CN116949020A - 一种稳定性提升的碱性蛋白酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及通过易错PCR技术进行随机突变获得在两种阴表面活性剂中稳定性提高的碱性蛋白酶突变体及其应用。所述碱性蛋白酶突变体为G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。在2％烷基苯磺酸AES存在情况下12h后的残余酶活达到85.9％，在2％烷基苯磺酸LAS存在情况下4h后的残余酶活达到61.2％。能够有效解决碱性蛋白酶在液体洗涤液中稳定性较低的问题。

Description

一种稳定性提升的碱性蛋白酶突变体及其应用
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及通过易错PCR技术进行随机突变获得在两种阴离子表面活性剂中稳定性提高的碱性蛋白酶酶突变体及其制备应用。
技术背景：
蛋白酶是一类能将蛋白质降解成小分子肽和氨基酸的水解酶，在工业生产中发挥重要的作用，被应用于诸多领域。碱性蛋白酶，则是一类能够在碱性条件下发挥其水解功能的，将蛋白质降解成氨基酸的蛋白酶，它在商业酶的销售中占据很大比例。碱性蛋白酶销量之大是因为其应用的广泛性，食品工业中用于改善食品的品质和风味；洗涤剂行业中添加碱性蛋白酶提升清洗效率；医药行业中可用于制备弹性蛋白酶来治疗脓肿和烧伤等；皮革工业中能有效增加皮革的柔韧性等，特别是消耗量巨大的洗涤剂行业，99％的洗涤剂都要添加碱性蛋白酶。碱性蛋白酶广泛的应用导致需求量巨大，价值攀升，碱性蛋白酶的生产菌也应运而生。碱性蛋白酶来源非常广泛，包括动物，植物和微生物。而微生物产生的碱性蛋白酶有很大一部分属于胞外分泌代谢产物，因此具有微生物培养基简单，生长迅速，产物提取分离简便等优点。
碱性蛋白酶自1914年作为洗涤剂添加剂引入以来，至今已占据洗涤剂酶市场上最大的份额，约占全球碱性蛋白酶需求量的三分之二。
在日常生活中，衣物洗涤是一个无法避开的问题，虽然随着社会的进步，已经可以利用机器代替人力进行衣物洗涤，但是在洗涤过程中洗涤剂的选择仍然是个棘手的问题。洗涤剂中的主要成分是表面活性剂，表面活性剂同时具有亲水基和疏水基，在洗涤过程中，多个表面活性剂分子会包裹衣物上的污渍，疏水基与污渍结合，而亲水基与水分子结合，从而形成一个胶束团，再经过机械摩擦运动，将胶束团从衣物上除去，从而达到净洗的效果。但是在这个过程中存在一个不足，那就是表面活性剂很容易和小分子物质形成胶束团，但是对于大分子的污渍力的去除较弱，需要添加更多的表面活性剂，这势必会对环境造成更坏的影响。而在洗涤剂中加入蛋白酶后，可以将许多污渍中的大分子成分分解为小分子，利于表面活性剂作用，提高去污力，降低表面活性剂的用量，减少环境污染。
液体洗涤剂中的碱性蛋白酶直接暴露于溶液中，与洗涤剂成分如表面活性剂、洗涤助剂及漂白剂直接接触作用，使得蛋白酶洗涤稳定性下降。除此之外，蛋白酶在液体洗涤环境中存在普遍的自溶失活现象，对其洗涤性能造成不利影响。因此酶的稳定性成了突出问题，提高碱性蛋白酶在表面活性剂中的稳定性迫在眉睫。
现阶段的加酶洗涤剂一般是添加多种酶和多种表面活性剂，这就要保证酶在多种表面活性剂存在的情况下要保持一定的活性。研究表明只使用一种表面活性剂时，阴离子表面活性剂如十二烷基苯磺酸钠(LAS)、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠(AES)、α－烯基磺酸钠(AOS)、十二烷基硫酸钠(SDS)在浓度过高的情况下对洗涤用复合酶产生一定的抑制作用，其中LAS所产生的抑制作用最大。非离子表面活性剂对酶没有很明显的抑制作用。在使用多种表面活性剂的情况下，阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂共同使用时，酶活力的降低程度比使用单一阴离子表面活性剂的降低程度小，不同的阴离子表面活性剂共同使用时对酶活力的影响也相对减少。
蛋白质定向进化的原理是指在试管内模拟自然界的进化方式，符合达尔文的进化论，在试管内是目标酶的基因发生随机突变，使碱基发生多点突变，使目标酶的某些特性产生改变，形成各种突变体，然后筛选出我们所需的酶蛋白。1999年美国科学家Arnold FH首次提出酶分子定向进化的概念，并应用于天然酶的改造。酶的体外定向进化不需要了解酶的空间结构和催化机制的前提下模拟自然进化过程，酶的定向进化主要有三个关键步骤:首先，通过随机突变或者基因片段重组技术获得突变体基因；其次，将突变后的基因片段与载体连接构建突变体文库；最后，根据酶的功能，酶与底物的反应机制和现象，建立快速高效的高通量筛选方法。易错PCR技术是指通过改变PCR的反应条件，如：改变易错PCR反应体系中Mg2+的浓度、加入Mn2+并改变其浓度、4种dNTP的浓度需重新调整或使用低保真度Taq酶等，在某种程度下使碱基随机错配产生不同的突变体，然后构建突变体文库以便后续筛选出我们需要的突变体。
