CN116855392B - 一种鱼腥草发酵液及其制备方法与应用 - Google Patents

一种鱼腥草发酵液及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液及其制备方法与应用，属于微生物发酵技术领域。本发明公开了一种紫红曲霉，命名为紫红曲霉（Monascus anka）MF02，于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No.M 2023750。本发明还公开了一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液，由紫红曲霉发酵制得，所述紫红曲霉的保藏编号为CCTCC No.M 2023750。本发明利用“植物内生真菌+药用植物”液态发酵，通过微生物的活动与代谢，以温和的方式生物转化鱼腥草原料，得到的发酵液活性物质含量高，具有较好的舒缓、修护、抗炎和抗菌的功效。

Description

一种鱼腥草发酵液及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液及其制备方法与应用。
背景技术
鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordataThunb的全草。鱼腥草味辛，性微寒，归肺经，具有清热解毒，消痈排脓，利尿通淋等功效。中药药理研究表明，鱼腥草具有抗病毒、提高机体免疫力、利尿等作用，并具有一定程度的抗辐射和抗癌防癌作用。鱼腥草的主要有效成分是挥发油和黄酮，其中以鱼腥草素、檞皮素含量最高。
目前对鱼腥草化妆品的原料开发大都用植物提取的手段进行，提取的原理都是通过机械外力破坏植物细胞壁，使有效成分溶解出来，此方法效率不高，还会造成活性分子因机械外力的作用使其结构被破坏，导致活性分子的溶出率较低。
现有技术中鱼腥草主要以提取的方式为主，利用生物发酵的方式研究内容较少；在化妆品方面的应用文献比较少，多以专利的形式呈现，且专利中以多种植物组合物的形式出现居多。现有技术中存在发酵过程较为工艺流程繁琐，需多次调配、多次发酵；耗时长且活性物未能充分提取出来。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种紫红曲霉，所述紫红曲霉命名为紫红曲霉（Monascusanka）MF02，所述紫红曲霉于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No.M 2023750。
第二方面，本发明提供了一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液，所述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液由紫红曲霉发酵制得，所述紫红曲霉的保藏编号为CCTCC No.2023750。
第三方面，本发明提供了上述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液的制备方法，所述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液的制备方法包括以下步骤：
（1）将紫红曲霉二级种子液接种至含鱼腥草的发酵基质中，在25-30℃、100-150r/min下发酵24-72 h，得到发酵产物；所述紫红曲霉的保藏编号为CCTCC No. M 2023750；
（2）对步骤（1）所得发酵产物进行灭菌、过滤，得到处理后的发酵液；
（3）将防腐剂加入至步骤（2）所得处理后的发酵液中，静置后过滤，得到具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液。
本发明通过紫红曲霉（保藏编号为CCTCC No. M 2023750）在含鱼腥草的发酵基质中发酵得到鱼腥草发酵液，所得鱼腥草发酵液含有的活性成分槲皮素最高可达177.3ppm，远高于水提法或酶解法得到的鱼腥草提取液的槲皮素含量，说明通过本发明提取方法得到的鱼腥草发酵液所含活性成分更高。此外，本发明的鱼腥草发酵液具有优异的舒缓、修护、抗炎的效果，透明质酸钠抑制率高达92.6%，皮肤血红素变化率最低可达-20.75%，均优于水提液或酶解法得到的鱼腥草提取液。此外，本发明的鱼腥草发酵液还具有较好的马拉色菌抑制效果，抑菌圈平均直径最高可达12.92mm，与传统抗生素5wt%卡那霉素的效果相当。
在实验过程中，发明人发现当发酵条件为25-30℃、100-150 r/min和发酵时间为24-72 h时得到的鱼腥草发酵液具有更优异的舒缓、抗炎、修护和抗菌的效果。在发酵过程中设置一定的转速，可以使得发酵液的溶氧量增高，为紫红曲霉带来氧气，发酵过程为好氧发酵，使得紫红曲霉更好利用地含鱼腥草的发酵基质中的营养成分，提高发酵液的活性成分；发酵温度在25-30℃的范围内能够使紫红曲霉在最适温度下生长发育，使发酵液中的活性成分含量提高，从而提高鱼腥草发酵液的效果。
本发明通过对鱼腥草发酵产物进行过滤、加入防腐剂、以及二次过滤处理，得到的鱼腥草发酵液在不同温度环境下储存3个月，其外观和气味无显著变化，表明本发明的鱼腥草发酵液具有较好的稳定性，放置一段时间后的鱼腥草发酵液仍具有很好的舒缓、修护、抗炎和抗菌的功效。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，包括（Ⅰ）~（Ⅱ）中的至少一种：
（Ⅰ）步骤（1）中，所述含鱼腥草的发酵基质包括以下组分：鱼腥草粉、碳源、氮源、无机盐和水；
