CN109593702B - 一种基因工程菌株实现全细胞转化合成l-苯乳酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基因工程菌株实现全细胞转化合成L‑苯乳酸的方法，具体涉及一种能实现辅因子NAD+和NADH自循环的共表达苯丙氨酸脱氢酶和L‑羟基异己酸还原酶的基因工程菌株，通过全细胞转化底物L‑苯丙氨酸合成L‑苯乳酸的方法，属于生物工程技术领域。用重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a‑pdh‑ldh的全细胞转化合成L‑苯乳酸，并且在添加表面活性剂的作用下全细胞转化率可达到88.9％～95.6％。该方法实现了辅因子NAD+和NADH的自循环，减少了辅因子的添加量，降低了生产成本，在工业化合成L‑苯乳酸领域有广阔的应用前景。

Description

一种基因工程菌株实现全细胞转化合成L-苯乳酸的方法
技术领域
本发明涉及一种基因工程菌株实现全细胞转化合成L-苯乳酸的方法，具体涉及一种能实现辅因子NAD+和NADH自循环的共表达苯丙氨酸脱氢酶和L-羟基异己酸还原酶的基因工程菌株，通过全细胞转化底物L-苯丙氨酸合成L-苯乳酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
L-苯乳酸(L-phenyllactic acid，L-PLA)，即L-2-羟基-3-苯基丙酸，是PLA两种手性对映异构体中的一种，与手性对映异构体D-PLA天然共存于乳酸菌发酵产物和蜂蜜中，具有特殊的生物活性，可以作为手性中间体广泛应用于化工、医药、农药和生物合成等领域。
L-PLA不仅对多种食源性致病菌有抑制作用，也能抑制大部分的革兰氏阳性菌和阴性菌的生长，延长食品的保质期。L-PLA是小分子有机酸，稳定性高，亲水性强，在食品和饲料中容易扩散，是L-苯丙氨酸的代谢产物，对人和动物细胞均无毒性，在食品防腐方面有很大的发展潜力。
L-苯乳酸的合成主要通过化学法和生物法，化学法合成步骤复杂，需要使用有机化学试剂，对环境造成一定的污染。相比较而言，L-苯乳酸的生物法制备反应条件温和，工艺简单，无需手性拆分。生物法还分为微生物发酵法、酶催化法和全细胞转化法。微生物发酵法发酵时间长，产物需要分离，操作复杂。酶催化法需要消耗辅酶I，成本高，酶纯化操作复杂，不适合工业化生产。全细胞转化法避免了酶的分离纯化，为酶催化反应提供了稳定的细胞环境，与发酵法比转化时间短，在工业化合成L-苯乳酸领域有很大的潜力。
目前，以苯丙氨酸为底物转化合成苯乳酸，并实现辅因子NAD+和NADH的循环，至少需要三个酶的参与，比如用氨基酸脱氨酶和乳酸脱氢酶转化苯丙氨酸合成苯乳酸，还需在体系中添加葡萄糖脱氢酶，再在乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的作用下实现辅因子NAD+和NADH的循环。因此，提供一种操作简便、成本低、转化率高、适合工业化生产的L-苯乳酸合成方法，对于工业上制备L-苯乳酸有重要的应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，共表达了苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)和L-羟基异己酸还原酶(L-HicDH)，苯丙氨酸脱氢酶含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，L-羟基异己酸还原酶含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，以E.coli BL21(DE3)为宿主。
在本发明的一种实施方式中，以pET系列载体为表达载体。
本发明的第二个目的是提供一种构建上述基因工程菌的方法，将编码苯丙氨酸脱氢酶的基因、编码L-羟基异己酸还原酶的基因和载体通过酶切连接，得到重组质粒，将重组质粒转入宿主细胞中。
在本发明的一种实施方式中，所述的基因工程菌是大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-pdh-ldh，是以pET28a为载体，构建来自栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)的苯丙氨酸脱氢酶基因(pdh)和来自副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的L-羟基异己酸还原酶基因(ldh)的共表达质粒pET28a-pdh-ldh，转化到E.coli BL21(DE3)中后得到共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-pdh-ldh，并实现这两个酶在大肠杆菌的共表达。
在本发明的一种实施方式中，编码苯丙氨酸脱氢酶的基因如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，编码L-羟基异己酸还原酶的基因如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第三个目的是提供一种表达上述基因工程菌的方法，将基因工程菌接种到LB液体培养基，35～38℃，150～170rpm培养10～14h，作为种子液；将种子液以1.0％～5.0％的接种量接种到LB培养基中，振荡培养至OD600为0.4～0.6，加入诱导剂IPTG，20～25℃下培养10～20h。
本发明的第四个目的是提供一种生产苯乳酸的方法，以L-苯丙氨酸为底物，以上述的基因工程菌为生物催化剂。