近年来，研究者对于芽孢菌的研究越来越多。与大肠杆菌等原核表达***相比，主要是由于芽孢杆菌表达***：1、只有单层细胞外膜，分泌***完善，能够高效的分泌各种蛋白质；2、除少数类型外(如炭疽芽胞杆菌,蜡样芽胞杆菌等)，常见的芽孢杆菌都没有致病性，为公认的安全表达宿主菌株；3、表达产物折叠状态接近天然蛋白，不易形成包涵体、溶解度更好，可以更好地保持生物活性；4、可以直接将细胞外酶分泌到培养基中，无需细胞破碎，无胞内蛋白污染，利于后续分离纯化；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。
因此，在本发明将通过易错PCR技术对克劳氏芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶基因进行分子改造，利用枯草芽孢杆菌表达***进行高通量筛选，并进一步在解淀粉芽孢杆菌表达，得到在两种阴离子表面活性剂环境中稳定性均提高的碱性蛋白酶突变体基因。
发明内容：
基于酶在液体洗涤环境中容易失活的问题，为了获得在表面活性剂环境中稳定性提高的碱性蛋白酶，需对其现有性质作进一步的提升，本发明的目的在于提供一种在阴离子表面活性剂环境中稳定性提高的碱性蛋白酶突变体。将克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)来源的碱性蛋白酶基因(apr)同穿梭载体pBSA43构建重组表达载体pBSA43-apr，在枯草芽孢杆菌WB600、解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218中进行异源表达；利用易错PCR技术在G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T(以下简称MT6)突变体的基础上进行随机突变，并利用底物AAPF(Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA)对突变体进行高通量筛选，筛选出在两种阴离子表面活性剂环境中稳定性都提高的突变体。
实现本发明目的的技术路线概述如下：
对碱性蛋白酶G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T(以下简称MT6)突变体编码基因进行随机突变，利用枯草芽孢杆菌表达***筛选得到在阴离子表面活性剂环境中稳定性均有所提高的ALK突变体G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S(以下简称MT7)及其编码基因aprMT7，并实现了突变体在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得稳定性提高的ALK突变体。
本发明提供的技术方案之一，是一种碱性蛋白酶突变体，所述突变体是在SEQ IDNO.3所示碱性蛋白酶G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T突变体酶原区的基础上发生成熟肽的N212S突变获得的，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，命名为G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S突变体(以下简称MT7)；
进一步地，所述G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S突变体的编码基因aprMT7具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
本发明提供的技术方案之二，是包含上述突变体编码基因的重组质粒或重组菌株；
进一步地，所述重组质粒采用的表达载体为pBSA43；
进一步地，所述重组菌株采用的宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600或者解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218；
优选地，所述重组菌株是将突变体编码基因aprMT7与表达载体pBSA43连接后在宿主解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218表达所得。
本发明提供的技术方案之三，是上述重组质粒或重组菌株的应用，特别是在生产碱性蛋白酶中的应用。
本发明提供的技术方案之四，是碱性蛋白酶G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S突变体的应用，特别是在作为洗涤剂添加剂中的应用；
进一步地，是在添加有阴离子表面活性剂的洗涤剂中的应用；
更进一步地，所述阴离子表面活性剂分别为：烷基苯磺酸(LAS)，和/或乙氧基化烷基硫酸钠(AES)。
本发明的实验方案具体如下：