所述碳源为葡萄糖、蔗糖和麦芽糖中的至少一种；
所述氮源为大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏中的至少一种；
所述无机盐为硫酸盐和/或磷酸盐；
（Ⅱ）步骤（1）中，所述紫红曲霉二级种子液和含鱼腥草的发酵基质的体积比为紫红曲霉二级种子液：含鱼腥草的发酵基质=（0.5-2）：100。
在优选参数条件下，本发明通过实验证明，含鱼腥草的发酵基质中的碳源、氮源和无机盐均需要在特定的种类范围下才能够实现较好的舒缓、修护、抗炎和抗菌的效果。在实验过程中发明人发现，以乳糖作为碳源得到的鱼腥草发酵液在舒缓、抗炎、修护和抗菌效果上均差于采用葡萄糖、蔗糖或麦芽糖作为碳源的鱼腥草发酵液。此外，发明人还发现，葡萄糖、蔗糖和麦芽糖中的至少一种作为碳源时，葡萄糖的效果最佳，蔗糖和麦芽糖次之；大豆蛋白胨、胰蛋白胨和酵母浸膏中的至少一种作为氮源时，大豆蛋白胨的效果最佳，胰蛋白胨和酵母浸膏次之，说明本发明的含鱼腥草的发酵基质碳源最优选为葡萄糖、氮源最优选为大豆蛋白胨、无机盐最优选为磷酸二氢钾。
在优选配比范围下，本发明得到的鱼腥草发酵液的舒缓、抗炎、修护和抗菌效果更佳，这是由于紫红曲霉二级种子液的接种量会对鱼腥草活性成分产生影响，实验发现紫红曲霉二级种子液的接种量为1v/v%，即紫红曲霉二级种子液：含鱼腥草的发酵基质=1:100（体积比）时，得到的鱼腥草发酵液效果最佳。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述含鱼腥草的发酵基质包括以下质量份的组分：鱼腥草粉0.1-2.5份、碳源1-3份、氮源0.5-3份和无机盐0.1-1份，水补足至总质量份为100份。
在优选配比范围下，本发明鱼腥草发酵液的舒缓、抗炎、修护和抗菌效果更好。实验表明，本发明的含鱼腥草的发酵基质中的鱼腥草粉、碳源、氮源、无机盐的配比与发酵液的效果密切相关，并且发明人已证实当发酵基质中各质量份组分为鱼腥草粉1份、碳源2份、氮源1份、无机盐0.3份时，所得到的鱼腥草发酵液的效果最佳。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤（1）中，所述紫红曲霉二级种子液的制备方法包括以下步骤：
S1、挑取紫红曲霉MF02接种至麦芽汁液体培养基中，在20-30℃下培养1-4天，得到紫红曲霉一级种子液；
S2、将步骤S1所得的紫红曲霉一级种子液接种至麦芽汁液体培养基中，20-30℃下培养1-4天，得到紫红曲霉二级种子液；所述紫红曲霉一级种子液的接种量为0.5-5v/v%。
本发明选用紫红曲霉二级种子液作为接种菌液，是由于二级种子液的生长速度、发育状态一致，属于同步培养，能够最大程度地提高紫红曲霉利用含鱼腥草的发酵基质中的各个营养成分，使鱼腥草发酵液的活性成分含量提高。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，包括（Ⅲ）~（Ⅴ）中的至少一种：
（Ⅲ）步骤（2）中，所述灭菌的方法为：将发酵产物置于85-115℃的环境中保温15-30 min；
（Ⅳ）步骤（3）中，所述静置为在20-35℃下静置5-10天；
（Ⅴ）步骤（2）和步骤（3）中，所述过滤的方法为：采用硅藻土过滤器进行过滤。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤（3）中，所述防腐剂的体积占处理后的发酵液总体积的2-12%；所述防腐剂包括丁二醇、戊二醇和乙二醇中的至少一种。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述防腐剂包括丁二醇、戊二醇和乙二醇；所述防腐剂中的丁二醇、戊二醇和乙二醇的体积百分比为丁二醇：戊二醇：乙二醇=（3-6）:（1-3）:1。
在优选配比范围下，本发明所述防腐剂中的丁二醇、戊二醇和乙二醇最优选的体积百分比为丁二醇：戊二醇：乙二醇=5:2:1。
第四方面，本发明提供了上述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液在制备日化用品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明利用“植物内生真菌+药用植物”液态发酵，通过微生物的活动与代谢，以温和的方式生物转化鱼腥草原料，得到的发酵液活性物质含量高，具有较好的舒缓、修护、抗炎和抗菌的功效。
（2）本发明是以鱼腥草植株的内生真菌紫红曲霉MF02作为发酵菌种，对鱼腥草进行发酵，因该菌种从鱼腥草中分离得到，其与鱼腥草的匹配性更好，能更好地利用鱼腥草植物的活性物质，从而使得鱼腥草发酵液中生物活性成分含量高且稳定性好，本发明通过采用植物内生真菌发酵鱼腥草粉，对鱼腥草的发酵过程和发酵条件进行了详细的探索，确定了最佳的发酵工艺，得到具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液。
附图说明
图1为鱼腥草内生菌的分离过程图，其中A为鱼腥草放置在麦芽汁固体培养基表面，B为鱼腥草内生真菌分离过程得到的菌株；
图2为紫红曲霉MF02的菌落形态图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例、对比例及效果例中所用的其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所用到的培养基为现有技术中常用的培养基，其制备方法如下。
