CN116869870B - 一种具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一种具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液及其制备方法和应用。本发明偶然发现，通过自主分离的菌种发酵制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有很好的保湿、紧致和舒缓功效，且半乳糖酵母样菌发酵产物滤液安全无刺激、制备工艺简单，可实现工业化生产，适合应用于化妆品中。

Description

一种具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物 滤液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液及其制备方法和应用。
背景技术
半乳糖酵母样菌发酵产物(原料名称为Pitera)是由日本学者Kashiwayama从酵母菌Trichosporon Kashiwayama菌株发酵得到。目前，半乳糖酵母样菌发酵产物滤液已成为国家药监局公布的《已使用化妆品原料目录(2021年版)》新增的原料之一。半乳糖酵母样菌发酵产物滤液富含游离氨基酸、矿物质、有机酸、无机酸等，具有多种护肤功效。
目前，人们对半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法进行改了深入研究，希望能制备出如Pitera功效一样好的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液，但现有的方法制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液其保湿、紧致和舒缓的功效仍较差，无法满足消费者的需求。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液及其制备方法和应用。本发明通过自主分离筛选获得一种贝雷丝孢酵母，使用贝雷丝孢酵母发酵得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液活性成分较多，可用于化妆品领域。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了一种具有很好的保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备粮醅：将高粱、玉米、大米、糯米、小麦和水混合均匀，得到混合物，进行蒸煮，晾凉后加入酒曲进行糖化发酵，过滤，获得粮醅；
S2、制备种子液：将贝雷丝孢酵母的菌落接种至液体培养基中培养，得到种子液；
S3、发酵处理：将步骤S1的所述粮醅、乳糖、奶粉和水混合均匀，灭菌处理，得到发酵基质；将步骤S2的所述种子液接种至所述发酵基质中发酵，得到发酵液；
S4、后处理：对步骤S4的所述发酵液进行高压均质处理、过滤处理和灭菌处理，获得具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
所述贝雷丝孢酵母已于2023年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2023647，保藏地址为中国武汉。
本发明提供的所述贝雷丝孢酵母发酵得到的产物活性成分较多，可以提高化妆品的功效。
本发明半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法简单，可实现工业化生产。其中制备的粮醅对于本发明自主分离的贝雷丝孢酵母的发酵过程产生了重要影响，带壳的高粱、大米、糯米及小麦制备得到的粮醅更有利于贝雷丝孢酵母的发酵，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液富含多种营养物质，提高了半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的保湿、紧致毛孔、舒缓、修护效果，且制备的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液安全无刺激。
本发明的贝雷丝孢酵母从白酒的酒醅糟中分离得到，具体的，将白酒的酒醅糟的样品制备成菌悬液；将菌悬液稀释后涂布于孟加拉红培养基中，培养后得到具有酵母菌特征的菌落；将所述菌落置于YPD固体培养基分离纯化，挑取具有典型酵母菌落特征的单菌落置于YPD固体培养基二次分离纯化，得到酵母菌；所述酵母菌经鉴定后，确定为贝雷丝孢酵母。
白酒的酒醅糟含有大量的微生物，选用不同培养基进行分离纯化，得到的微生物的种类有很大差别。本发明选用孟加拉红培养基、YPD固体培养基对白酒的酒醅糟中的微生物进行分离与纯化，挑选了具有典型酵母菌落的贝雷丝孢酵母用于制备半乳糖酵母样菌发酵产物滤液，结果表明，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有很好的保湿、紧致毛孔、舒缓、修护效果。
同时，在发酵基质中，加入的粮醅、乳糖、奶粉之间存在协同作用，贝雷丝孢酵母利用含有粮醅、乳糖、奶粉进行发酵，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的保湿、紧致毛孔、舒缓、修护效果更好。
作为本发明所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法的优选实施方式，步骤S1中，以质量百分比计，所述混合物包括3～8％高粱，9～13％玉米，12～18％大米，2～5％糯米，3～8％小麦，余量为水；优选地，所述混合物包括5％高粱，12％玉米，15％大米，3％糯米，5％小麦，余量为水。
本发明选用上述质量百分比的高粱、玉米、大米、糯米、小麦，可以有效提高半乳糖酵母样菌发酵产物滤液在保湿、紧致、舒缓等效果。
作为本发明所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法的优选实施方式，所述高粱、大米、糯米、小麦均带壳。带壳的高粱、大米、糯米、小麦可以提高制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的性能。
在一些具体实施方式中，步骤S1中，所述酒曲的加入量为所述混合物质量的0.2～1％，优选地，所述酒曲的加入量为所述混合物质量的0.5％。
