养发酵异亮氨酸的转化产量达到857 mg/L，CO2自养发酵异亮氨酸的转化产量达到105 mg/L。
附图说明
图1显示了本发明实施例1中提供的罗尔斯通氏菌工程菌株Cn102、CnIle1与CnIle2摇瓶发酵葡萄糖生产异亮氨酸的结果；
图2显示了本发明实施例2中提供的罗尔斯通氏菌工程菌株CnIle2、CnIle3与CnIle4摇瓶发酵葡萄糖生产异亮氨酸的结果；
图3显示了本发明实施例3中提供的罗尔斯通氏菌工程菌株CnIle4与CnIle5摇瓶发酵葡萄糖生产异亮氨酸的结果；
图4为本发明实施例4中提供的罗尔斯通氏菌工程菌株CnIle4与CnIle5发酵罐发酵葡萄糖生产异亮氨酸的结果图；
图5为本发明实施例5中提供的罗尔斯通氏菌工程菌株CnIle4与CnIle5自养发酵CO2生产异亮氨酸的结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
表1本发明各实施例中构建的罗尔斯通氏菌工程菌株列表
| 菌株 | 构建过程 |
| 罗尔斯通氏菌 | 野生菌株 |
| 罗尔斯通氏菌-Cn101 | 源自野生菌株，点突变基因组中nagE(G793C) |
| 罗尔斯通氏菌-Cn102 | 源自Cn101，nagR基因敲除菌株 |
| 罗尔斯通氏菌-CnIle1 | 源自Cn102，基因组整合表达cimA基因 |
| 罗尔斯通氏菌-CnIle2 | 源自CnIle1，基因组整合表达ygaZ、ygaH基因 |
| 罗尔斯通氏菌-CnIle3 | 源自CnIle2，phaC1AB1基因敲除菌株 |
| 罗尔斯通氏菌-CnIle4 | 源自CnIle3，质粒过表达cimA基因 |
| 罗尔斯通氏菌-CnIle3+1 | 源自CnIle3，替换基因组ldhA1、ldhA2基因为ilvE、ilvC基因 |
| 罗尔斯通氏菌-CnIle3+2 | 源自CnIle3+1，替换基因组ldh基因为ilvB、ilvN基因 |
| 罗尔斯通氏菌-CnIle5 | 源自CnIle3+2，质粒过表达cimA基因 |
如以上表1所示，本申请的具体实施例通过以下措施提高罗尔斯通氏菌的异亮氨酸的产量：
第一，通过改造基因组中的N-乙酰葡糖胺转运***、向基因组中整合甲基苹果酸合酶基因cimA和支链氨基酸外泌蛋白基因ygaZ、ygaH，在罗尔斯通氏菌中构建了甲基苹果酸途径并实现了从葡萄糖到异亮氨酸的生产过程；第二，通过敲除基因组中的聚羟基丁酸酯合成基因phaC1、phaA、phaB1和质粒过表达甲基苹果酸合酶基因cimA，增加甲基苹果酸途径的碳代谢流，提高了罗尔斯通氏菌工程菌株通过甲基苹果酸途径合成异亮氨酸的生产能力；第三，通过敲除乳酸合成基因ldh、ldhA1、ldhA2向基因组中整合NADPH依赖的乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC、支链氨基转移酶基因ilvE、失去反馈调节位点的乙酰羟酸合酶基因ilvB、ilvN，在减少副产物、平衡辅酶与解除反馈调节的共同作用下，进一步提高罗尔斯通氏菌工程菌株通过甲基苹果酸途径合成异亮氨酸生产能力；第四，在提高接种量、采用补料方式、并控制pH和溶氧水平的发酵条件下，通过加快菌株的生长与代谢过程，再次提高了罗尔斯通氏菌工程菌株通过甲基苹果酸途径合成异亮氨酸的生产能力；第五，在使用CO2作为唯一碳源的自养发酵条件下，本发明构建的罗尔斯通氏菌工程菌株仍具有通过甲基苹果酸途径合成异亮氨酸的生产能力。
实施例1构建通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株
一、构建罗尔斯通氏菌-Cn101菌株
将带有nagE点突变位点及其上下游同源臂的pK18mobsacB质粒转化至大肠杆菌S17-1中间宿主中，通过接合转移过程转化至罗尔斯通氏菌野生型菌株中，先后利用抗生素筛选和蔗糖诱导完成单交换和双交换菌株筛选，获得点突变基因组中nagE(G793C)的罗尔斯通氏菌-Cn101菌株（表1）。具体方法如下：
1. 构建带有nagE基因突变位点及其上下游同源臂的pK18mobsacB质粒
在罗尔斯通氏菌基因组中nagE基因突变位上下游各选取约500 bp，设计扩增引物对nagE-up-F（SEQ ID NO：16）/nagE-up-R（SEQ ID NO：17）和nagE-down-F（SEQ ID NO：18）/nagE-down-R（SEQ ID NO：19）扩增罗尔斯通氏菌基因组，获得上下游同源臂，通过overlapPCR将各片段连接后，通过Gibson组装整合至限制性核酸内切酶EcoRI、SmaI双酶切的线性化质粒pK18mobsacB。重组体系转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，使用LB卡那霉素抗性平板筛选。挑取阳性克隆并进行LB液体培养。提取质粒并利用M13-47（SEQ ID NO：20）/RV-M（SEQ ID NO：21）引物对进行PCR验证，目的片段为1136 bp。将成功构建的质粒命名为pK18-nagE(G793C)。
2. 构建罗尔斯通氏菌-Cn101菌株
将pK18-nagE(G793C)质粒电转化至大肠杆菌S17-1感受态中，通过LB卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子进行LB液体培养。将罗尔斯通氏菌野生型菌株进行LB液体培养。富集菌体后按照罗尔斯通氏菌：大肠杆菌=2：1的比例混合菌体，滴至无抗性LB平板中30 ℃培养24 h进行接合转移，通过卡那霉素和庆大霉素双抗性LB平板筛选阳性转化子并进行LB液体培养，稀释涂布至含5%蔗糖的LB平板进行诱导，使用引物nagE-up-testF（SEQ ID NO：22）/nagE-down-testR（SEQ ID NO：23）对转化子进行PCR验证并测序，获得罗尔斯通氏菌-Cn101菌株。
