CN117771141A - 一种具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液，属于应用生物技术领域，所述仙人掌发酵滤液包括如下原料：复合微生物、辅料和仙人掌；所述复合微生物包括酵母菌、米曲霉、卷枝毛霉；所述辅料包括大米和去离子水。本发明将仙人掌、大米和复合微生物进行联用，协效使得仙人掌发酵滤液成品具有优异的DPPH自由基消除效果。将酵母菌、米曲霉和卷枝毛霉复配联用，能协效使得仙人掌发酵更充分完全，从而进一步提高仙人掌发酵滤液成品对DPPH自由基的消除率。本发明制得的仙人掌发酵滤液成品无皮肤刺激性，无***反应，无急性经口毒性，可以安全用于护肤品。
Description
技术领域
本发明属于应用生物技术领域，具体地，涉及一种具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液。
背景技术
仙人掌茎(Opunt ia)是一类仙人掌茎目仙人掌茎科植物的统称，其品种广泛分布于全球各地。据统计，全球共有近百种不同的仙人掌茎属品种，其中相当一部分品种具有独特的食用及药用价值。我国中医很早就开始关注仙人掌茎的药用价值，清代医家赵学敏的《本草纲目拾遗》提到，仙人掌茎味淡性寒，入心、肺、胃三经，可行气活血，清热解毒，消肿止痛，健脾止泻，安神利尿。仙人掌茎除了应用于食品和医药行业外，还广泛应用于化妆品行业，其原汁、干粉以及提取物在化妆品中具有舒缓、清除自由基、保湿、抗菌、护发等多种功效，是一种良好的天然物质。
虽然仙人掌及其提取物在化妆品行业上应用较多，但对于仙人掌茎中活性物质的提取大多还是采用溶剂提取、超声或微波辅助提取、物理压榨等物理或化学方法，鲜少见到应用生物技术作为提取工艺，即应用生物技术作为对仙人掌的提取工艺在提取仙人掌活性物质领域较为空白，且即使市面上存在该技术，但它们提取的仙人掌发酵滤液DPPH自由基消除效果极其欠佳，难以满足应用所需。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液，将仙人掌、大米和复合微生物进行联用，协效使得仙人掌发酵滤液成品具有优异的DPPH自由基消除效果。将酵母菌、米曲霉和卷枝毛霉复配联用，能协效使得仙人掌发酵更充分完全，从而进一步提高仙人掌发酵滤液成品对DPPH自由基的消除率，解决了现有仙人掌发酵滤液技术中存在的对DPPH自由基消除率欠佳的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液，所述仙人掌发酵滤液包括如下原料：复合微生物、辅料和仙人掌。
所述复合微生物包括酵母菌、米曲霉、卷枝毛霉；所述辅料包括大米和去离子水。
作为本发明的一种优选技术方案，所述仙人掌发酵滤液各原料质量百分比如下：
酵母菌，为酿酒酵母或其他传统上用于食品生产的酵母。而米曲霉、卷枝毛霉为传统上用于食品生产的无毒无害且可以把淀粉降解成葡萄糖供酵母菌发酵生长用的一类微生物。
作为本发明的一种优选技术方案，所述酵母菌、米曲霉和卷枝毛霉的质量百分比均为4～6％。
更优选地，所述酵母菌的质量百分比为5％，米曲霉的质量百分比为4％，所述卷枝毛霉的质量百分比为6％。
一种具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
S10、将复合微生物和仙人掌分别进行前处理，得到前处理复合微生物和前处理仙人掌；
S20、将大米和质量百分比为10％的去离子水混匀后，控温控压处理，处理完成后降温至30℃以下，得到处理后米料，将处理后米料按质量均分接入前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉中，进行第一控温发酵，将发酵后的前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉混合均匀并接入前处理仙人掌中，加入余量去离子水，进行第二控温发酵，得到中间仙人掌发酵液；
S30、将中间仙人掌发酵液过滤，于管式离心中除大颗粒杂质，再无菌过滤，即得具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液成品。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤S10具体包括如下步骤：
S11、复合微生物的前处理：
分别从复合微生物平板上无菌挑取酵母菌、米曲霉、卷枝毛霉，将其分别接种于灭菌YEPD培养基中，控温摇瓶培养，得到前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉；
S12、仙人掌的前处理：将仙人掌清洗、粉碎，控温加热处理，降温30℃以下后备用，得到前处理仙人掌。
对仙人掌进行加热处理相当于通过给仙人掌加热消毒，消除其仙人掌所可能携带的微生物，便于酵母菌、米曲霉、卷枝毛霉发酵。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤S11所述YEPD培养基的成分包括：酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和蒸馏水。
