CN111154706B - L-色氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

L-色氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L‑色氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明是以大肠杆菌CICC 10303作为出发菌株，采用易错PCR和CRISPR‑Cas9基因编辑技术，敲除关键基因trpR解除了色氨酸合成和转运关键酶受到的反馈阻遏调控，敲除预苯脱氢酶编码基因pheA后解除苯丙氨酸合成途径的竞争后，利用基因随机突变试剂盒随机突变L‑色氨酸合成相关基因aroK的启动子序列ParoK，构建得到5株重组菌ECTR1、ECTR2、ECTR3‑1～ECTR3‑3，其中ECTR3‑2使得L‑色氨酸的发酵罐产量得到了显著提高，达到了40g/l，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产L‑色氨酸奠定了基础。

Description

L-色氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种L-色氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
L-色氨酸作为一种非常重要的芳香性氨基酸，是人体必需的八种氨基酸之一。在生物体内，L-色氨酸可以合成5-羟基色胺、烟酸、色素、生物碱、辅酶、吲哚乙酸等重要的生物活性物质，对人和动物的生长发育起重要作用，广泛应用于食品、医药、饲料等方面。L-色氨酸的生产最早主要依靠化学合成法和蛋白质水解法，但是这些方法存在着材料来源有限、周期长、工艺复杂等缺点，因而逐渐被淘汰。由于成本低廉、原料来源广泛、环境污染小等特点，微生物法生产L-色氨酸已经得到了广泛的应用。
目前，微生物法生产L-色氨酸存在产量不高、操作复杂等缺点。2001年，王健等用硫酸二乙酯(DES)作为诱变剂，选取了一株酪氨酸、苯丙氨酸双营养缺陷株出发菌株，经过多次诱变处理之后，选育出一株L-色氨酸生产菌株，分批连续发酵64h后，L-色氨酸积累量可以达到7.28g/L。2007年，陈俊峰等利用多次诱变的分离方法，以一株谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，得到一株苯丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷型的L.色氨酸结构类似物抗性突变株，摇瓶发酵96h后，L-色氨酸积累量达到10.82g/L。
大肠杆菌(Escherichia coli)已经被应用于工业发酵生产各类氨基酸。因此，运用代谢工程手段构建重组大肠杆菌是生产L-色氨酸的有效途径。目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径和竞争途径中关键性酶基因的过表达或弱化是对大肠杆菌进行基因改造的主要手段。然而利用表达质粒介导基因过表达必将在大肠杆菌细胞内引入抗生素抗性基因并在生长过程中添加一定的抗生素，引起人们对抗生素使用的疑虑。因此，提供一种安全高效的对大肠杆菌进行遗传改造的方法，对于氨基酸生产领域有重要的意义。
近年来，随着合成生物学的发展，人工合成功能元件在代谢工程领域显示出巨大应用潜力。细胞的代谢通量主要受到转录水平的调控，而启动子是转录水平的重要调控元件，因此，启动子被列为合成生物学的重要功能元件之一。易错PCR通过调整PCR反应体系中镁离子浓度、加入锰离子、改变4种dNTPs浓度、加入保真性差的DNA聚合酶等，来增加扩增的突变率，从而引入突变位点。易错PCR是简单、有效的体外随机诱变技术，是获得序列多样性的有效方法。易错PCR引入的突变是随机突变，可以发生在启动子区域的任何位置，为构建较大的文库提供了保证。
目前生产L-色氨酸的大肠杆菌，L-色氨酸的产量还不够高，不能满足工业生产的需求。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种L-色氨酸产量提高的重组大肠杆菌，以大肠杆菌CICC 10303为出发菌株，敲除L-色氨酸反馈阻遏抑制编码基因trpR和敲除预苯脱氢酶编码基因pheA后，利用基因随机突变试剂盒随机突变L-色氨酸合成相关基因aroK的启动子序列ParoK，并筛选出最适组合得到高产L-色氨酸的重组大肠杆菌ECTR3-2。
本发明的第一个目的是提供一种L-色氨酸产量提高的重组大肠杆菌，所述的重组大肠杆菌是在大肠杆菌宿主菌中，敲除L-色氨酸反馈阻遏抑制编码基因trpR和预苯脱氢酶编码基因pheA。
进一步地，所述的重组大肠杆菌还将莽草酸激酶编码基因aroK启动子序列ParoK突变为如SEQ ID NO.7所示的序列。
进一步地，所述的大肠杆菌宿主菌为大肠杆菌CICC10303。
进一步地，所述的trpR基因的核苷酸序列如ECK4385所示，pheA基因的核苷酸序列如ECK2596所示。
进一步地，所述的aroK基因的核苷酸序列如ECK3377所示。
