CN108753677B - 一种改善婴幼儿肠道菌群多样性的高活性益生菌组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种益生菌的培养方法，在含有促进益生菌生长繁殖的促生长因子的培养基中添加多孔材料，培养基与多孔材料的体积比为1∶100，在培养基中接种益生菌并进行培养，实现益生菌培养；所获得的益生菌可用于制备食品、食品添加剂、医药、饲料或者环保处理等产品。本发明获得的益生菌具有良好的耐热性、耐酸性及耐药性等性能，在食品、医药、饲料、环保等领域有广阔的应用前景。

Description

一种改善婴幼儿肠道菌群多样性的高活性益生菌组合物
技术领域
本发明属于益生菌组合物领域，具体涉及一种改善婴幼儿肠道菌群多样性的高活性益生菌组合物
背景技术
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖***内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。补充益生菌不仅可调理肠胃，还能增强人体免疫力、缓解乳糖不耐乳糖症、预防生殖***感染，促进肠道消化***健康，降低血清胆固醇，帮助吸收营养成分，造就健康肠道。近年来的研究表明，人体内的细菌多达1000多种，特别是胃肠道内细菌最为丰富，占全身微生态菌总数80%左右，是人体细胞的10倍，被誉为人类的“第二基因组”。这些发现为益生菌产品在食品、保健品、医药、养殖、环境、卫生用品等领域的应用带来了巨大的推动力。目前，益生菌被广泛用于酸奶、乳酸菌饮料、益生菌粉剂、动物饲料、环境治理等产品中，形成了相对完整和成熟的益生菌行业。需要特殊注意的是，益生菌只有达到一定的数量水平时，益生菌才能在宿主体内产生相应的效果。所以，以益生菌为功能成分的食品、保健品或药品需要保证所含活的益生菌数量保持在一定的水平。这一需求对益生菌的生产和制备提出了相应的要求，现有技术中，益生菌活化培养的方法较为传统，得到的种子液活性不高，导致应用效果较差。
随着人们生活水平的随着人们生活水平的提高，对健康的要求也越来越高，益生菌普遍的被接受并广泛使用。益生菌的概念在1989年被提出，2002年科学家确定益生菌的概念和疗效。之后短短十年世界人类卫生领域发生了巨大的变化，益生菌益生元的研究和产品开发成为了潮流。该领域的研发、生产，目前在乳酸菌、双歧杆菌的研究和应用方面尤其突出。这方面的产品有传统的酸奶，以及新开发的各种酸奶，乳酸饮料，各种单复合菌保健品、食品，还有用于治疗肠道疾病的益生菌制剂。因为益生菌的保存条件苛刻，现有产品普遍存在着活菌易死亡，菌数不稳定，导致益生菌产品保质期短，质量不稳定的技术问题。
例如，中国专利申请201710288326.2中公开了一种益生菌共生体、培养方法及其应用，其公开了培养了包括CGMCC编号11870的耐久肠球菌CR-29和CGMCC编号11869的肠膜明串珠菌肠膜亚种菌SR-19，得到共生体益生菌菌粉，用于食品、食品添加剂、保健食品、人类药物、兽药、动物饲料生领域。但是本申请对于益生菌应用于食品等中的效果并没有描述。
因为益生菌会对人体带来多种益处，所以人们开始考虑将其应用于婴幼儿食品中，但是婴幼儿皮肤角质层比较薄，毛细血管网丰富而且内皮含水及氯化物比较多，对各种刺激因素较敏感，加之婴儿消化吸收差，胃肠道防御能力较弱，食物得不到充分消化分解，而以大分子形式吸收入血液，目前虽然已在开发可供婴幼儿使用的益生菌饮品，但是种类很少。
例如，中国专利申请201310742689.0中公开了一种益生菌组合物及其应用、婴幼儿食品，该益生菌组合物包括双歧杆菌HN019和鼠李糖乳杆菌HN001。本发明提供的婴幼儿食品能显著提高婴儿肠道中的双歧杆菌和乳杆菌含量，同时显著降低产气荚膜杆菌含量，从而有效改善婴儿肠道的微生态环境 ；能显著提高婴儿粪便中的乙酸含量和短链脂肪酸总含量，并接近纯母乳喂养婴儿 ；能显著提高婴儿粪便中的 sIgA 含量，并接近纯母乳喂养婴儿 ；可以显著降低婴儿的湿疹发生率。但是该发明中所添加的益生菌种类较少，对改善婴幼儿肠道菌群多样性效果不是特别明显。