1、ALK突变体编码基因的获得，包括如下步骤：
(1)以SEQ ID NO.4所示的MT6突变体编码基因aprMT6为出发基因，构建表达载体pBSA43-aprMT6，进行随机突变。
(2)将突变后的基因，通过构建重组质粒后转入枯草芽孢杆菌WB600中，利用AAPF法测定突变体酶在两种阴离子表面活性剂中的初始活力及在20℃保温不同时间的残余酶活。
(3)经筛选获得相对于MT6在两种阴离子表面活性剂中稳定性均提高的ALK突变体，经测序获得突变体编码基因aprMT7，将含有在表面活性剂环境中稳定性提高的ALK突变体编码基因的质粒pBSA43-aprMT7保存。
2、含有碱性蛋白酶编码基因的解淀粉芽孢杆菌重组菌株的制备，具体包括如下步骤：
(1)将ALK突变体编码基因aprMT7与解淀粉芽孢杆菌表达质粒pBSA43通过连接得到新的重组质粒pBSA43-aprMT7；
(2)将重组质粒转入解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218中，经卡纳霉素(Kan)抗性筛选，酶切验证得到重组菌株，之后将重组菌株进行发酵培养。
在本发明中采用如下定义：
1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用单字母或三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2.碱性蛋白酶突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示碱性蛋白酶突变体中突变的氨基酸。如Asn212Ser，表示位置212的氨基酸由野生型ALK的Asn替换成Ser，位置编号对应于SEQ IDNO.7中野生型碱性蛋白酶成熟肽的氨基酸序列编号。
在本发明中，小写斜体apr表示野生型碱性蛋白酶ALK的编码基因，小写斜体aprMT6表示突变体G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T的编码基因，小写斜体aprMT7表示突变体G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S的编码基因。具体信息如下表。
有益效果：
1、本发明利用易错PCR技术在MT6的基础上进行随机突变，得到在阴离子表面活性剂LAS存在时稳定性相对于MT6提高的突变体G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S(MT7)，在LAS存在时稳定性相较于MT6提高了45.7％。
2、本发明利用易错PCR技术在MT6的基础上进行随机突变，得到在阴离子表面活性剂AES存在时稳定性相对于MT6提高的突变体G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S(MT7)，在AES存在时稳定性相较于MT6提高了55.6％。
3、本发明使用解淀粉芽孢杆菌表达***实现了在两种阴离子表面活性剂中稳定性提高的ALK突变体的高效表达和制备。
附图说明：
图1为碱性蛋白酶突变基因的PCR扩增电泳图。
其中：M为DNA Marker，1为碱性蛋白酶酶原突变基因；
图2为重组pBSA43-aprMT7质粒酶切验证图。
其中：M为DNA Marker，1为pBSA43-aprMT7经BamHI和SmaI双酶切图；
图3为野生型WT、MT6、N212S、MT7的酶液在烷基苯磺酸(LAS)20℃保温4h的残余酶活。
图4为野生型WT、MT6、N212S、MT7的酶液在乙氧基化烷基硫酸钠(AES)20℃保温12h的残余酶活。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明实施例所用培养基如下：
LB培养基：酵母提取物5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，121℃灭菌20min。
固体培养基是在液体LB培养基的基础上添加2％琼脂所获得的。
发酵培养基：玉米粉64g/L，豆饼粉40g/L，淀粉酶2.7g/L，Na2HPO44g/L，KH2PO40.3g/L；90℃保温30min后再121℃灭菌20min。
在本发明中，野生型碱性蛋白酶ALK的酶原区序列如SEQ ID NO.1所示：AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR。
在本发明中，野生型碱性蛋白酶ALK的成熟肽序列如SEQ ID NO.7所示：AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGE PSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR。
在本发明中，突变体G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S(MT7)的酶原区序列如SEQ ID NO.5所示：
AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLS
VELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGS
GVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNS
IGVLGVAPSAELYAVKVLPDSGWGTVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGTSS
PSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNR
ASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLSGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR。
以下将通过具体实施例对本发明作进一步解释说明。
实施例1野生型碱性蛋白酶基因的获得
1、使用试剂盒(OMEGA:Bacterial DNAKit)提取克劳氏芽孢杆菌(BacillusclausiiTCCC11004)的基因组DNA，提取步骤如下：
(1)用接种环将菌株接种至LB固体平板上，37℃恒温培养过夜。
(2)从培养菌体的平板上挑取单菌落接种到液体试管培养基中，37℃，220r/min振荡培养过夜。
(3)菌液倒入已灭菌的EP管中，12000rpm离心2min收集菌体，弃上清，重复3次。
(4)加入200μL无菌水重悬菌体，再加入100μL溶菌酶，吹吸混匀，37℃保温20min。
(5)加入100μL BTL buffer和20μL蛋白酶K，旋涡振荡混匀，55℃保温40min，每隔20min振荡混匀。
(6)加入5μL RNA酶，颠倒混匀数次，室温放置10min.
(7)12000rpm离心2min，除去未消化的部分，将上清转移至新的EP管中，加入220μLBDL buffer，65℃水浴15min。
(8)加入220μL无水乙醇，吹吸混匀。
(9)将EP管中的液体转入回收柱静置1min，12000rpm离心1min，将滤液重新倒入回收柱中，重复两次，弃下清。
(10)加入500μL HBC buffer，12000rpm离心1min，弃下清。
(11)加入700μL DNAwash buffer，静置1min，12000rpm离心1min，弃下清。
(12)加入500μL DNAwash buffer，静置1min，12000rpm离心1min，弃下清。
(13)12000rpm空离2min，弃废液管，将回收柱放到一个新的EP管中。
(14)置于55℃金属浴烘干10min，目的是挥发掉回收柱中的乙醇。
(15)加入50μL 55℃的无菌水，室温静置5min，12000rpm离心2min，弃回收柱，EP管中液体为基因组。
2、以提取的野生型基因组为模板，在ORF框上下游设计一对引物扩增野生型apr基因，分别引入限制性酶切位点BamHI、SmaI，本发明的碱性蛋白酶基因apr的扩增引物如下(其中划线部分为限制性内切酶的酶切位点)：
上游引物ALK-F：
5’-CGCGGATCCGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAAT-3’
下游引物ALK-R：
5’-TCCCCCGGGTTAGCGTGTTGCCGCTTCT-3’
以ALK-F和ALK-R作为上、下游引物，以提取的野生型基因组为模板进行扩增。
其扩增的反应体系为：
ALK-F 2.0μL
ALK-R 2.0μL
模板 2.0μL
Primer Star Max酶 25μL
ddH2O 19μL
扩增程序为：
PCR扩增后的产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到1062bp的条带，用小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到野生型碱性蛋白酶酶原区基因apr(SEQ ID NO.2)，apr与pBSA43质粒分别用限制性内切酶BamHI和SmaI进行双酶切，将切胶回收的apr与线性化载体pBSA43载体连接，得到重组质粒pBSA43-apr，并将其转化至大肠杆菌JM109及枯草芽孢杆菌WB600中，得到重组菌株JM109/pBSA43-apr、WB600/pBSA43-apr。
实施例2构建碱性蛋白酶突变体文库筛选稳定性提高的碱性蛋白酶突变体
一、碱性蛋白酶基因G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T(MT6)的质粒的构建：