本发明的第二个目的是提供所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)构建序列突变启动子的整合片段：合成含PmaroK基因的aroK上下游同源臂片段融合得到片段maroK-(1-3)；
(2)构建重组质粒：分别将3个重组片段maroK-(1-3)与含有sgRNA的线性化载体连接，得到含有maroK-1、maroK-2和maroK-3的重组质粒；
(3)构建高产L-色氨酸重组大肠杆菌：将含cas9蛋白的质粒转化大肠杆菌CICC10303，得到重组大肠杆菌ECC9；重组质粒pTTRP转化大肠杆菌ECC9，得到重组大肠杆菌ECTR1，将重组质粒pTPHEA转化大肠杆菌ECTR-1，得到重组大肠杆菌ECTR2，将重组质粒pT-aroK(1-3)分别转化大肠杆菌ECTR-2，去除外源质粒，得到重组大肠杆菌ECTR3-(1-3)。
进一步地，在步骤(2)中，所述的线性化载体包括lpTdap或lpTtd或pT-thrA。
进一步地，所述的含cas9蛋白的质粒包括pCas9质粒。
本发明的第三个目的是提供所述的重组大肠杆菌在生产L-色氨酸中的应用。
进一步地，所述的应用是将所述的重组大肠杆菌在发酵培养基中培养40～50h得到所述的L-色氨酸，所述的发酵培养基(g/L)：葡萄糖50～70，七水硫酸镁14～18，硫酸铵22～26，酵母浸出粉8～12，柠檬酸三钠二水物14～18，磷酸氢二钾5～6。
本发明的有益效果是：
(1)本发明通过对L-色氨酸生物合成途径相关基因的改造，构建得到5株重组菌ECTR1、ECTR2、ECTR3-1～ECTR3-3，其中ECTR3-2使得L-色氨酸的产量得到了显著提高，发酵罐产量达到了40g/L，是原始菌株的的产量的1.54倍。
(2)本发明提供了一种改造微生物中L-色氨酸生物合成途径提高L-色氨酸产量的方法，为构建L-色氨酸的高产菌株提供了理论依据。
附图说明
图1为重组质粒pTTRP。
图2为重组质粒pTPHEA。
图3为重组质粒pET20b-PpheA。
图4为突变启动子表达绿色荧光蛋白时相对荧光强度。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明的大肠杆菌CICC 10303为高产L-色氨酸大肠杆菌，在专利CN201811465696.X中公开。
重组大肠杆菌种子培养及发酵培养基：
平板培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠5，琼脂粉15，pH调至7.0。
种子培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉15.2，磷酸氢二钾24，硫酸铵5，磷酸二氢钾9.6，七水硫酸镁1。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，七水硫酸镁16，硫酸铵24，酵母浸出粉10，柠檬酸三钠二水物16，磷酸氢二钾5.6。
培养条件：将37℃下培养24h的平板挑取单菌落至种子培养基，于37℃、220rpm条件下培养10h，10％的接种量接种发酵培养基，35℃、220rpm条件下培养42h。
(三)L-色氨酸的测定方法：
1.样品处理：
取1mL发酵液，离心去除菌体取上清。用5％的三氯乙酸将上清液适当稀释后12000rpm/min离心10min，然后经孔径为0.22μm的滤膜过滤。
2.分析方法：OPA硼酸柱前衍生化，13.768min洗脱峰为色氨酸
3.色谱条件：
(1)色谱柱：色谱柱C18(250×4.6)mm
(2)柱温：40℃
(3)流动相A：称取3.01g无水乙酸钠于烧杯中，加去离子水溶解并定容至1L，然后加入200μL三乙胺，用5％的醋酸将pH调到7.20±0.05；抽滤后加入5mL四氢呋喃，混合后备用。流动相B：称取3.01g无水乙酸钠于烧杯中；加去离子水溶解并定容至200mL；用5％醋酸将pH调到7.20±0.05；抽滤后，再向此溶液加入400mL乙腈和400mL甲醇，混合后备用。
(4)流速：1.0ml/min；
(5)紫外检测器：338nm；
(6)柱温：40℃；
下述实施例中，没有多作说明的都是采用常规的分子生物学实验方法。
设计引物序列参照表1。
表1引物序列表
Figure BDA0002365138740000041
实施例1：重组片段的构建
根据大肠杆菌序列信息，设计引物pT-TRP-1F、pT-TRP-1R、pT-TRP-2F和pT-TRP-2R，使用上述引物从大肠杆菌CICC 10303基因组中分别扩增trpR基因两侧同源臂基因序列各600bp，得到片段TRP1和TRP2(序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)；将和根据大肠杆菌序列信息，设计引物pT-PHEA-1F、pT-PHEA-1R、pT-PHEA-2F和pT-PHEA-2R，使用上述引物从大肠杆菌CICC 10303基因组中分别扩增pheA基因两侧同源臂基因序列各600bp，得到片段PHEA1和PHEA2(序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)。
实施例2：重组质粒的构建