作为本发明所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法的优选实施方式，步骤S1中，所述糖化发酵的温度为32～38℃，所述糖化发酵的时间为24～38h，所述糖化发酵的相对湿度为60～80％；优选地，所述糖化发酵的温度为35℃，所述糖化发酵的时间为36h，所述糖化发酵的相对湿度为70％。
在一些具体实施方式中，步骤S1中，所述蒸煮的温度为90～105℃，所述蒸煮的时间为20～60min；优选地，所述蒸煮的温度为100℃，所述蒸煮的时间为40min。
在一些具体实施方式中，步骤S1中，所述过滤为网筛过滤或滤膜过滤。
在一些具体实施方式中，步骤S2中，所述液体培养基包括PDB培养基、马铃薯综合培养基、麦芽汁培养基、YM培养基、察氏培养基中的至少一种。
更为优选地，步骤S2中，所述液体培养基为马铃薯综合培养基。
在一些具体实施方式中，步骤S2中，所述培养的温度为25～32℃，所述培养的时间为36～60h，所述培养的转速为100～200rpm；优选地，所述培养的温度为28℃，所述培养的时间为48h，所述培养的转速为150rpm。
作为本发明所述具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法的优选实施方式，步骤S3中，以质量百分比计，所述发酵基质包括12～18％粮醅，1～2％乳糖，3～8％奶粉，余量为水；优选地，所述发酵基质包括15％粮醅，1.5％乳糖，5％奶粉，余量为水。
在一些具体实施方式中，步骤S3中，所述灭菌处理的温度为110℃～125℃，所述灭菌处理的时间为15～30min；更优选地，所述灭菌处理的温度为121℃，所述灭菌处理的时间为20min。
在一些具体实施方式中，步骤S3中，所述种子液的接种量为0.5～2％；优选地，所述种子液的接种量为1％。
在一些具体实施方式中，步骤S3中，通入无菌空气进行发酵，所述无菌空气的通入量为30～60dm3/(h·L)；优选地，所述无菌空气的通入量为50dm3/(h·L)。
在一些具体实施方式中，步骤S3中，所述发酵的温度为25～32℃，所述发酵的时间为18～36h，所述发酵的转速为120～220rpm；优选地，所述发酵的温度为28℃，所述发酵的时间为24h，所述发酵的转速为180rpm。
作为本发明所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法的优选实施方式，步骤S4中，所述高压均质处理是将所述发酵液于8～12MPa下高压均质20～60min；优选地，所述发酵液于10MPa下高压均质30min；所述灭菌处理为高压灭菌处理，所述高压灭菌处理是将过滤后的发酵液置于300～800MPa下高压灭菌5～20min；优选地，所述高压灭菌处理是将过滤后的发酵液置于500MPa下高压灭菌10min。
本发明选用将过滤后的发酵液置于300～800MPa下高压灭菌5～20min，避免了传统巴氏灭菌法需要在80-105℃的条件下灭菌，高温的条件容易导致半乳糖酵母样菌发酵产物滤液内活性物质的流失，导致半乳糖酵母样菌发酵产物滤液保湿、修护等效果较差。
在一些具体实施方式中，步骤S4中，所述过滤处理是将高压均质后的发酵液用硅藻土过滤机过滤或用过滤膜过滤。
第二目的，本发明提供了采用上述制备方法制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
本发明提供的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液采用酵母菌进行发酵，具有很好的保湿、紧致和舒缓功效。
第三目的，本发明提供了上述具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液在制备化妆品中的应用。
在一些具体实施方式中，所述具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液在化妆品的添加量为0.1～100wt％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液及其制备方法和应用，本发明发现通过自主分离的贝雷丝孢酵母制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液安全无刺激、制备工艺简单，可实现工业化生产。并且本发明提供的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有很好的保湿、紧致和舒缓功效，适合应用于化妆品中。
附图说明
图1为本发明分离得到的贝雷丝孢酵母形态图；
图2为本发明分离得到的贝雷丝孢酵母光学镜检图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例和对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例及对比例中所提及的百分比，如无特殊说明，均为质量百分比。
本发明中提及的无菌空气的接入量的单位为dm3/(h·L)，其中，dm3是指通入的无菌空气的量，h是指小时，L是指发酵基质的体积。如本发明提及的无菌空气的接入量为50dm3/(h·L)，即指每一升发酵基质中，每小时通入的无菌空气的量为50dm3。
本发明所用的孟加拉红培养基、YPD固体培养基、YPD液体培养基、PDB培养基、马铃薯综合培养基、麦芽汁培养基、YM培养基、察氏培养基均为现有技术中常用的培养基，其制备方法如下：
孟加拉红培养基(以制备1L的孟加拉红培养基为例)：蛋白胨5g、葡萄糖10g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O 0.5g、氯霉素0.1g、1/3000孟加拉红溶液100mL，蒸馏水加至1L，121℃灭菌20min后贮存备用。
YPD固体培养基(以制备1L的YPD固体培养基为例)：酵母浸出粉10g、蛋白胨15g、葡萄糖15g、琼脂粉20g，蒸馏水加至1L，121℃灭菌20min后贮存备用。
YPD液体培养基(以制备1L的YPD液体培养基为例)：酵母浸出粉10g、蛋白胨15g、葡萄糖15g，蒸馏水加至1L，121℃灭菌20min后贮存备用。
PDB培养基(以制备1L的PDB培养基为例)：马铃薯(去皮)200g、蔗糖20g，水定容1000mL，在120℃下灭菌20min后贮存备用。
马铃薯综合培养基(以制备1L的马铃薯综合培养基为例)：分别取磷酸二氢钾3g，七水合硫酸镁1.5g，维生素B1 8mg，葡萄糖20g，20％马铃薯汁至总体积为1000mL，在120℃下灭菌20min后贮存备用；其中20％马铃薯汁配制方法：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL煮沸20min，滤去马铃薯块，将滤液补足1000mL。