在本发明的一种实施方式中，反应条件为22～26℃，200～220rpm反应7～15h。
在本发明的一种实施方式中，湿菌体与底物的质量比为(3～24):1。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中添加了终浓度为0.005％～0.2％(V/V)的曲拉通-X-100、终浓度为0.005％～0.2％(V/V)的吐温-20或终浓度为0.005％～0.2％(W/V)的CTAB。
本发明的第五个目的是提供上述生产苯乳酸的方法在化工、制药或生物合成领域的应用。
本发明通过构建共表达苯丙氨酸脱氢酶和L-羟基酸还原酶的质粒pET28a-pdh-ldh，将该质粒转入大肠杆菌，获得重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-pdh-ldh。用重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-pdh-ldh的全细胞转化合成L-苯乳酸，20.0g/L～160.0g/L的全细胞转化合成L-苯乳酸的转化率为30.0％～70.0％，在添加了表面活性剂的条件下转化率可提高到89.6％～95.6％。本发明只需采用两种酶就可以解决辅因子NAD+和NADH的循环问题，相比已公开或公布的其他发明减少了辅因子循环所需酶的种类，并减少了辅因子的添加量，降低了生产成本，在工业化合成L-苯乳酸领域有很广阔的应用前景。
附图说明
图1：pET28a-pdh-ldh共表达质粒的构建过程。
图2：重组基因工程菌诱导表达后全菌液的SDS-PAGE图。
图3：以L-苯丙氨酸为底物转化合成L-苯乳酸的反应过程。
图4：不同全细胞浓度条件下L-苯乳酸的转化率。
图5：不同表面活性剂条件下L-苯乳酸的转化率。
具体实施方式
(一)培养基
LB培养基：蛋白胨10.0g/L，氯化钠10.0g/L，酵母粉5.0g/L。
(二)HPLC测定L-苯乳酸含量
柱：Sunfire C18；流速：1.0mL/min；温度：30℃；检测波长是254nm；流动相：乙腈(缓冲液A，含有0.1％三氟乙酸)和H2O(缓冲液B，含有0.1％三氟乙酸)；梯度：在22分钟内从95.0％水梯度洗脱至100.0％乙腈。
实施例1共表达质粒pET28a-pdh-ldh的构建
人工合成苯丙氨酸脱氢酶基因pdh和L-羟基异己酸还原酶基因ldh。PCR扩增反应体系(50.0μL)：ddH2O 35.5μL，5×Phusion HF Buffer 10.0μL，dNTPs 1.0μL，pdh-up/ldh-up 1.0μL，pdh-down/ldh-down 1.0μL，模板质粒1.0μL，Phusion酶0.5μL。反应条件：1)98℃预变性30s；2)98℃变性10s；3)68℃(pdh)/58.5℃(ldh)引物退火30s；4)72℃引物延伸35s(pdh)/50s(ldh)(重复步骤2～4，循环30次)；5)72℃继续延伸7min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒去除杂质，纯化后的目的基因在4℃保存备用。
表1扩增基因pdh和ldh的引物
引物名称 引物序列
pdh-up 5’-GGGCCCCATATGAGCTTAGTAGAAAAAACATCC-3’
pdh-down 5’-GGGCCCGAATTCTTAGTTGCGAATATCCCATT-3’
ldh-up 5’-GGGCCCGAATTCAAGGAGATATAATGGCACGTAAGATTGGAATTATCGG-3’
ldh-down 5’-GATCCCCTCGAGGAGTGTATCCACAATTTCGTCGA-3’
(2)pET28a-pdh-ldh共表达质粒的构建(图1)：以质粒pET28a为表达载体，构建重组质粒pET28a-pdh1。质粒pET28a与基因pdh用NdeI和EcoRI限制性内切酶双酶切。酶切体系(30.0μL)：10×Buffer 3.0μL，pET28a-pdh 5.0μL，NdeI 1.0μL，EcoRI 1.0μL，ddH2O补足至30.0μL，37℃水浴15min，80℃水浴5min。
酶切后的产物用T4DNA连接酶连接，得到重组质粒pET28a-pdh1。连接体系(20.0μL)：pET28a 3.0μL，pdh基因片段9.0μL，5×Buffer 4.0μL，T4DNA连接酶1.0μL，无菌水补足至20.0μL，22℃水浴15min，4℃冰浴过夜连接。
将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞中，将得到的重组菌命名为E.coli DH5α/pET28a-pdh1。从平板上挑取转化子单菌落接入LB(含1.0mmol/L卡那霉素)液体培养基过夜培养后，抽质粒酶切后，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳验证，将验证成功后的菌液送测序，构建的重组质粒命名为pET28a-pdh1。
将重组质粒pET28a-pdh1和基因ldh片段用EcoRI和XhoI限制性内切酶双酶切，酶切体系(30.0μL)：10×Buffer 3.0μL，pET28a-pdh-ldh 5.0μL，XhoI 1.0μL，EcoRI 1.0μL，ddH2O补足至30.0μL，37℃水浴15min，80℃水浴5min。
酶切后的产物用T4DNA连接酶连接，得到重组质粒pET28a-pdh-ldh。连接体系(20.0μL)：pET28a-pdh1 4.0μL，ldh基因片段5.0μL，5×Buffer 4.0μL，T4DNA连接酶1.0μL，无菌水补足至20.0μL，22℃水浴15min，4℃冰浴过夜连接。