基于现有技术中存在的不足，提供一种复合益生菌的培养方法，并将培养的复合益生菌用于改善婴幼儿肠道菌群多样性，该应用对于益生菌的大规模应用具有重要意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种益生菌的培养方法及其应用，用于解决的技术问题一方面是现有益生菌饮料中益生菌难以上期保存的问题，另一方面是扩大益生菌在改善婴幼儿肠道菌群多样性方面的应用。
一方面，本发明提供了一种益生菌的培养方法
在含有促进益生菌生长繁殖的促生长因子的培养基中添加多孔材料，培养基与多孔材料的体积比为1：100，在培养基中接种益生菌并进行培养，实现益生菌高密度培养。
所述培养为厌氧培养，所接种的益生菌为厌氧或兼性厌氧的微生物。
厌氧培养是在30-42℃下培养12-48h。
培养结束后，所述益生菌聚集到多孔材料的表面或者内部或者表面和内部得到干燥后的产品中总活菌数可达1011-1015CFU/g以上。活均数受干燥方法等因素的影响，冷冻干燥的产品中活菌数更高。
所制备得到的益生菌具有良好的耐热性、耐酸性即耐药性等性能。
所述的培养基为液态、半固态或者固态，培养体系可为液体培养、半固体培养和固体培养三中培养方式中的任一种，所述的多孔材料为固体。
所述的培养基为双歧杆菌培养基（乳双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌）；SIIM0012培养基（鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌）等。
所述的培养基中含有促进益生菌生长繁殖的促生长因子。含有促进益生菌生长繁殖的促生长因子如乳清发酵液、胶原蛋白发酵液、马铃薯发酵液、海藻提取物、菌菇类发酵液或提取物、豆乳、番茄汁、胡萝卜汁、玉米汁、冬虫夏草提取物、灵芝提取物、铁皮石斛去提取物，当归提取物、银杏叶提取物、麦芽提取物、参类提取物、黄芪提取物、罗汉果提取物、菊粉、酵母葡聚糖、低聚木糖、维生素、氨基酸、多巴胺、植酸、黄腐酸、腐殖酸、镁盐、锌盐、锰盐、钙盐、铁盐、硒盐等的一种或几种。
所述的培养基中的多孔材料的平均孔径大小为1纳米-500微米，体积孔隙率为5-99.9%（v/v）。5-99.9%（v/v）指的是多孔材料的孔隙占整个材料的体积比为5-99.9%。
所述的多孔材料为凝胶材料、气凝胶材料、泡沫材料、纤维材料、微孔材料、介孔材料或者大孔材料等。
所述的凝胶材料、气凝胶材料、泡沫材料和纤维材料的平均孔径从纳米级尺寸到微米级尺寸不等；所述的微孔材料的平均孔径小于2纳米，介孔材料的平均孔径为2-50纳米，大孔材料的平均孔径大于50纳米。
所述的多孔材料为天然多糖类及其衍生物、天然蛋白类及其衍生物、合成高分子的均聚物或者共聚物、无机材料等材料中的一种或几种。
天然多糖类如甲壳素、壳聚糖、维生素、木质素、纤维素、葡聚糖、琼脂糖、低聚果糖、大豆低聚糖、魔芋蒲甘聚糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、低聚麦芽糖、淀粉、糊精、菊粉、海藻酸及其盐、右旋糖酐、透明质酸、海藻多糖、褐藻多糖、螺旋藻多糖、地衣多糖、香菇多糖、灵芝多糖、银耳多糖、***胶、果胶、瓜尔胶、黄原胶角叉菜胶等来源与植物、动物、海藻哈微生物的多糖及其衍生物。
天然蛋白类如大豆蛋白、绿豆蛋白、小麦蛋白、玉米蛋白、谷蛋白、蚕丝蛋白、蜘蛛丝蛋白、胶原蛋白、乳清蛋白、明胶、酪蛋白酸钠、纤维蛋白、角蛋白等来源与植物、动物和微生物的蛋白及其衍生物。
合成高分子的均聚物和共聚物如聚氨基酸、聚乙二醇、聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚己酸内酯、聚β羟基丁酸酯、聚β羟基戊酸等。
无机材料如珍珠岩、蒙脱石、炭黑、白炭黑、陶瓷等。
所用的益生菌为对人体和（或）动物有益的微生物。如乳双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌等中的一种或几种。
所述培养基中，多孔材料上接种的益生菌菌液量为0.1%-50%(v/v）。0.1%-50%(v/v）指的是益生菌菌液加入的体积量为加入后整个培养基的体积为0.1-50%。
所属益生菌接种菌液中的菌液的浓度为108-109CFU/mL。
本发明属于益生菌组合物领域，具体涉及一种改善婴幼儿肠道菌群多样性的高活性益生菌组合物。
