CN114752504B - 裂褶菌菌种ysc1、基于该裂褶菌制备的胞内胞外多糖、化妆品及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供一种裂褶菌(Schizophyllum commune)菌种YSC1，其保藏编号为CGMCC No.17788。还提供一种裂褶菌胞内、胞外多糖及制备方法，包括：将裂褶菌菌种YSC1经活化、纯化、扩大培养后得到裂褶菌菌液；将大米与水按比例调配后灭菌制得大米发酵底物；将裂褶菌菌液接种至大米发酵底物进行发酵处理；分离产物后分别对菌丝体和发酵液提取裂褶菌胞内胞外多糖。本公开采用新型裂褶菌菌种YSC1，对大米进行液体发酵提取的胞内胞外多糖具有良好的抗氧化、抗衰以及保湿功效，无致敏性，安全性高；用于制备膏霜化妆品，稳定性好，人体安全性高，同时具有良好的抗衰、抗皱、保湿等美肤效果。

Description

裂褶菌菌种YSC1、基于该裂褶菌制备的胞内胞外多糖、化妆品 及制备方法
技术领域
本公开属于化妆品技术领域，具体涉及一种裂褶菌菌种(Schizophyllumcommune) YSC1、基于该裂褶菌制备的胞内胞外多糖、化妆品及制备方法。
背景技术
对于裂褶菌的认识，早在《新华本草纲要》、《云南食用菌》、《中国药用真菌》等古书籍中就有刊录，裂褶菌有别样的气味，性平，滋补强壮、镇静的作用。目前，裂褶菌按照微生物的分类，在褶菌科公认有2属8种，我国裂褶菌现有3个种，其中白参菌分布最广。裂褶菌是药食同源真菌，含有丰富的活性物质。
寻求更多的裂褶菌菌种并提取其活性物质，满足广大消费者群体所需，是技术研究人员的共同目标。
发明内容
为解决以上问题，本公开提供了一种裂褶菌菌种(Schizophyllum commune)YSC1、基于该裂褶菌制备的胞内胞外多糖、化妆品及制备方法。
为解决上述技术问题，本公开提供的技术方案是：
第一方面，本公开提供一种裂褶菌(Schizophyllum commune)菌种YSC1，其保藏编号为CGMCC No.17788。
本公开的裂褶菌(Schizophyllum commune)菌种YSC1，由申请人从甘肃省张掖市肃南县祁连山国家自然保护区(E100°14'31.13"，N 38°32'52.71"；海拔 2810-2980m)采集野生真菌子实体，挑取其菌盖和菌柄交接处组织，然后置于装有PDA 加富培养基的斜面培养基上，25℃暗培养5d，得到菌丝。挑出菌丝纯化两次，获得真菌YSC1的纯化菌株。每次纯化的步骤为：将菌丝置于装有PDA加富培养基的斜面培养基上，25℃暗培养5d。
第二方面，本公开提供一种裂褶菌胞内多糖的制备方法，包括：
菌液制备步骤：将裂褶菌(Schizophyllum commune)菌种YSC1接种于合适的培养基进行培养活化处理，然后将培养活化处理得到的单菌落接种至合适的培养基进行扩大培养得到裂褶菌菌液；
大米发酵底物制备步骤：将大米与水按比例调配后，进行灭菌处理，制得大米发酵底物；
发酵步骤：将所述裂褶菌菌液接种至所述大米发酵底物，进行发酵处理；
菌丝体干粉制备步骤：从所述发酵处理后的产物中分离得到菌丝体，洗净后进行研磨处理，干燥后得到菌丝体干粉；
热水浸提步骤：对所述菌丝体干粉进行热水浸提处理，得到裂褶菌胞内粗多糖。
进一步地，上述裂褶菌胞内多糖的制备方法，还包括：
Sevage法除杂步骤，对所述裂褶菌胞内粗多糖进行2-6次Sevage法除蛋白操作，能得到纯度更高的裂褶菌胞内多糖。
上述裂褶菌胞内多糖的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述菌液制备步骤中，所述裂褶菌菌液的浓度为104-1010CFU/mL(比如105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL等)。
上述裂褶菌胞内多糖的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述大米发酵底物制备步骤中，所述大米用量为大米与水总质量的1-3％(比如0.8％、1％、1.5％、2％、2.5％、2.8％等)。
上述裂褶菌胞内多糖的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述发酵步骤中，按体积百分比，接种量为1-10％(1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、9％等)，即，所述裂褶菌菌液与所述大米发酵底物的体积比为1-10:100；更优选地接种量为1-7％。
上述裂褶菌胞内多糖的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述发酵步骤中，所述发酵处理的温度为20-35℃(比如20℃、30℃、32℃、34℃等)，时间为48-72h (比如50h、55h、60h、65h、70h等)；更优选地，所述发酵处理在摇床中进行，转速为150-210r/min(比如160r/min、170r/min、180r/min、190r/min、200r/min等)。在上述发酵条件下裂褶菌的繁殖情况较好，产物质量较好。
上述裂褶菌胞内多糖的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述菌丝体干粉制备步骤中，所述分离处理采用离心处理，所述离心处理的转速为4000-5000rpm(比如4200rpm、4500rpm、4800rpm等)，时间为20-40min(比如22min、25min、30min、 35min、38min等)。
上述裂褶菌胞内多糖的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述热水浸提步骤中，料液比(即所述菌丝体干粉与热水的质量体积比，单位为g/mL)为1:20-70(比如1:25、1:30、1:40、1:50、1:60等)，浸提时间为0.5-3h(比如1h、1.5h、2h、2.5h 等)，浸提温度为60-80℃(比如60℃、65℃、70℃、75℃、80℃等)，提取次数为1-4 次(比如2次、3次等)。
第三方面，本公开提供一种裂褶菌胞内多糖，采用上述制备方法制成。
上述裂褶菌胞内多糖，优选，纯度为60％以上，即裂褶菌胞内多糖的含量在60％以上。
第四方面，本公开提供一种裂褶菌胞外多糖的制备方法，包括：
菌液制备步骤：将裂褶菌(Schizophyllum commune)菌种YSC1接种于合适的培养基进行培养活化处理，然后将培养活化处理得到的单菌落接种至合适的培养基进行扩大培养得到裂褶菌菌液；
