CN118240692A - 一株乳杆菌及其应用 - Google Patents
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- Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
Abstract
本发明公开了一株乳杆菌及其应用，所述乳杆菌为耐酸乳杆菌，命名为HSCY2071，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年11月27日，保藏编号为CGMCC No.29137。HSCY2071具有良好的耐乙醇、耐乙酸、耐高温特性，产乳酸能力可达1.83g/100mL。HSCY2071应用在食醋酿造领域，可明显提高食醋中乳酸含量，改善产品风味，提高产品品质。
Description
技术领域
本发明属于微生物应用和食醋酿造领域，具体涉及一株耐乙醇、耐乙酸、耐高温、高产酸的乳杆菌及其应用。
背景技术
我国传统固态发酵食醋的酿造环境具有高乙醇、高乙酸、高温的特性，许多酿造微生物因在醋酸发酵过程中受到多种胁迫，导致生长受到限制，但仍有少部分微生物适应了这种发酵环境而大量生长繁殖。目前，利用传统可培养技术和高通量测序技术研究食醋发酵过程中微生物的群落结构，发现醋醅中优势微生物主要是醋酸菌和乳酸菌。乳酸菌在醋酸发酵阶段主要贡献乳酸，乳酸具有酸味柔和、刺激性小的特点，可以缓和醋酸刺激的酸味。此外，乳酸也是乳酸乙酯、乙偶姻等一些风味物质的前体物质，直接或间接地影响着食醋的品质和风味。
传统发酵过程中的乳酸菌主要从原料、环境和接种的醋醅中带入，部分乳酸菌在发酵过程中因不适应食醋酿造的特殊环境而无法增殖。微生物的环境耐受能力的高低决定了其在食醋酿造中发挥作用的大小，有关食醋源耐受性好的耐酸乳杆菌的报道较少，筛选出耐乙醇、耐乙酸、耐高温的乳酸菌，对稳定并提高食醋产品品质具有重要的意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明从镇江香醋发酵后期的醋醅中分离筛选得到一株适合于食醋酿造的耐乙醇、耐乙酸、耐高温，高产酸的耐酸乳杆菌。
具体地，本发明第一方面提供了耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)菌株HSCY2071，其特征在于，所述菌株HSCY2071保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年11月27日，保藏编号为CGMCC No.29137。
本发明第二方面提供了微生物菌剂，所述菌剂包含本发明第一方面所述的菌株HSCY2071。
本发明第三方面提供了本发明第一方面所述的HSCY2071菌株或本发明第二方面所述的微生物菌剂在食醋酿造中的应用。
在某些实施方式中，所述食醋酿造包括固态发酵和液态发酵。
在某些实施方式中，所述食醋包括发酵包括香醋或陈醋。
本发明第四方面提供了一种食醋酿造的方法，在醋酸发酵阶段接种本发明第一方面所述的菌株或本发明第二方面所述的微生物菌剂。
本发明第五方面提供了根据本发明第四方面所述的方法制备获得的食醋。
本发明第六方面提供了一种食醋，所述食醋包括本发明第一方面所述的菌株HSCY2071或本发明第二方面所述的微生物菌剂。
本发明相对于现有技术具有以下效果：
本发明从镇江香醋的醋醅中分离筛选得到一株耐乙醇、耐乙酸、耐高温的耐酸乳酸菌，该耐酸乳杆菌在乙醇浓度(v/v)3％～17％范围内正常生长，具有良好的耐乙醇特性；在乙酸浓度2g/100mL～9g/100mL范围内正常生长，具有良好的耐乙酸特性；在25℃～45℃温度范围内正常生长，具有良好的耐高温特性。产乳酸能力可达1.83g/100mL。应用在食醋酿造领域，可明显提高食醋中乳酸含量，改善产品风味，提高产品品质。
附图说明
图1为本发明的耐酸乳杆菌HSCY2071的平板培养菌落形态。
图2为本发明的耐酸乳杆菌HSCY2071的结晶紫染色的菌体形态。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另作定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。同样，“一个”或者“一”等类似词语也不表示数量限制，而是表示存在至少一个。
实施例1菌株HSCY2071的分离、纯化及鉴定
1.1菌株的分离与纯化
称取镇江香醋发酵后期的醋醅样品10g，置于90mL已灭菌的MRS液体培养基中，温度37℃、转速200r/min，振荡培养20min后，对样品进行10倍梯度稀释，选取稀释梯度为10-3、10-4、10-5和10-6的稀释液，各梯度稀释液各吸取100μL涂布MRS培养基平板，37℃倒置培养48h。挑取MRS培养基平板上产透明圈最大的菌落，将单个菌落平板划线分离3次获得纯培养物，4℃冰箱保存以供试用。其中，MRS培养基：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，碳酸钙20.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6，115℃灭菌20min。MRS液体培养基不加琼脂。