二、构建罗尔斯通氏菌-Cn102菌株
将带有nagR基因上下游同源臂的pK18mobsacB质粒转化至大肠杆菌S17-1中间宿主中，通过接合转移过程转化至罗尔斯通氏菌-Cn101菌株中，先后利用抗生素筛选和蔗糖诱导完成单交换和双交换菌株筛选，获得nagR基因敲除的罗尔斯通氏菌-Cn102菌株（表1），此时菌株具有代谢葡萄糖的能力。具体方法如下：
1. 构建带有nagR基因上下游同源臂的pK18mobsacB质粒
在罗尔斯通氏菌基因组中nagR基因上下游各选取约500 bp，设计扩增引物对nagR-up-F（SEQ ID NO：24）/nagR-up-R（SEQ ID NO：25）和nagR-down-F（SEQ ID NO：26）/nagR-down-R（SEQ ID NO：27）扩增罗尔斯通氏菌基因组，获得上下游同源臂，通过overlapPCR将各片段连接后，通过Gibson组装整合至限制性核酸内切酶EcoRI、SmaI双酶切的线性化质粒pK18mobsacB。重组体系转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，使用LB卡那霉素抗性平板筛选。挑取阳性克隆并进行LB液体培养。提取质粒并利用M13-47/RV-M引物对进行PCR验证，目的片段为1160 bp。将成功构建的质粒命名为pK18-ΔnagR。
2. 构建罗尔斯通氏菌-Cn102菌株
将pK18-ΔnagR质粒电转化至大肠杆菌S17-1感受态中，通过LB卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子进行LB液体培养。将罗尔斯通氏菌-Cn101菌株进行LB液体培养。富集菌体后按照罗尔斯通氏菌：大肠杆菌=2：1的比例混合菌体，滴至无抗性LB平板中30 ℃培养24 h进行接合转移，通过卡那霉素和庆大霉素双抗性LB平板筛选阳性转化子并进行LB液体培养，稀释涂布至含5%蔗糖的LB平板进行诱导，使用引物nagR-uup-F（SEQ ID NO：28）/nagR-ddown-R（SEQ ID NO：29）对转化子进行PCR验证，成功敲除nagR基因的PCR产物大小为1283bp，获得罗尔斯通氏菌-Cn102菌株。
三、构建罗尔斯通氏菌-CnIle1菌株
将带有PphaC1启动子，cimA基因及上下游同源臂的pK18mobsacB质粒转化至大肠杆菌S17-1中间宿主中，通过接合转移过程转化至罗尔斯通氏菌-Cn102菌株中，先后利用抗生素筛选和蔗糖诱导完成单交换和双交换菌株筛选，获得基因组整合表达cimA基因的罗尔斯通氏菌-CnIle1菌株（表1），此时菌株具有通过甲基苹果酸途径代谢葡萄糖合成异亮氨酸的能力。具体方法如下：
1. 构建带有PphaC1启动子，cimA基因及上下游同源臂的pK18mobsacB质粒
在罗尔斯通氏菌基因组中phaR基因上下游各选取约500 bp，设计扩增引物对phaR-up-F（SEQ ID NO：30）/phaR-up-R（SEQ ID NO：31）和phaR-down-F（SEQ ID NO：32）/phaR-down-R（SEQ ID NO：33）扩增罗尔斯通氏菌基因组，获得上下游同源臂；设计引物对PphaC1-phaR-F（SEQ ID NO：34）/PphaC1-phaR-R（SEQ ID NO：35）扩增通过罗尔斯通氏菌基因组，获得PphaC1启动子片段；设计引物对cimA-phaR-F（SEQ ID NO：36）/cimA-phaR-R（SEQID NO：37）扩增cimA基因（人工合成的经过密码子优化的cimA基因，其核苷酸序列详见SEQID NO：1），获得cimA基因片段；overlap PCR将各片段连接后，通过Gibson组装整合至限制性核酸内切酶EcoRI、SmaI双酶切的线性化质粒pK18mobsacB。重组体系转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，使用LB卡那霉素抗性平板筛选。挑取阳性克隆并进行LB液体培养。提取质粒并利用M13-47/RV-M引物对进行PCR验证，目的片段为2706 bp。将成功构建的质粒命名为pK18-cimA。
2. 构建罗尔斯通氏菌-CnIle1菌株
将pK18-cimA质粒电转化至大肠杆菌S17-1感受态中，通过LB卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子进行LB液体培养。将罗尔斯通氏菌-Cn102菌株进行LB液体培养。富集菌体后按照罗尔斯通氏菌：大肠杆菌=2：1的比例混合菌体，滴至无抗性LB平板中30 ℃培养24 h进行接合转移，通过卡那霉素和庆大霉素双抗性LB平板筛选阳性转化子并进行LB液体培养，稀释涂布至含5%蔗糖的LB平板进行诱导，使用引物phaR-uup-F（SEQ ID NO：38）/phaR-ddown-R（SEQ ID NO：39）对转化子进行PCR验证，成功整合cimA基因的PCR产物大小为2751bp，获得罗尔斯通氏菌-CnIle1菌株。
四、构建罗尔斯通氏菌-CnIle2菌株
将带有PphaC1启动子，ygaZ、ygaH基因及上下游同源臂的pK18mobsacB质粒转化至大肠杆菌S17-1中间宿主中，通过接合转移过程转化至罗尔斯通氏菌-CnIle1菌株中，先后利用抗生素筛选和蔗糖诱导完成单交换和双交换菌株筛选，获得基因组整合表达ygaZ、ygaH基因的罗尔斯通氏菌-CnIle2菌株（表1），此时菌株具有通过甲基苹果酸途径合成并分泌异亮氨酸的能力。具体方法如下：
1. 构建带有PphaC1启动子，ygaZ、ygaH基因及上下游同源臂的pK18mobsacB质粒