将MT6的编码基因aprMT6与pBSA43质粒分别用限制性内切酶BamHI和SmaI进行双酶切，将切胶回收的目的片段aprMT6与线性化载体pBSA43载体连接，得到重组质粒pBSA43-aprMT6，并将其转化至大肠杆菌JM109，得到重组菌株JM109/pBSA43-aprMT6，随机挑取两个转化子进行质粒提取，并进行酶切验证。之后送去金唯智公司进行测序，将测序正确的质粒再次转化至枯草芽孢杆菌WB600中，得到重组菌株WB600/pBSA43-aprMT6。
二、以重组质粒pBSA43-aprMT6为模板、ALK-F/R为引物进行随机突变。
其扩增的反应体系为：
ALK-F 2.0μL
ALK-R 2.0μL
模板 2.0μL
Taq酶 25μL
ddH2O 19μL
扩增程序为：98℃预变性30min；98℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸8s反应30个循环；72℃延伸10min
三、PCR结束后经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到1000bp左右的条带(见图1)。用小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到突变体的基因aprMT。aprMT与pBSA43质粒分别用限制性内切酶BamHI和SmaI进行双酶切，将切胶回收的片段与线性化pBSA43载体连接，转化至大肠杆菌JM109感受态中。将长出的单菌落全部洗下于试管中培养，提取其质粒。并将其转入至枯草芽孢杆菌WB600中。将长出的所有转化子对接活化到一个新的分区划线的卡纳抗性板上，37℃倒置培养12小时。然后利用高通量筛选体系对这些突变体菌株进行孔板筛选。具体操作步骤如下：
(1)在无菌条件下，将含有Kan抗性的液体LB培养基分装到无菌的48孔板中，每个孔700μL。
(2)挑取单菌落接种到48深孔板中(做好标记)，每个孔板中留四个空白对照(即WB600/pBSA43-apr、WB600/pBSA43-aprMT6)，37℃，600r/min振荡培养过夜。
(3)在无菌条件下，将含有Kan抗性的液体LB培养基分装到无菌的24深孔板中，每个孔1mL，吸取20μL菌液按标记加到各个孔中，37℃，600r/min振荡培养48h。
(4)培养结束后，取出24深孔板，在OD600下测定每个孔中菌液的菌浓。
(5)将24深孔板放到孔板离心机中，5000r/min，离心30min，收集上清作为粗酶液进行酶活测定。
(6)将收集好的粗酶液稀释20倍后，分别吸取100μL加入到终浓为2％的两种阴离子表面活性中(烷基苯磺酸LAS、乙氧基化烷基硫酸钠AES)，分别测定酶液在刚加入至阴离子表面活性剂时的酶活以及在20℃保温不同时间的酶活(测酶活步骤参照实施例2步骤四)。以不加表面活性剂测出的酶活为100％，计算出酶液在表面活性剂的环境下保温不同时间的残余酶活。初步筛选出在阴离子表面活性剂中比WT、MT6稳定性好的突变体。
四、短肽底物测定碱性蛋白酶酶活力
短肽底物：AAPF法是以Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA为底物，其中Ala-Ala两个氨基酸残基会组成一个疏水基团，Pro氨基酸具有空间位阻，导致其C端肽键不容易被切割，因此碱性蛋白酶更倾向于水解Phe-pNA之间连接的肽键，从而将pNA(对硝基苯胺)释放出来，游离的pNA可以在OD410处被检测到。用分光光度计于OD410处测定溶液的吸光值，酶活力与吸光度成正比，即可计算碱性蛋白酶的酶活力。
测定方法：精准吸取20μL浓度为4mM的AAPF溶液置于96孔板中，加入80μL pH为10.5的硼酸缓冲液，吹吸混匀，40℃保温2min。实验组加入100μL稀释后的酶液，对照组加入100μL的硼酸缓冲液，吹吸混匀。40℃下反应10min，用酶标仪测定OD＝410nm处的吸光值。将实验组测得的OD值与对照组的OD值相减得到ΔOD，再将ΔOD代入以下公式算出相应的酶活力，以不加表面活性剂算出的酶活为100％，计算出酶液在阴离子表面活性剂中保温不同时间的残余酶活：
其中，N为稀释倍数。
酶活定义为在40℃，pH＝10.5的条件下，1mL酶液1min水解AAPF产生1μmol pNA的酶量定义为一个酶活力单位U。
五、将筛选出来的含稳定性较高的突变体的转化子接于5mL液体LB抗性试管，37℃，220r/min振荡培养过夜，并将其质粒提出(提质粒步骤实施例2)，并进行酶切验证(见附图2)。之后送去金唯智公司进行测序，将测序结果与碱性蛋白酶MT6基因进行比对，确定其是在MT6的基础上发生了成熟肽212位Asn→Ser的突变，并将该碱性蛋白酶命名为G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S(简称MT7)突变体，其编码基因命名为aprMT7，并将含有该基因的转化子WB600/pBSA43-aprMT7进行菌种保存。
实施例3碱性蛋白酶单突变体的制备