麦芽汁培养基(以制备1L的麦芽汁培养基为例)：将干麦芽粉加4倍水，在55～65℃下保温糖化3～4小时，用碘液检查至完全糖化为止，得到麦芽汁糖。将麦芽汁糖加水稀释至糖度为8～10巴林度，调pH至6.0～6.5，在120℃下灭菌20min后贮存备用。
YM培养基(以制备1L的YM培养基为例)：酵母膏3.0g，麦芽提取物3.0g，葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，蒸馏水定容1.0L，pH 6.2±0.2，在120℃下灭菌20min后贮存备用。
察氏培养基(以制备1L的察氏培养基为例)：分别取蔗糖30g，硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，七水合硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，加入去离子水至总体积为1000mL，混合均匀，在120℃下灭菌20min后贮存备用。
实施例1、贝雷丝孢酵母的分离和鉴定
1、贝雷丝孢酵母的分离与纯化：
将白酒的酒醅糟样品粉碎，称取10g粉碎后的酒醅糟样品置于装有90mL无菌蒸馏水的三角瓶中，在28℃、150rpm下振荡培养30min，得到菌悬液；将菌悬液稀释105倍，取稀释后的菌悬液100μL，均匀涂布于孟加拉红培养基中，于28℃下培养48h，得到具有酵母菌特征的菌落；将菌落置于YPD固体培养基上划线分离纯化，28℃培养48h，挑取具有典型酵母菌落特征的单菌落于YPD固体培养基上再次进行划线，二次分离纯化，于28℃培养48h，所得单菌落为本发明制备半乳糖酵母发酵样菌发酵产物滤液所用酵母菌。
2、贝雷丝孢酵母的鉴定
(1)菌落形态及形态学观察
图1为本发明分离得到的酵母菌株菌落形态图。如图1所示。菌落形态几乎一致，菌落呈细小的圆形，白色，菌落中间凸起，菌落表面具有褶皱。
挑取一环菌株，接种于YPD液体培养基中28℃培养48h，得到活化后的菌液。将活化后的菌液在YPD固体培养基上划线分离，28℃下培养48h，取少量菌体进行染色，于1000倍显微镜下观察菌株形态，菌株的光学镜检图如图2所示。
(2)酵母菌株分子鉴定
2.1、酵母基因组DNA提取
用接种环挑取纯化后的酵母菌，溶于无菌水中，混合均匀。以6000rpm转速离心5min，收集菌体；用磷酸缓冲液清洗菌体，采用酵母基因组DNA提取试剂盒对清洗后的酵母菌株进行基因组DNA提取，核酸蛋白测定仪ND-1600测定所提取酵母基因组DNA的浓度、纯度，质量合格的酵母基因组DNA在-2℃的条件下进行保存，代用。
2.2、靶基因PCR扩增
以提取的不同酵母基因组DNA为模板，以NL1和NL4为引物，扩增26rsDNA目标基因，PCR扩增体系(25uL)中包括：10xPCRbuffer2.5 uL；dNTP2.0 uL；TapDNA聚合酶0.3uL；引物各1.0uL；DNA模板1.0uL；ddH2O 18.0uL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性45s；60℃退火50s；延伸75℃，1min；35次循环；修复延伸75℃，1minPW。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，交由北京擎科生物股份有限公司进行测序，测序后的结果在NCBI数据库中进行同源性比对分析。
根据菌株的菌落形态、基因序列的实验数据综合分析，本发明分离纯化的酵母菌株鉴定为贝雷丝孢酵母属，命名为贝雷丝孢酵母DGJW-58(Trichosporon behrendii DGJW-58)；本发明分离得到的贝雷丝孢酵母其于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO:M 2023647，保藏日期为2023年4月27日，保藏单位地址为中国武汉。
实施例2、一种具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液及其制 备方法
本实施例提供了一种具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备粮醅：将质量百分比为5％的高粱(带壳)、12％的玉米、15％的大米(带壳)、3％的糯米(带壳)、5％的小麦(带壳)、60％的水混合均匀，得到混合物。将混合物在100℃下蒸煮40min，摊开晾凉。撒入质量为混合物的0.5％的酒曲，混合均匀，于35℃、相对湿度为70％的条件下固体糖化发酵36h。发酵完成用200目的网筛进行过滤，所得滤液为粮醅。
(2)制备种子液：用接种环将上述筛选得到的贝雷丝孢酵母的菌落(保藏编号CCTCC NO:M 2023647)接种至马铃薯综合培养基中，于28℃、搅拌桨的转速为150rpm下培养48h，得到贝雷丝孢酵母种子液。
(3)发酵处理：将质量百分比为15％的粮醅、1.5％的乳糖、5％的奶粉和78.5％的去离子水混合均匀，于121℃下灭菌20min，得到发酵基质。将贝雷丝孢酵母种子液以1％的接种量接种至发酵基质中，通入50dm3/(h L)的无菌空气，设置搅拌桨的转速为180rpm，于28℃的条件下发酵24h，得到发酵液。
(4)后处理：将发酵液至于高压均质机中，于10MPa下高压均质30min。均质后的发酵液经过硅藻土过滤机过滤后，于500MPa下高压灭菌10min，得到具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
实施例3、一种具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液及其制 备方法
与实施例2相似，区别在于，步骤(1)中高粱(带壳)、玉米、大米(带壳)、糯米(带壳)和小麦(带壳)的质量百分比不同，将质量百分比为8％的高粱(带壳)、9％的玉米、18％的大米(带壳)、2％的糯米(带壳)、3％的小麦(带壳)、60％的水混合均匀，得到混合物。其余步骤等参数和实施例2相同。
实施例4、一种具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液及其制 备方法
与实施例2相似，区别在于，步骤(1)中高粱(带壳)、玉米、大米(带壳)、糯米(带壳)和小麦(带壳)的质量百分比不同，将质量百分比为3％的高粱(带壳)、13％的玉米、12％的大米(带壳)、5％的糯米(带壳)、8％的小麦(带壳)、59％的水混合均匀，得到混合物。其余步骤等参数和实施例2相同。
实施例5、一种具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液及其制 备方法