大米发酵底物制备步骤：将大米与水按比例调配后，进行灭菌处理，制得大米发酵底物；
发酵步骤：将所述裂褶菌菌液接种至所述大米发酵底物，进行发酵处理；然后将所述发酵处理后的产物依次进行离心分离、灭菌处理，得到上清液，干燥后得到裂褶菌胞外粗多糖；
Sevage法除杂步骤，对所述裂褶菌胞内粗多糖进行2-6次Sevage法除蛋白操作，能得到纯度更高的裂褶菌胞外多糖。
上述裂褶菌胞外多糖的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述菌液制备步骤中，所述裂褶菌菌液的浓度为104-1010CFU/mL(比如105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL等)。
上述裂褶菌胞外多糖的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述大米发酵底物制备步骤中，所述大米用量为大米与水总质量的1-3％(比如0.8％、1％、1.5％、2％、2.5％、2.8％等)。
上述裂褶菌胞外多糖的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述发酵步骤中，按体积百分比，接种量为1-10％(1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、9％等)，即，所述裂褶菌菌液与所述大米发酵底物的体积比为1-10:100；更优选地接种量为1-4％；进一步优选地，接种量为1-2％。
上述裂褶菌胞外多糖的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述发酵步骤中，所述发酵处理的温度为20-35℃(比如20℃、30℃、32℃、34℃等)，时间为48-72h (比如50h、55h、60h、65h、70h、等)；瓶容量即发酵体系体积与发酵容器容量之比为100-300毫升mL/500mL(比如150mL/500mL、200mL/500mL、250mL/500mL等)；更优选地，所述发酵处理在摇床中进行，转速为150-210r/min(比如160r/min、170r/min、 180r/min、190r/min、200r/min等)。在上述发酵条件下裂褶菌的繁殖情况较好，产物质量较好。
上述裂褶菌胞外多糖的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述尾处理步骤中，所述分离处理采用离心处理，所述离心处理的转速为4000-5000rpm(比如4200rpm、4500rpm、4800rpm等)，时间为20-40min(比如22min、25min、30min、35min、38min 等)。
第五方面，本公开提供一种裂褶菌胞外多糖，采用上述制备方法制成。
上述裂褶菌胞外多糖，优选纯度为60％以上，即裂褶菌胞外多糖的含量(纯度) 在60％以上。
第六方面，本公开还提供一种使用上述裂褶菌胞内多糖制备的膏霜化妆品。
上述裂褶菌胞内多糖制备的膏霜化妆品中，作为一种优选实施方式，所述裂褶菌胞内多糖的添加量为0.1-2.0wt％。
第七方面，本公开还提供一种使用上述裂褶菌胞外多糖制备的膏霜化妆品。
上述裂褶菌胞外多糖制备的膏霜化妆品中，作为一种优选实施方式，所述裂褶菌胞外多糖的添加量为0.1-2.0wt％。
本公开的有益效果包括但不限于：
1、本公开选用保藏编号为CGMCC No.17788的裂褶菌(Schizophyllum commune)菌种YSC1，用于对大米发酵后提取的胞内胞外多糖具有良好的抗氧化、抗衰以及保湿功效，无致敏性，安全性高。
2、采用本公开的裂褶菌多糖制备膏霜化妆品，稳定性好，人体安全性高，同时具有良好的抗衰、抗皱、保湿等美肤效果。
本公开的裂褶菌新菌种保藏日期为2019年06月05日，保藏编号为CGMCCNo.17788，分类命名为：裂褶菌(Schizophyllum commune)YSC1，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。
附图说明
图1至图5示出了不同条件对胞外多糖浓度的影响，其中，图1示出了大米发酵底物中大米浓度对上清液中多糖浓度的影响，图2示出了瓶容量对上清液中多糖浓度的影响，图3示出了发酵时间对多糖浓度的影响，图4示出了接种量对上清液中多糖浓度的影响，图5示出了转速对上清液中多糖浓度的影响；图中不同字母表示有显著性差异p<0.05，相同字母表示无显著性差异p>0.05。
图6至图9示出了不同条件对胞内多糖浓度的影响，其中，图6示出了料液比对裂褶菌胞内多糖提取率的影响，图7示出了提取时间对裂褶胞内多糖提取率的影响，图8示出了浸提温度对裂褶胞内多糖提取率的影响，图9示出了浸提次数对裂褶菌胞内多糖提取率的影响；图中不同字母表示有显著性差异p<0.05，相同字母表示无显著性差异p>0.05。
图10示出了Sevage法脱除裂褶菌胞外多糖时脱除次数与胞外蛋白质脱除率的关系。
图11示出了Sevage法脱除裂褶菌胞内多糖时脱除次数与胞内蛋白质脱除率的关系。
图12分别示出了Sevage法除杂后的裂褶菌胞内多糖、胞外多糖以及β-葡聚糖在不同浓度下对DPPH自由基的清除作用。
图13分别示出了Sevage法除杂后的裂褶菌胞内多糖、胞外多糖以及β-葡聚糖在不同浓度下对羟自由基的清除作用。
图14分别示出了Sevage法除杂后的裂褶菌胞内多糖、胞外多糖以及β-葡聚糖在不同浓度下对螯合Fe2+能力的影响。
图15分别示出了Sevage法除杂后的裂褶菌胞内多糖、胞外多糖以及β-葡聚糖在不同浓度下对还原能力的影响。
图16分别示出了裂褶胞内胞外多糖以及标品β-葡聚糖处理HSF细胞24h的存活率。
图17分别示出了不同浓度的裂褶胞内胞外多糖对受损伤的人成纤维细胞的修复作用，其中(a)、(b)、(c)为不同浓度的标品β-葡聚糖、胞内多糖、胞外多糖对人成纤维细胞存活率的影响示意图。
图18分别为标品β-葡聚糖以及裂褶胞内胞外多糖修复H2O2伤害后细胞的显微镜照片。
图19分别示出了不同样品对细胞内总抗氧化能力ABTS的影响，其中，S1组为胞内多糖2.5mg/mL，S2组为胞外多糖2.5mg/mL，阳组为β-葡聚糖2.5mg/mL。
图20分别示出了不同样品对细胞内总SOD活力的影响，其中，S1组为胞内多糖2.5mg/mL，S2组为胞外多糖2.5mg/mL，阳组为β-葡聚糖2.5mg/mL。
图21分别示出了不同样品对细胞内MDA含量的影响，其中，S1组为胞内多糖2.5mg/mL，S2组为胞外多糖2.5mg/mL，阳组为β-葡聚糖2.5mg/mL。