作为本发明的一种优选技术方案，所述酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和蒸馏水的质量比为1:2:2:95。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤S11所述控温摇瓶培养的温度为28～30℃，时间为16～30h。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤S12所述控温加热处理的温度为70～80℃，时间为2～3h。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤S20所述控温控压处理的温度为120～122℃、压力为0.11Mpa、处理时间为20min；所述第一控温发酵的温度为28～30℃，时间为3～4天；所述第二控温发酵的温度为28～30℃，时间为5～6天。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤S30所述过滤为40～200目粗过滤；所述管式离心的转速为8000～12000rpm；所述无菌过滤的微孔滤膜为0.22μm。
本发明的有益效果：
(1)以微生物发酵作为生物提取技术，在适宜条件下利用微生物体内酶的分解作用将仙人掌经过特定的代谢途径转化为更易于被人体皮肤吸收、利用的产物，并且发酵过程中促进仙人掌活性成分分离从而产生新的功效或增强原有的功效。一方面通过发酵技术强化了仙人掌的提取，另一方面产生更多新活性物质，极大地提高原料的利用率，且也为仙人掌资源的开发利用增加新的途径。
(2)本发明将仙人掌、大米和复合微生物进行联用，以仙人掌提高仙人掌发酵滤液成品对DPPH自由基的消除率；以大米提供碳源营养物质辅助复合微生物生长进而有效发酵仙人掌；以复合微生物起主要发酵作用，进一步反馈体系产生大量营养物质，同时，也进一步协助仙人掌强化仙人掌发酵滤液成品对DPPH自由基的消除率；即仙人掌、大米和复合微生物三者联用，协效使得仙人掌发酵滤液成品具有优异的DPPH自由基消除效果。
(3)本发明将酵母菌、米曲霉和卷枝毛霉复配联用，米曲霉和卷枝毛霉能有效作用于大米，供予酵母菌生长的糖类等碳源，使得酵母菌大量繁殖；另一方面米曲霉、卷枝毛霉具有大量可以水解仙人掌等植物细胞壁的酶，能有效使得仙人掌细胞内的营养物质充分释放，让酵母菌可以充分发酵仙人掌；因此，将酵母菌、米曲霉和卷枝毛霉联用，能协效使得仙人掌发酵更充分完全，从而进一步提高仙人掌对仙人掌发酵滤液成品对DPPH自由基的消除率。
(4)本发明的仙人掌发酵滤液成品发酵后pH偏酸性，不易污染微生物，且其理化指标在质量规格要求内，可常温存放1年。
(5)本发明制得的仙人掌发酵滤液成品无皮肤刺激性，无***反应，无急性经口毒性，可以安全用于护肤品。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所采用的酵母菌、米曲霉、卷枝毛霉均采购于中国微生物研究所；本发明的大米、仙人掌来源均为市售，且仙人掌为2012年11月12日，在***发布的2012年第19号文件批准为普通食品的梨果仙人掌(Opuntia ficus-indica(Linn.)Mill，米邦塔品种)；后续不作赘述。
实施例1
一种具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液，所述仙人掌发酵滤液包括如下原料：复合微生物、辅料和仙人掌；
所述复合微生物包括酵母菌、米曲霉、卷枝毛霉；所述辅料包括大米和去离子水；
所述仙人掌发酵滤液各原料质量百分比如下：
所述具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液的制备方法包括如下步骤：
S10、将复合微生物和仙人掌分别进行前处理：
S11、复合微生物的前处理：
分别从复合微生物平板上无菌挑取酵母菌、米曲霉、卷枝毛霉，将其分别接种于灭菌YEPD培养基中，控温30℃摇瓶培养30h，得到前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉；
所述YEPD培养基的成分包括：酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和蒸馏水；
所述酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和蒸馏水的质量比为1:2:2:95；
S12、仙人掌的前处理：将仙人掌清洗干净、粉碎，控温80℃加热处理2.5h，处理完成后降温至30℃以下后备用，得到前处理仙人掌；
S20、将大米和质量百分比为10％的去离子水混匀后，控温121℃，控压0.11Mpa，处理20min，处理完成后降温至30℃以下，得到处理后米料，将处理后米料按质量均分接入前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉中，控温29℃发酵4天，将发酵后的前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉混合均匀并接入前处理仙人掌中，加入余量去离子水，控温30℃发酵6天，得到中间仙人掌发酵液；
