CN116848255A - 改进的重组多肽和病毒的生产 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于生产重组多肽或病毒颗粒的改进方法。在一些实施方案中，本文公开的用于生产重组多肽或病毒颗粒的方法包括提供包含能够生产所述重组多肽或病毒颗粒的细胞和硫酸葡聚糖的细胞培养物，以及通过向所述培养物中添加包含一种或多种多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞。在一些实施方案中，所述重组病毒颗粒是重组AAV(rAAV)颗粒。
Description
技术领域
本公开涉及一种方法，其包括在包含硫酸葡聚糖的培养基中转染宿主细胞。
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月21日提交的美国申请号63/139,992的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
背景技术
基于重组腺相关病毒(AAV)的载体目前是开发中的使用最广泛的基因治疗产品。rAAV载体***的优选用途部分是由于缺乏与野生型病毒相关联的疾病、AAV转导非***细胞和***细胞的能力以及在临床试验中观察到的所得的长期稳健的转基因表达，并且表明在基因疗法适应症中具有巨大的递送潜力。另外，不同的天然存在和重组rAAV载体血清型特异性地靶向不同的组织、器官和细胞，并帮助逃避对所述载体的任何预先存在的免疫，从而扩大基于AAV的基因疗法的治疗性应用。在基于复制缺陷型病毒例如AAV的基因疗法可更广泛地用于后期临床阶段和商业用途之前，需要开发大规模生产重组病毒颗粒的新方法。
因此，本领域需要提高用于大规模生产rAAV颗粒的方法的生产率和产量。
发明内容
一方面，本公开提供了一种转染细胞的方法，所述方法包括(a)提供包含所述细胞的细胞培养物，其中所述培养物包含约0.1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖；以及(b)通过向所述培养物添加包含一种或多种多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞。在一些实施方案中，所述细胞培养物是悬浮培养物。在一些实施方案中，所述细胞培养物是包含悬浮适应性HEK细胞的悬浮培养物。在一些实施方案中，所述转染试剂包含聚乙烯亚胺(PEI)。
另一方面，本公开提供了一种生产重组多肽的方法，所述方法包括(a)提供包含适用于生产所述重组多肽的细胞的细胞培养物，其中所述培养物包含约0.1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖；(b)通过向所述(a)的培养物添加包含一种或多种编码所述多肽的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞；以及(c)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组多肽的条件下。在一些实施方案中，所述重组多肽是抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体、酶、融合蛋白或Fc融合蛋白。
另一方面，本公开提供了一种生产重组病毒颗粒的方法，所述方法包括(a)提供包含适用于生产所述重组病毒颗粒的细胞的细胞培养物，其中所述培养物包含约0.1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖；(b)通过向所述(a)的培养物添加包含一种或多种含有生产所述重组病毒颗粒所必需的基因的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞；以及(c)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组病毒颗粒的条件下。在一些实施方案中，所述重组病毒是重组腺相关病毒(rAAV)。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述细胞培养物是包含悬浮适应性HEK细胞的悬浮培养物。在一些实施方案中，所述转染试剂包含聚乙烯亚胺(PEI)。
一方面，本公开提供了一种转染细胞的方法，所述方法包括：(a)在细胞培养物中培养所述细胞，其中所述培养物包含约1mg/L与约20mg/L之间的起始硫酸葡聚糖浓度和约0.1mg/L与约10mg/L之间的最终硫酸葡聚糖浓度；以及(b)通过向所述(a)的培养物添加包含一种或多种多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞。在一些实施方案中，所述细胞培养物是悬浮培养物。在一些实施方案中，所述细胞培养物是包含悬浮适应性HEK细胞的悬浮培养物。在一些实施方案中，所述转染试剂包含聚乙烯亚胺(PEI)。
另一方面，本公开提供了一种生产重组多肽的方法，所述方法包括(a)在细胞培养物中培养适用于生产所述重组多肽的细胞，其中所述培养物包含约1mg/L与约20mg/L之间的起始硫酸葡聚糖浓度和约0.1mg/L与约10mg/L之间的最终硫酸葡聚糖浓度；(b)通过向所述(a)的培养物添加包含一种或多种编码所述多肽的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞；以及(c)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组多肽的条件下。在一些实施方案中，所述重组多肽是抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体、酶、融合蛋白或Fc融合蛋白。
另一方面，本公开提供了一种生产重组病毒颗粒的方法，所述方法包括(a)在细胞培养物中培养适用于生产所述重组病毒颗粒的细胞约1天与约5天之间，其中所述培养物包含约1mg/L与约20mg/L之间的起始硫酸葡聚糖浓度和约0.1mg/L与约10mg/L之间的最终硫酸葡聚糖浓度；(b)通过向所述(a)的培养物添加包含一种或多种含有生产所述重组病毒颗粒所必需的基因的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞；以及(c)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组病毒颗粒的条件下。在一些实施方案中，所述重组病毒是重组腺相关病毒(rAAV)。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述细胞培养物是包含悬浮适应性HEK细胞的悬浮培养物。在一些实施方案中，所述转染试剂包含聚乙烯亚胺(PEI)。
另一方面，本公开提供了一种改进重组多肽的生产的方法，所述方法包括(a)提供包含适用于生产所述重组多肽的细胞的细胞培养物，其中所述培养物包含约0.1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖；(b)通过向所述(a)的培养物添加包含一种或多种编码所述多肽的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞；以及(c)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组多肽的条件下。在一些实施方案中，本文公开的方法比包括转染不包含硫酸葡聚糖的培养物中的细胞的方法产生更多的多肽。在一些实施方案中，所述重组多肽是抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体、酶、融合蛋白或Fc融合蛋白。
另一方面，本公开提供了一种改进重组病毒颗粒的生产的方法，所述方法包括(a)提供包含适用于生产所述重组病毒颗粒的细胞的细胞培养物，其中所述培养物包含约0.1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖；(b)通过向所述(a)的培养物添加包含一种或多种含有生产所述重组病毒颗粒所必需的基因的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞；以及(c)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组病毒颗粒的条件下。在一些实施方案中，本文公开的方法比包括转染不包含硫酸葡聚糖的培养物中的细胞的方法产生更多的重组病毒颗粒。在一些实施方案中，所述重组病毒是重组腺相关病毒(rAAV)。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述细胞培养物是包含悬浮适应性HEK细胞的悬浮培养物。在一些实施方案中，所述转染试剂包含聚乙烯亚胺(PEI)。
在一些实施方案中，本公开提供：
[1.]一种转染细胞的方法，所述方法包括：
a)提供包含所述细胞的细胞培养物，其中所述培养物包含约0.1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖；以及
b)通过向所述(a)的培养物添加包含一种或多种多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞。
[2.]一种生产重组多肽的方法，所述方法包括：
a)提供包含适用于生产所述重组多肽的细胞的细胞培养物，其中所述培养物包含约0.1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖；
b)通过向所述a)的培养物添加包含一种或多种编码所述多肽的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞；以及
c)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组多肽的条件下。
[3.]如权利要求[2]所述的方法，其中所述多肽是抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体、酶、融合蛋白或Fc融合蛋白。
[4.]一种生产重组病毒颗粒的方法，所述方法包括：
a)提供包含适用于生产重组病毒颗粒的细胞的细胞培养物，其中所述培养物包含约0.1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖；
b)通过向所述a)的培养物添加包含一种或多种含有生产所述重组病毒颗粒所必需的基因的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞；以及
c)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组病毒颗粒的条件下。
[5.]如权利要求[1]至[4]中任一项所述的方法，其中所述a)的培养物包含约0.5mg/L与约10mg/L之间、约0.5mg/L与约5mg/L之间、约0.5mg/L与约3mg/L之间、约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约1mg/L与约4mg/L之间或约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。
[6.]如权利要求[1]至[4]中任一项所述的方法，其中所述a)的培养物包含约0.5mg/L、约1mg/L、约1.5mg/L、约2mg/L、约2.5mg/L、约3mg/L、约4mg/L或约5mg/L的硫酸葡聚糖。
[7.]如权利要求[1]至[4]中任一项所述的方法，其中所述a)的培养物包含2mg/L的硫酸葡聚糖。
[8.]一种转染细胞的方法，所述方法包括：
a)在细胞培养物中培养所述细胞，其中所述培养物包含约1mg/L与约20mg/L之间的起始硫酸葡聚糖浓度和约0.1mg/L与约10mg/L之间的最终硫酸葡聚糖浓度；以及
b)通过向所述a)的培养物添加包含一种或多种多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞。
[9.]一种生产重组多肽的方法，所述方法包括：
a)在细胞培养物中培养适用于生产所述重组多肽的细胞，其中所述培养物包含约1mg/L与约20mg/L之间的起始硫酸葡聚糖浓度和约0.1mg/L与约10mg/L之间的最终硫酸葡聚糖浓度；
b)通过向所述a)的培养物添加包含一种或多种编码所述多肽的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞；以及
c)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组多肽的条件下。
[10.]如权利要求[9]所述的方法，其中所述多肽是抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体、酶、融合蛋白或Fc融合蛋白。
[11.]一种生产重组病毒颗粒的方法，所述方法包括：
a)在细胞培养物中培养适用于生产所述重组病毒颗粒的细胞约1天与约5天之间，其中所述培养物包含约1mg/L与约20mg/L之间的起始硫酸葡聚糖浓度和约0.1mg/L与约10mg/L之间的最终硫酸葡聚糖浓度；
b)通过向所述a)的培养物添加包含一种或多种含有生产所述重组病毒颗粒所必需的基因的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞；以及
c)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组病毒颗粒的条件下。
[12.]如权利要求[8]至[11]中任一项所述的方法，其中所述起始硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约2mg/L与约10mg/L之间、约3mg/L与约10mg/L之间或约3mg/L与约5mg/L之间。
[13.]如权利要求[8]至[11]中任一项所述的方法，其中所述起始硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L、约3mg/L、约4mg/L、约5mg/L、约6mg/L、约7mg/L、约8mg/L、约9mg/L或约10mg/L。
[14.]如权利要求[8]至[11]中任一项所述的方法，其中所述起始硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L。
[15.]如权利要求[8]至[14]中任一项所述的方法，其中所述最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L与约10mg/L之间、约0.5mg/L与约5mg/L之间、约0.5mg/L与约5mg/L之间、约0.5mg/L与约3mg/L之间、约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约1mg/L与约4mg/L之间或约1mg/L与约3mg/L之间。
[16.]如权利要求[8]至[14]中任一项所述的方法，其中所述最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L、约1mg/L、约1.5mg/L、约2mg/L、约2.5mg/L、约3mg/L、约4mg/L或约5mg/L。
[17.]如权利要求[8]至[14]中任一项所述的方法，其中所述最终硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L。
[18.]如权利要求[8]至[11]中任一项所述的方法，其中所述起始硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L，并且所述最终硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L。
[19.]如权利要求[4]至[7]和[11]至[18]中任一项所述的方法，其中所述重组病毒颗粒是重组腺相关病毒(rAAV)颗粒或重组慢病毒颗粒。
[20.]如权利要求[4]至[7]和[11]至[18]中任一项所述的方法，其中所述重组病毒颗粒是rAAV颗粒。
[21.]如权利要求[20]所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。
[22.]如权利要求[20]所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV8、AAV9、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1或AAV.hu37血清型的衣壳蛋白。
[23.]如权利要求[20]所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。
[24.]如权利要求[20]至[23]中任一项所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含有包含转基因的基因组。
[25.]如权利要求[24]所述的方法，其中所述转基因包含可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的调节元件。
[26.]如权利要求[25]所述的方法，其中所述调节元件包括增强子、启动子和polyA区中的一种或多种。
[27.]如权利要求[24]或权利要求[25]所述的方法，其中所述调节元件和编码多肽的多核苷酸是异源的。
[28.]如权利要求[24]至[27]中任一项所述的方法，其中所述转基因编码抗VEGFFab、艾杜糖苷酶(IDUA)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、三肽基肽酶1(TPP1)或VEGF受体1(sFlt-1)的非膜相关剪接变体。
[29.]如权利要求[24]至[27]中任一项所述的方法，其中所述转基因编码γ-肌聚糖、Rab护卫蛋白1(REP1/CHM)、类维生素A异构水解酶(RPE65)、环状核苷酸门控通道α3(CNGA3)、环状核苷酸门控通道β3(CNGB3)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、溶酶体相关膜蛋白2同工型B(LAMP2B)、因子VIII、因子IX、色素性视网膜炎GTP酶调节剂(RPGR)、视网膜劈裂蛋白(RS1)、肌浆网钙ATP酶(SERCA2a)、阿柏西普(aflibercept)、巴登氏病蛋白(CLN3)、跨膜ER蛋白(CLN6)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、水通道蛋白1(AQP1)、抗肌萎缩蛋白、微小抗肌萎缩蛋白(minidystrophin)、微型抗肌萎缩蛋白(microdystrophin)、肌微管素1(MTM1)、卵泡抑素(FST)、葡萄糖6磷酸酶(G6P酶)、载脂蛋白A2(APOA2)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-半乳糖苷酶(GLA)、β-半乳糖苷酶(GLB1)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、磷酸二酯酶6B(PDE6B)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶9OTC)、运动神经元生存蛋白(SMN1)、运动神经元生存蛋白(SMN2)、神经秩蛋白(NRTN)、神经营养蛋白3(NT-3/NTF3)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、神经生长因子(NGF)、线粒体编码的NADH：泛醌氧化还原酶核心亚基4(MT-ND4)、保护性蛋白组织蛋白酶A(PPCA)、戴斯弗林蛋白、MER原癌基因、酪氨酸激酶(MERTK)、囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR)或肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白(IgG1)Fc融合蛋白。
[30.]如权利要求[20]至[29]中任一项所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸编码
a)待包装的rAAV基因组，
b)包装所必需的腺病毒辅助功能，
c)足以用于包装的AAV rep蛋白，和
d)足以用于包装的AAV cap蛋白。
[31.]如权利要求[30]所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸包括编码所述rAAV基因组的多核苷酸、编码所述AAV rep蛋白和所述AAV cap蛋白的多核苷酸，以及编码所述腺病毒辅助功能的多核苷酸。
[32.]如权利要求[30]或权利要求[31]所述的方法，其中所述腺病毒辅助功能包括腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因中的至少一种。
[33.]如权利要求[20]至[28]中任一项所述的方法，其还包括回收所述rAAV颗粒。
[34.]如权利要求[20]至[33]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物生产约5x10e+10 GC/ml与约1x10e+12GC/ml之间的rAAV颗粒。
[35.]如权利要求[20]至[33]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物生产的以GC/ml测量的rAAV颗粒为其中所述a)的培养物不包含硫酸葡聚糖的参考方法的至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或2倍。
[36.]如权利要求[1]至[35]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物是悬浮细胞培养物。
[37.]如权利要求[36]所述的方法，其中所述细胞培养物包含悬浮适应性细胞。
[38.]如权利要求[36]或权利要求[37]所述的方法，其中所述细胞包括HEK293细胞、HEK衍生细胞、CHO细胞、CHO衍生细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞和/或PerC6细胞或其组合。
[39.]如权利要求[36]或权利要求[37]所述的方法，其中所述细胞包括HEK293细胞。
[40.]如权利要求[36]或权利要求[37]所述的方法，其中所述细胞包括CHO细胞或CHO-K1细胞。
[41.]如权利要求[1]至[40]中任一项所述的方法，其中所述转染试剂包含脂质、聚合物、肽或其组合。
[42.]如权利要求[41]所述的方法，其中所述转染试剂包含脂质，其中所述脂质包括DOTMA、DOTAP、DOSPA、DOGS或其组合。
[43.]如权利要求[41]所述的方法，其中所述转染试剂包含聚合物，其中所述聚合物包括聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、多糖、聚[甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯](PDMAEMA)、树枝状聚合物或其组合。
[44.]如权利要求[41]所述的方法，其中所述转染试剂包含聚乙烯亚胺(PEI)。
[45.]如权利要求[1]至[44]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物具有约50升与约20,000升之间的体积。
[46.]如权利要求[45]所述的方法，其中所述细胞培养物具有约50升与约5,000升之间的体积。
[47.]如权利要求[45]所述的方法，其中所述细胞培养物具有约50升与约2,000升之间的体积。
[48.]如权利要求[45]所述的方法，其中所述细胞培养物具有约50升与约1,000升之间的体积。
[49.]如权利要求[41]所述的方法，其中所述细胞培养物具有约50升与约500升之间的体积。
[50.]一种组合物，其包含通过如权利要求[20]至[49]中任一项所述的方法生产的分离的rAAV颗粒。
当结合附图阅读时，本文所描述的组合物和方法的另一些其他特征和优点将从以下具体实施方式变得更加明显。
附图说明
图1.在转染前和转染过程中对硫酸葡聚糖进行初始摇瓶筛选以供使用。1∶2,500、1∶500、1∶10,000、1∶20,000、1∶40,000和1∶80,000表示转染时存在的25g/L硫酸葡聚糖储备液的稀释因子，并且分别对应于10mg/L、5mg/L、2.5mg/L、1.25mg/L、625μg/L和313μg/L的浓度。
图2.在转染前和转染过程中对硫酸葡聚糖进行初始摇瓶筛选以供使用。6K、7K、8K、9K、10K、12K和15K表示转染时存在的25g/L硫酸葡聚糖储备液的稀释因子，并且分别对应于4.2mg/L、3.6mg/L、3.1mg/L、2.8mg/L、2.5mg/L、2.1mg/L和1.7mg/L的浓度。
图3.用于转染的实验室规模的2L硫酸葡聚糖滴定：基因组滴度。6K、7K、8K、9K和10K表示转染时存在的25g/L硫酸葡聚糖储备液的稀释因子，并且分别对应于4.2mg/L、3.6mg/L、3.1mg/L、2.8mg/L和2.5mg/L的浓度。
图4.用于转染的实验室规模的2L硫酸葡聚糖滴定：细胞成像。1∶6,000、1∶7,000、1∶8,000、1∶9,000和1∶10,000表示转染时存在的25g/L硫酸葡聚糖储备液的稀释因子，并且分别对应于4.2mg/L、3.6mg/L、3.1mg/L、2.8mg/L和2.5mg/L的浓度。
图5.用于转染的实验室规模的2L硫酸葡聚糖滴定：活细胞密度。1∶6,000、1∶7,000、1∶8,000、1∶9,000和1∶10,000表示转染时存在的25g/L硫酸葡聚糖储备液的稀释因子，并且分别对应于4.2mg/L、3.6mg/L、3.1mg/L、2.8mg/L和2.5mg/L的浓度。
图6.用于转染的实验室规模的2L硫酸葡聚糖滴定：细胞活力。1∶6,000、1∶7,000、1∶8,000、1∶9,000和1∶10,000表示转染时存在的25g/L硫酸葡聚糖储备液的稀释因子，并且分别对应于4.2mg/L、3.6mg/L、3.1mg/L、2.8mg/L和2.5mg/L的浓度。
图7.在转染过程中使用浓度为2mg/L的硫酸葡聚糖在实验室规模5L反应器中生产AAV8。
图8.使用不同商业培养基在2L实验室规模反应器中生产AAV8。在转染过程中硫酸葡聚糖以2mg/L存在。
图9.使用不同宿主细胞克隆在摇瓶中生产AAV8。在转染过程中硫酸葡聚糖以2mg/L存在。