本发明提供了一种改善婴幼儿肠道菌群多样性的高活性益生菌组合物，所述的益生菌组合物，按重量份数计包括以下组分：
抗性糊精40-60份、低聚半乳糖5-15份、低聚果糖5-15份、乳双歧杆菌HN019冻干粉2-8份、动物双歧杆菌BB-12冻干粉2-8份、短双歧杆菌M-16V冻干粉2-8份、鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉2-8份和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉2-8份。
优选地，上述益生菌组合物，按重量份数计包括以下组分：
抗性糊精50-60份、低聚半乳糖8-12份、低聚果糖8-12份、乳双歧杆菌HN019冻干粉3-7份、动物双歧杆菌BB-12冻干粉3-7份、短双歧杆菌M-16V冻干粉3-7份、鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉3-7份和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉3-7份。
进一步优选地，上述益生菌组合物，按重量份数计包括以下组分：
抗性糊精40-50份、低聚半乳糖9-11份、低聚果糖9-11份、乳双歧杆菌HN019冻干粉4-6份、动物双歧杆菌BB-12冻干粉4-6份、短双歧杆菌M-16V冻干粉4-6份、鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉4-6份和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉4-6份。
上述益生菌组合物，所述的乳双歧杆菌HN019冻干粉、动物双歧杆菌BB-12冻干粉和短双歧杆菌M-16V冻干粉的总重量份数计为M1，所述地鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉的总重量份数计为M2，M1和M2之比为2-5：2；优选为3-4：2。
所述的乳双歧杆菌HN019冻干粉、动物双歧杆菌BB-12冻干粉和短双歧杆菌M-16V冻干粉的重量份数之比为0.5-3：1：1；优选地，所述的乳双歧杆菌HN019冻干粉、动物双歧杆菌BB-12冻干粉和短双歧杆菌M-16V冻干粉的重量份数之比为1-2.5：1：1；再优选地，所述的乳双歧杆菌HN019冻干粉、动物双歧杆菌BB-12冻干粉和短双歧杆菌M-16V冻干粉的重量份数之比为1.5-2：1：1。
所述的鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉的重量份数之比为1：0.5-4；优选地，所述的鼠李糖乳杆菌HN00冻干粉1和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉的重量份数之比为1：1-3.5；再优选地，所述的鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉的重量份数之比为1：1.5-3；进一步优选地，所述的鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉的重量份数之比为1：2-2.5。
所述的乳双歧杆菌HN019冻干粉、动物双歧杆菌BB-12冻干粉、短双歧杆菌M-16V冻干粉、鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉的活菌数均为107-1010CFU/g，且水分含量低于4%。
上述益生菌组合物可应用于食品、食品添加剂、保健食品、人类食品、兽药、动物饲料方面。
在一个优选实施例中上述益生菌组合物应用于益生菌固体饮料。
在一个具体实施方案中，所述的益生菌固体饮料，按重量份数计包括以下组分：
抗性糊精40份、低聚半乳糖8份、低聚果糖10份、乳双歧杆菌HN019冻干粉8份、动物双歧杆菌BB-12冻干粉4份、短双歧杆菌M-16V冻干粉4份、鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉2份和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉6份。