在罗尔斯通氏菌基因组中H16-A2005基因上下游各选取约500 bp，设计扩增引物对A2005-up-F（SEQ ID NO：40）/A2005-up-R（SEQ ID NO：41）和A2005-down-F（SEQ ID NO：42）/A2005-down-R（SEQ ID NO：43）扩增罗尔斯通氏菌基因组，获得上下游同源臂；设计引物对PphaC1-A2005-F（SEQ ID NO：44）/PphaC1-A2005-R（SEQ ID NO：45）扩增通过罗尔斯通氏菌基因组，获得PphaC1启动子片段；设计引物对ygaZH-F（SEQ ID NO：46）/ygaZH-R（SEQ IDNO：47）扩增ygaZ、ygaH基因（人工合成的经过密码子优化的ygaZ、ygaH基因，编码支链氨基酸外泌蛋白，氨基酸序列来源于大肠杆菌，其核苷酸序列详见SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3），获得ygaZH基因片段；overlap PCR将各片段连接后，通过Gibson组装整合至限制性核酸内切酶EcoRI、SmaI双酶切的线性化质粒pK18mobsacB。重组体系转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，使用LB卡那霉素抗性平板筛选。挑取阳性克隆并进行LB液体培养。提取质粒并利用M13-47/RV-M引物对进行PCR验证，目的片段为2639 bp。将成功构建的质粒命名为pK18-ygaZH。
2. 构建罗尔斯通氏菌-CnIle2菌株
将pK18-ygaZH质粒电转化至大肠杆菌S17-1感受态中，通过LB卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子进行LB液体培养。将罗尔斯通氏菌-CnIle1菌株进行LB液体培养。富集菌体后按照罗尔斯通氏菌：大肠杆菌=2：1的比例混合菌体，滴至无抗性LB平板中30 ℃培养24 h进行接合转移，通过卡那霉素和庆大霉素双抗性LB平板筛选阳性转化子并进行LB液体培养，稀释涂布至含5%蔗糖的LB平板进行诱导，使用引物A2005-uup-F（SEQ ID NO：48）/A2005-ddown-R（SEQ ID NO：49）对转化子进行PCR验证，成功整合cimA基因的PCR产物大小为2782 bp，获得罗尔斯通氏菌-CnIle2菌株。
五、工程菌株Cn102，CnIle1及CnIle2的摇瓶发酵实验
将上述罗尔斯通氏菌-Cn102，CnIle1及CnIle2分别接种到40 mL LB培养基中，30℃、200 r/min过夜培养，作为一级种子液。测定一级种子液OD600，根据相应比例转接种于50mL添加30 g/L葡萄糖的培养基中（100 mL锥形瓶），使初始OD600约为0.05，其中所述培养基的配方为：15.14 g/L Na2HPO4·12H2O，3 g/L KH2PO4，5 g/L (NH4)2SO4，300 mg/L NaHCO3，80 mg/L MgSO4·7H2O，10 mg/L 柠檬酸铁，2 mg/L CaCl2，1.2 mg/L NiSO4·7H2O，1 mg/LCaSO4，1 mg/L ZnSO4·7H2O，0.6 mg/L CoCl2·6H2O，0.6 mg/L H3BO3，0.44 mg/L MnSO4·H2O，0.4 mg/L Na2MoO4·2H2O，0.4 mg/L CuSO4·5H2O。发酵在30 ℃，200 r/min摇床中共进行120 h。每隔24 h取样，使用岛津公司AJS-01氨基酸分析方法包通过高效液相色谱的紫外检测器分离并测定培养基中异亮氨酸的浓度。如图1所示，罗尔斯通氏菌-CnIle2的发酵液中异亮氨酸最高产量为56 mg/L。结果表明，通过表达甲基苹果酸合酶基因cimA和支链氨基酸外泌蛋白基因ygaZ、ygaH，及改造罗尔斯通氏菌基因组中的N-乙酰葡糖胺转运***，成功实现了罗尔斯通氏菌以葡萄糖作为碳源，通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸。
实施例2 通过敲除聚羟基丁酸酯合成基因和增加甲基苹果酸合酶基因的表达强度，提高罗尔斯通氏菌工程菌株的异亮氨酸生产能力
一、构建罗尔斯通氏菌-CnIle3菌株
将带有phaC1、phaA、phaB1基因上下游同源臂的pK18mobsacB质粒转化至大肠杆菌S17-1中间宿主中，通过接合转移过程转化至罗尔斯通氏菌-CnIle2菌株中，先后利用抗生素筛选和蔗糖诱导完成单交换和双交换菌株筛选，获得phaC1、phaA、phaB1基因敲除的罗尔斯通氏菌-CnIle3菌株（表1），增加异亮氨酸的生产能力。具体方法如下：
1. 构建带有phaC1、phaA、phaB1基因上下游同源臂的pK18mobsacB质粒
在罗尔斯通氏菌基因组中phaC1、phaA、phaB1基因上下游各选取约500 bp，设计扩增引物对PHB-up-F（SEQ ID NO：50）/PHB-up-R（SEQ ID NO：51）和PHB-down-F（SEQ ID NO：52）/PHB-down-R（SEQ ID NO：53）扩增罗尔斯通氏菌基因组，获得上下游同源臂，通过overlap PCR将各片段连接后，通过Gibson组装整合至限制性核酸内切酶EcoRI、SmaI双酶切的线性化质粒pK18mobsacB。重组体系转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，使用LB卡那霉素抗性平板筛选。挑取阳性克隆并进行LB液体培养。提取质粒并利用M13-47/RV-M引物对进行PCR验证，目的片段为1001 bp。将成功构建的质粒命名为pK18-ΔphaC1AB1。
2. 构建罗尔斯通氏菌-CnIle3菌株