图10.在转染过程中使用硫酸葡聚糖在实验室规模5L反应器中生产AAV9。
图11.转染前在高密度种子培养中加入硫酸葡聚糖增加AAV滴度。
图12.转染前在种子培养中加入硫酸葡聚糖增加AAV滴度。
具体实施方式
令人惊奇地发现硫酸葡聚糖能够在基于瞬时转染的生产方法中增加rAAV滴度。这一发现是令人出乎意料的，因为已知硫酸葡聚糖会干扰瞬时转染。例如，Geng等人(2007)第55页得出结论，硫酸葡聚糖完全抑制PEI介导的转染。类似地，Biotech最近出版的″Guide for DNA Transfection in/>500and iCELLis 500+Bioreactors forLarge Scale Gene Therapy Vector Manufacturing″(″2020Guide″)在第9页教导了硫酸葡聚糖抑制PEI介导的转染。考虑例如Geng等人(2007)的教导和2020年指南的技术人员会合理地预期，通过基于瞬时转染的方法生产rAAV将会受到转染过程中细胞培养物中存在硫酸葡聚糖的抑制，或至少会因其减少生产率。相反，如实施例中所讨论的，转染培养基中存在硫酸葡聚糖令人惊讶地增加了rAAV生产。在使用不同细胞培养基、宿主细胞克隆和生产体积生产包含不同衣壳血清型或转基因的rAAV颗粒的过程中观察到rAAV生产增加。
这些令人惊讶的发现被用于开发转染细胞、生产重组多肽、生产重组病毒颗粒(例如，重组腺相关病毒(rAAV)颗粒)、改进重组多肽的生产以及改进本文描述的重组病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)的生产的方法。在一些实施方案中，所述方法包括通过向包含细胞和硫酸葡聚糖的培养物添加包含一种或多种多核苷酸和转染试剂的组合物来转染细胞。在一些实施方案中，细胞培养物是悬浮细胞培养物。在一些实施方案中，细胞培养物包含在搅拌的生物反应器中附着于微载剂或大载剂上生长的贴壁细胞。在一些实施方案中，细胞培养物是包含悬浮适应性HEK293细胞的悬浮细胞培养物。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组腺相关病毒(rAAV)颗粒。在一些实施方案中，rAAV包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。
鉴于制备单一治疗性单位剂量所需的极大量rAAV颗粒，rAAV产量的任何提高提供降低的每单位剂量的商品成本。提高的病毒产量不仅可对应地降低生产rAAV颗粒所需的消耗品成本，而且可对应地减少与建设工业病毒纯化设施相关的资本支出成本。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科技术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。为促进对所公开方法的理解，以下定义多个术语和短语。
限定例如本文提供的方法中使用的组合物中成分的量、组合物中成分的浓度、流速、rAAV颗粒产量、进料体积、盐浓度和类似的值及其范围的“约(about)”，是指例如通过用于制备浓缩物或使用溶液的典型测量和处理程序；通过这些程序中的无意错误；通过制备组合物或实施方法使用的成分的制造、来源或纯度方面的差异；和类似的考虑因素可出现的数值数量变化。术语“约”还涵盖由于具有特定初始浓度的组合物或混合物的老化而不同的量。术语“约”还涵盖由于混合或加工具有特定初始浓度的组合物或混合物而不同的量。无论是否被术语“约”限定，权利要求书都包括数量的等效物。在一些实施方案中，术语“约”是指大于或小于所指示的数字或范围大约10％-20％的范围。在其他实施方案中，“约”是指所指示的数字或范围加或减10％。例如，“约10％”表示9％至11％的范围。
术语“硫酸葡聚糖”是指硫酸化多糖，其包含葡萄糖单体之间的α-1，6糖苷键联的聚合物主链和来自α-1，3键联的支链。硫酸葡聚糖可商购获得，例如从MilliporeSigma(Saint Louis，Mo.)获得。应理解，“硫酸葡聚糖”涵盖其游离酸及其盐。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖是盐。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖是游离酸。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖是包含一价阳离子的盐。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖是Li、Na、K、Rb或Cs盐。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖是Na盐。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖含有约10％至约25％的硫。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖含有约15％至约20％的硫。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖的每个葡糖基残基平均含有1至3个硫酸基团。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖的每个葡糖基残基平均含有2至3个硫酸基团。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖含有约17％的硫，其相当于每个葡糖基残基大约2.3个硫酸基团。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖的平均分子量为约3kDa至约500kDa、约3kDa至约250kDa、约3kDa至约100kDa、约3kDa至约50kDa、约3kDa至约25kDa或约3kDa至约10kDa。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖的平均分子量为约5kDa至约500kDa、约5kDa至约250kDa、约5kDa至约100kDa、约5kDa至约50kDa、约5kDa至约25kDa或约5kDa至约10kDa。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖的平均分子量为约3kDa至约25kDa。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖的平均分子量为约3kDa至约10kDa。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖的平均分子量为约4kDa至约25kDa。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖的平均分子量为约4kDa至约10kDa。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖的平均分子量为约5kDa至约25kDa。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖的平均分子量为约5kDa至约10kDa。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖的平均分子量为约5kDa。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖是具有约3kDa与10kDa之间的平均分子量的钠盐。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖是具有约5kDa的平均分子量的钠盐。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖是钠盐，含有约15％至约20％的硫，并且具有约3kDa与10kDa之间的平均分子量。在一些实施方案中，硫酸葡聚糖是钠盐，含有约17％的硫，并且具有约5kDa的平均分子量。
“AAV”是腺相关病毒的缩写，并且可用于指病毒本身或其修饰、衍生物或假型。除了另外要求的情况外，所述术语覆盖所有亚型以及天然存在和重组形式两者。缩写“rAAV”是指重组腺相关病毒。术语“AAV”包括AAV类型1(AAV1)、AAV类型2(AAV2)、AAV类型3(AAV3)、AAV类型4(AAV4)、AAV类型5(AAV5)、AAV类型6(AAV6)、AAV类型7(AAV7)、AAV类型8(AAV8)、AAV类型9(AAV9)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV和绵羊AAV及其修饰、衍生物或假型。“灵长类动物AAV”是指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类动物AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”是指感染牛哺乳动物的AAV，等。
应用于AAV颗粒的“重组”意指AAV颗粒是产生与自然界中的AAV颗粒不同的AAV颗粒构建体的一种或多种程序的产物。
重组腺相关病毒颗粒“rAAV颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸rAAV载体基因组组成的病毒颗粒，所述载体基因组包含异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组之外的多核苷酸，诸如待递送到哺乳动物细胞的转基因)。rAAV颗粒可以是任何AAV血清型，包括任何修饰、衍生物或假型(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10或其衍生物/修饰/假型)。此类AAV血清型和衍生物/修饰/假型，以及生产此类血清型/衍生物/修饰/假型的方法是本领域已知的(参见例如，Asokan等人，Mol.Ther.20(4)：699-708(2012)。
本公开的rAAV颗粒可以是任何血清型或血清型的任何组合(例如包含两种或更多种血清型例如包含rAAV2、rAAV8和rAAV9颗粒中的两种或更多种的rAAV颗粒群)。在一些实施方案中，rAAV颗粒是rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10或其他rAAV颗粒或其两种或更多种的组合。在一些实施方案中，rAAV颗粒是rAAV8或rAAV9颗粒。
在一些实施方案中，rAAV颗粒具有选自由AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16或其衍生物、修饰或假型组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV8、AAV9或其衍生物、修饰或假型的血清型的AAV衣壳蛋白。
术语“细胞培养物”是指在生物反应器、滚瓶、多层培养瓶(hyperstack)、微球、大球、烧瓶等中贴壁或悬浮生长的细胞，以及上清液或悬浮液本身的组分，包括但不限于rAAV颗粒、细胞、细胞碎片、细胞污染物、胶体颗粒、生物分子、宿主细胞蛋白、核酸和脂质以及絮凝剂。术语“细胞培养物”也涵盖大规模方法，诸如生物反应器，包括悬浮培养物和在搅拌的生物反应器中附着于微载剂或大载剂生长的贴壁细胞。本公开涵盖用于大规模和小规模生产蛋白质的细胞培养程序。在一些实施方案中，术语“细胞培养物”是指悬浮生长的细胞。在一些实施方案中，术语“细胞培养物”是指在搅拌的生物反应器中附着于微载剂或大载剂上生长的贴壁细胞。在一些实施方案中，术语“细胞培养物”是指灌注培养物中生长的细胞。在一些实施方案中，术语“细胞培养物”是指交替切向流(ATF)支持的高密度灌注培养物中生长的细胞。
如本文所用，术语“纯化(purifying/purification)”、“分离(separate/separating/separation)”或“分离(isolate/isolating/isolation)”是指提高包含靶产物和一种或多种杂质的样品中的靶产物例如rAAV颗粒和rAAV基因组的纯度。通常，通过从样品中(完全或部分地)去除至少一种杂质来提高靶产物的纯度。在一些实施方案中，通过使用本文所述的方法从样品中(完全或部分地)去除一种或多种杂质来提高样品中rAAV的纯度。
除非上下文另外明确规定，否则如本公开和权利要求书所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数形式。
应理解无论在本文中将实施方案用语言“包含”来描述的情况如何，都提供以“由......组成”和/或“基本上由......组成”的术语描述的另外相似的实施方案。还应理解无论在本文中将实施方案用语言“基本上由......组成”来描述的情况如何，都提供以“由......组成”的术语描述的另外相似的实施方案。
如本文中诸如“A和/或B”的短语中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
在以马库什组(Markush group)或替代方案的其他分组来描述本公开的实施方案的情况下，所公开的方法不仅涵盖作为整体列出的整个组，而且还涵盖单独列出的组的每个成员和主组的所有可能的子组，并且还包括缺少一个或多个组成员的主组。所公开的方法还设想在所公开的方法中明确排除任何组成员中的一个或多个。
转染细胞的方法
一方面，本公开提供了一种转染细胞的方法，所述方法包括(a)提供包含细胞的细胞培养物，其中培养物包含约0.1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖；以及(b)通过向(a)的培养物添加包含一种或多种多核苷酸和转染试剂的组合物来转染细胞。
在一些实施方案中，a)的培养物包含约0.5mg/L与约10mg/L之间、约0.5mg/L与约5mg/L之间、约0.5mg/L与约3mg/L之间、约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约1mg/L与约4mg/L之间或约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约0.5mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约1mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，a)的培养物包含约0.5mg/L、约1mg/L、约1.5mg/L、约2mg/L、约2.5mg/L、约3mg/L、约4mg/L或约5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约1mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约1.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约2mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约2.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约3mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约3.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约4mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，a)的培养物包含约2mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，本公开提供了一种转染细胞的方法，所述方法包括：(a)在细胞培养物中培养细胞，其中培养物包含约1mg/L与约20mg/L之间的起始硫酸葡聚糖浓度和约0.1mg/L与约10mg/L之间的最终硫酸葡聚糖浓度；以及(b)通过向(a)的培养物添加包含一种或多种多核苷酸和转染试剂的组合物来转染细胞。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约2mg/L与约10mg/L之间、约3mg/L与约10mg/L之间或约3mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约3mg/L与约6mg/L之间的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L、约3mg/L、约4mg/L、约5mg/L、约6mg/L、约7mg/L、约8mg/L、约9mg/L或约10mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约3mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约6mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约7mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约8mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L与约10mg/L之间、约0.5mg/L与约5mg/L之间、约0.5mg/L与约3mg/L之间、约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约1mg/L与约4mg/L之间或约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L、约1mg/L、约1.5mg/L、约2mg/L、约2.5mg/L、约3mg/L、约4mg/L或约5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约1.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约2.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约3mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约3.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约2mg/L与约10mg/L之间、约3mg/L与约10mg/L之间或约3mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L与约10mg/L之间、约0.5mg/L与约5mg/L之间、约0.5mg/L与约3mg/L之间、约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约1mg/L与约4mg/L之间或约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约3mg/L与约6mg/L之间的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L、约3mg/L、约4mg/L、约5mg/L、约6mg/L、约7mg/L、约8mg/L、约9mg/L或约10mg/L的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L、约1mg/L、约1.5mg/L、约2mg/L、约2.5mg/L、约3mg/L、约4mg/L或约5mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸包含转基因。在一些实施方案中，转基因包含可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的调节元件。在一些实施方案中，多肽包含抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体、酶、融合蛋白或Fc融合蛋白。在一些实施方案中，多肽包含抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸包含生产重组病毒颗粒所必需的基因。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组腺病毒颗粒。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组腺相关病毒(rAAV)颗粒。
可使用本领域已知的用于转染细胞的任何合适的转染试剂。在一些实施方案中，转染试剂包含阳离子有机载剂。参见，例如，Gigante等人，Medchemcomm 10(10)：1692-1718(2019)；Damen等人Medchemcomm 9(9)：1404-1425(2018)，所述文献中的每一个以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含脂质，例如DOTMA、DOTAP、辅助脂质(Dope、胆固醇)及其组合。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含多价阳离子脂质，例如，DOSPA、DOGS及其混合物。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含双极性脂质或双头基两亲分子(bolaamphiphile)(bolas)。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含可生物还原和/或可二聚化的脂质。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含双子(gemini)表面活性剂。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含LipofectinTM、TransfectamTM、LipofectamineTM、Lipofectamine 2000TM或Lipofectamin PLUS2000TM。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含聚合物，例如聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、多糖(壳聚糖、葡聚糖、环糊精(CD))、聚[甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯](PDMAEMA)和树枝状聚合物(聚酰胺胺(PAMAM)、聚(丙烯亚胺)(PPI))。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含肽，例如富含碱性氨基酸的肽(CWL18)、细胞穿透肽(CPP)(富含Arg的肽(八精氨酸，TAT))、核定位信号(NLS)(SV40)和靶向(RGD)。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含与阳离子脂质体组合的聚合物(例如，PEI)。Paris等人Molecules 25(14)：3277(2020)，其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，转染试剂包含磷酸钙、高度分支有机化合物(树枝状聚合物)、阳离子聚合物(例如，DEAE葡聚糖或聚乙烯亚胺(PEI))、脂质转染。
在一些实施方案中，转染试剂包含聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、线性PEI、分支PEI、葡聚糖、环糊精(CD)、聚[甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯](PDMAEMA)、聚酰胺胺(PAMAM)、聚(丙烯亚胺)(PPI))或其混合物。在一些实施方案中，转染试剂包含聚乙烯亚胺(PEI)、线性PEI、分支PEI或其混合物。在一些实施方案中，转染试剂包含聚乙烯亚胺(PEI)。在一些实施方案中，转染试剂包含线性PEI。在一些实施方案中，转染试剂包含分支PEI。在一些实施方案中，转染试剂包含具有约5与约25kDa之间的分子量的聚乙烯亚胺(PEI)。在一些实施方案中，转染试剂包含聚乙二醇化聚乙烯亚胺(PEI)。在一些实施方案中，转染试剂包含修饰的聚乙烯亚胺(PEI)，疏水性部分诸如胆固醇、胆碱、烷基和一些氨基酸附接到其上。
可使用本领域已知的任何细胞培养物***。在一些实施方案中，细胞培养物是悬浮细胞培养物。在一些实施方案中，细胞培养物是贴壁细胞培养物。在一些实施方案中，细胞培养物包含在搅拌的生物反应器中附着于微载剂或大载剂上生长的贴壁细胞。在一些实施方案中，细胞培养物是灌注培养物。在一些实施方案中，细胞培养物是交替切向流(ATF)支持的高密度灌注培养物。
在一些实施方案中，细胞包括哺乳动物细胞或昆虫细胞。在一些实施方案中，细胞包括哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞包括HEK293细胞、HEK衍生细胞、CHO细胞、CHO衍生细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞和/或PerC6细胞。在一些实施方案中，细胞包括HEK293细胞。
在一些实施方案中，细胞包括悬浮适应性细胞。在一些实施方案中，细胞包括悬浮适应性HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如，HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、BSC细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞或SF-9细胞。在一些实施方案中，细胞包括悬浮适应性HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如，HEK293T细胞、HEK293F细胞)、CHO细胞、CHO-K1细胞或CHO衍生细胞。在一些实施方案中，细胞包括悬浮适应性HEK293细胞。在一些实施方案中，细胞包括悬浮适应性CHO细胞。
在一些实施方案中，细胞培养物具有约50升与约20,000升之间的体积。在一些实施方案中，细胞培养物具有约50升与约5,000升之间的体积。在一些实施方案中，细胞培养物具有约50升与约2,000升之间的体积。在一些实施方案中，细胞培养物具有约50升与约1,000升之间的体积。在一些实施方案中，细胞培养物具有约50升与约500升之间的体积。
