CN110004093A - 一种枯草芽孢杆菌培养基原料及其制备方法和应用、提高杆菌霉素d产量的培养基 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌培养基原料及其制备方法和应用、提高杆菌霉素d产量的培养基 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种枯草芽孢杆菌培养基原料及其制备方法和应用、提高杆菌霉素D产量的培养基，涉及微生物发酵技术领域，本发明所述枯草芽孢杆菌培养基原料为纤维素酶和木聚糖酶双酶解玉米秸秆的酶解上清液。本发明结合纤维素酶和木聚糖酶的酶解特性，利用纤维素酶和木聚糖酶双酶解玉米杆菌，双酶解得到的酶解上清液作为培养基原料可有效提高杆菌霉素D的产量和合成效率。这为实现杆菌霉素D大规模的工业化应用，将杆菌霉素D开发成天然食品防腐剂，奠定了科学合理的技术基础。

Description

一种枯草芽孢杆菌培养基原料及其制备方法和应用、提高杆 菌霉素D产量的培养基
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌培养基原料及其制备方法和应用、一种提高杆菌霉素D产量的枯草芽孢杆菌培养基。
背景技术
中国是农业大国，每年会产生大量的玉米秸秆，玉米秸秆含有大量纤维素、半纤维素和木质素等大分子碳水化合物。如果将玉米秸秆直接用于微生物发酵，很难被微生物利用。酶解玉米秸秆，得到更小分子的还原糖类，应用于微生物发酵，生产一些有价值的目标代谢产物，已经成为国内外研究者的共识。尽管如此，由于单酶的作用底物种类较少，酶解效率较低，从而制约了酶解技术在微生物发酵领域的应用，而采用双酶解的方法，由于作用底物多，能显著提高酶解效率，获得更多类型小分子的还原糖类，从而丰富用于微生物发酵的碳源。
杆菌霉素D(bacillomyicinD)是由枯草芽孢杆菌产生的一种次生代谢产物，具有抑制病原菌生长和抗肿瘤等生理活性，具有十分广阔的应用前景。自然条件下，杆菌霉素D在枯草芽孢杆菌中的合成能力十分有限，这限制了杆菌霉素D的工业化应用。
发明内容
本发明为了克服现有杆菌霉素D产量不足的缺陷，提供了一种枯草芽孢杆菌培养基原料及其制备方法和应用、提高杆菌霉素D产量的培养基，采用本发明所述的培养基原料构建培养基并发酵枯草芽孢杆菌，可显著提高杆菌霉素D的产率，为实现杆菌霉素D大规模工业化应用奠定基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌培养基原料，所述培养基原料为纤维素酶和木聚糖酶双酶解玉米秸秆的酶解上清液。
优选的，所述纤维素酶和木聚糖酶酶解时的质量比为1～2:2～3。
优选的，所述纤维素酶的比活力为10000～120000U/g，所述木聚糖酶的比活力为10000～120000U/g。
本发明还提供了一种上述技术方案所述枯草芽孢杆菌培养基原料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将玉米秸秆、纤维素酶、木聚糖酶和水混合，在50～60℃条件下酶解60～80h，得到酶解复合物；
(2)将所述酶解复合物固液分离，得到所述酶解上清液。
优选的，所述步骤(1)中，玉米秸秆的质量、纤维素酶的质量、木聚糖酶的质量和水的体积之比为：1～2g:1～2g:2～3g:54～74ml。
优选的，所述步骤(2)中，固液分离的方法为离心，离心的转速为7000～10000r/min，离心的时间为8～15min。
本发明还提供了前述技术方案所述枯草芽孢杆菌培养基原料在提高杆菌霉素D产量中的应用。
本发明还提供了一种提高杆菌霉素D产量的枯草芽孢杆菌培养基，包括前述技术方案所述的枯草芽孢杆菌培养基原料、酵母提取物、L-谷氨酸钠和磷酸二氢钾。
优选的，所述培养基中，所述枯草芽孢杆菌培养基原料的体积、酵母提取物的质量、L-谷氨酸钠的质量和磷酸二氢钾的质量之比为100ml:1～4g:5～15g:0.5～2g。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌培养基原料，所述培养基原料为纤维素酶和木聚糖酶双酶解玉米秸秆的酶解上清液。本发明结合纤维素酶和木聚糖酶的酶解特性，利用纤维素酶和木聚糖酶双酶解玉米杆菌，双酶解得到的酶解上清液作为培养基原料可有效提高杆菌霉素D的产量和合成效率。这为实现杆菌霉素D大规模的工业化应用，将杆菌霉素D开发成天然食品防腐剂，奠定了科学合理的技术基础。