图22为胞内胞外多糖样品以及标品β-葡聚糖的眼刺激性评价结果状态图。
图23中的(a)示出了低温对胞内多糖样品可溶性固含物的影响，(b)示出了低温对胞外多糖样品可溶性固含物的影响。
图24中的(a)示出了高温对胞内多糖样品可溶性固含物的影响，(b)示出了高温对胞外多糖样品可溶性固含物的影响。
图25中的(a)示出了冷热循环对胞内多糖样品可溶性固含物的影响，(b)示出了冷热循环对胞外多糖样品可溶性固含物的影响。
图26示出了两种不同膏霜对皮肤水分含量(MMV)变化率的影响，其中，Y1为含裂褶胞内多糖1wt％的膏霜样品，Y2为含裂褶胞外多糖1wt％的膏霜样品，下同。
图27示出了两种不同膏霜使用前后对MMV的影响。
图28示出了两种不同膏霜对经皮水分散失(TEWL)变化率的影响。
图29示出了两种不同膏霜使用前后对TEWL的影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本公开，但并不限定本公开。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中，实验数据利用SPSS 19.0数据处理软件进行统计学处理，组间比较采用单因素ANOVA分析，两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，所得结果以表示。
实施例1裂褶菌(Schizophyllum commune)菌种YSC1的分离、鉴定和保藏。
1、菌种的分离
本发明的发明人从甘肃省张掖市肃南县祁连山国家自然保护区(E100°14'31.13"， N 38°32'52.71"；海拔2810-2980m)采集野生真菌子实体。挑取其菌盖和菌柄交接处组织，然后置于装有PDA加富培养基的斜面培养基上，25℃暗培养5d，得到菌丝。挑出菌丝纯化两次，获得真菌YSC1的纯化菌株。每次纯化的步骤为：将菌丝置于装有PDA加富培养基的斜面培养基上，25℃暗培养5d。
2、形态学鉴定
菌丝体菌丝白色，直径1～1.5μm，有分枝，弯曲，有锁状联合。在PDA培养基上，菌丝体生长旺盛时，表面分泌出一层含有草酸钙的白色结晶体。菌丝以接种点为中心，呈辐射状向四周生长，接种点菌丝常呈淡黄色，菌丝匍匐生长于基质表面，老熟时分泌黄色或黄褐色的色素，易形成菌膜。菌丝体发育到一定阶段后，在适宜的条件下，开始相互扭结，在基质表面形成光滑的白色物，并向上突起，即子实体的原基。
示例：菌丝体在试管斜面初期呈白色绒毛状，菌丝直径为1.0～1.5μm，一星期后菌丝体紧贴培养基，菌丝体转淡黄色，并形成韧性较强的皮膜，菌丝不分泌色素。
3、分子***发育分析
按照真菌基因组提取试剂盒(品牌为OMEGA，型号为D3390-02)的操作步骤，提取YSC1的基因组DNA。
以上述提取的YSC1基因组DNA作为扩增模板，以真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC为引物进行PCR反应。反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共35个循环。对得到的PCR产物进行测序，测序结果表明YSC1的rDNA-ITS序列如SEQ ID No.1所示，将该序列与NCBI数据库中已公开的rDNA-ITS序列进行在线同源性比对，结果显示 YSC1与裂褶菌属(Schizophyllum commune strain)真菌核酸序列同源性最高，相似性为99％。
4、裂褶菌YSC1(Schizophyllum commune)的菌种保藏
YSC1已于2019年06月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.17788。YSC1的全称为裂褶菌(Schizophyllum commune)YSC1 CGMCC No.17788。
实施例2使用裂褶菌(Schizophyllum commune)菌种YSC1CGMCC No.17788对大米进行液体发酵，分别提取胞外胞内多糖，具体包括如下步骤。
一、YSC1菌液的制备
裂褶菌YSC1菌液的制备步骤如下：
(1)将YSC1接种于葡萄糖马铃薯琼脂(PDA)培养基，28℃培养2d(目的为活化)；
(2)将步骤(1)获得的单菌落接种至100mL马铃薯葡萄糖水培养基(商品名：马铃薯葡萄糖水，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)，28℃、180rpm培养24h，得到YSC1菌液，浓度大致为108的CFU/ml。
二、大米发酵底物制备
将大米以0-3％的比例和蒸馏水调配，灭菌，灭菌条件为121℃/20min；制得大米发酵底物。
三、接种、发酵
将上述步骤二制备的大米发酵底物进行接种：取新鲜制备的YSC1菌液，接种量为1-7％，在容量为500毫升的三角瓶内发酵体系体积(即瓶容量)为50-400ml；随后置于 28℃90～210rpm下培养24～120h，得到发酵产物(发酵液)。
四、发酵产物分离
发酵结束后对发酵产物离心分离并灭菌，离心条件为4800rpm10min，灭菌条件为121℃20min，得到一系列上清液以及菌丝体。
1)所得上清液形状指标如下：pH 4.5～6；固形物含量3～5；电导率350以下；粘度约50-700mPa.s，颜色为微白色或淡黄色清澈或微浑浊液体；气味：轻微的特殊发酵气味。然后，将上清液冷冻干燥制备成一系列冻干粉，储存。
2)所得菌丝体清洗两遍，用玻璃匀浆器研磨菌丝体，冷冻干燥得菌丝体冻干粉。
五、裂褶菌胞外多糖提取(发酵制备)条件优化实验及结果分析
将配好的大米培养基(即步骤二制备的大米发酵底物)进行灭菌，通过调控培养基浓度A、培养时间B、接种量C、瓶容量D、转速E(摇床转速)等单因素，探究最佳发酵条件，并按下表的条件进行单因素实验，每组重复3组，4800r/min离心10min，取上清液(即步骤四制得到的上清液)。用苯酚-硫酸法(王倩，张佳婵，王昌涛，等. 碳氮比对真菌发酵桑枝-燕麦麸皮的活性成分和抗氧化能力的影响[J].食品工业科技， 2019，40(2):93-99+106.)检测上清液中多糖含量，具体的单因素实验条件见表1。
表1单因素实验条件表
A培养基浓度(％) B时间(h) C接种量(％) D瓶容量(mL) E转速(r/min)
1、1.5、2、3 72 1 200 150
1 48、72、96、120 1 200 150
1 72 1、2、3、4 200 150
1 72 1 100、200、300、400 150
1 72 1 200 120、150、180、210