不受任何特定理论的束缚，本文公开的方法提高了转染效率，使得根据本文公开的方法转染的细胞比在不包含硫酸葡聚糖的细胞培养物中转染的对照细胞更有可能包含一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的方法与使用不包含硫酸葡聚糖的细胞培养物的对照方法相比提供至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％的转染效率增加。测量转染效率的方法是本领域众所周知的。在一些实施方案中，使用报告转基因构建体(例如，编码荧光蛋白(例如，GFP)的报告转基因)来测量转染效率。
生产重组病毒颗粒的方法
一方面，本公开提供了一种生产重组病毒颗粒的方法，所述方法包括(a)提供包含适用于生产重组病毒颗粒的细胞的细胞培养物，其中培养物包含约0.1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖；(b)通过向(a)的培养物添加包含一种或多种含有生产重组病毒颗粒所必需的基因的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染细胞；以及(c)将包含转染细胞的细胞培养物保持在允许生产重组病毒颗粒的条件下。在一些实施方案中，a)的培养物包含约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组腺相关病毒(rAAV)颗粒。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸包含一种或多种辅助基因、rep基因、cap基因和转基因(例如感兴趣的基因或待包装的rAAV基因组)。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸包括三种多核苷酸的混合物：编码cap和rep基因的一种多核苷酸，编码包装所必需的腺病毒辅助功能(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)的一种多核苷酸，以及编码待包装的rAAV基因组的一种多核苷酸。在一些实施方案中，rAAV颗粒是AAV8或AAV9颗粒。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，细胞培养物是悬浮培养物。在一些实施方案中，细胞培养物包含适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。在一些实施方案中，细胞培养物具有约400升与约5,000升之间的体积。在一些实施方案中，转染试剂包含阳离子聚合物。在一些实施方案中，转染试剂包含PEI。
在一些实施方案中，本公开提供了一种增加重组病毒颗粒生产的方法，所述方法包括(a)提供包含适用于生产重组病毒颗粒的细胞的细胞培养物，其中培养物包含约0.1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖；(b)通过向a)的培养物添加包含一种或多种含有生产重组病毒颗粒所必需的基因的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染细胞；以及(c)将包含转染细胞的细胞培养物保持在允许生产所述重组病毒颗粒的条件下。在一些实施方案中，a)的培养物包含约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约2mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组腺相关病毒(rAAV)颗粒。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸包含一种或多种辅助基因、rep基因、cap基因和转基因(例如感兴趣的基因或待包装的rAAV基因组)。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸包括三种多核苷酸的混合物：编码cap和rep基因的一种多核苷酸，编码包装所必需的腺病毒辅助功能(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)的一种多核苷酸，以及编码待包装的rAAV基因组的一种多核苷酸。在一些实施方案中，rAAV颗粒是AAV8或AAV9颗粒。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述细胞培养物是悬浮培养物。在一些实施方案中，细胞培养物包含适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。在一些实施方案中，细胞培养物具有约400升与约5,000升之间的体积。在一些实施方案中，转染试剂包含阳离子聚合物。在一些实施方案中，转染试剂包含PEI。
在一些实施方案中，a)的培养物包含约0.5mg/L与约10mg/L之间、约0.5mg/L与约5mg/L之间、约0.5mg/L与约3mg/L之间、约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约1mg/L与约4mg/L之间或约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约0.5mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约1mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约2mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，a)的培养物包含约0.5mg/L、约1mg/L、约1.5mg/L、约2mg/L、约2.5mg/L、约3mg/L、约4mg/L或约5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约1mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约1.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约2mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约2.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约3mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约3.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约4mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，a)的培养物包含约2mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，本公开提供了一种生产重组病毒颗粒的方法，所述方法包括(a)在细胞培养物中培养适用于生产重组病毒颗粒的细胞约1天与约5天之间，其中培养物包含约1mg/L与约20mg/L之间的起始硫酸葡聚糖浓度和约0.1mg/L与约10mg/L之间的最终硫酸葡聚糖浓度；(b)通过向a)的培养物添加包含一种或多种含有生产重组病毒颗粒所必需的基因的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染细胞；以及(c)将包含转染细胞的细胞培养物保持在允许生产重组病毒颗粒的条件下。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约3mg/L与约6mg/L之间的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组腺相关病毒(rAAV)颗粒。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸包含一种或多种辅助基因、rep基因、cap基因和转基因(例如感兴趣的基因或待包装的rAAV基因组)。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸包括三种多核苷酸的混合物：编码cap和rep基因的一种多核苷酸，编码包装所必需的腺病毒辅助功能(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)的一种多核苷酸，以及编码待包装的rAAV基因组的一种多核苷酸。在一些实施方案中，rAAV颗粒是AAV8或AAV9颗粒。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述细胞培养物是悬浮培养物。在一些实施方案中，细胞培养物包含适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。在一些实施方案中，细胞培养物具有约400升与约5,000升之间的体积。在一些实施方案中，转染试剂包含阳离子聚合物。在一些实施方案中，转染试剂包含PEI。
在一些实施方案中，本公开提供了一种增加重组病毒颗粒生产的方法，所述方法包括(a)在细胞培养物中培养适用于生产重组病毒颗粒的细胞约1天与约5天之间，其中培养物包含约1mg/L与约20mg/L之间的起始硫酸葡聚糖浓度和约0.1mg/L与约10mg/L之间的最终硫酸葡聚糖浓度；(b)通过向(a)的培养物添加包含一种或多种含有生产重组病毒颗粒所必需的基因的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染细胞；以及(c)将包含转染细胞的细胞培养物保持在允许生产重组病毒颗粒的条件下。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约3mg/L与约6mg/L之间的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组腺相关病毒(rAAV)颗粒。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸包含一种或多种辅助基因、rep基因、cap基因和转基因(例如感兴趣的基因或待包装的rAAV基因组)。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸包括三种多核苷酸的混合物：编码cap和rep基因的一种多核苷酸，编码包装所必需的腺病毒辅助功能(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)的一种多核苷酸，以及编码待包装的rAAV基因组的一种多核苷酸。在一些实施方案中，rAAV颗粒是AAV8或AAV9颗粒。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述细胞培养物是悬浮培养物。在一些实施方案中，细胞培养物包含适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。在一些实施方案中，细胞培养物具有约400升与约5,000升之间的体积。在一些实施方案中，转染试剂包含阳离子聚合物。在一些实施方案中，转染试剂包含PEI。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约2mg/L与约10mg/L之间、约3mg/L与约10mg/L之间或约3mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约3mg/L与约6mg/L之间的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L、约3mg/L、约4mg/L、约5mg/L、约6mg/L、约7mg/L、约8mg/L、约9mg/L或约10mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约3mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约6mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约7mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约8mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L与约10mg/L之间、约0.5mg/L与约5mg/L之间、约0.5mg/L与约3mg/L之间、约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约1mg/L与约4mg/L之间或约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L、约1mg/L、约1.5mg/L、约2mg/L、约2.5mg/L、约3mg/L、约4mg/L或约5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约1.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约2.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约3mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约3.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约2mg/L与约10mg/L之间、约3mg/L与约10mg/L之间或约3mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L与约10mg/L之间、约0.5mg/L与约5mg/L之间、约0.5mg/L与约3mg/L之间、约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约1mg/L与约4mg/L之间或约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约3mg/L与约6mg/L之间的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L、约3mg/L、约4mg/L、约5mg/L、约6mg/L、约7mg/L、约8mg/L、约9mg/L或约10mg/L的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L、约1mg/L、约1.5mg/L、约2mg/L、约2.5mg/L、约3mg/L、约4mg/L或约5mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组腺相关病毒(rAAV)颗粒。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组腺病毒(例如，人腺病毒或黑猩猩腺病毒)颗粒。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组慢病毒颗粒。
在一些实施方案中，重组病毒颗粒是rAAV颗粒。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV8、AAV9、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1或AAV.hu37血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV8血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV9血清型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，重组病毒颗粒包含转基因。适用于特定宿主细胞的多种病毒转基因表达***是本领域技术人员已知的。应当理解，任何病毒转基因表达***都可根据本文公开的方法使用。在一些实施方案中，转基因包含可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的调节元件。在一些实施方案中，调节元件包括增强子、启动子和polyA区中的一种或多种。在一些实施方案中，调节元件和编码多肽的多核苷酸是异源的。
在一些实施方案中，转基因编码抗VEGF Fab、艾杜糖苷酶(IDUA)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、三肽基肽酶1(TPP1)或VEGF受体1(sFlt-1)的非膜相关剪接变体。在一些实施方案中，转基因编码γ-肌聚糖、Rab护卫蛋白1(REP1/CHM)、类维生素A异构水解酶(RPE65)、环状核苷酸门控通道α3(CNGA3)、环状核苷酸门控通道β3(CNGB3)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、溶酶体相关膜蛋白2同工型B(LAMP2B)、因子VIII、因子IX、色素性视网膜炎GTP酶调节剂(RPGR)、视网膜劈裂蛋白(RS1)、肌浆网钙ATP酶(SERCA2a)、阿柏西普、巴登氏病蛋白(CLN3)、跨膜ER蛋白(CLN6)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、水通道蛋白1(AQP1)、抗肌萎缩蛋白、微小抗肌萎缩蛋白、微型抗肌萎缩蛋白、肌微管素1(MTM1)、卵泡抑素(FST)、葡萄糖6磷酸酶(G6P酶)、载脂蛋白A2(APOA2)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-半乳糖苷酶(GLA)、β-半乳糖苷酶(GLB1)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、磷酸二酯酶6B(PDE6B)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶9OTC)、运动神经元生存蛋白(SMN1)、运动神经元生存蛋白(SMN2)、神经秩蛋白(NRTN)、神经营养蛋白3(NT-3/NTF3)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、神经生长因子(NGF)、线粒体编码的NADH：泛醌氧化还原酶核心亚基4(MT-ND4)、保护性蛋白组织蛋白酶A(PPCA)、戴斯弗林蛋白、MER原癌基因、酪氨酸激酶(MERTK)、囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR)或肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白(IgG1)Fc融合蛋白。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是rAAV颗粒。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV8血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV9血清型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，转基因编码异源病毒多肽。在一些实施方案中，病毒多肽是冠状病毒多肽。在一些实施方案中，冠状病毒是SARS-CoV1或SARS-CoV2。在一些实施方案中，转基因编码SARS-CoV1或SARS-CoV2的刺突蛋白或其免疫原性片段。在一些实施方案中，转基因编码SARS-CoV2的刺突蛋白或其免疫原性片段。在一些实施方案中，转基因编码SARS-CoV2刺突蛋白的受体结合结构域。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是rAAV颗粒。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组腺病毒颗粒。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组黑猩猩腺病毒颗粒。
基于转染的重组病毒颗粒生产***是技术人员已知的。参见，例如，Reiser等人，Gene Ther 7(11)：910-3(2000)；Dull等人，J Virol.72(11)：8463-8471(1998)；Hoffmann等人，PNAS 97(11)6108-6113(2000)；Milian等人，Vaccine 35(26)：3423-3430(2017)，所述文献中的每一个以引用的方式整体并入本文。本文公开的方法可用于在基于转染的生产***中生产重组病毒颗粒。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组登革热病毒、重组埃博拉病毒、重组人***瘤病毒(HPV)、重组人免疫缺陷病毒(HIV)、重组腺相关病毒(AAV)、重组慢病毒、重组流感病毒、重组水泡性口炎病毒(VSV)、重组脊髓灰质炎病毒、重组腺病毒、重组逆转录病毒、重组牛痘病毒、重组呼肠孤病毒、重组麻疹病毒、重组新城疫病毒(NDV)、重组带状疱疹病毒(HZV)、重组单纯疱疹病毒(HSV)或重组杆状病毒。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组腺相关病毒(AAV)、重组慢病毒或重组流感病毒。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组慢病毒。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组流感病毒。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组杆状病毒。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组腺相关病毒(AAV)。在一些实施方案中，rAAV颗粒是AAV8或AAV9颗粒。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。
可使用本领域已知的用于转染细胞的任何合适的转染试剂来根据本文公开的方法生产重组病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)。在一些实施方案中，细胞是HEK293细胞，诸如适于悬浮培养的HEK293细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用基于化学的转染方法转染细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用阳离子有机载剂转染细胞。参见，例如，Gigante等人，Medchemcomm 10(10)：1692-1718(2019)；Damen等人Medchemcomm 9(9)：1404-1425(2018)，所述文献中的每一个以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含脂质，例如DOTMA、DOTAP、辅助脂质(Dope、胆固醇)及其组合。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含多价阳离子脂质，例如，DOSPA、DOGS及其混合物。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含双极性脂质或双头基两亲分子(bolaamphiphile)(bolas)。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含可生物还原和/或可二聚化的脂质。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含双子表面活性剂。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含LipofectinTM、TransfectamTM、LipofectamineTM、Lipofectamine 2000TM或Lipofectamin PLUS2000TM。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含聚合物，例如聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、多糖(壳聚糖、葡聚糖、环糊精(CD))、聚[甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯](PDMAEMA)和树枝状聚合物(聚酰胺胺(PAMAM)、聚(丙烯亚胺)(PPI))。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含肽，例如富含碱性氨基酸的肽(CWL18)、细胞穿透肽(CPP)(富含Arg的肽(八精氨酸，TAT))、核定位信号(NLS)(SV40)和靶向(RGD)。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含与阳离子脂质体组合的聚合物(例如，PEI)。Paris等人Molecules 25(14)：3277(2020)，其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，转染试剂包含磷酸钙、高度分支有机化合物(树枝状聚合物)、阳离子聚合物(例如，DEAE葡聚糖或聚乙烯亚胺(PEI))、脂质转染。
在一些实施方案中，转染试剂包含聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、线性PEI、分支PEI、葡聚糖、环糊精(CD)、聚[甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯](PDMAEMA)、聚酰胺胺(PAMAM)、聚(丙烯亚胺)(PPI))或其混合物。在一些实施方案中，转染试剂包含聚乙烯亚胺(PEI)、线性PEI、分支PEI或其混合物。在一些实施方案中，转染试剂包含聚乙烯亚胺(PEI)。在一些实施方案中，转染试剂包含线性PEI。在一些实施方案中，转染试剂包含分支PEI。在一些实施方案中，转染试剂包含具有约5与约25kDa之间的分子量的聚乙烯亚胺(PEI)。在一些实施方案中，转染试剂包含聚乙二醇化聚乙烯亚胺(PEI)。在一些实施方案中，转染试剂包含修饰的聚乙烯亚胺(PEI)，疏水性部分诸如胆固醇、胆碱、烷基和一些氨基酸附接到其上。