在另一个具体实施方案中，所述益生菌固体饮料，按重量份数计包括以下组分：
抗性糊精60份、低聚半乳糖15份、低聚果糖8份、乳双歧杆菌HN019冻干粉3份、动物双歧杆菌BB-12冻干粉6份、短双歧杆菌M-16V冻干粉6份、鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉6份和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉4份。
本发明还提供了一种制备上述益生菌固体饮料的方法，具体步骤包括：
（1）制备粉末：将抗性糊精、低聚半乳糖和低聚果糖分别过50-120目筛，然后将3种粉末按配方重量份数混合反复搅拌均匀，得混合粉末A，备用；
（2）制备复合益生菌组合物：将乳双歧杆菌HN019、动物双歧杆菌BB-12、短双歧杆菌M-16V、鼠李糖乳杆菌HN001和发酵乳杆菌CECT5716分别放入试管中活化，得到一级种子液；然后将一级种子液接种于培养基A上培养条件为25～42℃，厌氧培养8～24h得到二级种子液；将二级种子液分别接入发酵培养基中进行高密度发酵，接种量为0.5％-5％，培养条件为30～40℃，厌氧培养8～18h，分别收集发酵液；
（3）将步骤（2）中所述发酵液分别离心，收集菌体后加入保护剂乳化，分别真空冷冻干燥制得菌粉，然后将菌粉按配方中的重量份数混合得到混合益生菌粉B。
（3）混合搅拌：将步骤（1）中得到的混合粉末A加入到搅拌机中，加入适量的水启动搅拌机，直至混合粉末A溶解，再搅拌过程中按一定速率加入混合益生菌粉B，搅拌均匀，得到混合物C；
（4）冷冻干燥：将步骤（4）中得到的混合物C放置在冷冻机内进行冷冻干燥，得到冻干粉D；
（5）粉碎包装：将步骤（4）中得到的冻干粉D放置于粉碎机中进行粉碎，然后过200-600目筛，得到复合益生菌冻干粉固体饮料，然后将复合益生菌冻干粉固体饮料放入包装机中等份包装，即得成品。
上述步骤（2）中所述的培养基A为在基础培养基MRS培养基中加入一定量的胶原蛋白、海藻糖、蔗糖、乳清发酵液和维生素C，搅拌均匀，灭菌20-30min，即制备得到培养基A；其中MRS培养基所占质量百分比为70%，胶原蛋白、海藻糖、蔗糖和乳清发酵液所占质量百分比为30%；胶原蛋白、海藻糖、蔗糖和乳清发酵液的质量比为1：1：3：5。
上述步骤（3）中所述的加入适量水的量为正好使混合粉末A完全溶解；所述的复合益生菌的加入速度为0.5份/分钟。
上述步骤（4）中所述的冻干时间为18-36h。
上述步骤（5）中所述的粉碎时间为30-90min。
本发明的有益效果：
（1）本发明公开的复合益生菌组合物，通过调整益生菌的种类以及含量使各菌株之间能够相互作用，能够更好的促进婴幼儿胃肠对营养物质的吸收。
（2）本发明公开了一种益生菌培养基，使培养的益生菌具有较高的活性，能够通过促进肠道中短链脂肪酸的增加，提高有机酸的含量，降低肠道pH值，导致肠道酸度降低而抑制有害菌，增加有益菌含量。
（3）本发明公开了一种高活性益生菌组合物，该组合物可以改善婴幼儿肠道菌群多样性，可以起到促进消化，刺激肠道免疫细胞，增强婴幼儿肠道免疫力等作用。
具体实施方案
以下实施例中所使用的乳双歧杆菌HN019冻干粉、鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉、动物双歧杆菌BB-12冻干粉、短双歧杆菌M-16V冻干粉和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉可购自美国杜邦，丹麦科汉森和上海百施生物等公司。
实施例1一种改善婴幼儿肠道菌群多样性的高活性益生菌组合物
配方：按重量份数计包括以下组分：
抗性糊精40份、低聚半乳糖8份、低聚果糖10份、乳双歧杆菌HN019冻干粉8份、动物双歧杆菌BB-12冻干粉4份、短双歧杆菌M-16V冻干粉4份、鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉2份和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉6份。
制备方法：具体步骤包括：
（1）制备粉末：将抗性糊精、低聚半乳糖和低聚果糖分别过100目筛，然后将3种粉末按配方重量份数混合反复搅拌均匀，得混合粉末A，备用；