从图1可以看出，当大米培养基的浓度为2％的时候，上清液中裂褶菌胞外多糖浓度达到最高。从图2可看出，300mL的瓶容量(即发酵体系与发酵容器体积比为3:5) 下培养效果较好。从图3可看出，当发酵时间为72h的时候上清液中裂褶菌胞外多糖浓度达到最高。从图4可看出，多糖的浓度随着接种量先增加后减小，上清液中裂褶菌胞外多糖浓度最高的时候，接种量为2％。从图5可看出，当转速为150r/min时，上清液中裂褶菌胞外多糖的浓度最高。
以300mL的瓶容量(即发酵体系与发酵容器体积比为3:5)、大米培养基的浓度为2％，接种量为2％，转速为150r/min，发酵时间72h为最优条件作为后续实施例中胞外多糖的制备方法。
六、采用热水浸提法从菌丝体中提取裂褶菌胞内多糖
一)单因素试验
取1g菌丝体冻干粉，并按下表2的条件进行单因素实验，每组3组平行实验，提取液4800r/min离心10min得上清，上清液多糖含量用苯酚硫酸法检测，得到多糖含量和胞内多糖提取率。
表2单因素实验条件表
A料液比(g/mL) B浸提时间(h) C浸提温度(℃) D提取次数
1:20 1:30 1:40 1:50 1:60 2 70 1
1:50 1、1.5、2、2.5、3 70 1
1:50 2 60、65、70、75、80 1
1:50 2 70 1、2、3
从图6可以看出，随着料液比的增加，多糖提取率也在增加，且在1:60(g/mL) 时，多糖的提取率最高。从图7可看出，随着提取时间的增加，胞内多糖提取率并没有提升，说明提取时间对其影响不显著，从工艺经济效益来看，选择提取时间1h，多糖提取率最高。从图8可看出，随温度的升高，多糖提取率先升高后下降，出现了一个最高值，考虑到经济效益方面，选择浸提温度为65℃。从图9可以看出，提取1 次的多糖提取率最高，实际生产可以选择提取2-5次。
二)正交试验
由单因素试验的结果，设计3因素3水平正交实验，并通过正交实验获取最佳的多糖提取条件。裂褶菌胞内多糖提取条件的3因素3水平设计见表3，正交实验设计及结果见表4，正交实验方差分析见表5。由K值分析得，最佳提取条件组合为A1B2C2，3因素对多糖提取率的影响由强到弱顺序为A>C>B，即裂褶胞内多糖最佳的提取条件为：料液比1:50，提取时间1h，提取温度65℃。在该条件下验证得到多糖的提取量为 (4.02±0.14)mg/mL，此值与正交试验结果基本一致。
裂褶胞内多糖最佳的提取条件为：料液比1:50，提取时间1h，提取温度65℃。以该方法制备后续实施例所用的胞内多糖。
表3三因素三水平
水平/因素 A料液比(g/mL) B浸提时间(h) C浸提温度(℃)
1 1:50 0.5 60
2 1:60 1 65
3 1:70 1.5 70
表4正交试验结果分析表
表5正交试验方差分析表
七、对提取的裂褶菌胞外多糖和胞内多糖进行Sevage法除蛋白
对于按照上述第五部分和第六部分所述的最优条件/最佳条件提取的裂褶菌胞外、保内粗多糖在进行脱蛋白之前，首先检测蛋白质与总糖的含量，见表6。之后进行Sevage法除蛋白实验，方法如下：配制10g/L的粗多糖溶液，再配制氯仿、正丁醇体积比5:1的Sevage试剂，将多糖样品和该试剂两者按照1v:4v混合，搅拌20-30min，之后4800r/min离心10min，将上层的糖液重复多次操作，标准蛋白曲线采用考马斯亮蓝法。计算每次Sevage试剂处理后蛋白含量。蛋白质脱除效果按公式计算：蛋白质脱除率＝(m0-m)/m0×100％，其中m0是裂褶菌粗多糖中蛋白质含量，m为每次Sevage 试剂处理后上层糖液中的蛋白质的含量。
脱蛋白与脱除次数之间的相关实验结果如图10和图11。从图中可以看出，随着脱除次数的增加，样品中蛋白质的脱除率一直下降，且在脱除的最后两次脱除率基本不变，说明蛋白质基本上已经除尽。
表6蛋白质与总糖含量表
蛋白含量g/100mL 总糖含量mg/mL
胞内多糖样品 27.00 6.83
胞外多糖样品 4.93 7.54
对于10.00mg/mL的胞内胞外多糖样品在去除蛋白之后，又进行了多糖含量、总糖含量、还原糖含量以及蛋白质含量的检测，发现其多糖的纯度在60％以上，见表7。
表7胞内胞外多糖样品中的含量指标
实施例3
一、紫外全波段扫描和红外光谱分析
用实施例2中的除蛋白后的胞内多糖、胞外多糖以及标品β-葡聚糖进行紫外全波段扫描，发现胞内多糖样品和胞外多糖样品在260nm和280nm波长附近出现了核酸和蛋白质的特征吸收峰，而标品中几乎没有任何的特征峰出现，再结合表7中的数据，说明多糖样品中可能还有少量的蛋白质。
采用红外光谱对除蛋白后的胞内多糖、胞外多糖以及标品β-葡聚糖进行分析，发现胞内多糖、胞外多糖的红外光谱在波数890cm-1附近出现的吸收峰(典型的β-型糖苷键链接的特征吸收峰)，说明胞内胞外多糖均有可能含有β-葡聚糖。
二、体外抗氧化活性测试
对实施例2中Sevage法脱蛋白获得裂褶菌胞内胞外多糖冻干粉样品，测试其多糖在体外对于·OH、DPPH·的清除作用，以及其还原能力以及对Fe2+的鳌合能力，以更全面的考察裂褶菌胞内胞外多糖的抗氧化活性。
1、清除1-二苯基-2-三硝基苦肼自由基(DPPH·)的能力测定。
实验方法：样品制备：用去离子水分别配制浓度为1.2mg/mL、1mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL的胞内胞外多糖溶液以及β-葡聚糖溶液，备用； 4mg/mL的DPPH·溶液用无水乙醇配制，取2mL的各浓度待测样品与2mL DPPH·溶液混匀，反应30min，在离心机中3000r/min离心10min，取上清液在517nm波长处测定吸光值(OD值)。
待测物质清除DPPH·的能力可以用清除率来表示，清除率越大，清除的能力越强。其公式为：清除率I＝[I-(Ai-Aj)/A0]×100％；其中：Ai-2mL DPPH·溶液+2mL样品； Aj-2mLDPPH·溶液的溶剂+2mL样品；A0-2mL DPPH·溶液+2mL样品的溶剂。
测试结果如图12所示，从图中可以看出，随着待测样品浓度的降低，DPPH·的清除能力也在逐渐降低，样品浓度与清除DPPH·的能力之间有明显的量效关系，本实施例制备的多糖具有一定的清除DPPH·的能力。随着待测样品浓度的减小对DPPH·的清除能力也在下降，对于胞内多糖来讲，其DPPH·自由基清除能力远远高于其他两种样品，推断其抗氧化能力优于另外两者，可能是胞内多糖样品中含有协同抗氧化的物质，如不饱和脂肪酸等，当然胞外多糖也具有一定的清除自由基的作用。
2、清除羟自由基(·OH)的能力测定。