将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞中，将得到的重组菌命名为E.coli DH5α(pET28a-pdh-ldh)。从平板上挑取转化子单菌落接入LB(含1.0mmol/L卡那霉素)液体培养基过夜培养后，抽质粒酶切后，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳验证，将验证成功后的菌液送测序，构建的共表达质粒命名为pET28a-pdh-ldh。
实施例2共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-pdh-ldh的构建及诱导表达
将重组菌E.coli DH5α/pET28a-pdh-ldh活化培养后，提取质粒，将共表达质粒pET28a-pdh-ldh转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，将得到的共表达菌株命名为E.coliBL21(DE3)/pET28a-pdh-ldh。
将共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-pdh-ldh接种到LB(含1.0mmol/L卡那霉素)液体培养基，37℃，160rpm过夜培养，作为种子液。将种子液以1.0％的接种量接种到100.0mL LB(含1.0mmol/L卡那霉素)液体培养基中，振荡培养至OD600为0.6，加入0.8mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，22℃下培养14h。培养后的菌液在4℃，8000rpm，离心10min去上清，收集菌体。菌体用0.85％的生理盐水洗涤两次后备用。菌液用SDS-PAGE电泳鉴定(图2)，其中：泳道1、泳道2为未诱导的全菌液，泳道3为IPTG诱导后全菌液，泳道3中两条条带大小分别符合苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)和L-羟基异己酸还原酶(L-HicDH)目的蛋白大小，说明两个目的蛋白在E.coli BL21(DE3)中成功实现共表达。
实施例3共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-pdh-ldh全细胞转化合成L-苯乳酸
以L-苯丙氨酸为底物转化合成L-苯乳酸分为两步反应：脱氨反应和还原反应(图3)。脱氨反应：苯丙氨酸脱氢酶将L-苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸，同时，伴随着NAD+到NADH的转变。还原反应：L-羟基异己酸还原酶将苯丙酮酸还原成L-苯乳酸，同时，伴随着NADH到NAD+的转变。因此，选用苯丙氨酸脱氢酶和L-羟基异己酸还原酶的串联反应转化合成L-苯乳酸，可以实现辅因子NAD+和NADH的自循环。
全细胞转化体系(1.0mL)：40.0mmol/L L-苯乳酸，10.0mmol/L NAD+，20.0～160.0g/L全细胞，150.0mmol/L甲酸铵缓冲液(pH 7.0)。该体系在25℃，200rpm反应12h。然后将样品4000rpm离心，取上清，过0.22μm膜后，进行HPLC测定。
结果显示(图4)，横坐标是共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-pdh-ldh全细胞的浓度，纵坐标是L-苯乳酸的转化率。共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-pdh-ldh全细胞转化合成L-苯乳酸，20.0g/L～160.0g/L的全细胞转化合成L-苯乳酸的转化率为30.0％～70.0％。
在转化体系中加入不同的表面活性剂：曲拉通-X-100(Triton-X-100)(反应体系终浓度：0.005％～0.2％V/V)、吐温-20(Tween-20)(反应体系终浓度：0.005％～0.2％V/V)或十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)(反应体系终浓度：0.005％～0.2％W/V)，采用上述相同条件，共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-pdh-ldh全细胞转化合成L-苯乳酸,以20.0g/L～160.0g/L的全细胞转化合成L-苯乳酸的转化率可达到88.9％～95.6％(图5)。本发明选用的两种酶能解决全细胞转化过程中辅因子NAD+和NADH的循环问题，减少了辅因子的添加量，降低L-苯乳酸的生产成本，在工业化生产L-苯乳酸领域有很大的潜力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种基因工程菌株实现全细胞转化合成L-苯乳酸的方法
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<170> PatentIn version 3.3
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Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Gln Pro Tyr Asn Ser Val Glu Glu Ala
50 55 60