（2）制备复合益生菌组合物：将乳双歧杆菌HN019、动物双歧杆菌BB-12、短双歧杆菌M-16V、鼠李糖乳杆菌HN001和发酵乳杆菌CECT5716分别放入试管中活化，得到一级种子液；然后将一级种子液接种于培养基A上培养条件为30℃，厌氧培养20h得到二级种子液；将二级种子液分别接入发酵培养基中进行高密度发酵，接种量为4％，培养条件为35℃，厌氧培养12h，分别收集发酵液；
（3）将步骤（2）中所述发酵液分别离心，收集菌体后加入保护剂乳化，分别真空冷冻干燥制得菌粉，然后将菌粉按配方中的重量份数混合得到混合益生菌粉B。
（3）混合搅拌：将步骤（1）中得到的混合粉末A加入到搅拌机中，加入适量的水启动搅拌机，直至混合粉末A溶解，再搅拌过程中按0.5份/分钟的速度加入混合益生菌粉B，搅拌均匀，得到混合物C；
（4）冷冻干燥：将步骤（4）中得到的混合物C放置在冷冻机内进行冷冻干燥18h，得到冻干粉D；
（5）粉碎包装：将步骤（4）中得到的冻干粉D放置于粉碎机中进行粉碎40min，然后过600目筛，得到复合益生菌冻干粉固体饮料，然后将复合益生菌冻干粉固体饮料放入包装机中等份包装，即得成品。
上述步骤（2）中所述的培养基A为在基础培养基MRS培养基中加入一定量的胶原蛋白、海藻糖、蔗糖、乳清发酵液和维生素C，搅拌均匀，灭菌20-30min，即制备得到培养基A；其中MRS培养基所占质量百分比为70%，胶原蛋白、海藻糖、蔗糖和乳清发酵液所占质量百分比为30%；胶原蛋白、海藻糖、蔗糖和乳清发酵液的质量比为1：1：3：5。
实施例2一种改善婴幼儿肠道菌群多样性的高活性益生菌组合物
配方：按重量份数计包括以下组分：
抗性糊精60份、低聚半乳糖15份、低聚果糖8份、乳双歧杆菌HN019冻干粉3份、动物双歧杆菌BB-12冻干粉6份、短双歧杆菌M-16V冻干粉6份、鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉6份和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉4份。
制备方法：具体步骤包括：除各组分含量不同以外，其他操作与步骤与实施例1相同。
实施例3一种改善婴幼儿肠道菌群多样性的高活性益生菌组合物
配方：按重量份数计包括以下组分：
抗性糊精50份、低聚半乳糖12份、低聚果糖12份、乳双歧杆菌HN019冻干粉8份、动物双歧杆菌BB-12冻干粉4份、短双歧杆菌M-16V冻干粉4份、鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉2份和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉8份。
制备方法：具体步骤包括：除各组分含量不同以外，其他操作与步骤与实施例1相同。
实施例4一种改善婴幼儿肠道菌群多样性的高活性益生菌组合物
配方：按重量份数计包括以下组分：
抗性糊精45份、低聚半乳糖10份、低聚果糖13份、乳双歧杆菌HN019冻干粉2份、动物双歧杆菌BB-12冻干粉4份、短双歧杆菌M-16V冻干粉4份、鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉5份和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉5份。
制备方法：具体步骤包括：（1）制备粉末：将抗性糊精、低聚半乳糖和低聚果糖分别过120目筛，然后将3种粉末按配方重量份数混合反复搅拌均匀，得混合粉末A，备用；
（2）制备复合益生菌组合物：将乳双歧杆菌HN019、动物双歧杆菌BB-12、短双歧杆菌M-16V、鼠李糖乳杆菌HN001和发酵乳杆菌CECT5716分别放入试管中活化，得到一级种子液；然后将一级种子液接种于培养基A上培养条件为35℃，厌氧培养18h得到二级种子液；将二级种子液分别接入发酵培养基中进行高密度发酵，接种量为3％，培养条件为30℃，厌氧培养18h，分别收集发酵液；
（3）将步骤（2）中所述发酵液分别离心，收集菌体后加入保护剂乳化，分别真空冷冻干燥制得菌粉，然后将菌粉按配方中的重量份数混合得到混合益生菌粉B。