可通过本领域技术人员已知的任何方法制备包含一种或多种多核苷酸和转染试剂的组合物。在一些实施方案中，通过将一种或多种多核苷酸与至少一种转染试剂混合制备组合物，包括将转染试剂和一种或多种多核苷酸中的每一种在无菌液体例如组织培养基中稀释，并且将稀释的转染试剂和稀释的一种或多种多核苷酸混合。在一些实施方案中，用于稀释转染试剂和/或一种或多种多核苷酸的组织培养基不包含硫酸葡聚糖。技术人员理解进行稀释和混合以便生产包含所需比率和浓度的转染试剂和多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，至少一种转染试剂和一种或多种多核苷酸的稀释和混合产生包含约1∶5与5∶1之间的重量比的转染试剂和多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，转染试剂与多核苷酸的重量比在约1∶3与3∶1之间。在一些实施方案中，转染试剂与多核苷酸的重量比在约1∶3与1∶1之间。在一些实施方案中，转染试剂与多核苷酸的重量比在约1∶2与1∶1.5之间。在一些实施方案中，转染试剂与多核苷酸的重量比为约1∶5、1∶4、1∶3、1∶2.5、1∶2、1∶1.75、1∶1.5、1∶1.25、1∶1、1.25∶1、1.5∶1、1.75∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、4∶1或5∶1。在一些实施方案中，转染试剂与多核苷酸的重量比为约1∶2。在一些实施方案中，转染试剂与多核苷酸的重量比为约1∶1.75。在一些实施方案中，转染试剂与多核苷酸的重量比为约1∶1.5。在一些实施方案中，转染试剂与多核苷酸的重量比为约1∶1.25。在一些实施方案中，转染试剂与多核苷酸的重量比为约1∶1。在一些实施方案中，转染试剂与多核苷酸的重量比为约1.25∶1。在一些实施方案中，转染试剂与多核苷酸的重量比为约1.5∶1。在一些实施方案中，转染试剂与多核苷酸的重量比为约1.75∶1。在一些实施方案中，转染试剂与多核苷酸的重量比为约2∶1。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸包含3种质粒。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸包含2种质粒。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸包含1种质粒。在一些实施方案中，重组病毒是重组AAV并且一种或多种多核苷酸包括三种多核苷酸的混合物：编码cap和rep基因的一种多核苷酸，编码包装所必需的腺病毒辅助功能(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)的一种多核苷酸，以及编码待包装的rAAV基因组的一种多核苷酸。在一些实施方案中，rAAV颗粒是AAV8或AAV9颗粒。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，转染试剂是PEI。
在一些实施方案中，将包含转染试剂和一种或多种多核苷酸的组合物在添加至培养物之前孵育以允许形成多核苷酸：转染试剂复合物。在一些实施方案中，孵育在室温下进行。在一些实施方案中，孵育包括例如在振荡器上以约100与约200rpm之间振荡组合物。在一些实施方案中，孵育持续约5分钟与约20分钟之间。在一些实施方案中，孵育持续约10分钟至约15分钟。在一些实施方案中，孵育持续不长于15分钟。在一些实施方案中，孵育持续不长于10分钟。在一些实施方案中，孵育持续约5分钟、约10分钟或约15分钟。在一些实施方案中，孵育持续约10分钟。在一些实施方案中，转染试剂包含PEI。
在一些实施方案中，添加到培养物中的包含一种或多种含有生产重组病毒颗粒所必需的基因的多核苷酸和转染试剂的组合物的体积为培养物体积的约5％与约20％之间。在一些实施方案中，添加的组合物体积为培养物体积的约7％与约15％之间。在一些实施方案中，添加的组合物体积为培养物体积的约10％。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸含有生产重组AAV颗粒所必需的基因。在一些实施方案中，转染试剂包含PEI。在一些实施方案中，培养物包含HEK293细胞，诸如适于悬浮培养的HEK293细胞。
在一些实施方案中，培养物具有约400升与约20,000升之间的体积。在一些实施方案中，培养物具有约500升与约20,000升之间的体积。在一些实施方案中，培养物具有约700升与约20,000升之间的体积。在一些实施方案中，培养物具有约1,000升与约20,000升之间的体积。在一些实施方案中，培养物具有约400升与约10,000升之间的体积。在一些实施方案中，培养物具有约500升与约10,000升之间的体积。在一些实施方案中，培养物具有约700升与约10,000升之间的体积。在一些实施方案中，培养物具有约1,000升与约10,000升之间的体积。在一些实施方案中，培养物具有约400升与约5,000升之间的体积。在一些实施方案中，培养物具有约500升与约5,000升之间的体积。在一些实施方案中，培养物具有约700升与约5,000升之间的体积。在一些实施方案中，培养物具有约1,000升与约5,000升之间的体积。在一些实施方案中，培养物包含HEK293细胞，诸如适于悬浮培养的HEK293细胞。
在一些实施方案中，培养物具有约200升与约5,000升之间的体积。在一些实施方案中，培养物具有约200升与约2,000升之间的体积。在一些实施方案中，培养物具有约200升与约1,000升之间的体积。在一些实施方案中，培养物具有约200升与约500升之间的体积。在一些实施方案中，培养物包含HEK293细胞，诸如适于悬浮培养的HEK293细胞。
在一些实施方案中，培养物具有约200升的体积。在一些实施方案中，培养物具有约300升的体积。在一些实施方案中，培养物具有约400升的体积。在一些实施方案中，培养物具有约500升的体积。在一些实施方案中，培养物具有约750升的体积。在一些实施方案中，培养物具有约1,000升的体积。在一些实施方案中，培养物具有约2,000升的体积。在一些实施方案中，培养物具有约3,000升的体积。在一些实施方案中，培养物具有约5,000升的体积。在一些实施方案中，培养物包含HEK293细胞，诸如适于悬浮培养的HEK293细胞。
在一些实施方案中，培养物包含约2x10E+6与约10E+7个活细胞/ml之间。在一些实施方案中，培养物包含约3x10E+6与约8x10E+6个活细胞/ml之间。在一些实施方案中，培养物包含约3x10E+6个活细胞/ml。在一些实施方案中，培养物包含约4x10E+6个活细胞/ml。在一些实施方案中，培养物包含约5x10E+6个活细胞/ml。在一些实施方案中，培养物包含约6x10E+6个活细胞/ml。在一些实施方案中，培养物包含约7x10E+6个活细胞/ml。在一些实施方案中，培养物包含约8x10E+6个活细胞/ml。在一些实施方案中，培养物包含HEK293细胞，诸如适于悬浮培养的HEK293细胞。
在一些实施方案中，细胞包括哺乳动物细胞或昆虫细胞。在一些实施方案中，细胞包括哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞包括HEK293细胞、HEK衍生细胞、CHO细胞、CHO衍生细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞和/或PerC6细胞。在一些实施方案中，细胞包括HEK293细胞。
在一些实施方案中，在添加包含一种或多种含有生产重组病毒颗粒所必需的基因的多核苷酸和转染试剂的组合物后，将培养物保持约2天与约10天之间。在一些实施方案中，在添加组合物之后，将培养物保持约5天与约14天之间或更多天。在一些实施方案中，在添加组合物之后，将培养物保持约2天与约7天之间。在一些实施方案中，在添加组合物之后，将培养物保持约3天与约5天之间。在一些实施方案中，在添加组合物之后，将培养物保持约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。在一些实施方案中，在添加组合物之后，将培养物保持约5天。在一些实施方案中，在添加组合物之后，将细胞培养物保持约6天。在一些实施方案中，将细胞培养物保持在允许生产rAAV颗粒的条件下以供连续收获。在一些实施方案中，培养物包含HEK293细胞，诸如适于悬浮培养的HEK293细胞。
在一些实施方案中，本文公开的方法相对于包括转染不包含硫酸葡聚糖的细胞培养物中的细胞的参考方法增加了重组病毒颗粒(例如rAAV颗粒)的生产。在一些实施方案中，本文公开的方法生产的病毒颗粒为包括转染不包含硫酸葡聚糖的细胞培养物中的细胞的参考方法的至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或2倍。在一些实施方案中，本文公开的方法比包括转染不包含硫酸葡聚糖的细胞培养物中的细胞的参考方法至少多生产约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的病毒颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法比包括转染不包含硫酸葡聚糖的细胞培养物中的细胞的参考方法至少多生产约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的病毒颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法比参考方法至少多生产约10％的病毒颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法比参考方法至少多生产约20％的病毒颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法比参考方法至少多生产约20％的病毒颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法比参考方法至少多生产约20％的病毒颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法比参考方法至少多生产约70％的病毒颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法比参考方法至少多生产约100％的病毒颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法增加重组病毒的生产至少约50％、至少约75％或至少约100％。在一些实施方案中，本文公开的方法增加重组病毒的生产至少约两倍、至少约三倍或至少约五倍。在一些实施方案中，本文公开的方法增加rAAV的生产至少约两倍。在一些实施方案中，生产的增加通过比较生产培养物中的重组病毒(例如rAAV)滴度来确定。在一些实施方案中，重组病毒(例如rAAV)滴度以每毫升生产培养物的基因组拷贝(GC)进行测量。在一些实施方案中，重组病毒是rAAV。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自AAV8和AAV9的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV8的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV9的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的衣壳血清型。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。
在一些实施方案中，本文公开的方法增加了rAAV颗粒的生产，同时保持或改善了rAAV颗粒和包含其的组合物的质量属性。在一些实施方案中，rAAV颗粒和包含其的组合物的质量通过确定rAAV颗粒的浓度(例如GC/m1)、包含rAAV基因组拷贝的颗粒的百分比；没有基因组的颗粒的比率、rAAV颗粒的感染性、rAAV颗粒的稳定性、残留宿主细胞蛋白的浓度或残留宿主细胞核酸(例如宿主细胞基因组DNA、编码rep和cap基因的质粒、编码辅助功能的质粒、编码rAAV基因组的质粒)的浓度来评估。在一些实施方案中，由本文公开的方法生产的rAAV颗粒或包含其的组合物的质量与由包括混合、孵育和转移相同体积的多核苷酸：转染试剂复合物中的单个步骤的参考方法生产的rAAV颗粒或组合物的质量相同。在一些实施方案中，由本文公开的方法生产的rAAV颗粒或包含其的组合物的质量比由包括混合、孵育和转移相同体积的多核苷酸：转染试剂复合物中的单个步骤的参考方法生产的rAAV颗粒或组合物的质量更好。
在一些实施方案中，本文公开的方法生产约1x10e+10GC/ml与约1x10e+13GC/ml之间的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法生产约1x10e+10GC/ml与约1x10e+11GC/ml之间的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法生产约5x10e+10GC/ml与约1x10e+12GC/ml之间的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法生产约5x10e+10GC/ml与约1x10e+13GC/ml之间的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法生产约1x10e+11GC/ml与约1x10e+13GC/ml之间的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法生产约5x10e+10GC/ml与约5x10e+12GC/ml之间的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法生产约1x10e+11GC/ml与约5x10e+12GC/ml之间的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法生产大于约1x10e+11GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法生产大于约5x10e+11GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法生产大于约1x10e+12GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自AAV8和AAV9的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV8的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV9的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。
在一些实施方案中，本文公开的方法生产至少约5x10e+10GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法生产至少约1x10e+11GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法生产至少约5x10e+11GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法生产至少约1x10e+12GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法生产至少约5x10e+12GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法生产至少约1x10e+13GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法生产至少约5x10e+13GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自AAV8和AAV9的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV8的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV9的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。
用于生产rAAV颗粒的许多基于细胞培养物的***是本领域已知的，所述***中的任何一种都可用于实施本文公开的方法。用于生产rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养物需要：(1)合适的宿主细胞，包括例如人衍生细胞系，诸如HeLa、A549或HEK293细胞及其衍生物(HEK293T细胞、HEK293F细胞)，或哺乳动物细胞系，诸如Vero、CHO细胞或CHO衍生细胞；(2)合适的辅助病毒功能，由野生型或突变型腺病毒(诸如温度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；(3)AAV rep和cap基因以及基因产物；(4)由AAVITR序列侧接的转基因(诸如治疗性转基因)；以及(5)支撑rAAV生产的合适的培养基和培养基组分。
技术人员知道可将AAV rep和cap基因、AAV辅助基因(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)和rAAV基因组(包含由反向末端重复序列(ITR)侧接的一个或多个感兴趣的基因)引入到细胞中以生产或包装rAAV的许多方法。短语“腺病毒辅助功能”是指在细胞中表达的多种病毒辅助基因(如RNA或蛋白质)，从而使AAV在细胞中高效生长。技术人员理解的是，包括腺病毒和单纯疱疹病毒(HSV)的辅助病毒促进AAV复制，并且已鉴定出提供基本功能的某些基因，例如，辅助基因可诱导细胞环境发生变化，从而促进这种AAV基因表达和复制。在本文公开的方法的一些实施方案中，通过转染编码AAV rep和cap基因、辅助基因和rAAV基因组的一种或多种质粒载体来将AAV rep和cap基因、辅助基因和rAAV基因组引入到细胞中。
开发编码AAV rep和cap基因、辅助基因和/或rAAV基因组的质粒或病毒载体的分子生物学技术是本领域通常已知的。在一些实施方案中，AAV rep和cap基因由一种质粒载体编码。在一些实施方案中，AAV辅助基因(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)由一种质粒载体编码。在一些实施方案中，E1a基因或E1b基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种病毒载体的转染来将剩余的AAV辅助基因引入到细胞中。在一些实施方案中，E1a基因和E1b基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种质粒载体的转染来将E4基因、E2a基因和VA基因引入到细胞中。在一些实施方案中，一种或多种辅助基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种质粒载体的转染来将一种或多种辅助基因引入到细胞中。在一些实施方案中，辅助基因由宿主细胞稳定表达。在一些实施方案中，AAV rep和cap基因由一种病毒载体编码。在一些实施方案中，AAV辅助基因(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)由一种病毒载体编码。在一些实施方案中，E1a基因或E1b基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种病毒载体的转染来将剩余的AAV辅助基因引入到细胞中。在一些实施方案中，E1a基因和E1b基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种病毒载体的转染来将E4基因、E2a基因和VA基因引入到细胞中。在一些实施方案中，一种或多种辅助基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种病毒载体的转染来将一种或多种辅助基因引入到细胞中。在一些实施方案中，通过使用一种或多种多核苷酸例如载体转染来将AAV rep和cap基因、包装所必需的腺病毒辅助功能以及待包装的rAAV基因组引入到细胞中。在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用三种多核苷酸的混合物转染细胞：编码cap和rep基因的一种多核苷酸，编码包装所必需的腺病毒辅助功能(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)的一种多核苷酸，以及编码待包装的rAAV基因组的一种多核苷酸。在一些实施方案中，AAV cap基因是AAV8或AAV9 cap基因。在一些实施方案中，AAV cap基因是AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB或AAV.7m8 cap基因。在一些实施方案中，AAV cap基因编码与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，编码待包装的rAAV基因组的载体包含由AAV ITR侧接的感兴趣的基因。在一些实施方案中，AAV ITR来自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他AAV血清型。
载体的任何组合都可用于将AAV rep和cap基因、AAV辅助基因和rAAV基因组引入到其中待生产或包装rAAV颗粒的细胞中。在本文公开的方法的一些实施方案中，可使用编码rAAV基因组的第一质粒载体(所述rAAV基因组包含与AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的感兴趣的基因)、编码AAV rep和cap基因的第二载体以及编码辅助基因的第三载体。在一些实施方案中，将三种载体的混合物共转染到细胞中。
在一些实施方案中，通过使用质粒载体以及病毒载体两者来使用转染和感染的组合。
在一些实施方案中，rep和cap基因以及AAV辅助基因中的一种或多种由细胞组成性表达，并且不需要被转染或转导到细胞中。在一些实施方案中，细胞组成性表达rep和/或cap基因。在一些实施方案中，细胞组成性表达一种或多种AAV辅助基因。在一些实施方案中，细胞组成性表达E1a。在一些实施方案中，细胞包含编码rAAV基因组的稳定转基因。
在一些实施方案中，AAV rep、cap和辅助基因(例如E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因或VA基因)可以是任何AAV血清型。同样，AAV ITR也可以是任何AAV血清型。例如，在一些实施方案中，AAV ITR来自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC 1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他AAV血清型(例如带有来自多于一种血清型的序列的杂合血清型)。在一些实施方案中，AAV cap基因来自AAV9或AAV8 cap基因。在一些实施方案中，AAV cap基因来自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAVLK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他AAV血清型(例如带有来自多于一种血清型的序列的杂合血清型)。在一些实施方案中，用于生产rAAV颗粒的AAV rep和cap基因来自不同的血清型。例如，rep基因来自AAV2，而cap基因来自AAV9。
可使用本领域已知的任何合适的培养基来根据本文公开的方法生产重组病毒颗粒(例如rAAV颗粒)。这些培养基包括但不限于由Hyclone Laboratories和JRH生产的培养基，包括如美国专利号6,723,551中所述的改良伊格尔培养基(Modified Eagle Medium，MEM)、杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)和Sf-900II SFM培养基，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，培养基包括来自Invitrogen/ThermoFisher的DynamisTM培养基、FreeStyleTM 293表达培养基或Expi293TM表达培养基。在一些实施方案中，培养基包括DynamisTM培养基。在一些实施方案中，本文公开的方法使用包含无血清培养基、无动物组分培养基或化学成分确定的培养基的细胞培养物。在一些实施方案中，培养基是无动物组分培养基。在一些实施方案中，培养基包含血清。在一些实施方案中，培养基包含胎牛血清。在一些实施方案中，培养基是无谷氨酰胺的培养基。在一些实施方案中，培养基包含谷氨酰胺。在一些实施方案中，培养基补充有营养素、盐、缓冲剂和添加剂(例如消泡剂)中的一种或多种。在一些实施方案中，培养基补充有谷氨酰胺。在一些实施方案中，培养基补充有血清。在一些实施方案中，培养基补充有胎牛血清。在一些实施方案中，培养基补充有泊洛沙姆(poloxamer)，例如P 188Bio。在一些实施方案中，培养基是基础培养基。在一些实施方案中，培养基是进料培养基。
重组病毒(例如rAAV)生产培养物可常规地在适合于所利用的特定宿主细胞的各种条件下(在宽的温度范围内、变化的时间长度等)生长。如本领域已知的，病毒生产培养物包含悬浮适应性宿主细胞，诸如HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、BSC细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞及SF-9细胞，它们可多种方式进行培养，包括例如旋转瓶、搅拌釜生物反应器和一次性***，诸如波浪袋***。用于生产rAAV颗粒的许多悬浮培养物是本领域已知的，包括例如在美国专利号6,995,006、9,783,826和在美国专利申请公开号20120122155中公开的培养物，所述专利中的每一个以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，重组病毒是重组AAV。