根据载体pTarget序列信息，设计引物pT-TRP-F、pT-TRP-R进行PCR得到含有sgRNA的线性化载体lpTtrp。将片段TRP1、TRP2和lpTtrp连接构建重组质粒pTTRP(参见图1)。根据载体pTarget序列信息，设计引物pT-pheA-F、pT-pheA-R进行PCR得到含有sgRNA的线性化载体lpTpheA。将片段PHEA1、PHEA2和lpTpheA连接构建重组质粒pTPHEA(参见图2)。
实施例3：重组TRP片段大肠杆菌的构建
将含有cas9蛋白的pCas9质粒转化大肠杆菌CICC 10303。采用Kana抗性板筛选转化成功的重组大肠杆菌ECC9，随后将重组质粒pTTRP转化大肠杆菌ECC9，筛选确认片段TRP1和TRP2成功，加0.05mM IPTG在30℃下诱导12h，去除重组质粒pTTRP，选用引物pT-TRP-1F与pT-TRP-2R挑选转化子进行菌落PCR，出现1200bp左右条带，测序正确后，得到trpR基因被敲除的重组大肠杆菌ECTR-1。
实施例4：重组PHEA片段大肠杆菌的构建
将重组质粒pTPHEA转化大肠杆菌ECTR-1，筛选确认片段PHEA1和PHEA2成功，加0.05mM IPTG在30℃下诱导12h，去除重组质粒pTPHEA，选用引物pT-PHEA-1F与pT-PHEA-2R挑选转化子进行菌落PCR，出现1200bp左右条带，测序正确后，得到pheA基因被敲除的重组大肠杆菌ECTR-2。
实施例5：启动子文库的构建
以大肠杆菌CICC 10303基因组为模板，采用引物aroK.FOR和aroK.REV以及QuickMutation基因随机突变试剂盒扩增aroK基因的上游启动子序列ParoK(序列如SEQ IDNO.5所示)，PCR条件：94℃，3min预变性，然后94℃，变性30s，55℃，退火30s，72℃，延伸0.5min，总共30个循环，切胶回收大小正确的片段，得到ParoK不同序列的混合启动子片段PmaroK。
实施例6：含不同启动子序列载体的获得
将含有eGFP的载体pET-20b采用引物ZTaroK.FOR,ZTaroK.REV线性化，PCR条件：98℃，3min预变性，然后98℃，变性10s，55℃，退火5s，72℃，延伸2min，总共34个循环，切胶回收大小正确的片段，得到线性化载体片段ZTaroK。将载体片段与实施案例5中得到的混合启动子片段分别连接后转化大肠杆菌JM109，提取混合质粒(参见图3)。
实施例7：混合质粒的转化
将实施例6中得到的混合质粒转化到大肠杆菌ECTR-2感受态细胞中。具体步骤为：
(1)将实施例6中构建好的质粒电转化大肠杆菌ECTR-2的感受态细胞，添加量为100-200ng，电转化条件：电压25kV，电击时间5ms，37℃复苏2h涂布终浓度为10μg/mL的氨苄霉素抗性的LB平板，37℃厌氧培养12h。氨苄霉素抗性呈阳性的为转化成功的大肠杆菌。
(2)挑选平板上长出的单菌落，利用引物AROKYZ.FOR，AROKYZ.REV进行菌落PCR验证，替换后扩增得到的片段长度为1000bp。并进行测序。
实施例8：重组菌株荧光强度的检测
挑取测序正确的菌株各10株，进行96浅孔板培养37℃培养20h，采用酶标仪在523nm处检测每个重组菌株发酵液的荧光强度(参见图4)，提取RNA检测相对转录强度。
实施例9：同源重组片段的构建
在整合ParoK不同序列的混合启动子片段PmaroK的菌株中选取荧光强度较强的菌株，测序后选择3个不同的突变序列，分别与aroK位点上游800bp的片段重新合成，设计引物aroK-1-F、aroK-1-R扩增；根据大肠杆菌CICC 23604基因组DNA序列信息，设计aroK-2-F和aroK-2-R，从大肠杆菌CICC 23604基因组中扩增aroK下游同源臂基因序列，将所得2个片段通过融合PCR技术融合得到重组片段maroK-(1-3)(序列分别如SEQ ID NO.6-8所示)。
实施例10：同源重组质粒的构建
根据载体pTarget序列信息，设计引物zharoK-F、zharoK-R,使用上述引物进行PCR，得到含有sgRNA的线性化载体pT-aroK，与重组片段maroK-(1-3)连接构建重组质粒。
实施例11：重组PmaroK启动子大肠杆菌的构建
将重组质粒pT-aroK(1-3)分别转化大肠杆菌ECTR-2，得到替换了aroK基因原始启动子的重组大肠杆菌，选用引物aroK-1-F与aroK-1-R挑选转化子进行菌落PCR，出现1000bp条带后测序构建成功重组大肠杆菌，加入0.01M IPTG诱导，在30℃条件下培养24h可以去除pT-aroK(1-3)质粒，随后37℃培养24h即可去除pCas9质粒，命名为ECTR3-(1-3)。
实施例3、4及11中构建的菌株基因型见表2。
表2菌株基因型
Figure BDA0002365138740000071
实施例12：利用重组PmaroK启动子菌株发酵生产L-色氨酸
(1)种子液制备
将出发菌株谷氨酸棒杆CICC 10303及实施例11中构建得到的重组菌ECTR3-(1-3)分别接种到种子培养基中。
将重组大肠杆菌CICC 10303-TRYP在平板培养基中37℃下培养24h，挑取单菌落至种子培养基，于37℃、220rpm条件下培养10h。
(2)发酵培养
10％的接种量接种发酵培养基，35℃、220rpm条件下培养42h，。利用HPLC高效液相色谱测定发酵液上清中L-色氨酸。结果见表3。
表3菌株发酵生产L-色氨酸