麦芽汁液体培养基（以制备1L为例）：取130.1 g麦芽汁培养基粉加入蒸馏水1000mL，完全溶解后在121℃下高压灭菌15 min，灭菌后冷却备用。
麦芽汁固体培养基（以制备1L为例）：取130.1 g麦芽汁培养基粉加入蒸馏水1000mL和琼脂粉20 g，完全溶解后在121℃下高压灭菌15 min，灭菌后冷却备用。
糠秕孢子菌培养基（以制备1L为例）：取60 g麦芽汁琼脂、20 g牛胆汁（干燥）、10 g吐温40、2.5 g甘油单油酸酯加入蒸馏水定容至1000 mL，完全溶解后再121℃下高压灭菌，灭菌后冷却备用。
鱼腥草粉：选取干燥的鱼腥草植株，去根，留叶茎部分，用破碎机打为粉末，过80目筛，得到鱼腥草粉。
紫红曲霉1，购买自北京北纳创联生物技术研究院，货号为BNCC336565。
酿酒酵母菌，购买自北京北纳创联生物技术研究院，货号为BNCC186936。
PCRmix，购自北京擎科生物科技股份有限公司，货号为TSE101。
实施例1
本实施例提供了鱼腥草发酵液中所采用的紫红曲霉（Monascusanka）MF02的采集方法，包括以下步骤：
1.鱼腥草内生菌的分离
1.1在贵州产地采摘到的新鲜、无病虫害的鱼腥草植株，用清水清洗干净后吸干表面水分，得到干净的鱼腥草植株；
1.2将干净的鱼腥草植株在超净工作台中用无菌水冲洗2-3遍并吸干表面水分，利用无菌手术刀将植株茎部切为小块，每个小块的长度约为2 cm，得到组织块；
1.3将组织块放入75v/v%乙醇溶液中消毒1 min，再转入2.5v/v%次氯酸钠溶液中消毒10 min，再次转入75v/v%乙醇溶液中消毒30 s，最后采用无菌水漂洗2-3次，得到消毒后的组织块；
1.4剪去消毒后的组织块的边缘，放置于麦芽汁固体培养基表面，28℃避光培养7天，得到含有多种鱼腥草内生菌的培养基；下述内生菌培养条件无特别说明均为28℃遮光培养；鱼腥草放置麦芽汁固体培养基结果图见图1-A。
2鱼腥草内生真菌的纯化
采用尖端菌丝挑取法挑取含有多种鱼腥草内生菌的培养基上不同形态的菌丝，接种到新的麦芽汁固体培养基上培养至菌丝长满整个培养基；再挑取菌丝转接至新的麦芽汁培养基中，纯化转接3-4次后，在显微镜下观察菌丝形态是否一致，若一致则得到纯化的鱼腥草内生真菌，鱼腥草内生真菌分离过程见图1-B。
3紫红曲霉的鉴定
从纯化的鱼腥草内生真菌中挑取菌丝呈***的真菌，并接种至麦芽汁固体培养基的斜面培养基上，在28℃下培养至菌丝布满斜面并确定接种无污染，将长满紫红曲霉的斜面培养基保藏至4℃冰箱中，并标记为鱼腥草内生真菌MF02，鱼腥草内生真菌MF02的形态特征见图2。
通过真菌DNA提取试剂盒提取鱼腥草内生真菌MF02的DNA，采用真菌分子鉴定通用引物ITS1和ITS4作为PCR扩增引物、稀释后的鱼腥草内生真菌MF02 DNA作为模板，在PCRmix的作用下进行PCR扩增，PCR扩增程序如表1所示，得到MF02的PCR产物；
取2μL所得MF02的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增，将剩余的MF02的PCR产物进行测序，得到PCR产物的核酸序列；
将PCR产物的核酸序列进行拼接、除去两端技术误差片段，得到处理后的核酸序列；
将处理后的核酸序列在NCBI数据库（blast.ncbi.nlm.nih.gov）中进行比对，根据比对结果鉴定鱼腥草内生真菌MF02为紫红曲霉Monascusanka，因此命名为紫红曲霉MF02。
将紫红曲霉MF02保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年5月15日，保藏编号为CCTCC No. M 2023750，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。下述实施例及对比例中无特别说明，所用的紫红曲霉均为紫红曲霉MF02。
表1 PCR扩增程序
实施例2
本实施例提供了一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液及其制备方法，所述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液的制备方法包括以下步骤：
B1、挑取2环紫红曲霉MF02接种至100 mL麦芽汁液体培养基中，在28℃条件下培养2天，得到紫红曲霉一级种子液；
B2、将10 mL步骤B1所得的紫红曲霉一级种子液接种至1000 mL麦芽汁液体培养基中，在28℃下培养2天，得到紫红曲霉二级种子液；
B3、将步骤B2所得紫红曲霉二级种子液接种至含鱼腥草的发酵基质中，在28℃、130 r/min、自然pH值下发酵45 h，得到发酵产物；所述紫红曲霉二级种子液的接种量为1v/v%；
B4、将步骤B3所得发酵产物在90℃环境下灭菌20 min，再通过硅藻土过滤器过滤，得到处理后的发酵液；
B5、将防腐剂加入至步骤B4所得处理后的发酵液中，在20-35℃下静置7天后通过硅藻土过滤器过滤，得到具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液。
步骤B3中的含鱼腥草发酵基质包括以下质量百分数的组分：1%鱼腥草粉、2%葡萄糖（碳源）、1%大豆蛋白胨（氮源）、0.3%磷酸二氢钾（无机盐）、余量为水；
步骤B5中的防腐剂包括以下体积百分数的组分：5%丁二醇、2%戊二醇、1%己二醇、余量为水。
实施例3-6