（3）混合搅拌：将步骤（1）中得到的混合粉末A加入到搅拌机中，加入适量的水启动搅拌机，直至混合粉末A溶解，再搅拌过程中按0.5份/分钟的速度加入混合益生菌粉B，搅拌均匀，得到混合物C；
（4）冷冻干燥：将步骤（4）中得到的混合物C放置在冷冻机内进行冷冻干燥24h，得到冻干粉D；
（5）粉碎包装：将步骤（4）中得到的冻干粉D放置于粉碎机中进行粉碎30min，然后过400目筛，得到复合益生菌冻干粉固体饮料，然后将复合益生菌冻干粉固体饮料放入包装机中等份包装，即得成品。
上述步骤（2）中所述的培养基A为在基础培养基MRS培养基中加入一定量的胶原蛋白、海藻糖、蔗糖、乳清发酵液和维生素C，搅拌均匀，灭菌20-30min，即制备得到培养基A；其中MRS培养基所占质量百分比为70%，胶原蛋白、海藻糖、蔗糖和乳清发酵液所占质量百分比为30%；胶原蛋白、海藻糖、蔗糖和乳清发酵液的质量比为1：1：3：5。
实施例5一种改善婴幼儿肠道菌群多样性的高活性益生菌组合物
配方：按重量份数计包括以下组分：
抗性糊精55份、低聚半乳糖13份、低聚果糖10份、乳双歧杆菌HN019冻干粉7份、动物双歧杆菌BB-12冻干粉5份、短双歧杆菌M-16V冻干粉5份、鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉6份和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉3份。
制备方法：具体步骤包括：除各组分含量不同以外，其他操作与步骤与实施例4相同。
对比例1一种益生菌组合物
与实施例1的区别在于：乳双歧杆菌HN019冻干粉、动物双歧杆菌BB-12冻干粉和短双歧杆菌M-16V冻干粉的总重量份数与鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉的总重量份数之比为1：2。
制备方法：具体步骤包括：除各组分含量不同以外，其他操作与步骤与实施例1相同。
对比例2一种益生菌组合物
与实施例1的区别在于：乳双歧杆菌HN019冻干粉、动物双歧杆菌BB-12冻干粉和短双歧杆菌M-16V冻干粉的总重量份数与鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉的总重量份数之比为3：1。
制备方法：具体步骤包括：除各组分含量不同以外，其他操作与步骤与实施例1相同。
对比例3一种益生菌组合物
与实施例2的区别在于：鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉的重量份数之比为1：0.1。
制备方法：具体步骤包括：除各组分含量不同以外，其他操作与步骤与实施例2相同。
对比例4一种益生菌组合物
与实施例2的区别在于：鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉的重量份数之比为1：5。
制备方法：具体步骤包括：除各组分含量不同以外，其他操作与步骤与实施例2相同。
对比例5一种益生菌组合物
与实施例3的区别在于：乳双歧杆菌HN019冻干粉、动物双歧杆菌BB-12冻干粉和短双歧杆菌M-16V冻干粉的重量份数之比为0.1：1：1。
制备方法：具体步骤包括：除各组分含量不同以外，其他操作与步骤与实施例3相同。
对比例6一种益生菌组合物
与实施例3的区别在于：乳双歧杆菌HN019冻干粉、动物双歧杆菌BB-12冻干粉和短双歧杆菌M-16V冻干粉的重量份数之比为5：1：1。
制备方法：具体步骤包括：除各组分含量不同以外，其他操作与步骤与实施例3相同。
实验部分
1、溶解性试验：
将实施例1-5的益生菌组合物固体饮料加入大约40℃的水中轻轻搅拌，约在1-2min内完全溶解。
2、安全性测试：
寻找10名志愿者，分别每天早饭后口服实施例1-5的益生菌组合物固体饮料10-20g，未发现腹泻等副作用。
3、临床检测
本发明对婴儿粪便中的双歧杆菌、乳杆菌、短链脂肪酸、sIgA的含量进行了检测。
婴儿粪便中的双歧杆菌和乳杆菌的含量可直接反应婴儿肠道中双歧杆菌和乳杆菌数量的多少，粪便中的双歧杆菌和乳杆菌的含量高，则肠道中双歧杆菌和乳杆菌数量多，其是衡量健康状况的指标之一。