Figure BDA0002365138740000072
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学，无锡中粮工程科技有限公司
<120> L-色氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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ttttttgttg acagcgtgaa aacagtacgg gtactgtact aaagtcactt aaggaaacaa 480
acatgaaaca cataccgttt ttcttcgcat tcttttttac cttcccctga atgggaggcg 540
tttcgtcgtg tgaaacagaa tgcgaagacg aacaataagg cctcccaaat cggggggcct 600
<210> 4
<211> 601
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
aaaggtgccg gatgatgtga atcatccggc actggattat tactggcgat tgtcattcgc 60
ctgacgcaat aacacgcggc tttcactctg aaaacgctgt gcgtaatcgc cgaaccagtg 120
ctccaccttg cggaaactgt caataaacgc ctgcttatcg ccctgctcca gcaactcaat 180
cgcctcgccg aaacgcttat agtaacgttt gattaacgcc agattacgct ctgacgacat 240
aatgatgtcg gcataaagct gcggatcctg agcaaacagt cgcccgacca tcgccagctc 300
aaggcggtaa atcggcgaag agagcgccag aagttgctca agctgaacat tttcttctgc 360
caggtgcagc ccgtaagcaa aagtagcaaa gtggcgcagt gcctgaataa acgccatatt 420
ctgatcgtgc tcgacggcgc taatacgatg cagccgagcg ccccagacct gaatttgctc 480
cagaaaccat tggtatgctt ccggtttacg tccatcacac cagaccacaa cttgctttgc 540
caggctaccg ctgtccggac cgaacatcgg gtgtagcccc agcaccggac catcatgcgc 600
c 601
<210> 5
<211> 400
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
acagccgtaa aagcggtaat gtttttacgc tgaacgtgtt tcatctattt gacgcgcgca 60
ggtatttagc atacaaggag taccgatttg agagttggtg ctcttcgctg cctgcgttcc 120
atgatgatga tttatcattc aggcggcatt ttgctgtctt ttttacgcta atcttacccg 180
gtgatttatc gccagagcgg tggtagcaag gcagcgcgct tgcagcgacc agatatgcag 240
agggatgggt gatttattca gttgccaaac ccgctggagt attgagataa ttttcagtct 300
gactctcgca atatcttatg aggtttcagt tcatgtcctg cggcgctctc tgagcgaagc 360
gggtttatca ttaacgaata gtcttagtag taccgaaaaa 400
<210> 6
<211> 400
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
acagccgtaa aagcggtaat gtttttacgc tgaacgtgtt tcatctattt gacgcgcgca 60
ggtatttagc atacaaggag taccgatttg agagttggtg ctcttcgctg cctgcgttcc 120
atgatgatga tttatcattc aggcggcatt ttgctgtctt ttttacgcta atcttacccg 180
gtgatttatc gccagagcgg tggtagcaag gcagcgcgct tgcagcgacc agatatgcag 240
agggatgggt gatttattca gttgccaaac ccgctggagt attgagatac ttttcagtct 300
gactctcgca atatcttatg aggtttcagt tcatgtaatc cggcgctctc tgagtccagc 360
gggtttatca ttaacgaata gtcttagtag taccgaaaaa 400