本实施例3-6提供了具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液及其制备方法，所述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液的制备方法与实施例2相似，不同之处为步骤B3中含鱼腥草的发酵基质的鱼腥草和葡萄糖的用量不同，其余步骤及参数条件不变，各实施例含鱼腥草的发酵基质组分及其用量如表2所示。
表2实施例2-6各含鱼腥草的发酵基质组分及其用量（按质量份计）
实施例7-8
本实施例7-8分别提供了一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液及其制备方法，所述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液的制备方法与实施例2相似，不同之处为步骤B3中的发酵温度不同，其余步骤及参数条件不变，各实施例的发酵温度如表3所示。
表3实施例2、实施例7-8各鱼腥草发酵液的发酵温度
实施例9-12
本实施例9-12分别提供了一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液及其制备方法，所述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液的制备方法与实施例2相似，不同之处为步骤B3中的含鱼腥草的发酵基质的碳源和氮源的种类不同，其余步骤及参数条件不变，各实施例含鱼腥草的发酵基质组分及其用量如表4所示。
表4实施例2、实施例9-12的含鱼腥草的发酵基质组分
实施例13-14
实施例13-14分别提供了一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液及其制备方法，所述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液的制备方法与实施例2相似，不同之处为步骤B3中的紫红曲霉二级种子液接种量不同，其余步骤及参数条件不变，各实施例的紫红曲霉二级种子液接种量如表5所示。
表5实施例2、实施例13-14各紫红曲霉二级种子液接种量（按体积百分比计）
对比例1
本对比例提供了一种鱼腥草提取液，所述鱼腥草提取液通过水提法提取得到，包括以下步骤：
（1）取1 g鱼腥草粉加入至100 mL蒸馏水中，在90℃下水浴2 h，得到鱼腥草粗提液；
（2）将步骤（1）的鱼腥草粗提液通过硅藻土过滤器过滤，在所得滤液中加入防腐剂，在20-35℃下静置7天，再用硅藻过滤器进行二次过滤，所得二次过滤的滤液即为鱼腥草提取液；所述防腐剂的组分及用量与实施例2的相同。
步骤（2）中的防腐剂包括以下体积百分数的组分：5%丁二醇、2%戊二醇、1%己二醇、余量为水。
对比例2
本对比例提供了一种鱼腥草提取液，所述鱼腥草提取液通过酶解法提取得到，包括以下步骤：
（1）取1 g鱼腥草粉加入至100 mL蒸馏水中，再加入1 g纤维素酶（60 U/g），在50℃、50 r/min下搅拌3 min，得到鱼腥草粗提液；
（2）将步骤（1）的鱼腥草粗提液通过硅藻土过滤器过滤，在所得滤液中加入防腐剂，在20-35℃下静置7天，再用硅藻过滤机进行二次过滤，所得二次过滤的滤液即为鱼腥草提取液；所述防腐剂的组分及用量与实施例2的相同。
步骤（2）中的防腐剂包括以下体积百分数的组分：5%丁二醇、2%戊二醇、1%己二醇、余量为水。
对比例3-4
对比例3-4分别提供了一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液及其制备方法，所述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液的制备方法与实施例2相似，不同之处为步骤B1、B2、B3中采用的紫红曲霉MF02替换为其他菌株，其余步骤及参数条件不变，各对比例的紫红曲霉替换菌株如表6所示。
表6实施例2、对比例3-4采用的菌株
对比例5
对比例5提供了一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液及其制备方法，所述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液的制备方法与实施例2相似，不同之处为步骤B3中的含鱼腥草的发酵基质中的碳源由葡萄糖替换为乳糖，其余步骤及参数条件不变。
对比例6
对比例6提供了一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液及其制备方法，所述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液的制备方法与实施例2相似，不同之处为步骤B3中的发酵条件由在130 r/min下发酵替换为静置发酵，其余步骤及参数条件不变。
对比例7
对比例7提供了一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液及其制备方法，所述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液的制备方法与实施例2相似，不同之处为步骤B5中不添加防腐剂，静置7天后直接过滤，其余步骤及参数条件不变。
对比例8
对比例8提供了一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液及其制备方法，所述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液的制备方法与实施例2相似，不同之处为步骤B5中加入防腐剂静置后不进行过滤处理，其余步骤及参数条件不变。