实验方法：样品制备：用去离子水分别配制浓度为5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、 2mg/mL、1mg/mL的胞内胞外多糖溶液以及β-葡聚糖溶液，备用；向1mL样品中加入6mmol/L的FeSO4溶液1mL，混匀后加入6mmol/L的H2O2溶液1mL，三者反应10min，最后加入1mL浓度为6mmol/L的水杨酸溶液，于37℃水浴中静置半小时，各反应溶液在离心机中3000r/min离心10min，取上清在510nm波长测定OD值。
待测物质清除·OH的能力用清除率来表示，清除率越大，清除·OH的能力就越强。其公式为：清除率％I＝[1-(AI-Aj)/Ao]×100％；其中：Ai-样品的吸光值；Aj-无水杨酸时样品的吸光值；A0-空白对照。
·OH是氧三电子还原产物，是氧化能力很强的自由基,反应性极强，寿命很短，是自由基中已知的最强的氧化剂，对生物机体的危害性极大。几乎可以与任何大分子物质如蛋白质、核酸、脂质等发生作用，导致机体受损和基因突变，引起机体衰老和癌变。测试结果如图13所示，从图中可以看出在探讨的实验浓度范围内，·OH清除能率均在40～50％左右，本实施例制备的发酵产物具有良好的·OH清除能力。从图13可以看出，样品浓度的变化对·OH的清除能力没有明显的影响，但仍然是存在一定的清除作用，而且胞内胞外多糖·OH的清除能力基本相当，从经济的方面考虑，相同清除率的情况下应该选择浓度低的样品浓度。
3、螯合Fe2+的能力测定。
实验方法：取各个浓度梯度下的多糖样品溶液5mL，再依次加入浓度为2mmol/L 的FeCl2溶液0.1mL，浓度为5mmol/L的菲啰嗪溶液0.2mL，溶液摇匀，静置10min 在562nm波长测定OD值。以0.2mL去离子水代替菲啰嗪溶液，按照上述操作做空白实验。再以5mL去离子水代替多糖样品溶液，按照上述操作做对照实验，以β-葡聚糖作阳性对照。螯合率下列公式计算：螯合率＝[1-(样品吸光值-空白吸光值)/对照吸光值]×100％。
过渡金属离子可以通过Fenton反应促进脂类的氧化反应，还可以使脂类氧化后的氢过氧化物降解产生各种自由基来传递氧化反应链。过渡金属离子鳌合剂可以降低其氧化能力，从而起到抗氧化剂的作用。螯合率越高表示抗氧化能力越强。
测试结果如图14所示，样品的浓度和螯合Fe2+能力存在着一定的相关性，且螯合能力的强弱顺序依次为胞外多糖、胞内多糖、标品β-葡聚糖，本实施例胞外多糖铁螯合能力较好，在1mg/mL浓度时能达到65％左右，胞内多糖在1mg/mL浓度时能达到 55％左右。
4、还原能力测定。
实验方法：样品制备：用去离子水分别配制浓度为1mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL的胞内胞外多糖溶液以及β-葡聚糖溶液，备用。取1mL的各浓度样品、2.5mL的磷酸盐缓冲液(pH＝6.6)、2.5mL的1％含量K3[Fe(CN)6]溶液，三者混合均匀，在50℃水浴锅中反应20min，最后加入2.5mL的10％含量Cl3CCOOH溶液，在离心机中3000r/min离心10min，将2.5mL的上清液，2.5mL的去离子水和0.5mL 的0.1％含量FeCl3溶液三者反应充分。在700nm波长测定OD值，OD值越高，该样品的还原性越强。
测试结果如图15所示，从图中可以看出，三种多糖的还原能力有明显的差别，胞内多糖的吸光值较其他两种大，说明胞内多糖具有较强的还原能力，可能是因为胞内多糖具有比较多的侧链，因而具有的还原性末端也相对较多；当然，胞外多糖也具有一定的还原能力。
三、细胞水平上探究样品的抗氧化功效评价
本实验所用到的试剂和生产厂家如下：0.25％(含EDTA)胰蛋白酶，美国GIBCO 生命技术公司；DMEM高糖培养基，美国GIBCO生命技术公司；胎牛血清，美国GIBCO 生命技术公司；DMSO，Biotopped；CCK-8，Merck Millipore；人成纤维细胞(HSF)，中国科学院细胞库；FM培养基，美国Corning公司；Trizol(总RNA抽提试剂)，总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)，脂质氧化(MDA)检测试剂盒，总SOD活性检测试剂盒(WST-8法)，碧云天生物技术有限公司。
实验方法如下：
1)细胞复苏：将-80℃冰箱中冻存的人成纤维细胞(HSF)取出，快速转移到37℃水浴锅中将其融化。向冻存液中加入1.5mL有血清的DMEM培养液进行稀释，在离心机中1000r/min离心5分钟，得细胞沉淀。向倒掉上清的细胞沉淀中加入有血清的 5mL FM培养基，将HSF混匀，移至细胞培养瓶中，于37℃，5％CO2条件的培养箱中培养。
2)细胞传代：当细胞长满培养瓶底80％以上时，倒掉液态培养基，再用适量pH＝7.4 的无菌磷酸缓冲液(PBS)清洗。用2mL 0.25％的胰酶使细胞从培养瓶上脱落，大约 3分钟，加入2mL有血清的DMEM培养液终止消化，在离心机中1500r/min离心3 分钟左右，在细胞沉淀中加入3mL FM培养液混匀，在T75培养瓶中以1:14的比例对细胞进行传代。
3)裂褶菌胞内、胞外多糖对细胞毒性的检测：将HSF以每孔1x104的细胞数量接种于96孔培养板中，在37℃，5％CO2条件下使HSF生长12小时。将HSF贴壁之后的培养液倒掉，在含有细胞的孔中加入不同浓度样品，每个浓度设5个平行，细胞对照组用不含血清的DMEM培养液，样品组和对照组都培养24小时。之后加入CCK-8 溶液，再培养2-4小时后，于490nm波长测定各孔OD值，按以下公式计算细胞存活率：V(％)＝(OD样品-OD空白对照)/(OD细胞对照-OD空白对照)×100％。
4)细胞衰老模型的建立：同步骤3)的细胞培养方法，弃培养基，分别加入100μL 不同浓度H2O2(50-1000μmol/L)的培养基，每个浓度做5个重复孔，细胞对照组不添加H2O2。H2O2刺激细胞1、2、3、4小时后，采用CCK-8法，于490nm波长下测定各孔OD值。计算HSF存活率，选择细胞存活率为50％左右的双氧水浓度作为建模浓度，并对其细胞状态进行观察。
5)裂褶菌胞内胞外多糖对H2O2刺激细胞后的影响：按步骤3)方法铺设96孔板，实验设置模型组、H2O2+裂褶胞内多糖组、H2O2+裂褶胞外多糖组、H2O2+β-葡聚糖组、空白组，每组设3个重复。步骤为细胞孔中先加入H2O2刺激2小时后，每孔加入100 μL样品培养24小时；采用CCK-8法测定细胞存活率，并对其细胞状态进行观察。