S30、将中间仙人掌发酵液进行80目粗过滤，然后10000rpm管式离心除大颗粒杂质，除杂质后再进行0.22μm无菌过滤，即得具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液成品。
实施例2
一种具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液，所述仙人掌发酵滤液包括如下原料：复合微生物、辅料和仙人掌；
所述复合微生物包括酵母菌、米曲霉、卷枝毛霉；所述辅料包括大米和去离子水；
所述仙人掌发酵滤液各原料质量百分比如下：
所述具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液的制备方法包括如下步骤：
S10、将复合微生物和仙人掌分别进行前处理：
S11、复合微生物的前处理：
分别从复合微生物平板上无菌挑取酵母菌、米曲霉、卷枝毛霉，将其分别接种于灭菌YEPD培养基中，控温28℃摇瓶培养23h，得到前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉；
所述YEPD培养基的成分包括：酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和蒸馏水；
所述酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和蒸馏水的质量比为1:2:2:95；
S12、仙人掌的前处理：将仙人掌清洗干净、粉碎，控温75℃加热处理2h，处理完成后降温至30℃以下后备用，得到前处理仙人掌；
S20、将大米和质量百分比为10％的去离子水混匀后，控温120℃，控压0.11Mpa，处理20min，处理完成后降温至30℃以下，得到处理后米料，将处理后米料按质量均分接入前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉中，控温28℃发酵3天，将发酵后的前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉混合均匀并接入前处理仙人掌中，加入余量去离子水，控温28℃发酵6天，得到中间仙人掌发酵液；
S30、将中间仙人掌发酵液进行40目粗过滤，然后12000rpm管式离心除大颗粒杂质，除杂质后再进行0.22μm无菌过滤，即得具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液成品。
实施例3
一种具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液，所述仙人掌发酵滤液包括如下原料：复合微生物、辅料和仙人掌；
所述复合微生物包括酵母菌、米曲霉、卷枝毛霉；所述辅料包括大米和去离子水；
所述仙人掌发酵滤液各原料质量百分比如下：
所述具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液的制备方法包括如下步骤：
S10、将复合微生物和仙人掌分别进行前处理：
S11、复合微生物的前处理：
分别从复合微生物平板上无菌挑取酵母菌、米曲霉、卷枝毛霉，将其分别接种于灭菌YEPD培养基中，控温29℃摇瓶培养16h，得到前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉；
所述YEPD培养基的成分包括：酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和蒸馏水；
所述酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和蒸馏水的质量比为1:2:2:95；
S12、仙人掌的前处理：将仙人掌清洗干净、粉碎，控温70℃加热处理3h，处理完成后降温至30℃以下后备用，得到前处理仙人掌；
S20、将大米和质量百分比为10％的去离子水混匀后，控温122℃，控压0.11Mpa，处理20min，处理完成后降温至30℃以下，得到处理后米料，将处理后米料按质量均分接入前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉中，控温30℃发酵4天，将发酵后的前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉混合均匀并接入前处理仙人掌中，加入余量去离子水，控温29℃发酵5天，得到中间仙人掌发酵液；
S30、将中间仙人掌发酵液进行200目粗过滤，然后8000rpm管式离心除大颗粒杂质，除杂质后再进行0.22μm无菌过滤，即得具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液成品。
对比例1
与实施例1相比，区别在于，对比例1中不添加大米进行发酵，即仙人掌发酵滤液原料中不含大米，仙人掌发酵滤液各原料质量百分比如下：