效果例1稳定性测试
为了探究鱼腥草粉加入量、是否加入防腐剂、以及是否进行二次过滤对实施例2-4、对比例7、8所得鱼腥草发酵液稳定性的影响，通过考察鱼腥草发酵液分别在25或45℃下存放0、1、2和3月的外观及气味，以考察鱼腥草发酵液的稳定性，结果见表7-8。
表7 25℃下存放不同时间的稳定性考察结果
表8 45℃下存放不同时间的稳定性考察结果
如表7-8所示，在25℃下，本发明实施例2-4的样品均具有很好的稳定性；在45℃下，实施例2、3表现出很好的稳定性，而实施例4由于发酵时鱼腥草的加入量较大，在放置3个月后，出现轻度浑浊。对比例7、8的样品在25℃和45℃下，稳定性较差，在放置1-3个月内，均出现不同程度的变质现象。上述结果表明，在制备得到发酵液后，经过2次过滤以及加入防腐剂，可以有利于产品的稳定性，提高产品的商业应用价值。
效果例2鱼腥草发酵液活性成分测定
在对鱼腥草进行质量评价时常用鱼腥草中的槲皮素含量以判断鱼腥草的品质，因此本效果例采用高效液相色谱以及外标法测定实施例2-14、对比例1-6的鱼腥草发酵液或鱼腥草提取液（下称为待测样品）中的槲皮素的含量。
1、高效液相色谱条件
柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10μL；检测器波长372 nm；流动相：甲醇-0.2wt%磷酸溶液（甲醇：0.2wt%磷酸溶液=50:50，v/v）；洗脱条件见表9。
表9高效液相色谱洗脱条件
2、测定步骤
（1）槲皮素标准溶液的配制：精密称取槲皮素标准品11.00 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，摇匀后作为对照品溶液（槲皮素浓度为0.22 mg/mL，即为220 ppm），于0.22μm过滤器中过滤后备用。
（2）标准曲线的绘制：分别精确吸取步骤（1）的对照品溶液1、2、4、6、8、10μL进样，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，槲皮素含量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
（3）待测样品的配制：将待测样品用去离子水稀释至标准曲线浓度范围内，得到稀释后的待测样品。
（4）待测样品的测定：将步骤（3）所得稀释后的待测样品进样，记录色谱峰的保留时间和峰面积，待测样品种被测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。
（5）计算待测样品中所含槲皮素浓度：确定待测样品的主峰保留时间与对照品的主峰保留时间一致后，按照公式计算样品含量，对照品溶液和稀释后的待测样品均先后进样各两次以避免机器造成的误差，各待测样品所含槲皮素含量如表10所示，样品含量计算公式如下所示：
样品含量（ppm）=（Ac×Pstd×Tstd）/（Astd×Pc）
式中，Ac为待测样品主峰面积；Pstd为对照品重量（mg/mL）；Tstd为对照品含量（ppm）；Astd为标准品主峰面积；Pc为待测样品重量（mg/mL）。
表10待测样品所含槲皮素含量计算结果
如表10所示，实施例2-14的槲皮素含量显著高于对比例1、2，这说明通过发酵方法提取活性物质的含量高于水提法（对比例1）和酶解法（对比例2）。实施例2的槲皮素含量显著高于对比例3、4，说明本发明采用的紫红曲霉菌MF02可以更好地利用鱼腥草植株中的各种物质，使得最终产品产生的槲皮素较多，换成相同的紫红曲霉或是常用的发酵菌种进行发酵，最终得到的发酵液槲皮素含量较少。
实施例2、9、10的槲皮含量显著高于对比例5、说明发酵过程中自主分离的植物内生真菌需要特定的碳源才能进行生长，在本发明中，选用葡萄糖作为碳源发酵得到的产品最终效果最好，蔗糖、麦芽糖次之，将乳糖作为碳源时进行发酵，得到的产品槲皮素含量较低。
实施例2的槲皮含量显著高于对比例6，说明发酵的方式影响最终产品的槲皮素含量，在本发明中，发酵过程中设置一定的转速，可以使得氧气融入到发酵液中，为紫红曲霉带来氧气，使得发酵过程为好氧发酵，对比例6采用静置发酵的方式，氧气无法进入到发酵液内，紫红曲霉无法很好生长，同时大量的紫红曲霉沉降在底部无法充分利用培养基的营养成分，使得最终得到的产品的槲皮素含量较差。
实施例2与实施例3-4、实施例5-6、实施例7-8比较，说明鱼腥草粉的添加量、葡萄糖的添加量以及发酵温度均会影响发酵液中有效成分的含量；随着鱼腥草粉的质量分数增加，槲皮素含量逐渐增加，但当增加至1wt%时，槲皮素含量的增长程度随着鱼腥草粉质量分数的增加变缓，基于发酵液后处理以及样品稳定性考虑，选择了添加1wt%鱼腥草粉为最佳的发酵料液比。
实施例2与实施例9-10、实施例11-12、实施例13-14比较，说明碳源的种类、氮源的种类以及菌种的添加量都会对鱼腥草中活性成分产生影响，该测试结果可以发现发酵培养基中碳源优选葡萄糖，氮源优选大豆蛋白胨，发酵效果更好，更有利于活性成分的释放。
效果例3舒缓、抗炎效果测定（透明质酸酶抑制效果测定）
透明质酸酶是体内过敏反应的参与酶，能影响肥大细胞组胺的释放；当透明质酸酶的活性越高，肥大细胞释放的组胺则越多。这说明透明质酸酶是Ⅰ型过敏反应的参与者，与炎症、过敏有非常强的相关性，根据现有技术报道各种肥大细胞释放组胺的药物能够调节透明质酸酶的活性。因此抑制透明质酸酶活性可以作为研究皮肤舒缓、抗炎作用的指标之一；当透明质酸酶的抑制率越高，则表明该样品的舒缓、抗炎效果越好。