与实施例2相似，区别在于，步骤(3)中粮醅、乳糖奶粉和去离子水的质量百分比不同，将质量百分比为12％的粮醅、2％的乳糖、8％的奶粉和78％的去离子水混合均匀，于121℃下灭菌20min，得到发酵基质。其余步骤等参数和实施例2相同。
实施例6、一种具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液及其制 备方法
与实施例2相似，区别在于，步骤(3)中粮醅、乳糖奶粉和去离子水的质量百分比不同，将质量百分比为18％的粮醅、1％的乳糖、3％的奶粉和78％的去离子水混合均匀，于121℃下灭菌20min，得到发酵基质。其余步骤等参数和实施例2相同。
实施例7、一种具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液及其制 备方法
(1)制备粮醅：将质量百分比为6％的高粱(带壳)、10％的玉米、14％的大米(带壳)、4％的糯米(带壳)、6％的小麦(带壳)、60％的水混合均匀，得到混合物。将混合物在90℃下蒸煮60min，摊开晾凉。撒入质量为混合物的1％的酒曲，混合均匀，于32℃、相对湿度为89％的条件下固体糖化发酵24h。发酵完成用纱布进行过滤，所得滤液为粮醅。
(2)制备种子液：用接种环将贝雷丝孢酵母(保藏编号CCTCC NO:M2023647)的菌落接种至马铃薯综合培养基中，于30℃、搅拌桨的转速为120rpm下培养52h，得到贝雷丝孢酵母种子液。
(3)发酵处理：将质量百分比为16％的粮醅、1.8％的乳糖、6％的奶粉和76.2％的去离子水混合均匀，于121℃下灭菌20min，得到发酵基质。将贝雷丝孢酵母种子液以1％的接种量接种至发酵基质中，通入30dm3/(h L)的无菌空气，设置搅拌桨的转速为150rpm，于30℃的条件下发酵18h，得到发酵液。
(4)后处理：将发酵液至于高压均质机中，于12MPa下高压均质20min。均质后的发酵液经0.45μm过滤后，于300MPa下高压灭菌20min，得到具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
对比例1
与实施例2相比，对比例1不含有步骤(1)制备粮醅的过程，步骤(3)的发酵基质中的粮醅用对应比例的乳糖和奶粉代替(对比例1中发酵基质含有质量百分比为4.96％的乳糖、16.54％的奶粉、78.5％的水)，其余步骤等参数和实施例2相同，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
对比例2
与实施例2相比，对比例2的步骤(1)的混合物中高粱(带壳)、大米(带壳)、糯米(带壳)、小麦(带壳)替换为去壳高粱、去壳大米、去壳糯米、去壳小麦，其余步骤等参数和实施例2相同，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
对比例3
与实施例2相比，对比例3中将质量百分比为5％的高粱(带壳)、12％的玉米、15％的大米(带壳)、3％的糯米(带壳)、5％的小麦(带壳)、60％的水改为质量百分比为12％的高粱(带壳)、5％的玉米、15％的大米(带壳)、3％的糯米(带壳)、5％的小麦(带壳)、60％的水，其余步骤等参数和实施例2相同，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
对比例4
与实施例2相比，对比例4的步骤(3)中的乳糖替换为葡萄糖，其余步骤等参数和实施例2相同，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
对比例5
与实施例2相比，对比例5中将本发明的贝雷丝孢酵母替换为编号为Bio-52146的贝雷丝孢酵母(购于北京百欧博伟生物技术有限公司)，其余步骤等参数和实施例2相同，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
对比例6
与实施例2相比，对比例6中将本发明的贝雷丝孢酵母替换为保藏编号CCTCC M20221857(保藏于中国典型培养物保藏中心)的扣囊覆膜孢酵母菌，其余步骤等参数和实施例2相同，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
对比例7
使用申请号为CN202211047185.2实施例1的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的方法，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
对比例8
与实施例2相比，对比例8中的步骤(4)于500MPa下高压灭菌10min替换为于90℃下保温30min，其余步骤等参数和实施例2相同，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
试验例一、半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的保湿功效测试
依据《QB/T 4256-2011化妆品保湿功效评价指南》对本发明中的实施例2～7和对比例1～8制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的保湿效果进行测试。
测试样品：实施例2～7以及对比例1～8所述方法制得的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液(均配制成质量百分比为5％的水溶液)、SK-II护肤精华露(即神仙水，市购，未稀释)、去离子水(作为空白对照组)。
测试仪器：皮肤角质层水分含量测试探头Corneometer。
受试者选择：年龄18～45岁健康志愿者300人(每20个志愿者使用一个样品)。
测试步骤：受试者清洁脸部后，取1～2mL样品随机涂抹在半脸区域，另一半脸区域作为空白对照组，涂抹去离子水。每天使用2次，早、晚各一次。在使用样品前、使用测试样品2周、4周后，使用皮肤角质层水分含量测试探头测试面部皮肤的角质层水分含量，测试结果取平均值，计算皮肤角质层水分含量的变化率。皮肤角质层水分含量的变化率计算公式如下：
皮肤角质层水分含量的变化率(％)＝(使用后皮肤角质层水分含量-使用前皮肤角质层水分含量)/使用前皮肤角质层水分含量×100％
如上表所示，本发明的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液(5％)的保湿性能优于对比例，且优于SK-II护肤精华露。实施例2～7的保湿性能优于对比例1，说明粮醅对于自主分离的贝雷丝孢酵母的发酵过程产生了重要影响，将粮醅换成对应比例的乳糖和奶粉，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的保湿效果较差。