将pK18-ΔphaC1AB1质粒电转化至大肠杆菌S17-1感受态中，通过LB卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子进行LB液体培养。将罗尔斯通氏菌-CnIle2菌株进行LB液体培养。富集菌体后按照罗尔斯通氏菌：大肠杆菌=2：1的比例混合菌体，滴至无抗性LB平板中30 ℃培养24 h进行接合转移，通过卡那霉素和庆大霉素双抗性LB平板筛选阳性转化子并进行LB液体培养，稀释涂布至含5%蔗糖的LB平板进行诱导，使用引物PHB-uup-F（SEQ ID NO：54）/PHB-ddown-R（SEQ ID NO：55）对转化子进行PCR验证，成功敲除phaC1、phaA、phaB1基因的PCR产物大小为1325 bp，获得罗尔斯通氏菌-CnIle3菌株。
二、构建罗尔斯通氏菌-CnIle4菌株
将带有PphaC1启动子和cimA基因的pBBR1-MCS2质粒电转化至罗尔斯通氏菌-CnIle3菌株中，利用抗生素完成转化筛选，获得质粒过表达cimA基因的罗尔斯通氏菌-CnIle4菌株（表1），增加异亮氨酸的生产能力。具体方法如下：
1. 构建带有PphaC1启动子和cimA基因的pBBR1-MCS2质粒
设计引物对PphaC1-cimA-F（SEQ ID NO：56）/PphaC1-cimA-R（SEQ ID NO：57）扩增通过罗尔斯通氏菌基因组，获得PphaC1启动子片段；设计引物对cimA-F（SEQ ID NO：58）/cimA-R（SEQ ID NO：59）扩增cimA基因（人工合成的经过密码子优化的cimA基因，其核苷酸序列详见SEQ ID NO：1），获得cimA基因片段；overlap PCR将各片段连接后，通过Gibson组装整合至限制性核酸内切酶EcoRI、NdeI双酶切的线性化质粒pBBR1-MCS2。重组体系转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，使用LB卡那霉素抗性平板筛选。挑取阳性克隆并进行LB液体培养。提取质粒并利用M13F（SEQ ID NO：60）/M13R（SEQ ID NO：61）引物对进行PCR验证，目的片段为1591 bp。将成功构建的质粒命名为pBBR1-cimA。
2. 构建罗尔斯通氏菌-CnIle4菌株
将罗尔斯通氏菌-CnIle3菌株进行LB液体培养，在4 ℃离心，用10%甘油重悬浓缩菌体3次，最终用10%甘油重悬菌体至OD600约60-80，制备罗尔斯通氏菌感受态。使用2 mm电转杯将600 ng pBBR1-cimA质粒电转化至100 μL罗尔斯通氏菌感受态细胞中，加入1 mL无抗性LB液体，30 ℃ 200 r/min孵育2 h后，通过LB卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，利用M13F/M13R引物对转化子进行PCR验证，成功质粒过表达cimA基因的PCR产物大小为1591bp，获得罗尔斯通氏菌-CnIle4菌株。
三、罗尔斯通氏菌-CnIle2、罗尔斯通氏菌-CnIle3及罗尔斯通氏菌-CnIle4的摇瓶发酵实验
将上述罗尔斯通氏菌-CnIle2、罗尔斯通氏菌-CnIle3及罗尔斯通氏菌-CnIle4分别接种到40 mL LB（CnIle4的培养基含卡那霉素）培养基中，30 ℃、200 r/min过夜培养，作为一级种子液。测定一级种子液OD600，根据相应比例转接种于50 mL添加30 g/L葡萄糖的培养基中（100 mL锥形瓶），使初始OD600约为0.05，其中所述培养基的配方为：15.14 g/LNa2HPO4·12H2O，3 g/L KH2PO4，5 g/L (NH4)2SO4，300 mg/L NaHCO3，80 mg/L MgSO4·7H2O，10 mg/L 柠檬酸铁，2 mg/L CaCl2，1.2 mg/L NiSO4·7H2O，1 mg/L CaSO4，1 mg/L ZnSO4·7H2O，0.6 mg/L CoCl2·6H2O，0.6 mg/L H3BO3，0.44 mg/L MnSO4·H2O，0.4 mg/L Na2MoO4·2H2O，0.4 mg/L CuSO4·5H2O（CnIle4的培养基含卡那霉素）。发酵在30 ℃，200 r/min摇床中共进行120 h。每隔24 h取样，使用岛津公司AJS-01氨基酸分析方法包通过高效液相色谱的紫外检测器分离并测定培养基中异亮氨酸的浓度。如图2所示，将罗尔斯通氏菌-CnIle2的phaC1、phaA、phaB1基因敲除后，罗尔斯通氏菌-CnIle3的发酵液中异亮氨酸最高产量从56 mg/L显著提升至114 mg/L；再对罗尔斯通氏菌-CnIle3中质粒过表达cimA基因后，罗尔斯通氏菌-CnIle4的发酵液中异亮氨酸最高产量进一步从114 mg/L显著提升至248 mg/L。结果表明，通过敲除聚羟基丁酸酯合成基因phaC1、phaA、phaB1和过表达甲基苹果酸合酶基因cimA，均成功提高了罗尔斯通氏菌工程菌株的异亮氨酸生产能力。
实施例3 通过敲除乳酸合成基因并表达NADPH依赖的乙酰羟酸异构还原酶基因，支链氨基转移酶基因，失去反馈调节位点的乙酰羟酸合酶基因，进一步提高罗尔斯通氏菌工程菌株的异亮氨酸生产能力
一、构建罗尔斯通氏菌-CnIle3+1菌株
将带有PphaC1启动子，ilvC，ilvE基因及ldhA1、ldhA2基因上下游同源臂的pK18mobsacB质粒转化至大肠杆菌S17-1中间宿主中，通过接合转移过程转化至罗尔斯通氏菌-CnIle3菌株中，先后利用抗生素筛选和蔗糖诱导完成单交换和双交换菌株筛选，获得替换基因组ldhA1、ldhA2基因为ilvC、ilvE基因的罗尔斯通氏菌-CnIle3+1菌株（表1），增加异亮氨酸的生产能力。具体方法如下：
1. 构建带有PphaC1启动子，ilvC，ilvE基因及ldhA1、ldhA2基因上下游同源臂的pK18mobsacB质粒