透明质酸酶能够和透明质酸那反应生成β-N-葡萄糖胺，该物质在碱性条件下与乙酰丙酮反应生成生色原2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物，生色原与埃尔利希试剂在浓盐酸乙醇条件下呈桃红色，于547 nm波长下测定吸光值，从而得到待测样品与对照样品对透明质酸酶的抑制性。
将实施例2-14、对比例1-8的鱼腥草发酵液或鱼腥草提取液作为测试对象（取放置7天后的提取液或发酵液），分别取上述的鱼腥草发酵液或鱼腥草提取液与水配制为质量分数为1%的待测样品溶液，甘草酸二钾与水配制为质量分数为1%的对照样品溶液。
样品对透明质酸酶抑制效果的测定步骤如下：
（1）取0.1 mL 0.25 mmol/L的CaCl2溶液和0.5 mL、1250 U/mL的透明质酸酶溶液在37℃下混合、保温20 min，得到含CaCl2的透明质酸酶溶液；
（2）分别在步骤（1）所得含CaCl2的透明质酸酶溶液中加入0.5 mL待测样品溶液或0.5 mL的对照样品溶液，于37℃下保温20 min，得到混合溶液a；
（3）在步骤（2）所得混合溶液a中加入0.5 mL透明质酸钠溶液，于37℃保温30 min，转至常温放置5 min，再于80℃下加热20min，得到混合溶液b；
（4）在步骤（3）所得混合溶液b中加入0.1 mL 0.4 mol/L的NaOH溶液和0.5 mL乙酰丙酮，于沸水浴中加热15 min后立即转入冰水中，冷却5 min后，加入1.0 mL埃尔利希试剂和3.0 mL无水乙醇，在常温中放置20 min显色，采用分光光度计测定其在547 nm处的吸光度。
各组的试剂加入要求如表11所示。
表11样品加液要求
根据以下公式计算样品对透明质酸酶的抑制率，结果如表12所示，透明质酸酶抑制率计算公式如下：
透明质酸酶抑制率（%）=[（A-B）-（C-D）]/（A-B）×100%
式中，A——对照溶液吸光度值（醋酸缓冲液代替样品溶液）；B——空白对照溶液吸光度值（醋酸缓冲液代替样品溶液及酶液）；C——试样溶液吸光度值；D——试样空白溶液吸光度值（醋酸缓冲液代替酶液）。
表12实施例2-14、对比例1-8的鱼腥草发酵液或鱼腥草提取液对透明质酸酶的抑制效果
如表12所示，实施例2-14的发酵液具有很好的舒缓、抗炎效果，实施例2-14的鱼腥草发酵液对透明质酸酶的抑制效果与甘草酸二钾相当或优于甘草酸二钾。
实施例2-14的舒缓、抗炎效果优于对比例1、2，这说明通过发酵方法提取活性物质的含量高于水提法（对比例1）和酶解法（对比例2），从而制备得到的发酵液具有很好的舒缓、抗炎效果。
实施例2的舒缓、抗炎效果优于对比例3、4，说明本发明自主分离的紫红曲霉MF02可以更好地利用鱼腥草植株中的各种物质，使得最终产品舒缓、抗炎效果较好，换成别的紫红曲霉或别的菌种进行发酵，所得产品的舒缓、抗炎效果较差。
实施例2、9、10的舒缓、抗炎效果优于对比例5、说明发酵过程中自主分离的紫红曲霉需要特定的碳源才能进行生长，在本发明中，选用葡萄糖作为碳源发酵得到的产品最终舒缓、抗炎效果最好。将乳糖作为碳源时进行发酵，得到的产品舒缓、抗炎效果较差。实施例2的舒缓、抗炎效果优于对比例6，说明发酵的方式影响最终产品的舒缓、抗炎效果，在本发明中，发酵过程中设置一定的转速，可以使得氧气融入到发酵液中，为紫红曲霉带来氧气，使得发酵过程为好氧发酵，对比例6采用静置发酵的方式，氧气无法进入到发酵液内，紫红曲霉无法很好生长，使得最终得到的产品的舒缓、抗炎效果较差。
实施例2-14的舒缓、抗炎效果优于对比例7、8，说明过滤、防腐剂的加入方式影响最终产品的稳定性，进而影响到最终产品的舒缓、抗炎效果。本发明将鱼腥草的提取液或发酵液静置7天后再进行透明质酸酶活性抑制实验，结果表明，对比例7、8放置7天后，出现了不同程度的变质现象，进而影响到最终产品的舒缓、抗炎效果。本发明中，在发酵完成后，需要经过硅藻土过滤器过滤后，加入防腐剂、随后进行二次过滤，制备得到的产品稳定性高，舒缓、抗炎效果较好。
实施例2与实施例3-4、实施例5-6、实施例7-8比较可知，鱼腥草粉的添加量、葡萄糖的添加量以及发酵温度均会影响发酵液中有效成分的含量；随着鱼腥草粉的质量分数增加，舒缓、抗炎效果逐渐变好，但当增加至1wt%时，舒缓、抗炎效果的增长程度随着鱼腥草粉质量分数的增加变缓，基于发酵液后处理以及样品稳定性考虑，选择了添加1wt%鱼腥草粉为最佳的发酵料液比。
实施例2与实施例9-10、实施例11-12、实施例13-14比较可知，碳源的种类、氮源的种类以及菌种的添加量都会对鱼腥草中活性成分产生影响，该测试结果可以发现发酵培养基中碳源优选葡萄糖，氮源优选大豆蛋白胨，发酵效果更好，更有利于活性成分的释放。
效果例4舒缓、修护效果测试（皮肤血红素测定）
为了探究本发明的鱼腥草发酵液对人体皮肤是否具有舒缓、修护的效果，通过测定人体皮肤使用鱼腥草发酵液前和使用后的皮肤血红素变化，以考察鱼腥草发酵液的舒缓、修护效果。
测试样品：实施例2-14、对比例1-8的鱼腥草发酵液或鱼腥草提取液（取放置7天后的提取液或发酵液），将上述鱼腥草发酵液或鱼腥草提取液分别配制为质量分数为5%的待测样品溶液，以去离子水作为空白对照。将待测样品溶液和去离子水分别浸润凝胶面膜布，凝胶面膜布的规格为2×2cm，制备得到含待测样品的贴片或含去离子水的贴片。
测试方法：招募220名健康、无皮肤病的志愿者作为受试者，分为22个组，每组10名志愿者，对应使用不同的鱼腥草发酵液、鱼腥草提取液或水。先在受试者的双臂的前臂屈侧皮肤上敷贴含10wt%乳酸溶液的凝胶面膜布（规格为2×2cm），直至皮肤发红，取下含10wt%乳酸溶液的凝胶面膜布，随机选取志愿者其中一前臂敷贴含待测样品的贴片10 min，另一前臂敷贴含去离子水的贴片，使用皮肤黑色素和血红素测试探头（MexameterMX18，Courage&Khazaka，德国）检测敷贴含待测样品的贴片或含去离子水的贴片前后测试区域的皮肤血红素，并计算皮肤血红素变化率，结果见表13，皮肤血红素变化率计算公式如下：