1.2菌株形态学鉴定
菌株HSCY2071在37℃培养48h后，平板上的菌落形态为乳白色、圆形、中间突起、光滑、不透明、湿润、易挑取。在显微镜下观察菌体形态为杆状，单独、成对或短链排列，革兰氏染色阳性，从菌落形态和菌体形态上初步判断为一种乳杆菌。
1.3菌株分子生物学鉴定
纯化筛选得到的细菌，取指数生长期的新鲜菌液，离心收集菌体，采用基因组抽提试剂盒提取基因组DNA。采用细菌通用引物P0-P6(中国硕士学位论文全文数据库，朱其瀚，“镇江香醋发酵过程中微生物分离及其产酸特性”，2008年)扩增其16S rDNA全长序列。PCR扩增产物的测序由上海生工生物技术公司完成。将测得的16S rDNA序列，在NCBI数据库中进行BLAST比对确定其种属。筛得的菌株16S rDNA全长序列为1419bp，与其具有最高同源性的菌株为Lactobacillus acetotolerans，相似度为99.72％，16S rDNA序列见SEQ ID NO：1，将该菌株命名为耐酸乳杆菌HSCY2071。
耐酸乳杆菌HSCY2071的16S rDNA核苷酸序列(SEQ ID NO:1)
TGCAGTCGAGCGAGCCGAACTAATTGATTACCTTCGGGTATGAAGTTAGGGAAGCGAG
CGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCCTATAGTCTGGGATACCACTTGG
AAACAGGTGCTAATACCGGATAAAAGGAGAGATCACATGATTTCTTTTTGAAAGGCGG
CGTAAGCTGTCGCTAAAGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGG
CTTACCAAGGCAACGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTG
AGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGC
AAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGT
TGTTGGTGAAGAAAGATAGTGAGAGTAACTGCTCATTATTTGCCGGTAATCAACCAGA
AAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTC
CGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAAGATAAGTCAGATGTGAAAGCC
CTCGGCTTAACCGAGGAATAGCATCGGAAACTGTCTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGA
GTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGA
AGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGG
ATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCTGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCC
GCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAG
GTCAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAT
TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCCAACCTAAGAGATT
AGGCGTTCCCTTCGGGGACACTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC
GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATTAGTTGCCAGCATT
AAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACG
TCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGTACAA
CGAGGAGCGAACTTGTGAAGGCAAGCGAATCTCTGAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTG
TAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCC
GCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTA
ACACCCAAAGCCGGCCGGATAACCTAGT
上述菌株于2023年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC No.29137，其分类命名分别为Lactobacillus acetotolerans。
1.4菌株产酸特性
将活化好的菌液按5％(v/v)的比例接种于液体培养基中，37℃静置培养5d。经HPLC测得发酵液中的乳酸含量为1.83g/100mL。
1.5菌株耐乙醇特性
将活化好的菌液按5％(v/v)的比例接种于乙醇浓度(v/v)分别为3％、6％、9％、12％、14％、15％、16％、17％、18％的MRS液体培养基中，37℃静置培养5d。在分光光度计波长600nm处测定菌液的OD值。菌株在乙醇浓度(v/v)3％～17％范围内正常生长，具有良好的耐乙醇特性。
1.6菌株耐乙酸特性
将活化好的菌液按5％(v/v)的比例接种于乙酸浓度分别为2g/100mL、4g/100mL、6g/100mL、7g/100mL、8g/100mL、9g/100mL、10g/100mL的MRS液体培养基中，37℃静置培养5d。在分光光度计波长600nm处测定菌液的OD值。菌株在乙酸浓度2g/100mL～9g/100mL范围内正常生长，具有良好的耐乙酸特性。
1.7菌株耐高温特性
将活化好的菌液按5％的比例接种于MRS液体培养基中，分别置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、47℃、50℃静置培养5d。在分光光度计波长600nm处测定菌液的OD值。菌株在25℃～45℃温度范围内正常生长，具有良好的耐高温特性。
实施例2耐酸乳杆菌HSCY2071在镇江香醋酿造中的应用
2.1菌株的扩大培养
一级种子液的制备：按照3％(v/v)的接种量，将纯化后、处于对数生长期的耐酸乳杆菌HSCY2071菌液接种到MRS液体培养基中，37℃静置培养48h。
二级种子液的制备：选用50L液态发酵罐，加水30L，搅拌速度为120r/min，将水加热到90℃，加入经粉碎并过100目筛得到的米粉10kg，加入2万U/mL高温α-淀粉酶，添加量为3.0mL，保温35min得到醪液；然后将醪液温度降至55℃，加入5万U/g糖化酶，添加量为0.50g，保温35min，制得糖化液；在所制备的糖化液中添加1‰(w/v)的脱脂奶粉，115℃灭菌20min；冷却至30℃后，按照3％(v/v)的接种量接入一级种子液，控制温度37℃，罐内压强为0.05MPa，搅拌速度为60r/min。发酵结束后，乳酸菌的活菌数达到109CFU/mL。
2.2酒精发酵
取50kg糯米加水浸泡过夜。然后再将糯米捞出、冲净、沥干、蒸煮，得到糯米熟料。用冷水淋洗糯米熟料，再取温水进行回淋，使糯米熟料温度上下均匀。将淋洗后的糯米熟料置于大缸中，加入熟料重量1.5％的麦曲和0.5％的活性干酵母，拌匀后进行酒精发酵，发酵周期为7天，得酒醪。
2.3醋酸发酵
添加耐酸乳杆菌组：
选取300kg大缸，加入酒醪188kg，麸皮63kg，大糠30kg，接入酒醪重量的2％的耐酸乳杆菌菌液，将菌液与所投原料一起充分拌匀后，接种原料总重量5％的种醅(发酵至第7天的醋醅)，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。
对照组1：
选取300kg大缸，加入酒醪188kg，麸皮63kg，大糠30kg，将所投原料充分拌匀后，接种原料总重量5％的种醅(发酵至第7天的醋醅)，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。
2.4加盐封醅7天，加入炒米色进行淋醋。经煎醋、陈酿、杀菌、灌装，即得成品。对照组1步骤与实施例1保持一致。
2.5醋卤指标对比
发酵结束时，取两组醋卤检测总酸、乳酸、乳酸乙酯及乙偶姻含量。总酸以乙酸计，采用酸碱滴定法测定。乳酸采用HPLC测定。乳酸乙酯采用GC-MS测定。乙偶姻采用肌酸比色法测定。相比于对照组1，实施例1的总酸含量增加了5.70％，乳酸含量增加了74.17％，乳酸乙酯含量增加了123.81％，乙偶姻含量增加了91.73％。
表1镇江香醋发酵结束醋卤指标对比
2.6成品醋感官指标分析
实施例1与对照组1的食醋产品感官指标评分结果见表3。实施例1的成品醋香味及滋味明显优于对照组1，说明在醋酸发酵阶段添加耐酸乳杆菌，显著提高了产品品质。