本发明所述的枯草芽孢杆菌培养基原料的原料来源广泛、成本低，并且制备方法简便易行。可进一步降低杆菌霉素D的生产成本，同时也提升了玉米秸秆的附加值。
具体实施方式
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌培养基原料，所述培养基原料为纤维素酶和木聚糖酶双酶解玉米秸秆的酶解上清液。本发明选择纤维素酶和木聚糖酶进行双酶解的目的是提高酶解效率和还原糖种类，利于微生物利用，累积菌体，提高代谢产物的合成能力。
在本发明中，双酶解玉米秸秆时，所述纤维素酶和木聚糖酶的质量比优选为1～2：2～3；更优选为2:3。
在本发明中，所述纤维素酶的比活力优选为10000～120000U/g，更优选为50000～100000U/g；所述木聚糖酶的比活力优选为10000～120000U/g，更优选为50000～100000U/g。
本发明还提供了上述技术方案所述枯草芽孢杆菌培养基原料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将玉米秸秆、纤维素酶、木聚糖酶和水混合，在50～60℃条件下酶解60～80h，得到酶解复合物；
(2)将所述酶解复合物固液分离，得到所述酶解上清液。
在本发明中，所述玉米秸秆在酶解前优选的粉碎为1～2cm，干燥至恒重后粉碎至60目以上。在本发明中，所述干燥的方法优选为热风干燥；更优选的，所述热风干燥的温度为60～70℃，进一步优选为65℃。本发明对玉米秸秆干燥至恒重的目的是灭菌、灭酶，便于保藏。
在本发明中，所述酶解的温度优选为50℃。在本发明中，所述酶解的时间优选为70h。在本发明中，所述玉米秸秆的质量、纤维素酶的质量、木聚糖酶的质量和水的体积之比优选为1～2g：1～2g：2～3g：54～74ml；更优选为2g:2g:3g:54ml。
在本发明中，所述固液分离的方法优选为离心分离；所述离心的转速优选为7000～10000r/min，更优选为8000r/min；所述离心的时间优选为8～15min，更优选为10min。
本发明还提供了前述技术方案所述枯草芽孢杆菌培养基原料在提高杆菌霉素D产量中的应用。采用本发明所述的培养基原料对枯草芽孢杆菌进行发酵，可显著提高杆菌霉素D的产量。如本发明的实施例所示，相比于单酶酶解得到的酶解上清液作为培养基原料，杆菌霉素D产量显著增强。
本发明还提供了一种提高杆菌霉素D产量的枯草芽孢杆菌培养基，包括前述技术方案所述的枯草芽孢杆菌培养基原料、酵母提取物、L-谷氨酸钠和磷酸二氢钾。本发明优选的，所述枯草芽孢杆菌培养基原料的体积、酵母提取物的质量、L-谷氨酸钠的质量和磷酸二氢钾的质量之比为100ml:1～4g:5～15g:0.5～2g；更优选为100ml:2g:10g:1g。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
选择无病虫害的成熟玉米秸秆，除去灰尘，清洗干净，用剪刀剪至1～2cm小段，放入电热鼓风干燥箱中，温度控制在65℃，烘干至恒重。取出干燥后的玉米秸秆小段，置室温下放置20分钟后，用固体高速粉碎机粉碎，过60目筛，制成粉末备用。
精确称取上述制备的2.00g玉米秸秆粉末，置于高压蒸汽灭菌锅，121℃灭菌30min后取出，冷却至室温，向灭菌后的玉米秸秆粉末中添加纤维素酶1g(100000U/g)、木聚糖酶2g(100000U/g)和无菌水54ml，并充分摇匀，在温度为50℃条件下进行充分酶解，酶解条件为：纤维素酶和木聚糖酶添加比2:3(质量比，g:g)，酶解时间70h，液料比为27mL/g(酶解液体积：玉米秸秆粉末质量，mL/g)。酶解后，取出酶解液，8000r/min离心10min，得到酶解上清液。
对比例1
除不添加纤维素酶、木聚糖酶添加量为0.1g外，其他条件均与实施例1相同。得到对照酶解上清液1。
对比例2
除不添加木聚糖酶、纤维素酶添加量为0.1g外，其他条件均与实施例1相同。得到对照酶解上清液2。
实施例2