机体肠道中的有益菌可分解食物中的多糖，将其分解为乙酸、丙酸等短链脂肪酸，因此粪便中的乙酸、丙酸的含量可直接反应肠道中益生菌的数量，短链脂肪酸的含量高，则肠道中益生菌的数量多。
sIgA是黏膜免疫***的主要效应因子，主要存在于泪液、唾液、乳汁和呼吸道、消化道及泌尿生殖道等黏膜表面分泌液中。sIgA在介导黏膜免疫抵御外界病原微生物的侵袭中发挥重要作用，具有免疫作用。因此，粪便中sIgA的含量可反应机体的免疫力水平，sIgA含量高，则机体的免疫力高
试验设计：招募6-12个月龄身体健康的婴幼儿200名，对照组为：纯母乳喂养婴儿50名，普通奶粉喂养婴儿50名，实验组为：婴幼儿使用添加8g本发明实施例1-5提供的益生菌组合物的普通奶粉喂养。试验组和对照组产品服用方式：口服，27g/次，5次/天。产品干预10周。
粪便实验室检测：分别于试验基线日、第21天及试验干预期结束后内由指定医务人员采取全部志愿者粪便样本，每位志愿者粪便采集一次，且限定1克，放入密闭带盖的厌氧取样瓶中，冷藏条件下立即送往实验室。对基线日及第21天的粪便样本进行细菌计数和短链脂肪酸检测，其中粪便细菌计数包括双歧杆菌、乳杆菌活菌数的检测，检测方法采用实时定量PCR；短链脂肪酸的检测包括乙酸、丙酸和丁酸，检测方法采用气相色谱法。此外还对基线日及试验干预期结束后的粪便样本进行sIgA的检测，检测方法采用酶联免疫方法。
临床监测结果如下：
（1）婴儿粪便中的双歧杆菌和乳杆菌含量检测结果
产品干预前后各组婴儿粪便中的双歧杆菌和乳杆菌含量见表1
表1产品干预前后各组婴儿粪便中的双歧杆菌和乳杆菌含量（log10cfu/g）
由表1中数据可以得知，产品干预前母乳对照组婴儿粪便中的双歧杆菌和乳杆菌含量显著高于普通奶粉对照组和添加本发明实施例1-5益生菌组合物的普通奶粉试验组（p<0.01），经过3周的产品干预后，添加本发明实施例1-5益生菌组合物的普通奶粉试验组婴儿粪便中的双歧杆菌和乳杆菌含量显著增加，而母乳对照组和普通奶粉对照组婴儿粪便中的各种菌群含量在干预前后均没有显著变化（p>0.05）。
对产品干预后各组婴儿粪便中的菌群含量进行差异性比较分析得出，添加本发明实施例1-5益生菌组合物的普通奶粉试验组婴儿粪便中的双歧杆菌和乳杆菌含量显著高于普通奶粉对照组（p<0.01），并且与母乳对照组没有显著性差异（p>0.05）。这表明本试验所用的本发明实施例1-5益生菌组合物的普通奶粉与普通奶粉相比，能显著提高婴儿肠道中的双歧杆菌和乳杆菌含量，从而有效改善婴儿肠道的微生态环境，即该益生菌组合物可以通过调整益生菌的种类以及含量使各菌株之间能够相互作用，能够更好的促进婴幼儿胃肠对营养物质的吸收。
（2）婴儿粪便中的短链脂肪酸含量检测结果
产品干预前后各组婴儿粪便中的短链脂肪酸含量见表2
表2产品干预前后各组婴儿粪便中的短链脂肪酸含量（mg/g）
由表2中数据可以得知，产品干预前母乳对照组婴儿粪便中的乙酸含量显著高于普通奶粉对照组和添加本发明实施例1-5益生菌组合物的普通奶粉试验组，数据具有统计学意义（p<0.01）。经过3周的产品干预后，添加本发明实施例1-5益生菌组合物的普通奶粉试验组婴儿粪便中的各种短链脂肪酸含量均显著增加（p<0.05），而母乳对照组和普通奶粉对照组在干预前后均没有显著变化（p>0.05）。
对产品干预后各组婴儿粪便中的短链脂肪酸含量进行差异性比较分析得出，添加本发明实施例1-5益生菌组合物的普通奶粉试验组婴儿粪便中的乙酸含量和丙酸含量均显著高于普通奶粉对照组（p<0.05），这表明本试验所用的添加本发明实施例1-5益生菌组合物的普通奶粉与普通奶粉相比，能显著提高婴儿粪便中的乙酸含量和丙酸含量，并接近纯母乳喂养婴儿，即该益生菌组合物可以促进肠道中短链脂肪酸的增加，提高有机酸的含量，降低肠道pH值，导致肠道酸度降低而抑制有害菌，增加有益菌含量。
（3）婴儿粪便中的sIgA含量检测结果
产品干预前后各组婴儿粪便中的sIgA含量见表3
表3产品干预前后各组婴儿粪便中的sIgA含量（ng/g）
对产品干预后各组婴儿粪便中的sIgA含量进行差异性比较分析得出，添加本发明实施例1-5益生菌组合物的普通奶粉试验组婴儿粪便中的sIgA含量显著高于普通奶粉对照组（p<0.01），并且与母乳对照组没有显著性差异（p>0.05）。这表明本试验所用的添加本发明实施例1-5益生菌组合物的普通奶粉与普通奶粉相比，能显著提高婴儿粪便中的sIgA含量，并接近纯母乳喂养婴儿。即该益生菌组合物可以改善婴幼儿肠道菌群多样性，可以起到促进消化，刺激肠道免疫细胞，增强婴幼儿肠道免疫力等作用。