实施例2～7的保湿性能优于对比例2，说明粮醅的制备原料对于后续自主分离的贝雷丝孢酵母的发酵产生影响，带壳的高粱、大米、糯米及小麦制备得到的粮醅更有利于酵母菌的发酵，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液富含多种营养物质，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的保湿效果更好。
实施例2～7的保湿性能优于对比例3，说明粮醅的制备原料的质量比对于后续自主分离的贝雷丝孢酵母的发酵产生影响，以3～8％的高粱(带壳)、9～13％的玉米、12～18％的大米(带壳)、2～5％的糯米(带壳)、3～8％的小麦(带壳)制备得到的粮醅更有利于酵母菌的发酵，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液富含多种营养物质，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的保湿效果更好。
实施例2～7的保湿性能优于对比例4，说明在发酵基质中，粮醅、乳糖、奶粉之间存在协同作用，本发明的贝雷丝孢酵母利用含有粮醅、乳糖、奶粉进行发酵，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的保湿效果更好。
实施例2～7的保湿性能优于对比例5、6，说明发酵菌种对于发酵过程产生重要的影响，使用本发明自主分离的贝雷丝孢酵母，在含有粮醅、乳糖、奶粉的发酵基质中进行发酵，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的保湿效果更好，换成其他的菌种进行发酵，得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的保湿效果较差。
实施例2～7的保湿性能优于对比例8，说明半乳糖酵母样菌发酵产物滤液灭菌的方式影响了最终产品的功效，本发明采用高压灭菌的方式，避免了传统巴氏灭菌法需要在80～105℃的条件下灭菌，高温的条件容易导致半乳糖酵母样菌发酵产物滤液内活性物质的流失，导致半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的保湿效果较差。
实施例2的保湿性能优于实施例3～6，说明粮醅中高粱(带壳)、玉米、大米(带壳)、糯米(带壳)及小麦(带壳)的加入量，发酵基质中粮醅、乳糖、奶粉的加入配比，对酵母菌的发酵过程产生重要影响，最终影响了半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的保湿性能。本发明在制备粮醅过程中，高粱(带壳)、玉米、大米(带壳)、糯米(带壳)、小麦(带壳)的加入量优选为3～8％、9～13％、12～18％、2～5％、3～8％。在发酵基质中，粮醅、乳糖、奶粉的加入量优选为12～18％、1～2％、3～8％。
试验例二、半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的紧致测试
对本发明中的实施例2～7和对比例1～8制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的紧致毛孔的效果进行测试。
测试样品：同试验例1。
测试仪器：面部图像分析仪VISIA-CR(Canfield，美国)
受试者选择：同试验例1。
测试步骤：测试步骤：受试者清洁脸部后，取1～2mL样品随机涂抹在半脸区域，另一半脸区域作为空白对照组，涂抹去离子水。每天使用2次，早、晚各一次。在使用样品前、使用测试样品2周、4周后，采集受试者面部正面图片，并对交叉偏振光图片进行图像分析，得到量化指标毛孔面积占比，评估面部毛孔的收缩情况。
皮肤中毛孔面积占比越小，表明皮肤中的毛孔越小，测试样品的毛孔紧致效果越好。
皮肤毛孔面积占比变化率(％)＝(使用后皮肤毛孔面积占比-使用前皮肤毛孔面积占比)/使用前皮肤毛孔面积占比×100％
如上表所示，本发明的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液(5％)的紧致性能优于对比例1～8，且实施例2～7的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液(5％)与SK-II护肤精华露紧致毛孔的效果相当。实施例2～7制备的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的紧致毛孔的效果优于对比例1，说明粮醅对于贝雷丝孢酵母的发酵过程产生了重要影响，将粮醅换成对应比例的乳糖和奶粉，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的紧致毛孔的效果较差。
实施例2～7的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的紧致毛孔效果优于对比例2，说明粮醅的制备原料对于后续贝雷丝孢酵母的发酵产生影响，带壳的高粱、大米、糯米及小麦制备得到的粮醅更有利于自主分离的贝雷丝孢酵母的发酵，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液富含多种营养物质，紧致毛孔的效果更好。
实施例2～7的紧致毛孔效果优于对比例3，说明粮醅的制备原料的质量比对于后续自主分离的贝雷丝孢酵母的发酵产生影响，以3～8％的高粱(带壳)、9～13％的玉米、12～18％的大米(带壳)、2～5％的糯米(带壳)、3～8％的小麦(带壳)制备得到的粮醅更有利于自主分离的贝雷丝孢酵母的发酵，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液富含多种营养物质，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的紧致毛孔效果更好。
实施例2～7的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的紧致毛孔效果优于对比例4，说明在发酵基质中，粮醅、乳糖、奶粉之间存在协同作用，自主分离的贝雷丝孢酵母利用含有粮醅、乳糖、奶粉进行发酵，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液紧致毛孔的效果更好。