在罗尔斯通氏菌基因组中ldhA1、ldhA2基因上下游各选取约600 bp，设计扩增引物对ldhA1A2-up-F（SEQ ID NO：62）/ldhA1A2-up-R（SEQ ID NO：63）和ldhA1A2-down-F（SEQID NO：64）/ldhA1A2-down-R（SEQ ID NO：65）扩增罗尔斯通氏菌基因组，获得上下游同源臂；设计引物对PphaC1-ilvCE-F（SEQ ID NO：66）/PphaC1-ilvCE-R（SEQ ID NO：67）扩增通过罗尔斯通氏菌基因组，获得PphaC1启动子片段；设计引物对ilvC-F（SEQ ID NO：68）/ilvC-R（SEQ ID NO：69）扩增大肠杆菌-MG1655基因组中的ilvC基因（编码具有NADPH辅酶依赖性的乙酰羟酸异构还原酶，其核苷酸序列详见SEQ ID NO：12），获得ilvC基因片段；设计引物对ilvE-F（SEQ ID NO：70）/ilvE-R（SEQ ID NO：71）扩增大肠杆菌-MG1655基因组中的ilvE基因（编码具有NADPH辅酶依赖性的支链氨基转移酶，其核苷酸序列详见SEQ ID NO：13），获得ilvE基因片段；overlap PCR将各片段连接后，通过Gibson组装整合至限制性核酸内切酶EcoRI、SmaI双酶切的线性化质粒pK18mobsacB。重组体系转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，使用LB卡那霉素抗性平板筛选。挑取阳性克隆并进行LB液体培养。提取质粒并利用M13-47/RV-M引物对进行PCR验证，目的片段为4063 bp。将成功构建的质粒命名为pK18-ldhA12-ilvCE。
2. 构建罗尔斯通氏菌-CnIle3+1菌株
将pK18-ldhA12-ilvCE质粒电转化至大肠杆菌S17-1感受态中，通过LB卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子进行LB液体培养。将罗尔斯通氏菌-CnIle3菌株进行LB液体培养。富集菌体后按照罗尔斯通氏菌：大肠杆菌=2：1的比例混合菌体，滴至无抗性LB平板中30 ℃培养24 h进行接合转移，通过卡那霉素和庆大霉素双抗性LB平板筛选阳性转化子并进行LB液体培养，稀释涂布至含5%蔗糖的LB平板进行诱导，使用引物ldhA1A2-uup-F（SEQ ID NO：72）/ldhA1A2-ddown-R（SEQ ID NO：73）对转化子进行PCR验证，成功敲除乳酸合成基因ldhA1、ldhA2并表达NADPH依赖的乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC、支链氨基转移酶基因ilvE的PCR产物大小为4063 bp，获得罗尔斯通氏菌-CnIle3+1菌株。
二、构建罗尔斯通氏菌-CnIle3+2菌株
将带有PphaC1启动子，ilvB、ilvN基因及ldh基因上下游同源臂的pK18mobsacB质粒转化至大肠杆菌S17-1中间宿主中，通过接合转移过程转化至罗尔斯通氏菌-CnIle3+1菌株中，先后利用抗生素筛选和蔗糖诱导完成单交换和双交换菌株筛选，获得替换基因组ldh基因为ilvB、ilvN基因的罗尔斯通氏菌-CnIle3+2菌株（表1），增加异亮氨酸的生产能力。具体方法如下：
1. 构建带有PphaC1启动子，ilvB、ilvN基因及ldh基因上下游同源臂的pK18mobsacB质粒
在罗尔斯通氏菌基因组中ldh基因上下游各选取约600 bp，设计扩增引物对ldh-up-F（SEQ ID NO：74）/ldh-up-R（SEQ ID NO：75）和ldh-down-F（SEQ ID NO：76）/ldh-down-R（SEQ ID NO：77）扩增罗尔斯通氏菌基因组，获得上下游同源臂；设计引物对PphaC1-ilvBN-F（SEQ ID NO：78）/PphaC1-ilvBN-R（SEQ ID NO：79）扩增通过罗尔斯通氏菌基因组，获得PphaC1启动子片段；设计引物对ilvBN-F（SEQ ID NO：80）/ilvBN-R（SEQ ID NO：81）扩增合成的ilvB、ilvN基因（编码乙酰羟酸合酶基因，谷氨酸棒状杆菌来源，已突变失去反馈调节位点，其核苷酸序列详见SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15），获得ilvBN基因片段；overlapPCR将各片段连接后，通过Gibson组装整合至限制性核酸内切酶EcoRI、SmaI双酶切的线性化质粒pK18mobsacB。重组体系转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，使用LB卡那霉素抗性平板筛选。挑取阳性克隆并进行LB液体培养。提取质粒并利用M13-47/RV-M引物对进行PCR验证，目的片段为4123 bp。将成功构建的质粒命名为pK18-ldh-ilvBN。
2. 构建罗尔斯通氏菌-CnIle3+2菌株
将pK18-ldh-ilvBN质粒电转化至大肠杆菌S17-1感受态中，通过LB卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子进行LB液体培养。将罗尔斯通氏菌-CnIle3+1菌株进行LB液体培养。富集菌体后按照罗尔斯通氏菌：大肠杆菌=2：1的比例混合菌体，滴至无抗性LB平板中30 ℃培养24 h进行接合转移，通过卡那霉素和庆大霉素双抗性LB平板筛选阳性转化子并进行LB液体培养，稀释涂布至含5%蔗糖的LB平板进行诱导，使用引物ldh-uup-F（SEQ ID NO：82）/ldh2-ddown-R（SEQ ID NO：83）对转化子进行PCR验证，成功敲除乳酸合成基因ldh并表达失去反馈调节位点的乙酰羟酸合酶基因ilvB、ilvN的PCR产物大小为4140 bp，获得罗尔斯通氏菌-CnIle3+2菌株。
三、构建罗尔斯通氏菌-CnIle5菌株