<210> 7
<211> 400
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
acagccgtaa aagcggtaat gtttttacgc tgaacgtgtt tcatctattt gacgcgcgca 60
ggtatttagc atacaaggag taccgatttg agagttggtg ctcttcgctg cctgcgttcc 120
atgatgatga tttatcattc aggcggcatt ttgctgtctt ttttacgcta atcttacccg 180
gtgatttatc gccagagcgg tggtagcaag gcagcgcgct tgcagcgacc agatatgcag 240
agggatgggt gatttattca gttgccaaac ccgctggacc tatgagataa ttttcagtct 300
gactctcgca atatcttatg aggaagcagt tcatgtcctg cggcgctctc tgagcgaagc 360
gggtttatca ttaacgaata gtcttagtag taccgaaaaa 400
<210> 8
<211> 401
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
acagccgtaa aagcggtaat gtttttacgc tgaacgtgtt tcatctattt gacgcgcgca 60
ggtatttagc atacaaggag taccgatttg agagttggtg ctcttcgctg cctgcgttcc 120
atgatgatga tttatcattc aggcggcatt ttgctgtctt ttttacgcta atcttacccg 180
gtgatttatc gccagagcgg tggtagcaag gcagcgcgct tgcagcgacc agatatgcag 240
agggatgggt gatttattca gttgccaaac ccgctggaag gttcgagata attttcagtc 300
tgactctcgc aatatcttat gaggtttcag ttcatgggtc gcggcgctct ctgagcgaag 360
cgggtttatc attaacgaat agtcttagta gtaccgaaaa a 401
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
ttcaggcaac gatcgccggg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
actcgctaaa gagtacgata 20
<210> 11
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
tatcgtactc tttagcgagt tttgtaggcc tgataagacg tggcgcatca ggca 54
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
catttcacga gatcttcggc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
tgaattcacc aagacgggaa 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 14
aggccccccg atttgggag 19
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 15
cctcccaaat cggggggcct aaaggtgccg gatgatgtga 40
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 16
ggcgcatgat ggtccggt 18
<210> 17
<211> 49
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 17
cgccgaagat ctcgtgaaat gtttgcaaca gtgccgttga tcgtgctat 49
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 18
cccggcgatc gttgcctgaa tagtcggtgg tgataaactt atcat 45
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 19
caccggacca tcatgcgcct ttgcaacagt gccgttgatc gt 42
<210> 20
<211> 41
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 20
ttcccgtctt ggtgaattca tagtcggtgg tgataaactt a 41
<210> 21