本领域已知可生产重组病毒颗粒(例如rAAV颗粒)的任何细胞或细胞系可用于本文公开的任何一种方法中。在一些实施方案中，本文公开的生产重组病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)或增加重组病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)的生产的方法使用HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如，HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、LLC-MK细胞、MDCK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、PK15细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、BHK细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞或SF-9细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法使用哺乳动物细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法使用昆虫细胞，例如SF-9细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法使用适于在悬浮培养物中生长的细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法使用适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组AAV颗粒。
在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物是悬浮培养物。在一些实施方案中，本文公开的大规模悬浮细胞培养物包含适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物包含无血清培养基、无动物组分培养基或化学成分确定的培养基。在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物包含无血清培养基。在一些实施方案中，悬浮适应性细胞在摇瓶、旋转瓶、细胞袋或生物反应器中进行培养。
在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物包含无血清培养基、无动物组分培养基或化学成分确定的培养基。在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物包含无血清培养基。
在一些实施方案中，本文公开的大规模悬浮培养细胞培养物包括高密度细胞培养物。在一些实施方案中，培养物的总细胞密度为约1x10E+06个细胞/ml与约30x10E+06个细胞/ml之间。在一些实施方案中，超过约50％的细胞是活细胞。在一些实施方案中，细胞是HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞或SF-9细胞。在其他实施方案中，细胞是HEK293细胞。
本文公开的方法可用于生产包含来自任何AAV衣壳血清型的衣壳蛋白的rAAV颗粒。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC 1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含作为AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自AAV8和AAV9的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV8的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV9的AAV衣壳血清型。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含作为AAV8或AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV8衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV8衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含作为AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV9衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV9衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB或AAV.7m8衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与与AAV8或AAV9具有高度序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含镶嵌衣壳。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含假型rAAV颗粒。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳含有两种或更多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白嵌合体。
rAAV颗粒
所提供的方法适用于生产任何分离的重组AAV颗粒。因此，rAAV可以是本领域已知的任何血清型、修饰或衍生物，或本领域已知的其任何组合(例如，包含两种或更多种血清型，例如，包含rAAV2、rAAV8和rAAV9颗粒中的两种或更多种的rAAV颗粒群)。在一些实施方案中，rAAV颗粒是AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他rAAV颗粒或其两种或更多种的组合。
在一些实施方案中，rAAV颗粒具有来自选自AAV1、AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC 1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其衍生物、修饰或假型的AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与例如选自AAV1、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC 1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自AAV1、AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC 1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其衍生物、修饰或假型的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与例如选自AAV1、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含如Zinn等人，2015，Cell Rep.12(6)：1056-1068中所述的Anc80或Anc80L65的衣壳，所述文献以引用的方式整体并入。在某些实施方案中，rAAV颗粒包含如美国专利号9,193,956；9458517；和9,587,282以及美国专利申请公开号2016/0376323中所述的具有以下氨基酸***中的一种的衣壳：LGETTRP或LALGETTRP，所述专利中的每一个以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含如美国专利号9,193,956；9,458,517；和9,587,282以及美国专利申请公开号2016/0376323中所述的AAV.7m8的衣壳，所述专利中的每一个以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含美国专利号9,585,971中公开的任何AAV衣壳，诸如AAV.PHP.B。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含美国专利号9,840,719和WO 2015/013313中公开的任何AAV衣壳，诸如AAV.Rh74和RHM4-1，所述专利中的每一个以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含WO 2014/172669中公开的任何AAV衣壳，诸如AAV rh.74，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含如Georgiadis等人，2016，GeneTherapy 23：857-862和Georgiadis等人，2018，Gene Therapy 25：450中所述的AAV2/5的衣壳，所述文献中的每一个以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含WO2017/070491中公开的任何AAV衣壳，诸如AAV2tYF，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含如Puzzo等人，2017，Sci.Transl.Med.29(9)：418中所述的AAVLK03或AAV3B的衣壳，所述文献以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含美国专利号8,628,966；US 8,927,514；US 9,923,120和WO 2016/049230中公开的任何AAV衣壳，诸如HSC1、HSC2、HSC3、HSC4、HSC5、HSC6、HSC7、HSC8、HSC9、HSC10、HSC11、HSC12、HSC13、HSC14、HSC15或HSC16，所述专利中的每一个以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含在任何以下专利和专利申请中公开的AAV衣壳，所述专利和专利申请中的每一个以引用的方式整体并入本文：美国专利号7,282,199；7,906,111；8,524,446；8,999,678；8,628,966；8,927,514；8,734,809；US 9,284,357；9,409,953；9,169,299；9,193,956；9458517；和9,587,282；美国专利申请公开号2015/0374803；2015/0126588；2017/0067908；2013/0224836；2016/0215024；2017/0051257；以及国际专利申请号PCT/US2015/034799；PCT/EP2015/053335。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与任何以下专利和专利申请中公开的AAV衣壳的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的衣壳蛋白，所述专利和专利申请中的每一个以引用的方式整体并入本文：美国专利号7,282,199；7,906,111；8,524,446；8,999,678；8,628,966；8,927,514；8,734,809；US 9,284,357；9,409,953；9,169,299；9,193,956；9458517；和9,587,282；美国专利申请公开号2015/0374803；2015/0126588；2017/0067908；2013/0224836；2016/0215024；2017/0051257；以及国际专利申请号PCT/US2015/034799；PCT/EP2015/053335。
在一些实施方案中，rAAV颗粒具有在国际申请公开号WO 2003/052051(参见例如SEQ ID NO：2)、WO 2005/033321(参见例如SEQ ID NO：123和88)、WO 03/042397(参见例如SEQ ID NO：2、81、85和97)、WO2006/068888(参见例如SEQ ID NO：1和3-6)、WO 2006/110689(参见例如SEQ ID NO：5-38)、WO2009/104964(参见例如SEQ ID NO：1-5、7、9、20、22、24和31)、W0 2010/127097(参见例如SEQ ID NO：5-38)和WO 2015/191508(参见例如SEQ ID NO：80-294)和美国申请公开号20150023924(参见例如SEQ ID NO：1、5-10)中公开的衣壳蛋白，所述专利各自的内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与AAV衣壳的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的衣壳蛋白，所述AAV衣壳在国际申请公开号WO 2003/052051(参见例如SEQ ID NO：2)、WO 2005/033321(参见例如SEQ ID NO：123和88)、WO 03/042397(参见例如SEQ ID NO：2、81、85和97)、WO 2006/068888(参见例如SEQ ID NO：1和3-6)、WO 2006/110689(参见例如SEQ ID NO：5-38)、WO2009/104964(参见例如SEQ ID NO：1-5、7、9、20、22、24和31)、W02010/127097(参见例如SEQ ID NO：5-38)和WO 2015/191508(参见例如SEQ ID NO：80-294)和美国申请公开号20150023924(参见例如SEQ ID NO：1、5-10)中公开。
基于AAV的病毒载体的核酸序列以及制备重组AAV衣壳和AAV衣壳的方法在例如美国专利号7,282,199；7,906,111；8,524,446；8,999,678；8,628,966；8,927,514；8,734,809；US 9,284,357；9,409,953；9,169,299；9,193,956；9458517；和9,587,282；美国专利申请公开号2015/0374803；2015/0126588；2017/0067908；2013/0224836；2016/0215024；2017/0051257；国际专利申请号PCT/US2015/034799；PCT/EP2015/053335；WO 2003/052051、WO 2005/033321、WO 03/042397、WO 2006/068888、WO 2006/110689、WO2009/104964、W0 2010/127097和WO 2015/191508，以及美国申请公开号20150023924中有所教导。
所提供的方法适用于生产编码转基因的重组AAV。在某些实施方案中，转基因来自表1A至表1C。在一些实施方案中，rAAV基因组包含有包含以下组分的载体：(1)位于表达盒侧翼的AAV反向末端重复序列；(2)调节控制元件，诸如a)启动子/增强子，b)poly A信号，和c)任选地内含子；以及(3)编码转基因的核酸序列。在用于表达完整或基本上完整的单克隆抗体(mAb)的其他实施方案中，rAAV基因组包含有包含以下组分的载体：(1)位于表达盒侧翼的AAV反向末端重复序列；(2)调节控制元件，诸如a)启动子/增强子，b)poly A信号，和c)任选地内含子；以及(3)编码抗体的轻链Fab和重链Fab或至少重链或轻链Fab以及任选地重链Fc区的核酸序列。在用于表达完整或基本上完整的mAb的其他实施方案中，rAAV基因组包含有包含以下组分的载体：(1)位于表达盒侧翼的AAV反向末端重复序列；(2)调节控制元件，诸如a)启动子/增强子，b)poly A信号，和c)任选地内含子；以及(3)编码抗VEGF(例如赛伐珠单抗(sevacizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)和溴珠单抗(brolucizumab))、抗EpoR(例如LKA-651)、抗ALK1(例如阿斯万卡单抗(ascrinvacumab))、抗C5(例如特斯多鲁单抗(tesidolumab)和依库丽单抗(eculizumab))、抗CD105(例如卡罗妥昔单抗(carotuximab))、抗CC1Q(例如ANX-007)、抗TNFα(例如阿达木单抗(adalimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)和戈利木单抗(golimumab))、抗RGMa(例如伊菜单抗(elezanumab))、抗TTR(例如NI-301和PRX-004)、抗CTGF(例如帕姆雷单抗(pamrevlumab))、抗IL6R(例如沙曲利珠单抗(satralizumab)和沙利姆单抗(sarilumab))、抗IL4R(例如杜匹鲁单抗(dupilumab))、抗IL17A(例如依克珠单抗(ixekizumab)和苏金单抗(secukinumab))、抗IL-5(例如美泊利单抗(mepolizumab))、抗IL12/IL23(例如乌司奴单抗(ustekinumab))、抗CD19(例如尼比珠单抗(inebilizumab))、抗ITGF7 mAb(例如依托珠单抗(etrolizumab))、抗SOST mAb(例如罗莫珠单抗(romosozumab))、抗pKal mAb(例如拉那利尤单抗(lanadelumab))、抗ITGA4(例如那他珠单抗(natalizumab))、抗ITGA4B7(例如维多珠单抗(vedolizumab))、抗BLyS(例如贝利木单抗(belimumab))、抗PD-1(例如纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab))、抗RANKL(例如地诺单抗(densomab))、抗PCSK9(例如阿罗洛单抗(alirocumab)和依洛尤单抗(evolocumab))、抗ANGPTL3(例如依维苏单抗(evinacumab)*)、抗OxPL(例如E06)、抗fD(例如兰帕珠单抗(lampalizumab))或抗MMP9(例如安达昔单抗(andecaliximab))的重链Fab；任选地，具有与治疗性抗体的天然形式相同的同种型的Fc多肽，诸如IgG同种型氨基酸序列IgG1、IgG2或IgG4或其修饰的Fc；以及抗VEGF(例如赛伐珠单抗、兰尼单抗、贝伐珠单抗和溴珠单抗)、抗EpoR(例如LKA-651)、抗ALK1(例如阿斯万卡单抗)、抗C5(例如特斯多鲁单抗和依库丽单抗)、抗CD105或抗ENG(例如卡罗妥昔单抗)、抗CC1Q(例如ANX-007)、抗TNFα(例如阿达木单抗、英夫利昔单抗和戈利木单抗)、抗RGMa(例如伊菜单抗)、抗TTR(例如NI-301和PRX-004)、抗CTGF(例如帕姆雷单抗)、抗IL6R(例如沙曲利珠单抗和沙利姆单抗)、抗IL4R(例如杜匹鲁单抗)、抗IL17A(例如依克珠单抗和苏金单抗)、抗IL-5(例如美泊利单抗)、抗IL12/IL23(例如乌司奴单抗)、抗CD19(例如尼比珠单抗)、抗ITGF7mAb(例如依托珠单抗)、抗SOST mAb(例如罗莫珠单抗)、抗pKal mAb(例如拉那利尤单抗)、抗ITGA4(例如那他珠单抗)、抗ITGA4B7(例如维多珠单抗)、抗BLyS(例如贝利木单抗)、抗PD-1(例如纳武单抗和派姆单抗)、抗RANKL(例如地诺单抗)、抗PCSK9(例如阿罗洛单抗和依洛尤单抗)、抗ANGPTL3(例如依维苏单抗)、抗OxPL(例如E06)、抗fD(例如兰帕珠单抗)或抗MMP9(例如安达昔单抗)的轻链的核酸序列；其中所述重链(Fab和任选地Fc区)和所述轻链由自裂解的弗林蛋白酶(furin)(F)/F2A或柔性接头分离，确保表达等量的所述重链多肽和所述轻链多肽。
表1A
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表1B
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表1C
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在一些实施方案中，rAAV颗粒是编码抗VEGF Fab的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，rAAV颗粒是编码抗VEGF Fab的基于rAAV8的病毒载体。在更具体的实施方案中，rAAV颗粒是编码兰尼单抗的基于rAAV8的病毒载体。在一些实施方案中，rAAV颗粒是编码艾杜糖苷酶(IDUA)的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，rAAV颗粒是编码IDUA的基于rAAV9的病毒载体。在一些实施方案中，rAAV颗粒是编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，rAAV颗粒是编码IDS的基于rAAV9的病毒载体。在一些实施方案中，rAAV颗粒是编码低密度脂蛋白受体(LDLR)的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，rAAV颗粒是编码LDLR的基于rAAV8的病毒载体。在一些实施方案中，rAAV颗粒是编码三肽基肽酶1(TPP1)蛋白的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，rAAV颗粒是编码TPP1的基于rAAV9的病毒载体。在一些实施方案中，rAAV颗粒是编码VEGF受体1(sFlt-1)的非膜相关剪接变体的rAAV病毒载体。在一些实施方案中，rAAA颗粒是编码γ-肌聚糖、Rab护卫蛋白1(REP1/CHM)、类维生素A异构水解酶(RPE65)、环状核苷酸门控通道α3(CNGA3)、环状核苷酸门控通道β3(CNGB3)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、溶酶体相关膜蛋白2同工型B(LAMP2B)、因子VIII、因子IX、色素性视网膜炎GTP酶调节剂(RPGR)、视网膜劈裂蛋白(RS1)、肌浆网钙ATP酶(SERCA2a)、阿柏西普、巴登氏病蛋白(CLN3)、跨膜ER蛋白(CLN6)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、水通道蛋白1(AQP1)、抗肌萎缩蛋白、微型抗肌萎缩蛋白、肌微管素1(MTM1)、卵泡抑素(FST)、葡萄糖6磷酸酶(G6P酶)、载脂蛋白A2(APOA2)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-半乳糖苷酶(GLA)、β-半乳糖苷酶(GLB1)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、磷酸二酯酶6B(PDE6B)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶9OTC)、运动神经元生存蛋白(SMN1)、运动神经元生存蛋白(SMN2)、神经秩蛋白(NRTN)、神经营养蛋白3(NT-3/NTF3)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、神经生长因子(NGF)、线粒体编码的NADH：泛醌氧化还原酶核心亚基4(MT-ND4)、保护性蛋白组织蛋白酶A(PPCA)、戴斯弗林蛋白、MER原癌基因、酪氨酸激酶(MERTK)、囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR)或肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白(IgG1)Fc融合蛋白的rAAV病毒载体。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含假型AAV衣壳。在一些实施方案中，所述假型AAV衣壳是rAAV2/8或rAAV2/9假型AAV衣壳。用于生产和使用假型rAAV颗粒的方法是本领域已知的(参见例如Duan等人，J.Virol.，75：7662-7671(2001)；Halbert等人，J.Virol.，74：1524-1532(2000)；Zolotukhin等人，Methods 28：158-167(2002)；以及Auricchio等人，Hum.Molec.Genet.10：3075-3081，(2001)。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳含有两种或更多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白嵌合体。在一些实施方案中，所述衣壳蛋白是来自选自AAV1、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16的AAV血清型的2种或更多种AAV衣壳蛋白的嵌合体。