皮肤血红素变化率（%）=（使用后皮肤血红素-使用前皮肤血红素）/使用前皮肤血红素×100%
当皮肤血红素变化率为负值，则表明使用样品后，皮肤泛红情况减轻，即样品具有舒缓、修护效果；当皮肤血红素变化率的负值越大，则样品的舒缓、修护效果越好。
表13实施例2-14、对比例1-8的鱼腥草发酵液或鱼腥草提取液对皮肤血红素变化率的计算结果
如表13所示，实施例2-14的发酵液具有很好的舒缓、修护效果。实施例2-14的舒缓修护效果优于对比例1、2，这说明通过发酵方法提取活性物质的含量高于水提法（对比例1）和酶解法（对比例2），从而制备得到的发酵液具有很好的舒缓修护效果。
实施例2的舒缓修护效果优于对比例3、4，说明本发明自主分离的紫红曲霉MF02可以更好地利用鱼腥草植株中的各种物质，使得最终产品舒缓修护效果较好，换成别的紫红曲霉或别的菌种进行发酵，最终产品的舒缓修护效果较差。
实施例2、9、10的舒缓修护效果优于对比例5、说明发酵过程中自主分离的紫红曲霉需要特定的碳源才能进行生长，在本发明中，选用葡萄糖作为碳源发酵得到的产品最终舒缓修护效果最好。将乳糖作为碳源时进行发酵，得到的产品舒缓修护效果较差。实施例2的舒缓修护效果优于对比例6，说明发酵的方式影响最终产品的舒缓、修护效果，在本发明中，发酵过程中设置一定的转速，可以使得氧气融入到发酵液中，为紫红曲霉带来氧气，使得发酵过程为好氧发酵，对比例6采用静置发酵的方式，氧气无法进入到发酵液内，紫红曲霉无法很好生长，使得最终得到的产品的舒缓、抗炎效果较差。
实施例2-14的舒缓修护效果优于对比例7、8，说明过滤、防腐剂的加入方式影响最终产品的稳定性，进而影响到最终产品的舒缓修护效果。本发明将鱼腥草的提取液或发酵液静置7天后再进行测试，结果表明，对比例7、8放置7天后，出现了不同程度的变质现象，进而影响到最终产品的舒缓修护效果。本发明中，在发酵完成后，需要经过硅藻土过滤器过滤后，加入防腐剂、随后进行二次过滤，制备得到的产品稳定性高，舒缓修护效果较好。
实施例2与实施例3-4、实施例5-6、实施例7-8比较可知，鱼腥草粉的添加量、葡萄糖的添加量以及发酵温度均会影响发酵液中有效成分的含量；随着鱼腥草粉的质量分数增加，舒缓修护效果逐渐变好，但当增加至1wt%时，舒缓修护效果的增强程度随着鱼腥草粉质量分数的增加变缓，基于发酵液后处理以及样品稳定性考虑，选择了添加1wt%鱼腥草粉为最佳的发酵料液比。实施例2与实施例9-10、实施例11-12、实施例13-14比较可知，碳源的种类、氮源的种类以及菌种的添加量都会对鱼腥草中活性成分产生影响，该测试结果可以发现发酵培养基中碳源优选葡萄糖，氮源优选大豆蛋白胨，发酵效果更好，更有利于活性成分的释放。
效果例5抑菌性能测试
为了探究本发明的鱼腥草发酵液是否具有较好的抑菌性能，通过抑菌圈法测试鱼腥草发酵液对马拉色菌的抑制效果。
测试样品：实施例2-14、对比例1-8的鱼腥草发酵液或鱼腥草提取液（取放置7天后的提取液或发酵液），将上述鱼腥草发酵液或鱼腥草提取液分别配制为质量分数为5%的待测样品溶液，以5wt%的卡那霉素作为对照溶液。分别取直径为6 mm的滤纸分别浸泡在上述待测样品溶液、对照溶液中备用。
测试步骤：取0.1 mL 5×105cfu/mL的马拉色菌菌悬液涂布至糠秕孢子菌培养基中，将浸有待测样品溶液或对照溶液的铝制品放置在上述培养基中，于30℃中培养24 h后测量抑菌直径，每个样品进行6次平行实验，结果取平均值，结果见表14。
表14实施例2-14、对比例1-8的鱼腥草发酵液或鱼腥草提取液对马拉色菌的抑制作用结果
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如表14所示，实施例2-14的发酵液具有很好的抑制马拉色菌的效果。
实施例2-14的抑菌效果优于对比例1、2，这说明通过发酵方法提取活性物质的含量高于水提法（对比例1）和酶解法（对比例2），从而制备得到的发酵液具有很好的抑菌效果。
实施例2的抑菌效果优于对比例3、4，说明本发明自主分离的紫红曲霉MF02可以更好地利用鱼腥草植株中的各种物质，使得最终抑菌效果较好，换成别的紫红曲霉或别的菌种进行发酵，最终产品的抑菌效果较差。
实施例2、9、10的抑菌效果优于对比例5、说明发酵过程中自主分离的紫红曲霉需要特定的碳源才能进行生长，在本发明中，选用葡萄糖作为碳源发酵得到的产品最终抑菌效果最好，将乳糖作为碳源时进行发酵，得到的产品抑菌效果较差。实施例2的抑菌效果优于对比例6，说明发酵的方式影响最终产品的抑菌效果，在本发明中，发酵过程中设置一定的转速，可以使得氧气融入到发酵液中，为紫红曲霉带来氧气，使得发酵过程为好氧发酵，对比例6采用静置发酵的方式，氧气无法进入到发酵液内，紫红曲霉无法很好生长，使得最终得到的产品的抑菌效果较差。
实施例2-14的舒缓、抗炎效果优于对比例7、8，说明过滤、防腐剂的加入方式影响最终产品的稳定性，进而影响到最终产品的抑菌效果。本发明将鱼腥草的提取液或发酵液静置7天后再进行抑菌实验，结果表明，对比例7、8放置7天后，出现了不同程度的变质现象，进而影响到最终产品的抑菌效果。本发明中，在发酵完成后，需要经过硅藻土过滤器过滤后，加入防腐剂、随后进行二次过滤，制备得到的产品稳定性高，抑菌效果较好。