由于在MT7突变体中发现了新的突变位点Asn212Ser，为了确定该突变位点的作用，本实施例将在SEQ ID NO.1所示的野生型碱性蛋白酶的基础上进行Asn212Ser定点突变，获得N212S突变体的编码基因。具体如下：
以获得的野生型质粒pBSA43-apr为模板，在212位点设计一对引物进行定点突变，扩增引物如下：
上游引物ALK-P1：
5’-GCTTAAGCGGTACATCGATGGC-3’
下游引物ALK-P2：
5’-TAAGCTGGCATACGTTGAACC-3’
以ALK-P1和ALK-P2作为上、下游引物，以质粒pBSA43-apr为模板进行扩增。
其扩增的反应体系为：
ALK-P1 0.35μL
ALK-P2 0.35μL
模板 0.5μL
KOD酶 0.25μL
ddH2O 8.5μL
105iPCR Buffer 1.25μL
dNTPS 1.25μL
扩增程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，54℃退火20s，反应8个循环；16℃保温。
PCR扩增后的产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到7000bp左右的条带(包含载体和目的基因)，用DPNI消化PCR产物，消化结束后，将消化产物与T4连接酶进行连接，得到重组质粒pBSA43-aprN212S，并将其转化至大肠杆菌JM109，得到重组菌株JM109/pBSA43-aprN212S，随机挑取两个转化子进行质粒提取，并进行酶切验证。之后送去金唯智公司进行测序，将测序正确的质粒pBSA43-aprN212S再次转化至枯草芽孢杆菌WB600中，得到重组菌株WB600/pBSA43-aprN212S。
实施例4碱性蛋白酶突变体在阴离子表面活性剂中的稳定性评估
将上述实施例2、例3所获得的突变体重组菌株WB600/pBSA43-aprMT7、WB600/pBSA43-aprN212S和野生型重组菌株WB600/pBSA43-apr、碱性蛋白酶突变体重组菌株WB600/pBSA43-aprMT6分别接种于5mL含有卡纳霉素的LB液体培养基(卡那霉素的终浓为50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，以2％的接种量转接于50mL新鲜含卡那霉素的LB培养基中，37℃，220r/min培养48h。
发酵液离心取上清，首先，杂蛋白以25％饱和度的硫酸铵盐析除去，再用饱和度为65％的硫酸铵盐析沉淀目的蛋白。蛋白溶解后，透析除盐，再将盐析脱盐后得到的活性组分用pH 7.0的0.02mol/L Tris-HCl缓冲液溶解。将蛋白上样至纤维素离子交换层析柱，再用含不同浓度NaCl(0～1mol/L)的0.02mol/L Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液对蛋白进行梯度洗脱，收集目的蛋白。再将蛋白上样至sephadex g25凝胶层析柱，用含不同浓度NaCl(0～1mol/L)的0.02mol/L Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液以0.5mL/min的速度洗脱，最后获得纯化的酶液，继而进行酶活测定，酶活测定方法如实施例2。
(1)测定野生型ALK与突变体MT6、MT7、N212S的酶活，结果如下表：
表2：野生型ALK、突变体N212S、MT6、MT7比酶活
比酶活(U/mg)
WT 9.32
N212S 11.03
G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T 40.93
G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S 38.98
(2)将纯化后的酶液稀释20倍吸取100μL加入到终浓为2％的两种阴离子表面活性剂中(烷基苯磺酸LAS、乙氧基化烷基硫酸钠AES)，分别测定酶液在刚加入至两种阴离子表面活性剂时的酶活以及在20℃保温不同时间的酶活。以不加表面活性剂测出的酶活为100％，计算出酶液在表面活性剂的环境下保温不同时间的残余酶活。
最终计算得到野生型ALK与突变体N212S、MT6及MT7分别在20℃、两种阴离子表面活性剂存在的环境下保温12h和4h的残余酶活如下表所示。
表3：酶液在2％ AES/LAS保温12h/4h的残余酶活
AES中12h残余酶活 LAS中4h残余酶活
WT 9.3％ 4.4％
N212S 30.0％ 9.5％
G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T 30.3％ 15.5％
G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S 85.9％ 61.2％