在某些实施方案中，可使用单链AAV(ssAAV)。在某些实施方案中，可使用自补载体，例如scAAV(参见例如Wu，2007，Human Gene Therapy，18(2)：171-82，McCarty等人，2001，Gene Therapy，第8卷，第16号，第1248-1254页；以及美国专利号6,596,535；7,125,717和7,456,683，所述文献中的每一个以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自AAV8或AAV9的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV8的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有AAV9的AAV衣壳血清型。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含作为AAV8或AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV8衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV8衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含作为AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV9衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV9衣壳蛋白。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含镶嵌衣壳。镶嵌AAV颗粒由来自不同AAV的血清型的病毒衣壳蛋白的混合物组成。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3R、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的血清型的衣壳蛋白的镶嵌衣壳。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVhu.37、AAVrh.20和AAVrh.74的血清型的衣壳蛋白的镶嵌衣壳。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含假型rAAV颗粒。在一些实施方案中，假型rAAV颗粒包含(a)包含AAV ITR的核酸载体和(b)由衍生自AAVx(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC 1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16)的衣壳蛋白组成的衣壳。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含假型rAAV颗粒，所述颗粒由选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh.8和AAVrh.10、AAVhu.37、AAVrh.20以及AAVrh.74的AAV血清型的衣壳蛋白组成。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含含有AAV8衣壳蛋白的假型rAAV颗粒。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含由AAV9衣壳蛋白组成的假型rAAV颗粒。在一些实施方案中，假型rAAV8或rAAV9颗粒是rAAV2/8或rAAV2/9假型颗粒。用于生产和使用假型rAAV颗粒的方法是本领域已知的(参见例如Duan等人，J.Virol.，75：7662-7671(2001)；Halbert等人，J.Virol.，74：1524-1532(2000)；Zolotukhin等人，Methods 28：158-167(2002)；以及Auricchio等人，Hum.Molec.Genet.10：3075-3081，(2001)。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳含有两种或更多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白嵌合体。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV8衣壳蛋白和来自AAV血清型的一种或多种AAV衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体，所述AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV8衣壳蛋白和来自AAV血清型的一种或多种AAV衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体，所述AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、rAAVrh10、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVhu.37、AAVrh.20和AAVrh.74。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV9衣壳蛋白和一种或多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体，所述AAV衣壳血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV9衣壳蛋白和一种或多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体，所述AAV衣壳血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVhu.37、AAVrh.20和AAVrh.74。
用于分离rAAV颗粒的方法
在一些实施方案中，本公开提供了用于生产包含分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的组合物的方法，所述方法包括从包含杂质的进料(例如，rAAV生产培养物)中分离rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的用于生产包含分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的制剂的方法包括(a)从包含杂质的进料(例如，rAAV生产培养物)中分离rAAV颗粒，以及(b)配制分离的rAAV颗粒以生产制剂。
在一些实施方案中，本公开还提供了用于生产药物单位剂量的包含分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的制剂的方法，所述方法包括从包含杂质的进料(例如，rAAV生产培养物)中分离rAAV颗粒，以及配制分离的rAAV颗粒。
可使用本领域已知的方法将分离的rAAV颗粒分离。在一些实施方案中，分离rAAV颗粒的方法包括下游加工，例如像收获细胞培养物、澄清收获的细胞培养物(例如通过离心或深度过滤)、切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、无菌过滤或其任何组合。在一些实施方案中，下游加工包括以下中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种：收获细胞培养物、澄清收获的细胞培养物(例如通过离心或深度过滤)、切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱和无菌过滤。在一些实施方案中，下游加工包括收获细胞培养物、澄清收获的细胞培养物(例如通过深度过滤)、无菌过滤、切向流过滤、亲和色谱和阴离子交换色谱。在一些实施方案中，下游加工包括澄清收获的细胞培养物、无菌过滤、切向流过滤、亲和色谱和阴离子交换色谱。在一些实施方案中，下游加工包括通过深度过滤来澄清收获的细胞培养物、无菌过滤、切向流过滤、亲和色谱和阴离子交换色谱。在一些实施方案中，澄清收获的细胞培养物包括无菌过滤。在一些实施方案中，下游加工不包括离心。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV8血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV9血清型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，一种分离根据本文公开的方法生产的rAAV颗粒的方法包括收获细胞培养物、澄清收获的细胞培养物(例如通过深度过滤)、第一无菌过滤、第一切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、第二切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，一种分离本文公开的rAAV颗粒的方法包括收获细胞培养物、澄清收获的细胞培养物(例如通过深度过滤)、第一无菌过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，一种分离根据本文公开的方法生产的rAAV颗粒的方法包括澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、第一切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、第二切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，一种分离本文公开的rAAV颗粒的方法包括澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，一种分离根据本文公开的方法生产的rAAV颗粒的方法包括通过深度过滤来澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、第一切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、第二切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，一种分离本文公开的rAAV颗粒的方法包括通过深度过滤来澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，所述方法不包括离心。在一些实施方案中，澄清收获的细胞培养物包括无菌过滤。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV8血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV9血清型的衣壳蛋白。
用于生产rAAV颗粒的许多方法是本领域已知的，包括转染、稳定的细胞系生产以及包括腺病毒-AAV杂合体、疱疹病毒-AAV杂合体和杆状病毒-AAV杂合体的感染性杂合病毒生产***。用于生产rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养物都需要：(1)合适的宿主细胞，包括例如人衍生细胞系，诸如HeLa、A549或HEK293细胞及其衍生物(HEK293T细胞、HEK293F细胞)；哺乳动物细胞系，诸如Vero或昆虫衍生细胞系诸如SF-9(在杆状病毒生产***的情况下)；(2)合适的辅助病毒功能，其由野生型或突变型腺病毒(诸如温度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；(3)AAV rep和cap基因以及基因产物；(4)由AAV ITR序列侧接的转基因(诸如治疗性转基因)；以及(5)支撑rAAV生产的合适的培养基和培养基组分。本领域已知的合适的培养基可用于生产rAAV载体。这些培养基包括但不限于由Hyclone Laboratories和JRH生产的培养基，包括如美国专利号6，723，551中所述的改良伊格尔培养基、杜尔贝科改良伊格尔培养基和Sf-900II SFM培养基，所述专利以引用的方式整体并入本文。
rAAV生产培养物可常规地在适合于所利用的特定宿主细胞的各种条件下(在宽的温度范围内、变化的时间长度等)生长。如本领域中已知的，rAAV生产培养物包括可在合适的粘附依赖性容器，例如像滚瓶、中空纤维过滤器、微载剂和填充床或流化床生物反应器中培养的粘附依赖性培养物。rAAV载体生产培养物还可包括悬浮适应性宿主细胞，诸如HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、BSC细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞或SF-9细胞，它们可以多种方式进行培养，包括例如旋转瓶、搅拌釜生物反应器和一次性***，诸如波浪袋***。在一些实施方案中，所述细胞是HEK293细胞。在一些实施方案中，所述细胞是适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。用于生产rAAV颗粒的许多悬浮培养物是本领域已知的，包括例如在美国专利号6,995,006、9,783,826和在美国专利申请公开号20120122155中公开的培养物，所述专利中的每一个以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，所述rAAV生产培养物包括高密度细胞培养物。在一些实施方案中，所述培养物的总细胞密度为约1x10E+06个细胞/ml与约30x10E+06个细胞/ml之间。在一些实施方案中，超过约50％的细胞是活细胞。在一些实施方案中，细胞是HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞或SF-9细胞。在其他实施方案中，细胞是HEK293细胞。在其他实施方案中，所述细胞是适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。
在所提供方法的另外的实施方案中，所述rAAV生产培养物包含有包含rAAV颗粒的悬浮培养物。用于生产rAAV颗粒的许多悬浮培养物是本领域已知的，包括例如在美国专利号6,995,006、9,783,826和在美国专利申请公开号20120122155中公开的培养物，所述专利中的每一个以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，所述悬浮培养物包括哺乳动物细胞的培养物或昆虫细胞的培养物。在一些实施方案中，所述悬浮培养物包括HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、BSC细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞或SF-9细胞的培养物。在一些实施方案中，所述悬浮培养物包括HEK293细胞的培养物。
在一些实施方案中，用于生产rAAV颗粒的方法涵盖提供包含能够生产rAAV的细胞的细胞培养物；向细胞培养物中添加组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂至约0.1mM与约20mM之间的最终浓度；以及将细胞培养物保持在允许生产rAAV颗粒的条件下。在一些实施方案中，HDAC抑制剂包含短链脂肪酸或其盐。在一些实施方案中，HDAC抑制剂包含丁酸盐(例如丁酸钠)、丙戊酸盐(例如丙戊酸钠)、丙酸盐(例如丙酸钠)或其组合。
在一些实施方案中，rAAV颗粒如WO 2020/033842中所公开生产，所述文献以引用的方式整体并入本文。
可通过收获包含宿主细胞的生产培养物或从生产培养物中收获废培养基(spentmedia)来从rAAV生产培养物中收获重组AAV颗粒，前提是要在本领域已知的条件下培养细胞以使rAAV颗粒从完整的宿主细胞释放到培养基中。还可通过裂解生产培养物的宿主细胞来从rAAV生产培养物中收获重组AAV颗粒。裂解细胞的合适方法也是本领域已知的，并且包括例如多次冷冻/解冻循环、超声处理、微流化和使用化学物质诸如洗涤剂和/或蛋白酶处理。
在收获时，rAAV生产培养物可含有以下中的一种或多种：(1)宿主细胞蛋白；(2)宿主细胞DNA；(3)质粒DNA；(4)辅助病毒；(5)辅助病毒蛋白；(6)辅助病毒DNA；和(7)培养基组分，包括例如血清蛋白、氨基酸、转铁蛋白和其他低分子量蛋白。rAAV生产培养物还可含有产物相关的杂质，例如无活性载体形式、空的病毒衣壳、聚集的病毒颗粒或衣壳、错误折叠的病毒衣壳、降解的病毒颗粒。
在一些实施方案中，澄清rAAV生产培养物收获物以去除宿主细胞碎片。在一些实施方案中，所述生产培养物收获物通过经由一系列深度过滤器的过滤来澄清。还可通过本领域已知的多种其他标准技术来实现澄清，诸如离心或通过本领域已知的0.2mm或更大孔径的任何乙酸纤维素过滤器的过滤。在一些实施方案中，澄清收获的细胞培养物包括无菌过滤。在一些实施方案中，所述生产培养物收获物通过离心来澄清。在一些实施方案中，澄清生产培养物收获物不包括离心。
在一些实施方案中，使用过滤澄清收获的细胞培养物。在一些实施方案中，澄清收获的细胞培养物包括深度过滤。在一些实施方案中，澄清收获的细胞培养物还包括深度过滤和无菌过滤。在一些实施方案中，使用包括一种或多种不同过滤介质的过滤器系列澄清收获的细胞培养物。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括深度过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括一种或多种深度过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括两种深度过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括无菌过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括2种深度过滤介质和无菌过滤介质。在一些实施方案中，深度过滤器介质是多孔深度过滤器。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括20MS、/>C0HC和无菌级过滤器介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括20MS、/>C0HC和/>2XLG 0.2μm。在一些实施方案中，在使收获的细胞培养物与深度过滤器接触之前对其进行预处理。在一些实施方案中，所述预处理包括将盐添加到收获的细胞培养物中。在一些实施方案中，所述预处理包括将化学絮凝剂添加到收获的细胞培养物中。在一些实施方案中，在使收获的细胞培养物与深度过滤器接触之前不对其进行预处理。
在一些实施方案中，通过公开于WO 2019/212921中的过滤来澄清生产培养物收获物，所述文献以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，使用核酸酶(例如)或核酸内切酶(例如来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的核酸内切酶)处理rAAV生产培养物收获物，以消化生产培养物中存在的高分子量DNA。核酸酶或核酸内切酶消化可常规地在本领域已知的标准条件下进行。例如，核酸酶消化在最终浓度为1-2.5个单位/ml/>温度在环境温度至37℃范围内，时间段为30分钟至若干个小时下进行。
无菌过滤涵盖使用无菌级过滤器介质的过滤。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是0.2或0.22μm的孔过滤器。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质包括聚醚砜(PES)。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质包括聚偏氟乙烯(PVDF)。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质具有亲水性异质双层设计。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质具有0.8μm的预过滤器和0.2μm的最终滤膜的亲水性异质双层设计。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质具有1.2μm的预过滤器和0.2μm的最终滤膜的亲水性异质双层设计。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是0.2或0.22μm的孔过滤器。在其他实施方案中，所述无菌级过滤器介质是0.2μm的孔过滤器。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是2XLG 0.2μm、DuraporeTM PVDF膜0.45μm或/>PES1.2μm+0.2μm标称孔径组合。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是/>2XLG 0.2μm。
在一些实施方案中，在将澄清的进料施加到色谱介质例如亲和色谱介质之前，将其经由切向流过滤(“TFF”)进行浓缩。Paul等人，Human Gene Therapy 4：609-615(1993)已描述了使用TFF超滤的大规模病毒浓缩。澄清进料的TFF浓缩使得经受色谱法的澄清进料的体积在技术上可以控制，并且可使柱得以更合理地设定大小，而无需漫长的再循环时间。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩至少两倍与至少十倍之间。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩至少十倍与至少二十倍之间。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩至少二十倍与至少五十倍之间。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩约二十倍。本领域普通技术人员还将认识到，TFF还可用于经由渗滤从所述澄清进料中去除小分子杂质(例如包含培养基组分、血清白蛋白或其他血清蛋白的细胞培养物污染物)。在一些实施方案中，对澄清进料进行渗滤以去除小分子杂质。在一些实施方案中，所述渗滤包括使用约3倍与约10倍之间的渗滤体积的缓冲液。在一些实施方案中，所述渗滤包括使用约5倍渗滤体积的缓冲液。本领域普通技术人员还将认识到，TFF还可用于纯化过程中的任何步骤，其中期望在进行纯化过程的下一步骤之前交换缓冲液。在一些实施方案中，本文公开的用于从澄清进料中分离rAAV的方法包括使用TFF以交换缓冲液。
亲和色谱可用于从组合物中分离rAAV颗粒。在一些实施方案中，亲和色谱用于从澄清进料中分离rAAV颗粒。在一些实施方案中，亲和色谱用于从已经过切向流过滤的澄清进料中分离rAAV颗粒。合适的亲和色谱介质是本领域已知的，并且包括但不限于AVBSepharoseTM、POROSTM CaptureSelectTM AAVX亲和树脂、POROSTM CaptureSelectTM AAV9亲和树脂和POROSTM CaptureSelectTM AAV8亲和树脂。在一些实施方案中，所述亲和色谱介质是POROSTM CaptureSelectTM AAV9亲和树脂。在一些实施方案中，所述亲和色谱介质是POROSTM CaptureSelectTM AAV8亲和树脂。在一些实施方案中，所述亲和色谱介质是POROSTMCaptureSelectTM AAVX亲和树脂。
阴离子交换色谱可用于从组合物中分离rAAV颗粒。在一些实施方案中，在亲和色谱后使用阴离子交换色谱作为最终浓缩和抛光步骤。合适的阴离子交换色谱介质是本领域已知的，并且包括但不限于UNOsphereTM Q(Biorad，Hercules，Calif.)和N带电荷的氨基或亚氨基树脂，例如像POROSTM 50PI或任何DEAE、TMAE、叔胺或季胺或本领域已知的PEI基树脂(美国专利号6,989,264；Brument等人，Mol.Therapy 6(5)：678-686(2002)；Gao等人，Hum.Gene Therapy11：2079-2091(2000))。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱介质包含季胺。在一些实施方案中，所述阴离子交换介质是整体式阴离子交换色谱树脂。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质包括甲基丙烯酸缩水甘油酯-二甲基丙烯酸乙二醇酯或苯乙烯-二乙烯基苯聚合物。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质选自由CIMmultusTM QA-1高级复合柱(季胺)、CIMmultusTM DEAE-1高级复合柱(二乙氨基)、QA盘(季胺)、/>DEAE知/>EDA盘(乙烯二氨基)组成的组。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质是CIMmultusTM QA-1高级复合柱(季胺)。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质是/>QA盘(季胺)。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱介质是CIM QA(BIA Separations，Slovenia)。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱介质是BIA/>QA-80(柱体积为80mL)。本领域普通技术人员可理解的是，可确定具有合适离子强度的洗涤缓冲液，使得rAAV保持与树脂的结合，同时杂质(包括但不限于可能由上游纯化步骤引入的杂质)被除去。
在一些实施方案中，阴离子交换色谱是根据WO 2019/241535中公开的方法进行的，所述文献以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，一种分离rAAV颗粒的方法包括确定包含分离的rAAV颗粒的组合物中的载体基因组滴度、衣壳滴度和/或完整衣壳与空衣壳的比率。在一些实施方案中，载体基因组滴度由定量PCR(qPCR)或数字PCR(dPCR)或液滴数字PCR(ddPCR)确定。在一些实施方案中，衣壳滴度由血清型特异性ELISA确定。在一些实施方案中，完整衣壳与空衣壳的比率通过分析型超速离心法(AUC)或透射电子显微镜(TEM)确定。
在一些实施方案中，载体基因组滴度、衣壳滴度和/或完整衣壳与空衣壳的比率通过分光光度法，例如通过测量组合物在260nm处的吸光度；并测量组合物在280nm处的吸光度来确定。在一些实施方案中，rAAV颗粒在测量组合物的吸光度之前未变性。在一些实施方案中，rAAV颗粒在测量组合物的吸光度之前变性。在一些实施方案中，使用分光光度计测定组合物在260nm和280nm处的吸光度。在一些实施方案中，使用HPLC测定组合物在260nm和280nm处的吸光度。在一些实施方案中，吸光度是峰值吸光度。用于测量组合物在260nm和280nm处的吸光度的几种方法是本领域已知的。WO 2019/212922中公开了确定包含分离的重组rAAV颗粒的组合物的载体基因组滴度和衣壳滴度的方法，所述文献以引用的方式整体并入本文。
在另外的实施方案中，本公开提供了包含根据本文公开的方法生产的分离的rAAV颗粒的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是包含药学上可接受的载剂的药物组合物。