实施例2与实施例3-4、实施例5-6、实施例7-8比较可知，鱼腥草粉的添加量、葡萄糖的添加量以及发酵温度均会影响发酵液中有效成分的含量；随着鱼腥草粉的质量分数增加，抑菌效果逐渐变好，但当增加至1wt%时，抑菌效果的增长程度随着鱼腥草粉质量分数的增加变缓，基于发酵液后处理以及样品稳定性考虑，选择了添加1wt%鱼腥草粉为最佳的发酵料液比。实施例2与实施例9-10、实施例11-12、实施例13-14比较可知，碳源的种类、氮源的种类以及菌种的添加量都会对鱼腥草中活性成分产生影响，该测试结果可以发现发酵培养基中碳源优选葡萄糖，氮源优选大豆蛋白胨，发酵效果更好，更有利于活性成分的释放。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种紫红曲霉，其特征在于，所述紫红曲霉命名为紫红曲霉MF02，所述紫红曲霉保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2023750。
2.一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液，其特征在于，所述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液由紫红曲霉发酵制得，所述紫红曲霉的保藏编号为CCTCC No：M 2023750；
所述鱼腥草发酵液的制备方法包括以下步骤：
（1）将紫红曲霉二级种子液接种至含鱼腥草的发酵基质中，在25-30℃、100-150r/min下发酵24-72h，得到发酵产物；所述紫红曲霉的保藏编号为CCTCC No：M2023750；
（2）对步骤（1）所得发酵产物进行灭菌、过滤，得到处理后的发酵液；
（3）将防腐剂加入至步骤（2）所得处理后的发酵液中，静置后过滤，得到鱼腥草发酵液；
步骤（1）中，所述含鱼腥草的发酵基质包括以下组分：鱼腥草粉、碳源、氮源、无机盐和水；
所述碳源为葡萄糖、蔗糖和麦芽糖中的任一种；
所述氮源为大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏中的任一种；
所述无机盐为磷酸二氢钾；
所述含鱼腥草的发酵基质包括以下质量份的组分：鱼腥草粉0.5-2份、碳源1-3份、氮源0.5-3份和无机盐0.1-1份，水补足至总质量份为100份；
步骤（1）中，所述紫红曲霉二级种子液和含鱼腥草的发酵基质的体积比为紫红曲霉二级种子液：含鱼腥草的发酵基质=（0.5-2）：100；
步骤（3）中，所述防腐剂的体积占处理后的发酵液总体积的2-12%；所述防腐剂包括丁二醇、戊二醇和乙二醇；所述防腐剂中的丁二醇、戊二醇和乙二醇的体积百分比为丁二醇：戊二醇：乙二醇=（3-6）:（1-3）:1。
3.一种具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液的制备方法，其特征在于，所述具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的鱼腥草发酵液的制备方法包括以下步骤：
（1）将紫红曲霉二级种子液接种至含鱼腥草的发酵基质中，在25-30℃、100-150r/min下发酵24-72h，得到发酵产物；所述紫红曲霉的保藏编号为CCTCC No：M2023750；
（2）对步骤（1）所得发酵产物进行灭菌、过滤，得到处理后的发酵液；
（3）将防腐剂加入至步骤（2）所得处理后的发酵液中，静置后过滤，得到鱼腥草发酵液；
步骤（1）中，所述含鱼腥草的发酵基质包括以下组分：鱼腥草粉、碳源、氮源、无机盐和水；
所述碳源为葡萄糖、蔗糖和麦芽糖中的任一种；
所述氮源为大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏中的任一种；
所述无机盐为磷酸二氢钾；
所述含鱼腥草的发酵基质包括以下质量份的组分：鱼腥草粉0.5-2份、碳源1-3份、氮源0.5-3份和无机盐0.1-1份，水补足至总质量份为100份；
步骤（1）中，所述紫红曲霉二级种子液和含鱼腥草的发酵基质的体积比为紫红曲霉二级种子液：含鱼腥草的发酵基质=（0.5-2）：100；
步骤（3）中，所述防腐剂的体积占处理后的发酵液总体积的2-12%；所述防腐剂包括丁二醇、戊二醇和乙二醇；所述防腐剂中的丁二醇、戊二醇和乙二醇的体积百分比为丁二醇：戊二醇：乙二醇=（3-6）:（1-3）:1。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述紫红曲霉二级种子液的制备方法包括以下步骤：
S1、挑取活化的紫红曲霉MF02单菌落接种至麦芽汁液体培养基中，在20-30℃下培养1-4天，得到紫红曲霉一级种子液；
S2、将步骤S1所得的紫红曲霉一级种子液接种至麦芽汁液体培养基中，20-30℃下培养1-4天，得到所述紫红曲霉二级种子液；所述紫红曲霉一级种子液的接种量为0.5-5v/v%。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括（Ⅲ）~（Ⅴ）中的至少一种：
（Ⅲ）步骤（2）中，所述灭菌的方法为：将所述发酵产物置于85-115℃的环境中保温15-30min；
（Ⅳ）步骤（3）中，所述静置为在20-35℃下静置5-10天；
（Ⅴ）步骤（2）和步骤（3）中，所述过滤的方法为：采用硅藻土过滤器进行过滤。
6.如权利要求2所述的鱼腥草发酵液在制备对皮肤具有舒缓、修护、抗炎和抗菌功效的化妆品中的应用，所述菌为马拉色菌。
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