酵母菌7.5％、米曲霉6.5％、卷枝毛霉8.5％、仙人掌42.5％、去离子水35％；
步骤S20具体为：
S20、将前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉混合均匀并接入前处理仙人掌中，加入去离子水，控温30℃发酵6天，得到中间仙人掌发酵液；
其余操作步骤和参数均不变。
对比例2-4
与实施例1相比，对比例2-4中酵母菌、米曲霉和卷枝毛霉的质量百分比如表1所示，其余操作步骤和参数均不变。
表1
测试例1
根据标准T/SHRH 006-2018化妆品-自由基(DPPH)清除实验方法，对实施例1-3和对比例1-4制得的仙人掌发酵滤液成品进行清除自由基能力测试，其结果如表2所示。
表2
| DPPH自由基清除率(％) | 标准差(SD) | |
| 实施例1 | 84.33 | 0.62 |
| 实施例2 | 82.98 | 0.40 |
| 实施例3 | 83.40 | 0.58 |
| 对比例1 | 13.44 | 1.25 |
| 对比例2 | 18.86 | 0.63 |
| 对比例3 | 16.31 | 0.88 |
| 对比例4 | 15.17 | 0.45 |
以上实施例和对比例1可以说明，单独仙人掌发酵，由于缺少大米这种可以大量提供碳源的营养物质，只有仙人掌，菌种生长状态很差，无法有效发酵仙人掌，难以提高滤液对DPPH自由基的消除率，因此，将仙人掌、大米和复合微生物三者联用，能最好程度协效使得仙人掌发酵滤液成品具有优异的DPPH自由基消除效果。
而以上实施例和对比例2-4可以说明，本发明将酵母菌、米曲霉和卷枝毛霉复配联用，能协效使得仙人掌发酵更充分完全，从而进一步提高仙人掌对仙人掌发酵滤液成品对DPPH自由基的消除率。
测试例2
急性皮肤刺激性试验
检测方法：《化妆品安全技术规范》(2015年版)第六章4中5.3急性皮肤刺激性/腐蚀性试验。
检测对象：实施例1-3和对比例1-4制得的仙人掌发酵滤液成品。
检测环境：普通环境动物房，温度：18～26℃，相对湿度：40～70％。
实验动物和饲料：每组4只普通级新西兰兔，雄性，体重2.04～2.27kg。
试验方法：
a)动物处理：试验前约24h，将实验动物背部脊柱两侧毛剪掉，不可损伤表皮，去毛范围左、右各约3cmx3cm。
b)染毒：取受试物0.5mL直接涂在去毛区皮肤上，然后用二层医用纱布(2.5cmx2.5cm)和一层油纸覆盖，再用无刺激性医用绷带固定，另一侧皮肤作为对照。封闭贴敷4h。试验结束后用温水清除残留受试物。
c)动物观察：于清除受试物后的1h、24h、48h和72h观察涂抹部位皮肤反应，按皮肤刺激反应评分标准进行皮肤反应评分，以受试动物积分的平均值进行综合评价，根据24h、48h和72h各观察时点最高积分均值，按皮肤刺激强度分级表判定皮肤刺激强度。观察时间的确定应足以观察到可逆或不可逆刺激作用的全过程，一般不超过14d。
其中，皮肤刺激反应评分和皮肤刺激强度分级如下所示：
皮肤刺激反应评分
皮肤刺激强度分级
| 积分均值(n) | 强度 |
| 0≤n≤0.5 | 无刺激性 |
| 0.5≤n≤2.0 | 轻刺激性 |
| 2.0≤n≤6.0 | 中刺激性 |
| 6.0≤n≤8.0 | 强刺激性 |
试验结果:各组别24h、48h和72h各观察时间点最高积分均值均为0。
各实施例和对比例皮肤刺激反应积分测试结果如下表3-9所示：
受试物对家兔急性皮肤刺激性试验结果：
表3
表4
表5
表6
表7
表8
表9
试验结论:24h、48h和72h各组别的受试物各观察时间点最高积分均值为0，各受试物对家兔急性皮肤刺激性均为无刺激性。
测试例3
皮肤***反应试验(Buehler Test局部封闭涂皮)
1.测试方法:《化妆品安全技术规范》(2015年版)第六章6皮肤***反应试验中5.1局部封闭涂皮试验。
2.测试对象：实施例1-3和对比例1-4制得的仙人掌发酵滤液成品。
3.检测环境:普通环境动物房，温度:18～26℃相对湿度:40～70％。
4.实验动物和饲料:每组30只普通级FMMU豚鼠，雄性，体重301.0～359.5g。
5.样品处理:样品未经处理，直接应用。
6.阳性物:阳性物:2.4-二硝基氯苯，溶剂:95％乙醇和水，诱导浓度:5g/L，激发浓度:1g/L，用量:0.2mL/只。
7.试验方法
a)将30只豚鼠随机分为试验组和阴性对照组，试验组20只，阴性对照组10只
b)实验前约24h，将豚鼠背部左侧去毛，去毛范围为4cm～6cm。
c)诱导接触:将受试物约0.2L涂在实验动物去毛区皮肤上，以二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布封闭固定6h。第7d和第14d以同样的方法重复一次。阴性对照组以0.9％的氯化钠注射液同法操作。
d)激发接触末次诱导后14d将约0.2mL的受试物涂于试验组和阴性对照组豚鼠背部右侧2cmx2cm去毛区(接触前24h脱毛)，然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布固定6h。