如本文所用，术语“药学上可接受的”意指适用于一种或多种施用途径、体内递送或接触的生物学上可接受的制剂，其为气态、液态或固态或其混合物。“药学上可接受的”组合物是在生物学上或其他方面不是不期望的材料，例如可向受试者施用所述材料而不会引起实质的不期望的生物学效应。因此，这种药物组合物可用于例如向受试者施用根据所公开的方法分离的rAAV。此类组合物包括与药物施用或体内接触或递送相容的溶剂(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳剂(例如水包油或油包水)、悬浮液、糖浆、酏剂、分散和悬浮介质、包衣、等渗剂和吸收促进剂或延迟剂。水性和非水性溶剂、溶液和悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。此类药学上可接受的载剂包括片剂(包衣的或未包衣的)、胶囊(硬或软的)、微珠、粉末、颗粒和晶体。也可将补充活性化合物(例如防腐剂、抗菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)掺入组合物中。如本文所列出或本领域技术人员已知的，可将药物组合物配制为与特定的施用或递送途径相容。因此，药物组合物包括适用于通过各种途径施用的载剂、稀释剂或赋形剂。适用于本发明的rAAV颗粒以及方法和用途的药物组合物和递送***是本领域已知的(参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(2003)第20版，MackPublishing Co.，Easton，Pa.；Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)第18版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.；The Merck Index(1996)第12版，Merck PublishingGroup，Whitehouse，N.J.；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms(1993)，Technonic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，Pa.；Ansel和Stoklosa，PharmaceuticalCalculations(2001)第11版，Lippincott Williams&Wilkins，Baltimore，Md.；以及Poznansky等人，Drug Delivery Systems(1980)，R.L.Juliano编，Oxford，N.Y.，第253-315页)。
在一些实施方案中，所述组合物是药物单位剂量。“单位剂量”是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的实体上离散单位；每个单位含有任选地与药物载剂(赋形剂、稀释剂、媒介物或填充剂)缔合的预定数量，该数量经过计算以便当以一个或多个剂量施用时，可产生所需的作用(例如预防性或治疗性作用)。单位剂型可在例如安瓿和小瓶内，所述单位剂型可包括液体组合物或处于冷冻干燥或冻干状态的组合物；例如，可在体内施用或递送之前添加无菌液体载剂。各别单位剂型可包括在多剂量药盒或容器中。出于易于施用和剂量均一性，重组载体(例如AAV)序列、质粒、载体基因组和重组病毒颗粒及其药物组合物可以单个单位剂型或多个单位剂型进行包装。在一些实施方案中，所述组合物包含rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含来自选自AAV1、AAV2，AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC 1、AAV.HSC2，AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV衣壳血清型是AAV8。在一些实施方案中，AAV衣壳血清型是AAV9。
生产重组多肽的方法
一方面，本公开提供了一种生产重组多肽的方法，所述方法包括(a)提供包含适用于生产重组多肽的细胞的细胞培养物，其中培养物包含约0.1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖；(b)通过向a)的培养物添加包含一种或多种编码多肽的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染细胞；以及(c)将包含转染细胞的细胞培养物保持在允许生产重组多肽的条件下。
在一些实施方案中，a)的培养物包含约0.5mg/L与约10mg/L之间、约0.5mg/L与约5mg/L之间、约0.5mg/L与约3mg/L之间、约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约1mg/L与约4mg/L之间或约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约0.5mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约1mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，a)的培养物包含约0.5mg/L、约1mg/L、约1.5mg/L、约2mg/L、约2.5mg/L、约3mg/L、约4mg/L或约5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约1mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约1.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约2mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约2.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约3mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约3.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，a)的培养物包含约4mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，a)的培养物包含约2mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，本公开提供了一种生产重组多肽的方法，所述方法包括(a)在细胞培养物中培养适用于生产重组多肽的细胞，其中培养物包含约1mg/L与约20mg/L之间的起始硫酸葡聚糖浓度和约0.1mg/L与约10mg/L之间的最终硫酸葡聚糖浓度；(b)通过向(a)的培养物添加包含一种或多种编码多肽的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染细胞；以及(c)将包含转染细胞的细胞培养物保持在允许生产重组多肽的条件下。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约2mg/L与约10mg/L之间、约3mg/L与约10mg/L之间或约3mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约3mg/L与约6mg/L之间的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L、约3mg/L、约4mg/L、约5mg/L、约6mg/L、约7mg/L、约8mg/L、约9mg/L或约10mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约3mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约6mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约7mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约8mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L与约10mg/L之间、约0.5mg/L与约5mg/L之间、约0.5mg/L与约3mg/L之间、约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约1mg/L与约4mg/L之间或约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L、约1mg/L、约1.5mg/L、约2mg/L、约2.5mg/L、约3mg/L、约4mg/L或约5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约1.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约2.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约3mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约3.5mg/L的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，最终硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约2mg/L与约10mg/L之间、约3mg/L与约10mg/L之间或约3mg/L与约5mg/L之间的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L与约10mg/L之间、约0.5mg/L与约5mg/L之间、约0.5mg/L与约3mg/L之间、约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约1mg/L与约4mg/L之间或约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约3mg/L与约6mg/L之间的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L、约3mg/L、约4mg/L、约5mg/L、约6mg/L、约7mg/L、约8mg/L、约9mg/L或约10mg/L的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L、约1mg/L、约1.5mg/L、约2mg/L、约2.5mg/L、约3mg/L、约4mg/L或约5mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，起始硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L的硫酸葡聚糖，并且最终硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L的硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸包含转基因。在一些实施方案中，转基因包含可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的调节元件。
在一些实施方案中，多肽包含抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体、酶、融合蛋白或Fc融合蛋白。在一些实施方案中，多肽包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，多肽包含融合蛋白，例如Fc融合蛋白。在一些实施方案中，多肽包含酶。
如本文所用的术语“抗体”涵盖整个抗体和抗体片段，包括抗体的任何功能结构域，诸如抗原结合片段或其单链、效应子结构域、补救受体结合表位或其部分。典型的抗体包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。在一些实施方案中，重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。在一些实施方案中，轻链恒定区包含一个结构域C1。VH区和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FW)。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按照以下顺序布置的三个CDR和四个FW构成：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(C1q)。本公开的抗体的非限制类型包括典型的抗体、scFv及其组合。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指抗体的任何功能结构域，诸如抗原结合片段或其单链、效应子结构域或其部分。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv片段，线性抗体、单链抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用的“抗体片段”包含抗原结合位点或表位结合位点。
如本文所用，术语＂Fc区”或简单地“Fc”应理解为意指免疫球蛋白链恒定区的羧基末端部分，优选地免疫球蛋白重链恒定区或其部分的羧基末端部分。例如，免疫球蛋白Fc区可包含(1)CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，(2)CH1结构域和CH2结构域，(3)CH1结构域和CH3结构域，(4)CH2结构域和CH3结构域，或(5)两个或更多个结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。在一些实施方案中，Fc区至少包含免疫球蛋白铰链区、CH2结构域和CH3结构域，并且优选地缺少CH1结构域。在一些实施方案中，重链恒定区来源的免疫球蛋白的类别是IgG(Igγ)(γ亚类1、2、3或4)。可使用其他类别的免疫球蛋白IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)和IgM(Igμ)。认为从某些免疫球蛋白类别和亚类选择特定免疫球蛋白重链恒定区序列以达到特定结果在本领域的技术水平内。在一些实施方案中，编码免疫球蛋白Fc区的DNA构建体的部分优选包含铰链结构域的至少一部分，并且优选地Fcγ的CH3结构域或者IgA、IgD、IgE或IgM中的任一种中的同源结构域的至少一部分。此外，预期免疫球蛋白重链恒定区内的氨基酸的取代或缺失可用于实施本文公开的方法和组合物。一个实例是在上面的CH2区中引入氨基酸取代以产生对Fc受体具有降低的亲和力的Fc变体(Cole，J.Immunol.159：3613(1997))。
各种适用于在特定宿主细胞中生产重组多肽的重组表达***是本领域技术人员已知的。应理解，任何重组表达***均可按照本文公开的方法用于生产重组多肽。
本领域已知的用于转染细胞的任何合适的转染试剂均可根据本文公开的方法用于生产重组多肽。在一些实施方案中，转染试剂包含阳离子有机载剂。参见，例如，Gigante等人，Medchemcomm 10(10)：1692-1718(2019)；Damen等人Medchemcomm 9(9)：1404-1425(2018)，所述文献中的每一个以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含脂质，例如DOTMA、DOTAP、辅助脂质(Dope、胆固醇)及其组合。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含多价阳离子脂质，例如，DOSPA、DOGS及其混合物。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含双极性脂质或双头基两亲分子(bolaamphiphile)(bolas)。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含可生物还原和/或可二聚化的脂质。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含双子表面活性剂。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含LipofectinTM、TransfectamTM、LipofectamineTM、Lipofectamine 2000TM或LipofectaminPLUS2000TM。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含聚合物，例如聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、多糖(壳聚糖、葡聚糖、环糊精(CD))、聚[甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯](PDMAEMA)和树枝状聚合物(聚酰胺胺(PAMAM)、聚(丙烯亚胺)(PPI))。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含肽，例如富含碱性氨基酸的肽(CWL18)、细胞穿透肽(CPP)(富含Arg的肽(八精氨酸，TAT))、核定位信号(NLS)(SV40)和靶向(RGD)。在一些实施方案中，阳离子有机载剂包含与阳离子脂质体组合的聚合物(例如，PEI)。Paris等人Molecules 25(14)：3277(2020)，其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，转染试剂包含磷酸钙、高度分支有机化合物(树枝状聚合物)、阳离子聚合物(例如，DEAE葡聚糖或聚乙烯亚胺(PEI))、脂质转染。
在一些实施方案中，转染试剂包含聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、线性PEI、分支PEI、葡聚糖、环糊精(CD)、聚[甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯](PDMAEMA)、聚酰胺胺(PAMAM)、聚(丙烯亚胺)(PPI))或其混合物。在一些实施方案中，转染试剂包含聚乙烯亚胺(PEI.)、线性PEI、分支PEI或其混合物。在一些实施方案中，转染试剂包含聚乙烯亚胺(PEI)。在一些实施方案中，转染试剂包含线性PEI。在一些实施方案中，转染试剂包含分支PEI。在一些实施方案中，转染试剂包含具有约5与约25kDa之间的分子量的聚乙烯亚胺(PEI)。在一些实施方案中，转染试剂包含聚乙二醇化聚乙烯亚胺(PEI)。在一些实施方案中，转染试剂包含修饰的聚乙烯亚胺(PEI)，疏水性部分诸如胆固醇、胆碱、烷基和一些氨基酸附接到其上。
本领域已知的任何细胞培养***均可根据本文公开的方法用于生产重组多肽。在一些实施方案中，细胞培养物是悬浮细胞培养物。在一些实施方案中，细胞培养物是贴壁细胞培养物。在一些实施方案中，细胞培养物包含在搅拌的生物反应器中附着于微载剂或大载剂上生长的贴壁细胞。在一些实施方案中，细胞培养物是灌注培养物。在一些实施方案中，细胞培养物是交替切向流(ATF)支持的高密度灌注培养物。
在一些实施方案中，细胞包括哺乳动物细胞或昆虫细胞。在一些实施方案中，细胞包括哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞包括HEK293细胞、HEK衍生细胞、CHO细胞、CHO衍生细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞和/或PerC6细胞。在一些实施方案中，细胞包括HEK293细胞。
在一些实施方案中，细胞包括悬浮适应性细胞。在一些实施方案中，细胞包括悬浮适应性HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如，HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、BSC细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞或SF-9细胞。在一些实施方案中，细胞包括悬浮适应性HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如，HEK293T细胞、HEK293F细胞)、CHO细胞、CHO-K1细胞或CHO衍生细胞。在一些实施方案中，细胞包括悬浮适应性HEK293细胞。在一些实施方案中，细胞包括悬浮适应性CHO细胞。
在一些实施方案中，细胞培养物具有约50升与约20,000升之间的体积。在一些实施方案中，细胞培养物具有约50升与约5,000升之间的体积。在一些实施方案中，细胞培养物具有约50升与约2,000升之间的体积。在一些实施方案中，细胞培养物具有约50升与约1,000升之间的体积。在一些实施方案中，细胞培养物具有约50升与约500升之间的体积。
不受任何特定理论的束缚，本文公开的方法提高了转染效率，使得根据本文公开的方法转染的细胞比在不包含硫酸葡聚糖的细胞培养物中转染的对照细胞生产更多的重组多肽。在一些实施方案中，本文公开的方法比使用不包含硫酸葡聚糖的细胞培养物的对照方法多生产至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％的重组多肽。测量重组多肽产量的方法是本领域众所周知的。在一些实施方案中，使用Western印迹、ELIS测定或功能测定(例如测量重组表达的多肽的催化活性的测定)来测量重组多肽产量。
在一些实施方案中，本文公开的生产重组多肽的方法还包括分离所述多肽。用于分离重组表达的多肽的各种方法是本领域技术人员已知的。应当理解，用于分离重组表达的多肽的任何已知方法均可根据本文公开的方法使用。在一些实施方案中，分离重组表达的多肽的方法包括收获细胞培养物、澄清收获的细胞培养物(例如通过离心或深度过滤)、切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、无菌过滤或其任何组合。在一些实施方案中，下游加工包括以下中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种：收获细胞培养物、澄清收获的细胞培养物(例如通过离心或深度过滤)、切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱和无菌过滤。
实施例
实施例1-硫酸葡聚糖令人惊讶地增加了基于瞬时转染的***中的AAV生产。
本发明人惊讶地发现硫酸葡聚糖能够在基于瞬时转染的生产方法中增加AAV滴度。测试了交替切向流(ATF)支持的高密度灌注培养技术，以生产用于大规模基于瞬时转染的AAV生产培养的种子细胞。当使用来自高密度灌注反应器的悬浮适应性HEK细胞进行种子生产培养时，重组AAV生产减少了5倍。滴度下降的潜在原因是高密度灌注培养中生产的种子细胞的团聚增加，这可能导致播种密度和生长速率变化以及转染试剂浓度不准确。虽然已知细胞培养添加剂(诸如硫酸葡聚糖)可减少团聚，但在生产用于瞬时转染的细胞时，它们的使用不被认为是可行的选择，因为已知这些剂会干扰瞬时转染。例如，Geng等人(2007)第55页得出结论，硫酸葡聚糖完全抑制PEI介导的转染。类似地，Biotech最近出版的″Guide for DNA Transfection in/>500and iCELLis 500+Bioreactors forLargeScale Gene Therapy Vector Manufacturing″在第9页教导了硫酸葡聚糖抑制PEI介导的转染。
尽管有硫酸葡聚糖抑制转染的教导，本发明人在基于瞬时转染的AAV生产***中测试了硫酸葡聚糖对AAV滴度的影响。重组AAV经由HEK293细胞的瞬时转染产生。简而言之，将HEK293细胞在250m1摇瓶中在包含0.3至10mg/L硫酸葡聚糖的培养基中扩增48小时。用聚乙烯亚胺(PEI)和编码腺病毒辅助功能、转基因和AAV Cap/Rep的3种质粒的混合物转染细胞。转染的培养物在转染后维持5天以允许AAV生产。使用基于PCR的方法测定培养物上清液中的AAV滴度。使用包含转基因1和转基因2的重组AAV8获得的滴度分别示于图1和2中。令人惊讶的是，浓度在0.652mg/L与2.5mg/L之间(图1)和1.7mg/L与3.6mg/L之间的硫酸葡聚糖的存在导致AAV滴度增加。考虑到现有技术的明确教导，即硫酸葡聚糖抑制瞬时转染(与10mg/L或更高的硫酸葡聚糖抑制AAV生产(图1)的发现一致)，这一发现是出乎意料的。当以0.313mg/L使用时，硫酸葡聚糖对AAV滴度没有显著影响(图1)。
实施例2-硫酸葡聚糖对实验室觌模2L反应器中AAV滴度的影响。
研究了硫酸葡聚糖对实验室规模反应器中基于转染的AAV生产的影响。包含转基因2的重组AAV8经由HEK293细胞的瞬时转染生产。简而言之，HEK293细胞在2L反应器中在包含不同浓度硫酸葡聚糖的培养基中扩增3天。用聚乙烯亚胺(PEI)和编码腺病毒辅助功能、转基因和AAV Cap/Rep的3种质粒的混合物转染细胞。转染的培养物在转染后维持4天以允许AAV生产。从培养物上清液或细胞裂解后的培养物中回收AAV颗粒。图3.每天测定活细胞密度和细胞活力。图5和图6.在第4天评估细胞形态(图4)。范围为2.5至4.2mg/L的硫酸葡聚糖浓度不会抑制2L反应器中的转染，并且有利于细胞形态，包括增加活力和活细胞密度。
实施例3-硫酸葡聚糖对实验室觌模5L反应器中AAV滴度的影响。
研究了硫酸葡聚糖对实验室规模反应器中基于转染的AAV生产的影响。包含转基因2的重组AAV8经由HEK293细胞的瞬时转染生产。简而言之，HEK293细胞在5L反应器中在包含4mg/l的硫酸葡聚糖的培养基中扩增三天。转染前，用新鲜培养基1∶1稀释培养物，以提供2mg/L的硫酸葡聚糖浓度。用聚乙烯亚胺(PEI)和编码腺病毒辅助功能、转基因和AAV Cap/Rep的3种质粒的混合物转染细胞。转染的培养物在转染后维持四天以允许AAV生产。从培养物上清液或细胞裂解后的培养物中回收AAV颗粒。加入硫酸葡聚糖后，AAV上清液或裂解滴度分别平均增加35％至40％。图7.