将pBBR1-cimA质粒电转化至罗尔斯通氏菌-CnIle3+2菌株中，利用抗生素完成转化筛选，获得质粒过表达cimA基因的罗尔斯通氏菌-CnIle5菌株（表1），进一步增加异亮氨酸的生产能力。具体方法如下：
将罗尔斯通氏菌-CnIle3+2菌株进行LB液体培养，在4 ℃离心，用10%甘油重悬浓缩菌体3次，最终用10%甘油重悬菌体至OD600约60-80，制备罗尔斯通氏菌感受态。使用2 mm电转杯将600 ng 实施例2中构建的pBBR1-cimA质粒电转化至100 μL罗尔斯通氏菌感受态细胞中，加入1 mL无抗性LB液体，30 ℃ 200 r/min孵育2 h后，通过LB卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，利用M13F/M13R引物对转化子进行PCR验证，成功质粒过表达cimA基因的PCR产物大小为1591 bp，获得罗尔斯通氏菌-CnIle5菌株。
四、工程菌株CnIle4及CnIle5的摇瓶发酵实验
将上述罗尔斯通氏菌-CnIle4及CnIle5分别接种到40 mL LB（含卡那霉素）培养基中，30 ℃、200 r/min过夜培养，作为一级种子液。测定一级种子液OD600，根据相应比例转接种于50 mL添加30 g/L葡萄糖的培养基中（100 mL锥形瓶），使初始OD600约为0.05，其中所述培养基的配方为：15.14 g/L Na2HPO4·12H2O，3 g/L KH2PO4，5 g/L (NH4)2SO4，300 mg/LNaHCO3，80 mg/L MgSO4·7H2O，10 mg/L 柠檬酸铁，2 mg/L CaCl2，1.2 mg/L NiSO4·7H2O，1mg/L CaSO4，1 mg/L ZnSO4·7H2O，0.6 mg/L CoCl2·6H2O，0.6 mg/L H3BO3，0.44 mg/LMnSO4·H2O，0.4 mg/L Na2MoO4·2H2O，0.4 mg/L CuSO4·5H2O，200 mg/L卡那霉素。发酵在30 ℃，200 r/min摇床中共进行120 h。每隔24 h取样，使用岛津公司AJS-01氨基酸分析方法包通过高效液相色谱的紫外检测器分离并测定培养基中异亮氨酸的浓度。如图3所示，将罗尔斯通氏菌-CnIle4的乳酸合成基因ldh、ldhA1、ldhA2敲除并表达NADPH依赖的乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC，支链氨基转移酶基因ilvE，失去反馈调节位点的乙酰羟酸合酶基因ilvB、ilvN基因后，罗尔斯通氏菌-CnIle5的发酵液中异亮氨酸最高产量从248 mg/L显著提升至483 mg/L。结果表明，通过敲除乳酸合成基因ldh、ldhA1、ldhA2并表达NADPH依赖的乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC，支链氨基转移酶基因ilvE，失去反馈调节位点的乙酰羟酸合酶基因ilvB、ilvN，可进一步显著提高罗尔斯通氏菌工程菌株的异亮氨酸生产能力。
实施例4 罗尔斯通氏菌工程菌株在发酵罐中通过甲基苹果酸途径异养发酵葡萄糖生产异亮氨酸
将构建的通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌-CnIle4和罗尔斯通氏菌-CnIle5分别在3 L发酵罐中进行异养发酵，通过采用补料上罐发酵提高罗尔斯通氏菌工程菌株通过甲基苹果酸途径合成异亮氨酸的生产能力。具体方法如下：
首先，分别将罗尔斯通氏菌-CnIle4和罗尔斯通氏菌-CnIle5工程菌株接种到40mL LB（含卡那霉素）培养基中，30 ℃、200 r/min过夜培养，作为一级种子液。将一级种子液全部接种于4 L LB（含卡那霉素）培养基中，在37 ℃、200 r/min条件下培养24 h，作为二级种子液。测定二级种子液OD600，根据相应比例浓缩菌体并接种到含有2 L添加30 g/L葡萄糖的培养基中（3 L发酵罐），使初始OD600约为5。其中所述培养基的配方为：15.14 g/LNa2HPO4·12H2O，3 g/L KH2PO4，5 g/L (NH4)2SO4，300 mg/L NaHCO3，80 mg/L MgSO4·7H2O，10 mg/L 柠檬酸铁，2 mg/L CaCl2，1.2 mg/L NiSO4·7H2O，1 mg/L CaSO4，1 mg/L ZnSO4·7H2O，0.6 mg/L CoCl2·6H2O，0.6 mg/L H3BO3，0.44 mg/L MnSO4·H2O，0.4 mg/L Na2MoO4·2H2O，0.4 mg/L CuSO4·5H2O，200 mg/L卡那霉素。发酵过程温度维持在30 ℃，pH通过自动补充氨水维持在6.7，电机转速偶联控制溶氧水平在10%-30%。当初始葡萄糖消耗完毕后，通过蠕动泵补料控制葡萄糖浓度低于15 g/L，其中所述补料为500 g/L葡萄糖。每隔12 h取样，发酵共进行84 h，使用岛津公司AJS-01氨基酸分析方法包通过高效液相色谱的紫外检测器分离并测定培养基中异亮氨酸的浓度。如图4所示，在提高接种量、采用补料方式、并控制pH和溶氧水平的发酵罐中，培养基内累积异亮氨酸浓度最高的时间从摇瓶发酵的120 h显著缩短至36 h，罗尔斯通氏菌-CnIle4通过甲基苹果酸途径生产的异亮氨酸产量从摇瓶发酵248 mg/L显著提升至627 mg/L，罗尔斯通氏菌-CnIle5通过甲基苹果酸途径生产的异亮氨酸产量从摇瓶发酵483 mg/L显著提升至857 mg/L。结果表明，在发酵罐中提高接种量、采用补料方式、并控制pH和溶氧水平的发酵条件下，罗尔斯通氏菌工程菌株可通过甲基苹果酸途径异养发酵葡萄糖生产异亮氨酸，且异亮氨酸的产量与生产效率相比摇瓶发酵均有显著提高。
实施例5 罗尔斯通氏菌工程菌株通过甲基苹果酸途径在厌氧瓶中自养发酵CO2生产异亮氨酸