<211> 14
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 21
acagccgtaa aagc 14
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 22
tttttcggta ctactaaga 19
<210> 23
<211> 69
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 23
ttaccgcttt tacggctgtc gacggagctc gaattcggat ccgaattaat tccgatatcc 60
atggccatc 69
<210> 24
<211> 52
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 24
atagtcttag tagtaccgaa aaaatgagta aaggagaaga acttttcact gg 52
<210> 25
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 25
tcgagtgcgg ccgca 15
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 26
cgaattcgag ctccgtcg 18
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 27
aattccatat caggt 15
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 28
tttttcggta ctactaag 18
<210> 29
<211> 47
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 29
tcttagtagt accgaaaaaa tggcagagaa acgcaatatc tttctgg 47
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 30
ctgctcgccg tcagggagg 19
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 31
cctccctgac ggcgagcagt ttgcaacagt gccgttgatc 40
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 32
acctgatatg gaatttagtc ggtggtgata aacttatcat 40

Claims (6)

1.一种L-色氨酸产量提高的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌是在大肠杆菌宿主菌中，敲除L-色氨酸反馈阻遏抑制编码基因trpR和预苯脱氢酶编码基因pheA；
所述的重组大肠杆菌还将莽草酸激酶编码基因aroK启动子序列ParoK突变为如SEQ IDNO.7所示的序列；
所述的大肠杆菌宿主菌为大肠杆菌CICC10303。
2.一种权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建序列突变启动子的整合片段：合成含PmaroK基因的aroK上下游同源臂片段融合得到片段maroK-(1-3)；
（2）构建重组质粒：分别将3个重组片段maroK-(1-3)与含有sgRNA的线性化载体连接，得到含有maroK-1、maroK-2和maroK-3的重组质粒；
（3）构建高产L-色氨酸重组大肠杆菌：将含cas9蛋白的质粒转化大肠杆菌CICC 10303，得到重组大肠杆菌ECC9；重组质粒pTTRP转化大肠杆菌ECC9，得到重组大肠杆菌ECTR1，将重组质粒pTPHEA转化大肠杆菌ECTR-1，得到重组大肠杆菌ECTR2，将重组质粒pT-aroK(1-3)分别转化大肠杆菌ECTR-2，去除外源质粒，得到重组大肠杆菌ECTR3-（1-3）；
所述的重组大肠杆菌将莽草酸激酶编码基因aroK启动子序列ParoK突变为如SEQ IDNO.7所示的序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述的线性化载体包括lpTdap或lpTtd或pT-thrA。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的含cas9蛋白的质粒包括pCas9质粒。
5.权利要求1所述的重组大肠杆菌在生产L-色氨酸中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用是将所述的重组大肠杆菌在发酵培养基中培养40~50h得到所述的L-色氨酸，所述的发酵培养基：葡萄糖 50~70 g/L，七水硫酸镁14~18 g/L，硫酸铵22~26 g/L，酵母浸出粉8~12 g/L，柠檬酸三钠二水物14~18 g/L，磷酸氢二钾5~6 g/L。
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