实施例2～7的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的紧致毛孔效果优于对比例5、6，说明发酵菌种对于发酵过程产生重要的影响，使用本发明自主分离的贝雷丝孢酵母，在含有粮醅、乳糖、奶粉的发酵基质中进行发酵，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的紧致毛孔效果更好，换成其他的菌种进行发酵，得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液紧致毛孔的效果较差。
实施例2～7的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的紧致毛孔效果优于对比例8，说明半乳糖酵母样菌发酵产物滤液灭菌的方式影响了最终产品的功效，本发明采用高压灭菌的方式，避免了传统巴氏灭菌法需要在80～105℃的条件下灭菌，高温的条件容易导致半乳糖酵母样菌发酵产物滤液内活性物质的流失，导致半乳糖酵母样菌发酵产物滤液紧致毛孔的效果较差。
实施例2制备的的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的紧致毛孔效果优于实施例3～6，说明粮醅中高粱(带壳)、玉米、大米(带壳)、糯米(带壳)及小麦(带壳)的加入量，发酵基质中粮醅、乳糖、奶粉的加入配比，对贝雷丝孢酵母的发酵过程产生重要影响，最终影响了半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的紧致毛孔的效果。本发明在制备粮醅过程中，高粱(带壳)、玉米、大米(带壳)、糯米(带壳)、小麦(带壳)的加入量优选为3～8％、9～13％、12～18％、2～5％、3～8％。在发酵基质中，粮醅、乳糖、奶粉的加入量优选为12～18％、1～2％、3～8％。
试验例三、半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的舒缓功效测试
测试原理：斑马鱼胚胎的中性粒细胞和人体中性粒细胞在形态、生化和生理功能上高度相似，中性粒细胞是在损伤或病菌入侵部位第一批出现的白细胞，作用于清除感染或有害物质，应用硫酸铜诱导斑马鱼胚胎侧线区域神经丘细胞损伤而引起中性粒细胞聚集的模型进行测试，比较受试物处理组和模型对照组的鱼胚胎侧线区域的中性粒细胞的数量变化，计算中性粒细胞抑制率以评价测试样品的舒缓功效。
空白对照组：随机挑选24尾健康的受精后3天大的斑马鱼胚胎，转移至3cm培养皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)的鱼胚胎培养液；阳性对照组：随机挑选24尾健康的受精后3天大的斑马鱼胚胎，转移至3cm培养皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)和0.0036mg/L吲哚美辛的鱼胚胎培养液(吲哚美辛具有舒缓作用，可以抑制中性粒细胞聚集，阳性对照用于判断实验的有效性。)。
实验组：将实施例2～7、对比例1～8制备的半乳糖酵母发酵产物滤液溶于鱼胚胎培养液中，配制成质量百分比为3％的样品溶液，随机挑选24尾健康的受精后3天大的斑马鱼胚胎，转移至3cm培养皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)和待测样品的鱼胚胎培养液。
测试方法：将上述空白对照组、阳性对照组和实验组置于28℃恒温箱中培养40min，将每测试组鱼胚胎于多聚甲醛溶液(4％)中固定至少1h后，用PBST(Triton X-100的质量百分数为0.04％的PBS溶液)处理鱼胚胎3次，每次5min，然后用50％乙醇处理3min，用苏丹黑(0.4％)染色溶液对鱼胚胎进行室温染色1h后，用70％乙醇浸洗4次，每次5min，然后用PBST处理2次，每次5min，用漂白溶液(H2O2和KOH的质量百分数分别为3％和1％的混合水溶液)处理鱼胚胎10min，然后用70％乙醇溶液处理5min，PBST处理1min，用清澈液1(甘油和KOH的质量百分数分别为20％和0.25％的混合水溶液)处理15min，清澈液2(甘油和KOH的质量百分数分别为50％和0.25％的混合水溶液)处理10min，再用PBST处理3min，将鱼胚胎侧身摆放，置于体式显微镜，计数每尾鱼胚胎从肝门起四分之三尾部侧线区域的中性粒细胞数目，通过下式计算中性粒细胞聚集抑制率，所述实施例2～7、对比例1～8的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液(3wt％)对斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制结果如下表所示。
其中，T表示实验组斑马鱼胚胎中性粒细胞数目的平均值；C表示空白对照组斑马鱼胚胎中性粒细胞数目的平均值。
实施例2～7制备的半乳糖酵母发酵产物滤液的舒缓效果优于对比例1，说明粮醅对于贝雷丝孢酵母的发酵过程产生了重要影响，将粮醅换成对应比例的乳糖和奶粉，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的舒缓效果较差。
实施例2～7制备的半乳糖酵母发酵产物滤液的舒缓效果优于对比例2，说明粮醅的制备原料对于后续贝雷丝孢酵母的发酵产生影响，带壳的高粱、大米、糯米及小麦制备得到的粮醅更有利于贝雷丝孢酵母的发酵，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液富含多种营养物质，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的舒缓效果更好。
实施例2～7的舒缓效果优于对比例3，说明粮醅的制备原料的质量比对于后续自主分离的贝雷丝孢酵母的发酵产生影响，以3～8％的高粱(带壳)、9～13％的玉米、12～18％的大米(带壳)、2～5％的糯米(带壳)、3～8％的小麦(带壳)制备得到的粮醅更有利于贝雷丝孢酵母的发酵，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液富含多种营养物质，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的舒缓效果更好。
实施例2～7制备的半乳糖酵母发酵产物滤液的舒缓效果优于对比例4，说明在发酵基质中，粮醅、乳糖、奶粉之间存在协同作用，自主分离的贝雷丝孢酵母利用含有粮醅、乳糖、奶粉进行发酵，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的舒缓效果更好。