根据兼性化能自养的营养代谢特点，罗尔斯通氏菌可利用CO2作为唯一碳源进行生长和代谢。将构建的通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌-CnIle4和罗尔斯通氏菌-CnIle5分别在厌氧瓶中进行自养发酵，可在罗尔斯通氏菌工程菌株中实现通过甲基苹果酸途径发酵CO2生产异亮氨酸。具体方法如下：
首先，分别将罗尔斯通氏菌-CnIle4和罗尔斯通氏菌-CnIle5工程菌株接种到40mL LB（含卡那霉素）培养基中，30 ℃、200 r/min过夜培养，作为一级种子液。测定一级种子液OD600，根据相应比例转接种于50 mL培养基中（250 mL密封厌氧瓶），使初始OD600约为1。其中所述培养基的配方为：15.14 g/L Na2HPO4·12H2O，3 g/L KH2PO4，5 g/L (NH4)2SO4，300mg/L NaHCO3，80 mg/L MgSO4·7H2O，10 mg/L 柠檬酸铁，2 mg/L CaCl2，1.2 mg/L NiSO4·7H2O，1 mg/L CaSO4，1 mg/L ZnSO4·7H2O，0.6 mg/L CoCl2·6H2O，0.6 mg/L H3BO3，0.44mg/L MnSO4·H2O，0.4 mg/L Na2MoO4·2H2O，0.4 mg/L CuSO4·5H2O，200 mg/L卡那霉素。发酵在30 ℃，200 r/min摇床中共进行35天，发酵过程中，每天向密封厌氧瓶内充入1标准大气压混合气体置换瓶内原有气体，其中所述混合气体的成分及比例为H2：O2：CO2=8：1：1。每隔5天取样，使用岛津公司AJS-01氨基酸分析方法包通过高效液相色谱的紫外检测器分离并测定培养基中异亮氨酸的浓度。如图5所示，在以CO2作为唯一碳源的自养发酵中，培养基内累积异亮氨酸浓度最高的时间为25-30天，罗尔斯通氏菌-CnIle4通过甲基苹果酸途径转化CO2生产异亮氨酸的产量为105 mg/L，罗尔斯通氏菌-CnIle5通过甲基苹果酸途径转化CO2生产的异亮氨酸的产量为100 mg/L。结果表明，在以CO2作为唯一碳源的发酵条件下，罗尔斯通氏菌工程菌株可通过甲基苹果酸途径自养发酵CO2并生产异亮氨酸。
以上实施例仅用于理解本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。
Claims (10)
1.一种构建通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
改造野生型罗尔斯通氏菌菌株的内源N-乙酰葡糖胺转运***，包括步骤：将野生型罗尔斯通氏菌菌株的基于磷酸转移酶***的N-乙酰葡糖胺转运蛋白基因nagE的第793位碱基从G突变为C，突变后的N-乙酰葡糖胺转运蛋白基因nagE的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，并敲除所述N-乙酰葡糖胺转运蛋白的转录调节蛋白基因nagR，所述转录调节蛋白基因nagR 的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
在野生型罗尔斯通氏菌菌株中表达甲基苹果酸合酶基因cimA与支链氨基酸外泌蛋白基因ygaZ和ygaH，其中，所述甲基苹果酸合酶基因cimA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述支链氨基酸外泌蛋白基因ygaZ的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述支链氨基酸外泌蛋白基因ygaH的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述的构建通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
敲除野生型罗尔斯通氏菌菌株的内源聚羟基丁酸酯合成基因phaC1、phaA和phaB1，其中，所述聚羟基丁酸酯合成基因phaC1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述聚羟基丁酸酯合成基因phaA的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述聚羟基丁酸酯合成基因phaB1的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
在野生型罗尔斯通氏菌菌株中过表达所述甲基苹果酸合酶基因cimA。
3.根据权利要求2所述的构建通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
敲除野生型罗尔斯通氏菌菌株的乳酸合成基因ldhA1和ldhA2，并表达NADPH依赖的乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC和NADPH辅酶依赖性的支链氨基转移酶基因ilvE，其中，所述乳酸合成基因ldhA1的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述乳酸合成基因ldhA2的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，所述乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，所述NADPH辅酶依赖性的支链氨基转移酶基因ilvE的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；