6)细胞样品的制备以及抗氧化酶(SOD)活力、脂质过氧化物(MDA)含量的测定：分组及样品处理方法同步骤5)所述。裂解细胞遵循碧云天公司所提供的裂解方法。每100μL裂解液可裂解1×106个细胞，一般裂解细胞5-10分钟即可获得细胞裂解液。在离心机中设置4℃、12000g的条件，离心5分钟后，取上清液于-80℃冰箱保存。后续取该细胞样品，参照试剂盒说明书步骤，测定细胞内的总抗氧化能力ABTS、 SOD活性和MDA含量。
实验结果如下：
1)选择β-葡聚糖为阳性对照，对胞外、胞内多糖样品进行细胞毒性检测。图16 为裂褶胞内胞外多糖以及标品β-葡聚糖处理HSF细胞24h的存活率。结果发现这三种样品对细胞几乎无损伤，且有一定的增殖作用。
2)选择100μmol/L H2O2处理HSF细胞2h建立细胞衰老模型。对于培养好的细胞先加入H2O2刺激2h，再加入样品进行修复处理，采用CCK-8法测定细胞存活率如图 17，经样品组与模型组对比，发现样品组均能明显提高细胞的存活率，说明其对细胞有一定的增殖作用。对修复之后的细胞进行显微镜拍照记录如图18，从图中可以看出随样品浓度的增加，其细胞数量明显增加。
3)参见图19，与C组对比，M组是H2O2刺激之后的成纤维细胞的总抗氧化能力 ABTS，可以看出已经明显降低，与C组对比，S1组(胞内多糖2.5mg/mL)、阳性对照组(β-葡聚糖2.5mg/mL)均能提高被H2O2降低的总抗氧化能力，S2组样品(胞外多糖2.5mg/mL)则没有明显作用。
4)参见图20，与C组对比，H2O2刺激能降低成纤维细胞内的SOD活力，与C 组对比，S1组、S2组、阳性对照组样品能显著提升细胞内被H2O2降低的SOD活力。
5)参见图21，与C组对比，S1组、S2组、阳性对照组样品能显著降低细胞内被 H2O2升高的MDA含量，促进了细胞的新陈代谢。
四、基因水平探究样品的抗氧化损伤功效测试
申请人还检测了裂褶胞内胞外多糖对Keap1-Nrf2/ARE信号通路上下游调控因子的mRNA的相对表达量变化，从基因水平探究裂褶胞内胞外多糖样品的抗氧化损伤功效。具体实验方法如下：
1)样品的准备：将培养好的的HSF接种于6孔板中，每孔细胞数约为1×106个，在37℃，5％CO2的条件下培养，使得细胞贴壁。样品裂褶胞内胞外多糖分别设为2.5mg/mL，样品处理方法同上述第三部分步骤5)所述(培养在六孔板中，每孔2mL)。
2)RNA的提取与反转录：
取上述培养完的细胞，按照试剂盒Trizol总RNA抽提试剂的方法提取总RNA，提取的RNA放于-80℃冰箱备用。通过使用碧云天公司提供的反转录试剂盒进行cDNA合成反应，反应体系如表8所示。
表8反转录体系
试剂名称 体积(μL)
Total RNA 2.0
Anchored Oligo(dT)18Primer 1.0
2×ES Reaction Mix 10.0
EasyScript RT/RI Enzyme Mix 1.0
gDNA Remover 1.0
RNase-free Water 5.0
将该体系试剂混合，经短暂离心后，在PCR扩增仪上设定42℃孵育15min，85℃加热5s的条件进行反应，最后添加80μL生物级别水，存放于-20℃冰箱。
3)引物的设计与合成：
由NCBI中查找基因序列，利用PrimerExpress软件设计引物，β-actin是管家基因，并把它作为内参基因，设计出13个基因，其特异性引物序列见表9。
表9 Real-Time PCR引物序列
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4)qPCR检测细胞mRNA表达水平
提取RNA，qPCR检测这些基因的相对表达量，根据 Top Green qPCRSuperMix试剂盒进行操作，总反应体系为20μL具体试剂与用量如表10所示：
表10试剂与用量
循环参数：94℃预变性30s，然后按94℃15s，60℃15s，72℃10s，共45 个循环，72℃收集荧光数据。
实验结果如下：本实验以100μmol/L的H2O2处理人成纤维细胞2h后，再用2.5mg/mL的胞内多糖(S1组)、胞外多糖(S2组)及β-葡聚糖(阳性对照组)处理细胞24h，检测Keep1-Nrf2/ARE信号通路上衰老相关基因的表达，结果发现：对于Keep1基因，胞外多糖样品有明显的促进作用；而Nrf2基因，胞内多糖、胞外多糖两种样品对其有抑制作用，β-葡聚糖有促进作用；但是胞内多糖、胞外多糖两样品对该信号通路上的下游基因GSTT1、GCLC、HO-1有明显的促进作用，推测存在一定的积极作用。对该通路的上游基因AKT、ERK2、P38、JNK1，胞外多糖样品和阳性对照β-葡聚糖均有明显的促基因表达效果，而胞内多糖样品对基因的表达不明显，甚至有抑制作用，推测样品可能是影响上游基因ERK2、JNK1并与该通路的产生作用。总的来说，胞外多糖样品对该通路上的基因的表达相对胞内多糖样品有更好的促进作用。
实施例4
本实施例为应用实施例，将实施例2中Sevage法脱蛋白获得裂褶胞内胞外多糖样品制成膏霜化妆品，并对含不同胞内胞外多糖添加量的膏霜样品进行了稳定性测试、安全性测试、人体功效性测试。
一、裂褶胞内、胞外多糖膏霜化妆品制备
本实施例制备的裂褶胞内胞外多糖膏霜化妆品组分及用量参见表11，所用原料除裂褶胞内胞外多糖之外，都是从市场购得。
表11裂褶胞内胞外多糖膏霜配方表
根据上述配方，将不同比例的裂褶胞内/胞外多糖加入灭菌后的去离子水中，溶解充分之后用0.22mm聚砜醚滤膜过滤。在烧杯中分别称取A相、B相原料(g)，用玻璃棒搅拌均匀，将A、B相原料加热，升温至80～85℃后，该温度下搅拌10min，此时把A相中液体倒至B相液体的烧杯中，在3500r/min的速度下均质，均质时间为5～8min；搅拌降温至45℃时，最后加入C相，降温过程中继续搅拌，待温度降至室温后称量，分装。
二、裂褶胞内胞外多糖膏霜化妆品的性能测试
1、鸡胚绒毛***眼刺激性/腐蚀性实验
鸡胚***(CAM)有着丰富与结膜结构相似的血管组织，可通过观察CAM的血管变化，评价受试物的眼刺激性，因此，CAM的体外测试被广泛用作眼刺激性的替代方法。
将鸡胚室温静置24小时，进行9天孵化，之后每种样品按6只鸡胚重复试验。其中包含阳性对照组1％含量的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，阴性对照组0.9％氯化钠溶液。对于液体样品，采用反应时间法进行样品的眼刺激性评价。分别将0.1mL的阳性对照和阴性对照滴加在CAM表面，并对CAM在3分钟内的出血、凝血和血管溶解等情况出现的时间做记录，每个受试物进行6个平行，计算刺激评分(IS)。对于固体样品(本实验即为固体膏霜样品，多糖含量2w％)，将100mg受试样品作用于CAM 上，且覆盖50％的CAM表面，作用3分钟后，用生理盐水冲洗掉样品，观察CAM 表面的血管溶血、凝血或者溶解现象，参照表12打分，6只鸡胚平行测试，计算终点评分(ES)。