e)动物观察:激发接触后24h和48h观察皮肤反应，按表《***反应试验皮肤反应评分》评分。
8.判定标准：
***反应试验皮肤反应评分
当受试物组动物出现皮肤反应积分>2时，判为该动物出现皮肤***反应阳性，按表《致敏强度判定标准》判定受试物的致敏强度。
致敏强度判定标准
| 致敏率％ | 致敏强度 |
| 0～8 | 弱 |
| 9～28 | 轻 |
| 29～64 | 中 |
| 65～80 | 强 |
| 81～100 | 极强 |
注:致敏率为0时，可判为未见皮肤***反应。
9.试验结果如下表10所示：
表10
| 组别 | 结果 |
| 实施例1 | 未见皮肤***反应 |
| 实施例2 | 未见皮肤***反应 |
| 实施例3 | 未见皮肤***反应 |
| 对比例1 | 未见皮肤***反应 |
| 对比例2 | 未见皮肤***反应 |
| 对比例3 | 未见皮肤***反应 |
| 对比例4 | 未见皮肤***反应 |
由表10可知，各组别均未见皮肤***反应，本发明所用原料安全。
在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液，其特征在于，所述仙人掌发酵滤液包括如下原料：复合微生物、辅料和仙人掌；
所述复合微生物包括酵母菌、米曲霉、卷枝毛霉；所述辅料包括大米和去离子水。
2.根据权利要求1所述的具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液，其特征在于，所述仙人掌发酵滤液各原料质量百分比如下：
3.根据权利要求2所述的具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液，其特征在于，所述酵母菌、米曲霉和卷枝毛霉的质量百分比均为4～6％。
4.根据权利要求3所述的具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液，其特征在于，所述酵母菌的质量百分比为5％，米曲霉的质量百分比为4％，所述卷枝毛霉的质量百分比为6％。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
S10、将复合微生物和仙人掌分别进行前处理，得到前处理复合微生物和前处理仙人掌；
S20、将大米和质量百分比为10％的去离子水混匀后，控温控压处理，处理完成后降温至30℃以下，得到处理后米料，将处理后米料按质量均分接入前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉中，进行第一控温发酵，将发酵后的前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉混合均匀并接入前处理仙人掌中，加入余量去离子水，进行第二控温发酵，得到中间仙人掌发酵液；
S30、将中间仙人掌发酵液过滤，于管式离心中除大颗粒杂质，再无菌过滤，即得具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液成品。
6.根据权利要求5所述的具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液的制备方法，其特征在于，所述步骤S10具体包括如下步骤：
S11、复合微生物的前处理：
分别从复合微生物平板上无菌挑取酵母菌、米曲霉、卷枝毛霉，将其分别接种于灭菌YEPD培养基中，控温摇瓶培养，得到前处理酵母菌、前处理米曲霉、前处理卷枝毛霉；
S12、仙人掌的前处理：将仙人掌清洗、粉碎，控温加热处理，降温30℃以下后备用，得到前处理仙人掌。
7.根据权利要求6所述的具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液的制备方法，其特征在于，步骤S11所述YEPD培养基的成分包括：酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和蒸馏水。
8.根据权利要求7所述的具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液的制备方法，其特征在于，所述酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和蒸馏水的质量比为1:2:2:95。
9.根据权利要求6所述的具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液的制备方法，其特征在于，步骤S11所述控温摇瓶培养的温度为28～30℃，时间为16～30h；步骤S12所述控温加热处理的温度为70～80℃，时间为2～3h。
10.根据权利要求5所述的具有自由基清除功效的仙人掌发酵滤液的制备方法，其特征在于，步骤S20所述控温控压处理的温度为120～122℃、压力为0.11Mpa、处理时间为20min；所述第一控温发酵的温度为28～30℃，时间为3～4天；所述第二控温发酵的温度为28～30℃，时间为5～6天。
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