Leu Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Lys Cys Ala
65 70 75 80
Ala Ser Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp
85 90 95
Pro Gln Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe
100 105 110
Val Asp Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr
115 120 125
Asn Met Glu Asp Phe Ile His Ala Met Lys Glu Thr Asn Cys Ile Val
130 135 140
Gly Val Pro Glu Ala Tyr Gly Gly Gly Gly Asp Ser Ser Ile Pro Thr
145 150 155 160
Ala Met Gly Val Leu Tyr Gly Ile Lys Ala Thr Asn Lys Met Leu Phe
165 170 175
Gly Lys Asp Asp Leu Gly Gly Val Thr Tyr Ala Ile Gln Gly Leu Gly
180 185 190
Lys Val Gly Tyr Lys Val Ala Glu Gly Leu Leu Glu Glu Gly Ala His
195 200 205
Leu Phe Val Thr Asp Ile Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ile Gln Glu
210 215 220
Lys Ala Lys Thr Thr Ser Gly Ser Val Thr Val Val Ala Ser Asp Glu
225 230 235 240
Ile Tyr Ser Gln Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly
245 250 255
Val Val Asn Asp Glu Thr Met Lys Gln Phe Lys Val Lys Ala Ile Ala
260 265 270
Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Leu Thr Glu Asp His Gly Arg His Leu
275 280 285
Ala Asp Lys Gly Ile Leu Tyr Ala Pro Asp Tyr Ile Val Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Glu Val Asn Lys Glu Arg
305 310 315 320
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aaatctccag aactgttccg cgcgtttggc caatttgttg attcgcttgg cggccgtttc 360
tatacaggta ctgatatggg aacgaatatg gaagatttca ttcacgccat gaaagaaaca 420
aactgcattg ttggggtgcc ggaagcttac ggcggcggcg gagattcctc tattccaact 480
gccatgggtg tcctgtacgg cattaaagca accaacaaaa tgttgtttgg caaggacgat 540
cttggcggcg tcacttatgc cattcaagga cttggcaaag taggctacaa agtagcggaa 600
gggctgctcg aagaaggtgc tcatttattt gtaacggata ttaacgagca aacgttggag 660
gctatccagg aaaaagcaaa aacaacatcc ggttctgtca cggtagtagc gagcgatgaa 720
atttattccc aggaagccga tgtgttcgtt ccgtgtgcat ttggcggcgt tgttaatgat 780
gaaacgatga agcagttcaa ggtgaaagca atcgccggtt cagccaacaa tcagctgctt 840
acggaggatc acggcagaca ccttgcagac aaaggcattc tgtatgctcc ggattatatt 900
gttaactctg gcggtctgat ccaagtagcc gacgaattgt atgaggtgaa caaagaacgc 960
gtgcttgcga agacgaagca tatttacgac gcaattcttg aagtgtacca gcaagcggaa 1020
ttagatcaaa tcaccacaat ggaagcagcc aacagaatgt gtgagcaaag aatggcggca 1080
agaggccgac gcaacagctt ctttacttct tctgttaagc caaaatggga tattcgcaac 1140
taa 1143
<210> 4
<211> 933
<212> DNA
<213> Lactobacillus paracasei
<400> 4
atggcacgta agattggaat tatcggcctt ggaaacgttg gggctgccgt agcgcacgga 60