表12实验结果现象评分
固体样品采用终点评分法即：每只鸡胚积分＝每只鸡胚观察到出血、凝血和血管溶解程度的和；样品ES＝6只鸡胚得分的数学总和；ES值与刺激性分类标准见表13。
表13终点评分法标准
终点评分 刺激分类
ES≤12 无/轻刺激性
12＜ES＜16 中度刺激性
ES≥16 强刺激性/腐蚀性
根据判定方法，胞内胞外多糖样品以及标品β-葡聚糖的眼刺激性评价结果见表14，图谱见图22。
表14样品眼刺激性评分及分类
样品名称 ES 刺激性分类
阴性对照0.9％氯化钠 0 无/轻刺激性
阳性对照1％SDS 18 强刺激性/腐蚀性
β-葡聚糖样品 5 无/轻刺激性
胞内多糖样品 12 轻刺激性
胞外多糖样品 13 中刺激性
受试物的CAM模型血管观察见图22；由图中可知，空白对照和阴性对照组(生理盐水)未引起毛细血管、血管变化和蛋白变性；阳性对照组(SDS溶液)刺激性过强，引起毛细血管和血管结构变化，甚至引发CAM蛋白变性；对于样品组，除引起毛细血管末端轻微出血外，其他现象并未出现。
2、膏霜的可溶性固形物含量测定及样品稳定性检测
实验方法：1)使用PR-101αPALETTE系列数显折射计对样品的可溶性固形物含量进行测定。2)耐寒稳定性测试：在-20℃的环境中对样品进行耐寒稳定性测试，并在0、1、2、3、4周取出，温度回升至室温后，对样品进行是否分层、气味和可溶性固含物是否发生改变的观察。3)耐热稳定性测试：将耐寒稳定性中将温度条件改为 40℃，进行耐热稳定性测定，并做相应观测。4)循环稳定性测试：样品置于40℃的环境中24小时，再置于-20℃的环境中24小时，此过程视为1个循环过程，共观察五个循环，并做相应观测。5)离心稳定性测试：把样品置于(40±1)℃的环境中，1小时后取出，3000r/min离心30分钟，观察有无分层现象。
实验结果：1)在0～4周中各时段分别从-20℃的环境中取出样品进行观察，发现样品均未出现分层现象，没有油脂析出，没有异味，且可溶性固含物(参见图23)无明显变化。2)在0～4周中各时段分别从40℃的环境中取出样品进行观察，发现样品均未出现分层现象，没有油脂析出，没有异味，且可溶性固含物(参见图24)无明显变化。3)将样品置于40℃与-20℃的环境中，循环4次，考察不同温度作用下对样品稳定性的影响；4次循环中，几种样品在均没有分层现象产生，没有油脂析出，气没有异味出现，可溶性固含量(参见图25)没有明显变化。4)在离心机中以3000r/min 的转速离心30min，样品没有分层现象。可见，本实施例制备的膏霜具有良好的稳定性。
3、安全性检测-封闭斑贴实验
将0.02mL左右样品用移液枪滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内，并以蒸馏水设置空白对照，测试周期持续24h。在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验为阴性，则需要在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。人体斑贴试验皮肤不良反应分级标准参见表15。按表15标准观察皮肤反应并记录观察结果如表16所示。共30名志愿者完成了9个样品的斑贴实验，结果未出现阳性反应，说明样品较为安全。
表15皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准
表16皮肤封闭型斑贴试验结果
2、皮肤水分含量(MMV)测试以及经皮水分散失(TEWL)测试
测试样品对人体短时保湿效果的影响，样品包括两种膏霜，其中，一种膏霜中含裂褶胞内多糖1％，记为Y1样品；一种膏霜中含裂褶胞外多糖1％，记为Y2样品。实验环境、志愿者要求以及测试前准备工作按照文献进行(于佳.月季花抗衰老化妆品的开发研究[D].天津大学，2015.)。
实验中，在左右手臂内侧可同时标记多个试验区域，面积为9cm2，同一手臂间隔1cm以上。先测每个测试区域的空白值，然后每个区域涂抹量为(2.0±0.l)(mg样品·cm2)-1。皮肤含水量(MMV)、经皮水分散失(TEWL)测试在涂抹后5min、1h和2h分别进行测定，同一时段各测试点各测3次，计算平均值。为减少误差，同一个志愿者的测试应由同一个测量人员完成。MMV使用Corneometer探头测定，以水合率表示数据结果。公式如下：水合率＝每测试区域每时段测量值平均值/每测试区域空白值平均值。 TEWL使用Tewamter探头测定，以水散变化率表示数据结果。皮肤水散变化率公式如下：水散变化率＝每测试区域每时段测量值平均值/每测试区域空白值平均。
涂抹两种样品后2h内MMV变化率如图26所示。与皮肤本底相比，添加量为1％的胞内胞外多糖膏霜使MMV变化率明显升高，变化率随时间缓慢下降，但2h后的含水量是高于本底值的，表明在该浓度下胞内胞外多糖具有较好的保湿效果。
对两样品进行使用前后不同时间点的皮肤含水量测试，结果如图27，样品不同时间点的数值进行T检验，表明在涂抹样品5min时有显著差异(p<0.05)，而在60min和 120min时均无显著差异(p>0.05)。
涂抹两种样品后2h内TEWL变化率如图28所示。与皮肤本底相比，分别含1.0％的胞内胞外多糖的膏霜样品可降低TEWL变化率，且随时间的增长而降低，表明胞内胞外多糖具有一定的锁水效果。
对两样品进行使用前后不同时间点的皮肤水分散失测试，结果如图13，样品不同时间点的数值进行T检验，表明在涂抹Y1样品5min、60min时均有显著差异(p<0.05)，而在120min时无显著差异，涂抹Y2样品各时间段则均无差异性(p>0.05)
尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。
序列表
<110> 云南白药集团上海科技有限公司
北轻家化（黄山）科技有限公司
北京工商大学
云南白药集团健康产品有限公司
<120> 裂褶菌菌种YSC1、基于该裂褶菌制备的胞内胞外多糖、化妆品及制备方法
<130> PD210098CN0047
<140> 202111516706X
<141> 2021-12-07
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 641
<212> DNA
<213> PD210098CN0047(Schizophyllum commune)
<400> 1