实施例4-硫酸葡聚糖对不同培养基中AAV滴度的影响。
研究了硫酸葡聚糖对不同市售培养基(图8中的M1、M2和M3)中基于转染的AAV生产的影响。包含转基因2的重组AAV8经由HEK293细胞的瞬时转染生产。简而言之，HEK293细胞在2L反应器中在包含4mg/L的硫酸葡聚糖的不同培养基中扩增3天。在转染前，用新鲜培养基1∶1稀释培养物，以提供2mg/L的硫酸葡聚糖浓度。用聚乙烯亚胺(PEI)和编码腺病毒辅助功能、转基因和AAVCap/Rep的3种质粒的混合物转染细胞。转染的培养物在转染后维持4天以允许AAV生产。从培养物上清液或细胞裂解后的培养物中回收AAV颗粒。图8.对于M1、M2和M3培养基，培养物中加入硫酸葡聚糖使从细胞裂解中回收的滴度分别增加了25％、130％和10％。
实施例5-硫酸葡聚糖对使用不同宿主细胞克隆的AAV滴度的影响。
研究了硫酸葡聚糖对使用不同HEK293宿主细胞克隆的基于转染的AAV生产的影响。包含转基因2的重组AAV8经由不同HEK293细胞克隆的瞬时转染生产。简而言之，HEK293细胞克隆在摇瓶中在包含4mg/L的硫酸葡聚糖的培养基中扩增3天。在转染前，用新鲜培养基1：1稀释培养物，以提供2mg/L的硫酸葡聚糖浓度。用聚乙烯亚胺(PEI)和编码腺病毒辅助功能、转基因和AAV Cap/Rep的3种质粒的混合物转染细胞。转染的培养物在转染后维持4天以允许AAV生产。从培养物上清液中回收AAV颗粒。图9.在所研究的所有5个HEK细胞克隆中，随着硫酸葡聚糖的加入，AAV8滴度增加。在五个不同的HEK细胞克隆中加入硫酸葡聚糖后，AAV8滴度平均增加了18％。
实施例6-硫酸葡聚糖对实验室规模5L反应器中AAV9滴度的影响。
研究了硫酸葡聚糖对实验室规模反应器中基于转染的AAV9生产的影响。包含转基因3的重组AAV9经由HEK293细胞的瞬时转染生产。简而言之，HEK293细胞在5L反应器中在包含浓度为4mg/L的硫酸葡聚糖的培养基中扩增三天。在转染前，用新鲜培养基1：1稀释培养物，以提供2mg/L的硫酸葡聚糖浓度。用聚乙烯亚胺(PEI)和编码腺病毒辅助功能、转基因和AAV Cap/Rep的3种质粒的混合物转染细胞。转染的培养物在转染后维持五天以允许AAV生产。图10.加入硫酸葡聚糖后，AAV9上清液滴度平均增加了30％。
实施例7-在转染前的种子细胞培养和生产培养过程中使用时，硫酸葡聚糖对AAV滴度的影响(转基因3)。
包含转基因3的重组AAV9经由HEK293细胞的瞬时转染在200L生产培养物中生产。使用种子培养扩增HEK细胞，所述种子培养包括在4mg/L硫酸葡聚糖存在下的高密度灌注培养步骤。200L生产培养物接种有HEK种子细胞，并且在转染之前，将生产培养物中的硫酸葡聚糖浓度调节至2mg/L。用聚乙烯亚胺(PEI)和编码腺病毒辅助功能、转基因和AAV Cap/Rep的3种质粒的混合物转染细胞。转染的培养物在转染后维持五天以允许AAV生产。从培养物上清液(图11中的黑色柱)或细胞裂解后的培养物(图11中的灰色柱)中回收AAV颗粒。对照生产培养物接种有在不存在硫酸葡聚糖的情况下扩增的HEK种子细胞。图11.当在种子细胞扩增和生产培养物转染过程中使用硫酸葡聚糖时，AAV9滴度增加了30％。
实施例8-在转染前的种子培养和生产培养过程中使用时，硫酸葡聚糖对AAV滴度的影响(转基因1)。
研究了种子培养中的硫酸葡聚糖对实验室规模反应器中基于转染的AAV生产的影响。包含转基因1的重组AAV8经由HEK293细胞的瞬时转染生产。简而言之，HEK293细胞在含有或不含硫酸葡聚糖的培养基中扩增五代(18天)。然后将细胞在含有4mg/L或不合(0)硫酸葡聚糖的培养基(种子培养)中在一式三份的2L反应器中扩增三天。在转染前，用新鲜培养基1∶1稀释培养物，以提供硫酸葡聚糖浓度分别为2mg/L或0的培养物。用聚乙烯亚胺(PEI)和编码腺病毒辅助功能、转基因和AAV Cap/Rep的3种质粒的混合物转染细胞。转染的培养物在转染后维持四天以允许AAV生产。从细胞裂解后的培养物中回收AAV颗粒。在种子培养和生产培养中加入硫酸葡聚糖后，AAV裂解滴度平均增加了10％至15％(统计显著性p＜0.05)。图12.
尽管所公开的方法已经结合当前被认为是最实际和优选的实施方案来描述，但是应当理解，本公开所涵盖的方法不限于所公开的实施方案，而是相反，旨在覆盖包括在所附权利要求书的精神和范围内的各种修改和等效安排。
所有出版物、专利、专利申请、互联网站点和登录号/数据库序列(包括本文引用的多核苷酸和多肽序列)出于所有目的在此以引用的方式整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请、互联网站点或登录号/数据库序列具体地且单独地被指示为以引用的方式并入。
Claims (50)
1.一种转染细胞的方法，所述方法包括：
a)提供包含所述细胞的细胞培养物，其中所述培养物包含约0.1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖；以及
b)通过向所述(a)的培养物添加包含一种或多种多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞。
2.一种生产重组多肽的方法，所述方法包括：
a)提供包含适用于生产所述重组多肽的细胞的细胞培养物，其中所述培养物包含约0.1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖；
b)通过向所述a)的培养物添加包含一种或多种编码所述多肽的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞；以及
c)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组多肽的条件下。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述多肽是抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体、酶、融合蛋白或Fc融合蛋白。
4.一种生产重组病毒颗粒的方法，所述方法包括：
a)提供包含适用于生产所述重组病毒颗粒的细胞的细胞培养物，其中所述培养物包含约0.1mg/L与约10mg/L之间的硫酸葡聚糖；
b)通过向所述a)的培养物添加包含一种或多种含有生产所述重组病毒颗粒所必需的基因的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞；以及
c)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组病毒颗粒的条件下。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述a)的培养物包含约0.5mg/L与约10mg/L之间、约0.5mg/L与约5mg/L之间、约0.5mg/L与约3mg/L之间、约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约1mg/L与约4mg/L之间或约1mg/L与约3mg/L之间的硫酸葡聚糖。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述a)的培养物包含约0.5mg/L、约1mg/L、约1.5mg/L、约2mg/L、约2.5mg/L、约3mg/L、约4mg/L或约5mg/L的硫酸葡聚糖。
7.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述a)的培养物包含约2mg/L的硫酸葡聚糖。
8.一种转染细胞的方法，所述方法包括：
a)在细胞培养物中培养所述细胞，其中所述培养物包含约1mg/L与约20mg/L之间的起始硫酸葡聚糖浓度和约0.1mg/L与约10mg/L之间的最终硫酸葡聚糖浓度；以及
b)通过向所述a)的培养物添加包含一种或多种多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞。
9.一种生产重组多肽的方法，所述方法包括：
a)在细胞培养物中培养适用于生产所述重组多肽的细胞，其中所述培养物包含约1mg/L与约20mg/L之间的起始硫酸葡聚糖浓度和约0.1mg/L与约10mg/L之间的最终硫酸葡聚糖浓度；
b)通过向所述a)的培养物添加包含一种或多种编码所述多肽的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞；以及
c)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组多肽的条件下。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述多肽是抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体、酶、融合蛋白或Fc融合蛋白。
11.一种生产重组病毒颗粒的方法，所述方法包括：
a)在细胞培养物中培养适用于生产所述重组病毒颗粒的细胞约1天与约5天之间，其中所述培养物包含约1mg/L与约20mg/L之间的起始硫酸葡聚糖浓度和约0.1mg/L与约10mg/L之间的最终硫酸葡聚糖浓度；
b)通过向所述a)的培养物添加包含一种或多种含有生产所述重组病毒颗粒所必需的基因的多核苷酸和转染试剂的组合物来转染所述细胞；以及
c)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组病毒颗粒的条件下。
12.如权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述起始硫酸葡聚糖浓度为约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约2mg/L与约10mg/L之间、约3mg/L与约10mg/L之间或约3mg/L与约5mg/L之间。
13.如权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述起始硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L、约3mg/L、约4mg/L、约5mg/L、约6mg/L、约7mg/L、约8mg/L、约9mg/L或约10mg/L。
14.如权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述起始硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L。
15.如权利要求8至14中任一项所述的方法，其中所述最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L与约10mg/L之间、约0.5mg/L与约5mg/L之间、约0.5mg/L与约5mg/L之间、约0.5mg/L与约3mg/L之间、约1mg/L与约10mg/L之间、约1mg/L与约5mg/L之间、约1mg/L与约4mg/L之间或约1mg/L与约3mg/L之间。
16.如权利要求8至14中任一项所述的方法，其中所述最终硫酸葡聚糖浓度为约0.5mg/L、约1mg/L、约1.5mg/L、约2mg/L、约2.5mg/L、约3mg/L、约4mg/L或约5mg/L。
17.如权利要求8至14中任一项所述的方法，其中所述最终硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L。
18.如权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述起始硫酸葡聚糖浓度为约4mg/L，并且所述最终硫酸葡聚糖浓度为约2mg/L。
19.如权利要求4至7和11至18中任一项所述的方法，其中所述重组病毒颗粒是重组腺相关病毒(rAAV)颗粒或重组慢病毒颗粒。
20.如权利要求4至7和11至18中任一项所述的方法，其中所述重组病毒颗粒是rAAV颗粒。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV8、AAV9、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1或AAV.hu37血清型的衣壳蛋白。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。
24.如权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含有包含转基因的基因组。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述转基因包含可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的调节元件。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述调节元件包括增强子、启动子和polyA区中的一种或多种。
27.如权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述调节元件和编码多肽的多核苷酸是异源的。
28.如权利要求24至27中任一项所述的方法，其中所述转基因编码抗VEGF Fab、艾杜糖苷酶(IDUA)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、三肽基肽酶1(TPP1)或VEGF受体1(sFlt-1)的非膜相关剪接变体。
29.如权利要求24至27中任一项所述的方法，其中所述转基因编码γ-肌聚糖、Rab护卫蛋白1(REP1/CHM)、类维生素A异构水解酶(RPE65)、环状核苷酸门控通道α3(CNGA3)、环状核苷酸门控通道β 3(CNGB3)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、溶酶体相关膜蛋白2同工型B(LAMP2B)、因子VIII、因子IX、色素性视网膜炎GTP酶调节剂(RPGR)、视网膜劈裂蛋白(RS1)、肌浆网钙ATP酶(SERCA2a)、阿柏西普、巴登氏病蛋白(CLN3)、跨膜ER蛋白(CLN6)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、水通道蛋白1(AQP1)、抗肌萎缩蛋白、微小抗肌萎缩蛋白、微型抗肌萎缩蛋白、肌微管素1(MTM1)、卵泡抑素(FST)、葡萄糖6磷酸酶(G6P酶)、载脂蛋白A2(APOA2)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-半乳糖苷酶(GLA)、β-半乳糖苷酶(GLB1)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、磷酸二酯酶6B(PDE6B)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶9OTC)、运动神经元生存蛋白(SMN1)、运动神经元生存蛋白(SMN2)、神经秩蛋白(NRTN)、神经营养蛋白3(NT-3/NTF3)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、神经生长因子(NGF)、线粒体编码的NADH：泛醌氧化还原酶核心亚基4(MT-ND4)、保护性蛋白组织蛋白酶A(PPCA)、戴斯弗林蛋白、MER原癌基因、酪氨酸激酶(MERTK)、囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR)或肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白(IgG1)Fc融合蛋白。
30.如权利要求20至29中任一项所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸编码
a)待包装的rAAV基因组，
b)包装所必需的腺病毒辅助功能，
c)足以用于包装的AAV rep蛋白，和
d)足以用于包装的AAV cap蛋白。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸包括编码所述rAAV基因组的多核苷酸、编码所述AAV rep蛋白和所述AAV cap蛋白的多核苷酸，以及编码所述腺病毒辅助功能的多核苷酸。
32.如权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述腺病毒辅助功能包括腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因中的至少一种。
33.如权利要求20至28中任一项所述的方法，其还包括回收所述rAAV颗粒。
34.如权利要求20至33中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物生产约5x10e+10GC/ml与约1x10e+12GC/ml之间的rAAV颗粒。
35.如权利要求20至33中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物生产的以GC/ml测量的rAAV颗粒为其中所述a)的培养物不包含硫酸葡聚糖的参考方法的至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或2倍。
36.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物是悬浮细胞培养物。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述细胞培养物包含悬浮适应性细胞。
38.如权利要求36或权利要求37所述的方法，其中所述细胞包括HEK293细胞、HEK衍生细胞、CHO细胞、CHO衍生细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞和/或PerC6细胞或其组合。
39.如权利要求36或权利要求37所述的方法，其中所述细胞包括HEK293细胞。
40.如权利要求36或权利要求37所述的方法，其中所述细胞包括CHO细胞或CHO-K1细胞。
41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述转染试剂包含脂质、聚合物、肽或其组合。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述转染试剂包含脂质，其中所述脂质包括DOTMA、DOTAP、DOSPA、DOGS或其组合。
43.如权利要求41所述的方法，其中所述转染试剂包含聚合物，其中所述聚合物包括聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、多糖、聚[甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯](PDMAEMA)、树枝状聚合物或其组合。
44.如权利要求41所述的方法，其中所述转染试剂包含聚乙烯亚胺(PEI)。
45.如权利要求1至44中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物具有约50升与约20,000升之间的体积。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述细胞培养物具有约50升与约5,000升之间的体积。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述细胞培养物具有约50升与约2,000升之间的体积。
48.如权利要求45所述的方法，其中所述细胞培养物具有约50升与约1,000升之间的体积。
49.如权利要求41所述的方法，其中所述细胞培养物具有约50升与约500升之间的体积。
50.一种组合物，其包含通过如权利要求20至49中任一项所述的方法生产的分离的rAAV颗粒。
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