实施例2～7制备的半乳糖酵母发酵产物滤液的舒缓性能优于对比例5、6，说明发酵菌种对于发酵过程产生重要的影响，使用本发明自主分离的贝雷丝孢酵母，在含有粮醅、乳糖、奶粉的发酵基质中进行发酵，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的舒缓效果更好，换成其他的菌种进行发酵，得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的舒缓效果较差。
实施例2～7制备的半乳糖酵母发酵产物滤液的舒缓性能优于对比例8，说明半乳糖酵母样菌发酵产物滤液灭菌的方式影响了最终产品的功效，本发明采用高压灭菌的方式，避免了传统巴氏灭菌法需要在80～105℃的条件下灭菌，高温的条件容易导致半乳糖酵母样菌发酵产物滤液内活性物质的流失，导致半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的舒缓效果较差。
实施例2制备的半乳糖酵母发酵产物滤液的舒缓效果优于实施例3～6，说明粮醅中高粱(带壳)、玉米、大米(带壳)、糯米(带壳)及小麦(带壳)的加入量，发酵基质中粮醅、乳糖、奶粉的加入配比，对酵母菌的发酵过程产生重要影响，最终影响了半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的舒缓效果。本发明在制备粮醅过程中，高粱(带壳)、玉米、大米(带壳)、糯米(带壳)、小麦(带壳)的加入量优选为3～8％、9～13％、12～18％、2～5％、3～8％。在发酵基质中，粮醅、乳糖、奶粉的加入量优选为12～18％、1～2％、3～8％。
试验例四、半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的修护功效测试
对本发明中的实施例2～7和对比例1～8制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的修护效果进行测试。
测试样品：同试验例1。
测试仪器：皮肤水分流失测试探头(Tewameter TM330T)；皮肤色素测试探头(Mexameter MX18)。
受试者选择：同试验例1。
测试步骤：测试步骤：受试者清洁脸部后，取1～2mL样品随机涂抹在半脸区域，另一半脸区域作为空白对照组，涂抹去离子水。每天使用2次，早、晚各一次。在使用样品前、使用测试样品2周、4周后，用皮肤水分流失测试探头测试面部皮肤的经皮水分流失以及皮肤泛红区域的红色素含量。
适当的皮肤水分蒸发是正常的皮肤形成代谢，皮肤的经皮水分流失越大，表明单位时间内，皮肤水分蒸发越严重，皮肤的屏障功能越差。若使用样品后，皮肤的经皮水分流失变小，则说明，表明单位时间内，皮肤水蒸发量变少，皮肤屏障功能得到修护。
皮肤红色素含量越高，表明皮肤的泛红情况越严重，若使用样品后，皮肤的红色素含量降低，则说明皮肤的泛红情况得到改善，皮肤屏障功能得到修护。
皮肤经皮水分量变化率(％)＝(使用后皮肤经皮水分流失-使用前皮肤经皮水分流失)/使用前皮肤经皮水分流失×100％；
皮肤红色素含量变化率(％)＝(使用后皮肤红色素含量-使用前皮肤红色素含量)/使用前皮肤红色素含量×100％。
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如上表所示，使用本发明的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液(5％)的后，受试者面部皮肤的经皮水分流失减少，皮肤泛红区域的红色素含量降低，说明本发明的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有很好的屏障修护和改善泛红的效果，即本发明的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有很好的修护效果。其中，实施例(5％)的修护效果优于对比例(5％)，且优于SK-II护肤精华露。
实施例2～7制备的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的修护效果优于对比例1，说明粮醅对于酵母菌的发酵过程产生了重要影响，将粮醅换成对应比例的乳糖和奶粉，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的修护效果较差。
实施例2～7制备的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的修护效果优于对比例2，说明粮醅的制备原料对于后续贝雷丝孢酵母的发酵产生影响，带壳的高粱、大米、糯米及小麦制备得到的粮醅更有利于酵母菌的发酵，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液富含多种营养物质，修护效果更好。
实施例2～7的修护效果优于对比例3，说明粮醅的制备原料的质量比对于后续自主分离的贝雷丝孢酵母的发酵产生影响，以3～8％的高粱(带壳)、9～13％的玉米、12～18％的大米(带壳)、2～5％的糯米(带壳)、3～8％的小麦(带壳)制备得到的粮醅更有利于酵母菌的发酵，制备得到半乳糖酵母样菌发酵产物滤液富含多种营养物质，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的修护效果更好。
实施例2～7制备的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的修护效果优于对比例4，说明在发酵基质中，粮醅、乳糖、奶粉之间存在协同作用，自主分离的贝雷丝孢酵母利用含有粮醅、乳糖、奶粉进行发酵，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液修护效果更好。
实施例2～7制备的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的修护效果优于对比例5、6，说明发酵菌种对于发酵过程产生重要的影响，使用本发明自主分离的贝雷丝孢酵母，在含有粮醅、乳糖、奶粉的发酵基质中进行发酵，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的修护效果更好，换成其他的菌种进行发酵，得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液修护效果的效果较差。
实施例2～7制备的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的修护效果优于对比例8，说明半乳糖酵母样菌发酵产物滤液灭菌的方式影响了最终产品的功效，本发明采用高压灭菌的方式，避免了传统巴氏灭菌法需要在80～105℃的条件下灭菌，高温的条件容易导致半乳糖酵母样菌发酵产物滤液内活性物质的流失，导致半乳糖酵母样菌发酵产物滤液修护效果较差。