分别取实施例1、对比例1和对比例2的酶解上清液各100ml，分别向各酶解上清液中加入酵母提取物2.0g，L-谷氨酸钠(味精)10g和KH2PO41.0g，115℃灭菌20min，冷却至室温，制成杆菌霉素D发酵培养基(实施例1)和对照杆菌霉素D发酵培养基1(对比例1)、对照杆菌霉素D发酵培养基2(对比例2)。
将实验室保存的枯草芽孢杆菌，接种至斜面培养基上，于37℃恒温培养24h，挑取单菌落，接入种子培养基，于37℃摇瓶培养至OD600为0.8～1.0，按6％的接种量分别接入上述3个发酵培养基，于33℃，180r/min发酵培养110h。
发酵结束后，分别取三个杆菌霉素D发酵培养基发酵得到的发酵液，各10.0mL发酵液于6000r/min离心15min，弃菌体，取上清液，用HCl将上清液pH调至2.0以下，室温静置4h，6000r/min离心10min，取沉淀，60℃烘干至恒重，制成杆菌霉素D干燥粗肽固体。
取少量杆菌霉素D干燥粗肽固体，研成粉末，加入1.0mL甲醇进行萃取，10000r/min离心10min，取上清液，采用高效液相色谱(HPLC)法对杆菌霉素D进行含量测定，具体HPLC条件和测定方法参照Qian等文献(Shiquan Qian,Hedong Lu,Panpan Meng,Chong Zhang,Fengxia Lv,Xiaomei Bie,Zhaoxin Lu.Effect of inulin on efficient productionand regulatory biosynthesis of bacillomycin D inBacillus subtilisfmbJ.Bioresource Technology,2015,179:260-267)进行。重复上述试验5次，取平均值。
表1不同发酵培养基发酵得到的杆菌霉素D含量(n＝5)
测定结果如表1所述，由此可见，采用纤维素酶和木聚糖酶双酶解发酵得到的杆菌霉素D粗肽固体中杆菌霉素D的产量得到了显著提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种枯草芽孢杆菌培养基原料，其特征在于，所述培养基原料为纤维素酶和木聚糖酶双酶解玉米秸秆的酶解上清液。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌培养基原料，其特征在于，所述纤维素酶和木聚糖酶酶解时的质量比为1～2:2～3。
3.根据权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌培养基原料，其特征在于，所述纤维素酶的比活力为10000～120000U/g，所述木聚糖酶的比活力为10000～120000U/g。
4.权利要求1～3任意一项所述枯草芽孢杆菌培养基原料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将玉米秸秆、纤维素酶、木聚糖酶和水混合，在50～60℃条件下酶解60～80h，得到酶解复合物；
(2)将所述酶解复合物固液分离，得到所述酶解上清液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，玉米秸秆的质量、纤维素酶的质量、木聚糖酶的质量和水的体积之比为：1～2g:1～2g:2～3g:54～74ml。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，固液分离的方法为离心，离心的转速为7000～10000r/min，离心的时间为8～15min。
7.权利要求1～3任意一项所述枯草芽孢杆菌培养基原料在提高杆菌霉素D产量中的应用。
8.一种提高杆菌霉素D产量的枯草芽孢杆菌培养基，其特征在于，包括权利要求1～3任意一项所述的枯草芽孢杆菌培养基原料、酵母提取物、L-谷氨酸钠和磷酸二氢钾。
9.根据权利要求8所述的枯草芽孢杆菌培养基，其特征在于，所述培养基中，所述枯草芽孢杆菌培养基原料的体积、酵母提取物的质量、L-谷氨酸钠的质量和磷酸二氢钾的质量之比为100ml:1～4g:5～15g:0.5～2g。
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