为了进一步证明本发明公开含量及配比的益生菌组合物具有好的效果，将本发明实施例1与对比例1-2进行对比，检测干预前后各组婴儿粪便中的双歧杆菌和乳杆菌含量（log10cfu/g）见下表4。
表4
由表4中数据可以得知，产品干预前添加实施例1益生菌组合物的普通奶粉婴儿粪便中的双歧杆菌和乳杆菌含量与添加对比例1益生菌组合物的普通奶粉和添加对比例2益生菌组合物的普通奶粉没有明显区别，经过3周的产品干预后，添加对比例1益生菌组合物的普通奶粉和添加对比例2益生菌组合物的普通奶粉婴儿粪便中的双歧杆菌和乳杆菌含量虽有增加，但是变化不明显（p>0.05），即益生菌添加量不在本发明公开范围内时，得到的益生菌组合物对增加婴儿体内双歧杆菌和乳杆菌的作用不大。
将本发明实施例2和对比例3-6进行对比，检测婴儿粪便中的短链脂肪酸含量（mg/g）。
表5
对产品干预后各组婴儿粪便中的短链脂肪酸含量进行差异性比较分析得出，添加本发明实施例2益生菌组合物的普通奶粉试验组婴儿粪便中的乙酸含量和丙酸含量均显著高于普通奶粉对照组（p<0.05），而添加本发明对比例3-6益生菌组合物的普通奶粉试验组的婴儿粪便中的短链脂肪酸含量虽有所增加但是变化并不明显，这表明益生菌添加量不在本发明公开范围内时，得到的益生菌组合物对增加婴儿体内短链脂肪酸含量变化作用不大。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (4)

1.一种改善婴幼儿肠道菌群多样性的益生菌组合物，其特征在于：按重量份数计包括以下组分：抗性糊精40-60份、低聚半乳糖5-15份、低聚果糖5-15份、乳双歧杆菌HN019冻干粉2-8份、动物双歧杆菌BB-12冻干粉2-8份、短双歧杆菌M-16V冻干粉2-8份、鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉2-8份和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉2-8份；
所述的乳双歧杆菌HN019冻干粉、动物双歧杆菌BB-12冻干粉和短双歧杆菌M-16V冻干粉的总重量份数计为M1，所述的鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉的总重量份数计为M2，M1和M2之比为2-5∶2；
所述的乳双歧杆菌HN019冻干粉、动物双歧杆菌BB-12冻干粉和短双歧杆菌M-16V冻干粉的重量份数之比为0.5-3∶1∶1；
所述的鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉的重量份数之比为1∶0.5-4。
2.根据权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于：按重量份数计包括以下组分：抗性糊精50-60份、低聚半乳糖8-12份、低聚果糖8-12份、乳双歧杆菌HN019冻干粉3-7份、动物双歧杆菌BB-12冻干粉3-7份、短双歧杆菌M-16V冻干粉3～7份、鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉3-7份和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉3-7份。
3.根据权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于：所述的乳双歧杆菌HN019冻干粉、动物双歧杆菌BB-12冻干粉、短双歧杆菌M-16V冻干粉、鼠李糖乳杆菌HN001冻干粉和发酵乳杆菌CECT5716冻干粉的活菌数均为107-1010CFU/g，且水分含量低于4％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的益生菌组合物，其特征在于：所述的益生菌组合物可应用于食品添加剂、人类食品、兽药和动物饲料方面。
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