实施例2制备的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的修护效果优于实施例3～6，说明粮醅中高粱(带壳)、玉米、大米(带壳)、糯米(带壳)及小麦(带壳)的加入量，发酵基质中粮醅、乳糖、奶粉的加入配比，对贝雷丝孢酵母的发酵过程产生重要影响，最终影响了半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的修护效果。本发明在制备粮醅过程中，高粱(带壳)、玉米、大米(带壳)、糯米(带壳)、小麦(带壳)的加入量优选为3～8％、9～13％、12～18％、2～5％、3～8％。在发酵基质中，粮醅、乳糖、奶粉的加入量优选为12～18％、1～2％、3～8％。
试验例五、半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的皮肤刺激测试
本发明中的多次皮肤刺激性测试的具体方法参照《化妆品安全技术规范》(2015年版)中的标准进行试验，具体方法如下：
准备满足试验条件的白色家兔24只(每一样品使用4只白色家兔)，于试验前将家兔背部脊椎两侧的被毛剪掉(去毛范围各为3cm*3cm)。
取受试物(实施例2～7的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液)0.5mL涂抹在一侧皮肤上(涂抹面积为2.5cm*2.5cm)，另一侧不作处理作为对照。每天涂抹一次，连续涂抹14天。从第二天开始，每次涂抹前剪毛。用纯水清除残留受试物。1h后观察结果。
按《化妆品安全技术规范》(2015年版)的皮肤刺性/腐蚀性试验表1评分，对照区和试验区同样处理。
结果评价：按下列公式计算每天家兔每只家兔平均积分，按《化妆品安全技术规范》(2015年版)的皮肤刺激性/腐蚀性试验表判定家兔皮肤刺激强度。试验中观察皮肤是否有皮肤刺激性以外的其他症状。
每天每只动物平均积分＝(∑红斑和水肿积分/受试动物数)/14
测试结果如下表所示。
样品 每天每只动物积分均值 结果
对照组 0 无皮肤刺激性
实施例2 0 无皮肤刺激性
实施例3 0 无皮肤刺激性
实施例4 0 无皮肤刺激性
实施例5 0 无皮肤刺激性
实施例6 0 无皮肤刺激性
实施例7 0 无皮肤刺激性
测试结果表明，本发明实施例2～7制备的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有较佳的保湿、紧致和舒缓功效，且不具有皮肤刺激性，使用安全。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (11)

1.一种具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备粮醅：将高粱、玉米、大米、糯米、小麦和水混合均匀，得到混合物，进行蒸煮，晾凉后加入酒曲进行糖化发酵，过滤，获得粮醅；
S2、制备种子液：将贝雷丝孢酵母的菌落接种至液体培养基中培养，得到种子液；
S3、发酵处理：将步骤S1的所述粮醅、乳糖、奶粉和水混合均匀，灭菌处理，得到发酵基质；将步骤S2的所述种子液接种至所述发酵基质中发酵，得到发酵液；
S4、后处理：对步骤S3的所述发酵液进行高压均质处理、过滤处理和灭菌处理，获得具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液；
所述贝雷丝孢酵母已于2023年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2023647；
步骤S1中，以质量百分比计，所述混合物包括3～8％高粱，9～13％玉米，12～18％大米，2～5％糯米，3～8％小麦，余量为水；
步骤S3中，以质量百分比计，所述发酵基质包括12～18％粮醅，1～2％乳糖，3～8％奶粉，余量为水；
所述灭菌处理是将过滤后的发酵液置于300～800MPa下高压灭菌5～20min。
2.如权利要求1所述的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，步骤S1中，以质量百分比计，所述混合物包括5％高粱，12％玉米，15％大米，3％糯米，5％小麦，余量为水。
3.如权利要求1所述的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述高粱、大米、糯米、小麦均带壳。
4.如权利要求1所述的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，步骤S1中，所述酒曲的加入量为所述混合物质量的0.2～1％。
5.如权利要求4所述的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，所述酒曲的加入量为所述混合物质量的0.5％。
6.如权利要求1所述的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，步骤S1中，所述糖化发酵的温度为32～38℃，所述糖化发酵的时间为24～38h，所述糖化发酵的相对湿度为60～80％。
7.如权利要求1所述的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，步骤S3中，以质量百分比计，所述发酵基质包括15％粮醅，1.5％乳糖，5％奶粉，余量为水。
8.如权利要求1所述的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述发酵的温度为25～32℃，所述发酵的时间为18～36h。
9.如权利要求1所述的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述高压均质处理是将所述发酵液于8～12MPa下高压均质20～60min。
10.如权利要求1～9任一项所述的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法制备的具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
11.如权利要求10所述的具有保湿、紧致和舒缓功效的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液在制备化妆品中的应用。
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