敲除野生型罗尔斯通氏菌菌株的乳酸合成基因ldh，并表达失去反馈调节位点的乙酰羟酸合酶基因ilvB和ilvN，所述乳酸合成基因ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述乙酰羟酸合酶基因ilvB的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，所述乙酰羟酸合酶基因ilvN的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
4.一种通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株，其特征在于，所述罗尔斯通氏菌工程菌株为具有以下改造特征的野生型罗尔斯通氏菌菌株：
核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的突变后的N-乙酰葡糖胺转运蛋白基因nagE；
内源N-乙酰葡糖胺转运蛋白的转录调节蛋白基因nagR被敲除，所述转录调节蛋白基因nagR的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
表达外源甲基苹果酸合酶基因cimA与支链氨基酸外泌蛋白基因ygaZ和ygaH，其中，所述甲基苹果酸合酶基因cimA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述支链氨基酸外泌蛋白基因ygaZ的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述支链氨基酸外泌蛋白基因ygaH的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
5.根据权利要求4所述的通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株，其特征在于，所述罗尔斯通氏菌工程菌株进一步具有以下改造特征：
内源聚羟基丁酸酯合成基因phaC1、phaA和phaB1被敲除，其中，所述聚羟基丁酸酯合成基因phaC1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述聚羟基丁酸酯合成基因phaA的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述聚羟基丁酸酯合成基因phaB1的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
进一步过表达所述甲基苹果酸合酶基因cimA。
6.根据权利要求5所述的通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株，其特征在于，所述罗尔斯通氏菌工程菌株进一步具有以下改造特征：
内源乳酸合成基因ldhA1和ldhA2被敲除，并表达NADPH依赖的乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC和NADPH辅酶依赖性的支链氨基转移酶基因ilvE，其中，所述乳酸合成基因ldhA1的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述乳酸合成基因ldhA2的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，所述乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，所述NADPH辅酶依赖性的支链氨基转移酶基因ilvE的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；
内源乳酸合成基因ldh被敲除，并表达失去反馈调节位点的乙酰羟酸合酶基因ilvB和ilvN，所述乳酸合成基因ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述乙酰羟酸合酶基因ilvB的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，所述乙酰羟酸合酶基因ilvN的核苷酸序列如SEQID NO：15所示。
7.一种通过甲基苹果酸途径发酵生产异亮氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：使用权利要求4~6中任意一项所述的通过甲基苹果酸途径生产异亮氨酸的罗尔斯通氏菌工程菌株在培养基中发酵，获得异亮氨酸。
8.根据权利要求7所述的通过甲基苹果酸途径发酵生产异亮氨酸的方法，其特征在于，所述培养基的配方：15.14 g/L Na2HPO4·12H2O，3 g/L KH2PO4，5 g/L (NH4)2SO4，300 mg/LNaHCO3，80 mg/L MgSO4·7H2O，10 mg/L 柠檬酸铁，2 mg/L CaCl2，1.2 mg/L NiSO4·7H2O，1mg/L CaSO4，1 mg/L ZnSO4·7H2O，0.6 mg/L CoCl2·6H2O，0.6 mg/L H3BO3，0.44 mg/LMnSO4·H2O，0.4 mg/L Na2MoO4·2H2O，0.4 mg/L CuSO4·5H2O，200 mg/L卡那霉素。
9.根据权利要求7所述的通过甲基苹果酸途径发酵生产异亮氨酸的方法，其特征在于，利用葡萄糖作为唯一碳源进行异养发酵，葡萄糖的初始浓度为30 g/L，当初始葡萄糖消耗完毕后，补料控制葡萄糖浓度低于15 g/L。
10.根据权利要求7所述的通过甲基苹果酸途径发酵生产异亮氨酸的方法，其特征在于，利用CO2作为唯一碳源在封闭容器内进行自养发酵，所述封闭容器内每24小时置换新鲜混合气体，其中所述混合气体为8：1：1的H2：O2：CO2。
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