ttgattgcac aaggtgtagc cgacgactac gtctttattg atgcaaacga agcaaaggtg 120
aaggctgatc aaattgattt ccaagacgca atggcgaact tggaagcgca cggtaacatt 180
gtgattaacg attgggcagc cttggctgat gctgatgttg tgatttcaac actggggaac 240
atcaagttgc aacaagacaa cccaaccggt gaccgttttg ctgagttgaa gtttaccagc 300
agcatggtgc aatcagtcgg cacaaacttg aaggaatctg gtttccacgg cgtattggtc 360
gtgatttcaa acccggttga cgtgattacg gccttgttcc aacacgtgac tggtttccca 420
gctcacaagg ttatcggaac cggtactttg cttgacacgg cgcgtatgca acgtgcagtt 480
ggtgaggcgt ttgatttgga cccacgttct gtttcaggtt acaacttggg tgagcacggt 540
aactcacaat tcgtagcttg gtcaacggtg cgcgtgatgg gtcaaccaat cgtgacgttg 600
gctgatgccg gcgatattga cttggcggcc atcgaagagg aagcacgtaa gggtggcttc 660
acggtcttga atggtaaggg ctacacgagt tatggtgttg caacgtcagc aatccgcatt 720
gccaaggctg ttatggctga cgcgcatgct gaattggttg tctcaaatcg tcgcgatgac 780
atgggaatgt acttgtcata cccagcgatt attggtcgcg atggtgtctt ggcagaaacg 840
acgcttgatt tgacgacgga tgagcaagaa aagctcttgc aatcacgtga ctacatccaa 900
caacgtttcg acgaaattgt ggatacactc taa 933
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gggccccata tgagcttagt agaaaaaaca tcc 33
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gggcccgaat tcttagttgc gaatatccca tt 32
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gggcccgaat tcaaggagat ataatggcac gtaagattgg aattatcgg 49
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gatcccctcg aggagtgtat ccacaatttc gtcga 35

Claims (10)

1.一种基因工程菌，其特征在于，共表达了苯丙氨酸脱氢酶和L-羟基异己酸还原酶，苯丙氨酸脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，L-羟基异己酸还原酶氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述的基因工程菌，以E.coliBL21(DE3)为宿主。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，以pET系列载体为表达载体。
3.一种构建权利要求1-2任一所述基因工程菌的方法，将编码苯丙氨酸脱氢酶的基因、编码L-羟基异己酸还原酶的基因和载体通过酶切连接，得到重组质粒，将重组质粒转入宿主细胞中。
4.一种表达权利要求1-2任一所述基因工程菌的方法，其特征在于，将基因工程菌接种到LB液体培养基，35～38℃，150～170rpm培养10～14h，作为种子液；将种子液以1.0％～5.0％的接种量接种到LB培养基中，振荡培养至OD600为0.4～0.6，加入诱导剂IPTG，20-25℃下培养10～20h。
5.一种生产L-苯乳酸的方法，其特征在于，以L-苯丙氨酸为底物，以权利要求1-3任一所述的基因工程菌为生物催化剂。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，反应条件为22～26℃，200～220rpm反应7～15h。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，湿菌体与底物的质量比为(3～24)：1。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，湿菌体与底物的质量比为(3～24)：1。
9.如权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，反应体系中添加了终浓度为0.005％～0.2％(V/V)的曲拉通-X-100、终浓度为0.005％～0.2％(V/V)的吐温-20或终浓度为0.005％～0.2％(W/V)的CTAB。
10.权利要求5-9任一所述的方法在制备L-苯乳酸中的应用。
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