cttccgtagg gtgaacctgc ggaaggatca ttaacgaatc aaacaagttc atcttgttct 60
gatcctgtgc accttatgta gtcccaaagc cttcacgggc ggcggttgac tacgtctacc 120
tcacacctta aagtatgtta acgaatgtaa tcatggtctt gacagaccct aaaaagttaa 180
tacaactttc gacaacggat ctcttggctc tcgcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg 240
ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc accttgcgcc 300
ctttggtatt ccgaggggca tgcctgtttg agtgtcatta aataccatca accctctttt 360
gacttcggtc tcgagagtgg cttggaagtg gaggtctgct ggagcctaac ggagccagct 420
cctcttaaat gtattagcgg atttcccttg cgggatcgcg tctccgatgt gataatttct 480
acgtcgttga ccatctcggg gctgacctag tcagtttcaa taggagtctg cttctaaccg 540
tctcttgact gagactagcg acttgtgcgc taacttttga cttgacctca aatcaggtag 600
gactacccgc tgaacttaag catatcaata aagcggagga a 641

Claims (18)

1.一种裂褶菌（Schizophyllum commune）菌种YSC1，其保藏编号为CGMCC No. 17788。
2.一种裂褶菌胞内多糖的制备方法，其特征在于，包括：
菌液制备步骤：将如权利要求1所述的裂褶菌（Schizophyllum commune）菌种YSC1经活化、纯化、扩大培养后得到裂褶菌菌液；
大米发酵底物制备步骤：将大米与水按比例调配后，进行灭菌处理，制得大米发酵底物；
发酵步骤：将所述裂褶菌菌液接种至所述大米发酵底物，进行发酵处理；
菌丝体干粉制备步骤：从所述发酵处理后的产物中分离得到菌丝体，洗净后进行研磨处理，干燥后得到菌丝体干粉；
热水浸提步骤：对所述菌丝体干粉进行热水浸提处理，得到裂褶菌胞内粗多糖。
3.根据权利要求2所述的裂褶菌胞内多糖的制备方法，其特征在于，还包括：
Sevage法除杂步骤，对所述裂褶菌胞内粗多糖进行2-6次Sevage法除蛋白操作，得到纯度为60%以上裂褶菌胞内多糖。
4.根据权利要求2或3所述的裂褶菌胞内多糖的制备方法，其特征在于，所述菌液制备步骤中，所述裂褶菌菌液的浓度为104-1010 CFU/mL；
所述大米发酵底物制备步骤中，所述大米用量为大米与水总质量的1-3%；
所述发酵步骤中，按体积百分比，接种量为1-10%。
5.根据权利要求4所述的裂褶菌胞内多糖的制备方法，其特征在于，所述发酵步骤中，按体积百分比，接种量为1-7%。
6.根据权利要求2或3或5所述的裂褶菌胞内多糖的制备方法，其特征在于，所述发酵步骤中，所述发酵处理的温度为20-35℃，时间为48-72h。
7.根据权利要求6所述的裂褶菌胞内多糖的制备方法，其特征在于，所述发酵处理在摇床中进行，转速为150-210r/min.
8.根据权利要求6所述的裂褶菌胞内多糖的制备方法，其特征在于，所述热水浸提步骤中，即所述菌丝体干粉与热水的质量体积比为1 g:20-70mL，浸提时间为0.5-3h，浸提温度为60-80℃，提取次数为1-4次。
9.一种裂褶菌胞内多糖，采用如权利要求2-8中任一项所述的制备方法制成。
10.一种裂褶菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括：
菌液制备步骤：将如权利要求1所述的裂褶菌（Schizophyllum commune）菌种YSC1经活化、纯化、扩大培养后得到裂褶菌菌液；
大米发酵底物制备步骤：将大米与水按比例调配后，进行灭菌处理，制得大米发酵底物；
发酵步骤：将所述裂褶菌菌液接种至所述大米发酵底物，进行发酵处理；然后将产物依次进行离心分离、灭菌处理，得到上清液，干燥后得到裂褶菌胞外粗多糖；
Sevage法除杂步骤，对所述裂褶菌胞外粗多糖进行2-6次Sevage法除蛋白操作，能得到所述裂褶菌胞外多糖。
11.根据权利要求10所述的裂褶菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述菌液制备步骤中，所述裂褶菌菌液的浓度为104-1010 CFU/mL；
所述大米发酵底物制备步骤中，所述大米用量为大米与水总质量的1-3%；
所述发酵步骤中，按体积百分比，接种量为1-10%。
12.根据权利要求11所述的裂褶菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述发酵步骤中，按体积百分比，接种量为1-4%。
13.根据权利要求12所述的裂褶菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述发酵步骤中，按体积百分比，接种量为1-2%。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的裂褶菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述发酵步骤中，所述发酵处理的温度为20-35℃，时间为48-72h；发酵体系体积与发酵容器容量之比为100-300mL/500 mL。
15.根据权利要求14所述的裂褶菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述发酵处理在摇床中进行，转速为150-210r/min。
16.一种裂褶菌胞外多糖，其特征在于，采用如权利要求10-15中任一项所述的制备方法制成，所述裂褶菌胞外多糖纯度为60%以上。
17.一种膏霜化妆品，其特征在于，使用如权利要求9所述的裂褶菌胞内多糖和/或如权利要求16所述的裂褶菌胞外多糖制备的膏霜化妆品。
18.根据权利要求17所述的膏霜化妆品，其特征在于，所述多糖的添加量为0.1-2.0wt%。
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