表2镇江香醋成品醋感官指标分析
| 组别 | 色泽(10分) | 体态(10分) | 香味(10分) | 滋味(10分) |
| 实施例1 | 9.8 | 9.5 | 9.3 | 9.5 |
| 对照组1 | 9.7 | 9.5 | 7.8 | 7.0 |
实施例3耐酸乳杆菌HSCY2071在山西老陈醋中的应用
3.1菌株的扩大培养
一级种子液的制备：按照5％(v/v)的接种量，将纯化后、处于对数生长期的耐酸乳杆菌HSCY2071菌液接种到MRS液体培养基中，37℃静置培养24h。
二级种子液的制备：选用50L液态发酵罐，加水30L，搅拌速度为120r/min，将水加热到95℃，加入经粉碎并过100目筛得到的米粉10kg，加入2万U/mL高温α-淀粉酶，添加量为4.0mL，保温40min得到醪液；然后将醪液温度降至60℃，加入5万U/g糖化酶，添加量为1.0g，保温40min，制得糖化液；在所制备的糖化液中添加3‰(w/v)的脱脂奶粉，115℃灭菌20min；冷却至35℃后，按照5％(v/v)的接种量接入一级种子液，控制温度37℃，罐内压强为0.05MPa，搅拌速度为60r/min。发酵结束后，乳酸菌的活菌数达到109CFU/mL。
3.2酒精发酵
将高粱粉碎成四六瓣后，加入50℃温水浸泡过夜，将浸泡好的高粱蒸煮2h，每100kg高粱加入62.5kg大曲拌匀，控制发酵温度为28-32℃进行酒精发酵，前3天为敞口发酵，之后再封口静置发酵15天。
3.3醋酸发酵
添加耐酸乳杆菌组：
选取300kg大缸，加入酒醪150kg，麸皮68kg，大糠79kg，接入酒醪重量的5％的耐酸乳杆菌菌液，将菌液与所投原料一起充分拌匀后，接种原料总重量10％的种醅(2-3天发酵旺盛的醋醅)，再按照山西老陈醋的固态发酵工艺进行翻醅操作至发酵结束。
对照组2：
选取300kg大缸，加入酒醪150kg，麸皮68kg，大糠79kg，将所投原料充分拌匀后，接种原料总重量10％的种醅(2-3天发酵旺盛的醋醅)，再按照山西老陈醋的固态发酵工艺进行翻醅操作至发酵结束。
3.4加盐封醅10天，经熏醅、淋醋、煎醋、陈酿、杀菌、灌装，即得成品。对照组2步骤与实施例2保持一致。
3.5醋卤指标对比
发酵结束时，取两组醋卤检测总酸、乳酸、乳酸乙酯及乙偶姻含量。总酸以乙酸计，采用酸碱滴定法测定。乳酸采用HPLC测定。乳酸乙酯采用GC-MS测定。乙偶姻采用肌酸比色法测定。相比于对照组2，实施例2的总酸含量增加了9.30％，乳酸含量增加了62.95％，乳酸乙酯含量增加了118.36％，乙偶姻含量增加了124.58％。
表3山西老陈醋发酵结束醋卤指标对比
3.6成品醋感官指标分析
实施例2与对照组2的食醋产品感官指标评分结果见表4。实施例2的成品醋香味及滋味明显优于对照组2，说明在醋酸发酵阶段添加耐酸乳杆菌，显著提高了产品品质。
表4山西老陈醋成品醋感官指标分析
| 组别 | 色泽(10分) | 体态(10分) | 香味(10分) | 滋味(10分) |
| 实施例2 | 9.5 | 9.0 | 9.2 | 9.4 |
| 对照组2 | 9.2 | 9.0 | 8.0 | 7.8 |
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这中叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (8)
1.耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)菌株HSCY2071，其特征在于，所述菌株HSCY2071保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年11月27日，保藏编号为CGMCC No.29137。
2.微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含权利要求1所述的菌株HSCY2071。
3.权利要求1所述的HSCY2071菌株或权利要求2所述的微生物菌剂在食醋酿造中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述食醋酿造包括固态发酵和液态发酵。
5.根据权利要求3或4所述的应用，所述食醋包括发酵包括香醋或陈醋。
6.一种食醋酿造的方法，其特征在于，在醋酸发酵阶段接种权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的微生物菌剂。
7.根据权利要求6所述的方法制备获得的食醋。
8.食醋，其特征在于，包括权利要求1所述的菌株HSCY2071或权利要求2所述的微生物菌剂。
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