由上述结果可知，MT7相较MT6的比酶活虽略有降低的，但是在两种阴离子表面活性剂(LAS、AES)存在的情况下MT7相较MT6、N212S的稳定性均有显著提升。其中，MT7在2％烷基苯磺酸AES存在情况下12h后的残余酶活达到85.9％，在2％烷基苯磺酸LAS存在情况下4h后的残余酶活达到61.2％。
实施例5碱性蛋白酶突变体在解淀粉芽孢杆菌重组菌株中的表达及制备
将ALK野生型编码基因apr，以及突变体MT6、MT7、N212S编码基因与解淀粉芽孢杆菌表达质粒pBSA43通过连接得到新的重组质粒pBSA43-apr、pBSA43-aprMT6、pBSA43-aprMT7、pBSA43-aprN212S；
将重组质粒转入解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218中，经卡纳霉素(Kan)抗性筛选，酶切验证得到野生型重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-apr，和突变体重组菌CGMCCNo.11218/pBSA43-aprMT6、CGMCC No.11218/pBSA43-aprMT7、CGMCC No.11218/pBSA43-aprN212S。
分别将解淀粉芽孢杆菌突变体重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-aprN212S、CGMCC No.11218/pBSA43-aprMT6和CGMCC No.11218/pBSA43-aprMT7与野生型重组菌CGMCCNo.11218/pBSA43-apr接种于5mL的发酵培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜发酵培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，继续以37℃，220r/min培养48h。
使用实施例2中的短肽底物法测定解淀粉芽孢杆菌发酵所得碱性蛋白酶活力(发酵液离心取上清测定酶活)。在解淀粉芽孢杆菌中碱性蛋白酶的发酵液酶活：ALK野生型酶活为94.75U/ml，ALK突变体N212S的酶活为115.87U/mL，ALK突变体G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T(MT6)的酶活为404.39U/ml，ALK突变体G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S(MT7)的酶活为393.70U/ml。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (10)

1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶突变体为G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.如权利要求1所述的一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S突变体，具有如下氨基酸序列：
(1)具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；或者
(2)与(1)同源性75％以上的氨基酸序列；或者
(3)在(1)的基础上进行一个或多个氨基酸替换，和/或缺失，和/或添加后获得的具有(1)相同功能的氨基酸序列。
3.权利要求2所述碱性蛋白酶突变体的编码基因。
4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述G95P/A96D/S99W/S101T/P127S/S126T/N212S突变体的编码基因aprMT7核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.包含权利要求4所述编码基因的重组质粒或重组菌株。
6.如权利要求5所述的重组质粒或重组菌株，其特征在于，采用的表达载体为pBSA43，宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600或解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.11218。
7.权利要求6所述重组质粒或重组菌株在生产权利要求1所述碱性蛋白酶突变体中的应用。
8.权利要求1所述碱性蛋白酶突变体的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，是在作为洗涤剂添加剂中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，是在添加有阴离子表面活性剂的洗涤剂中的应用，所述阴离子表面活性剂为：烷基苯磺酸(LAS)，和/或乙氧基化烷基硫酸钠(AES)。
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