CN116694765A - 用于检测子宫内膜癌的试剂盒及其应用 - Google Patents
用于检测子宫内膜癌的试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116694765A CN116694765A CN202310671281.2A CN202310671281A CN116694765A CN 116694765 A CN116694765 A CN 116694765A CN 202310671281 A CN202310671281 A CN 202310671281A CN 116694765 A CN116694765 A CN 116694765A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- region
- seq
- chr5
- primer pair
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 60
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 56
- 101150059067 PCDHGA1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 99
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims description 61
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims description 61
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 60
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 33
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 33
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 32
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 30
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 24
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 23
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 claims description 11
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 9
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 20
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 15
- 230000003902 lesion Effects 0.000 abstract description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 10
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 abstract description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 abstract description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 92
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 21
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 20
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 12
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 description 6
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 6
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 101150087690 ACTB gene Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 3
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-{[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl](methyl)amino}-2-(propan-2-yl)pentanenitrile Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CCN(C)CCCC(C#N)(C(C)C)C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010049678 Endometrial dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 101000613332 Homo sapiens Protocadherin gamma-A1 Proteins 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000028183 atypical endometrial hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000006828 endometrial hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 210000001703 glandular epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请属于基因检测技术领域,具体涉及一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒及其应用。本申请采用传统宫颈脱落细胞取样方法,以PCDHGA1基因为靶点,加入DNA甲基化诊断技术,具有更高的灵敏度和特异性,用于癌前病变和早期子宫内膜癌的辅助诊断,优化医疗配置资源,定位早期门诊筛查,提升子宫内膜癌筛查与诊疗效率,为子宫内膜癌的临床诊断和用药提供更可靠的参考依据。
Description
技术领域
本申请属于基因检测技术领域,具体涉及一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒及其应用。
背景技术
子宫内膜癌(endometrial cancer),又称子宫体癌,是中国女性最常见的三大妇科恶性肿瘤之一。2015年国家癌症中心数据显示,子宫内膜癌的发病率为10.28/10万,死亡率为5.04/10万,研究显示其发病率呈逐年增加趋势,并且城市居民的发病率高于农村居民,在我国部分发达城市,其发病率居妇科恶性肿瘤的首位。随着营养结构的改善、生活习惯的改变和预期寿命的增加,子宫内膜癌的发病率可能会进一步增加,变成严重的公共卫生问题。
子宫内膜癌在40-65岁人群中呈现出相对高发的态势,然而其发病原因尚不明确,肥胖、糖尿病、未生育、不育、初潮早、绝经年龄晚,以及***的持续刺激等都是引发子宫内膜癌的高危因素。研究表明未治疗的子宫内膜不典型增生的患者,50%会在10年内发展成子宫内膜癌。子宫内膜癌患者术后的5年相对生存率大于70%,Ⅰ期子宫内膜癌患者生存率约达到80%。因此及早发现子宫内膜癌前病变及早期子宫内膜癌,对其早诊早治有重要意义,并能获得较好预后。
目前子宫内膜癌的主要检测方法包括血液生化检查、肿瘤标志物检查(CA125、CA19-9、CEA、CP2或HE4)、影像学检查(经腹或经***超声、MRI、CT、PET-CT)、细胞学检查、分段诊断性***等。尽管这些检测技术被广泛应用于子宫内膜癌的诊断,然而却存在诸如检测灵敏性低、有创损伤、过度诊疗的问题。因此根据子宫内膜癌在早期筛查中存在问题,需要建立一种灵敏性高、无创的有效筛查方法提高早期筛查的依从性。
发明内容
基于此,本申请提供一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒及其应用,以解决传统技术中需要有创并且检测灵敏度低的技术问题。
本申请一方面提供一种用于检测靶核酸分子的甲基化水平的试剂在制备用于检测子宫内膜癌的试剂盒中的用途,其特征在于,所述靶核酸分子包括来源于PCDHGA1基因的全长或部分区域的核苷酸序列,所述靶核酸分子包括至少一个CpG位点。
在其中一个实施例中,以GRCh38.p14为参考基因组,所述部分区域选自Chr5:141431876-141432274的负链DNA区域、Chr5:141417405-141417806的正链DNA区域和Chr5:141417468-141417963的负链DNA区域中的一种或多种。
在其中一个实施例中,所述靶核酸分子是从生物样本中分离的核酸分子,或者是人工合成的核酸分子。
本申请另一方面提供一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒,所述试剂盒包括检测靶核酸分子甲基化水平的试剂,所述靶核酸分子包括来源于PCDHGA1基因的全长或部分区域的核苷酸序列,所述靶核酸分子包括至少一个CpG位点。
在其中一个实施例中,以GRCh38.p14为参考基因组,所述部分区域选自Chr5:141431876-141432274的负链DNA区域、Chr5:141417405-141417806的正链DNA区域和Chr5:141417468-141417963的负链DNA区域中的一种或多种。
在其中一个实施例中,所述部分区域包括区域1~6中的一个或多个、区域7和区域8~9中的一个或者多个,其中:
所述区域1为Chr5:141431961-141432134;
所述区域2为Chr5:141431961-141432143;
所述区域3为Chr5:141432026-141432134;
所述区域4为Chr5:141432026-141432143;
所述区域5为Chr5:141432055-141432134;
所述区域6为Chr5:141432055-141432143;
所述区域7为Chr5:141417583-141417733;
所述区域8为Chr5:141417612-141417817;
所述区域9为Chr5:141417647-141417817。
在其中一个实施例中,所述试剂包括引物对和探针中的至少一种。
在其中一个实施例中,所述引物对包括所述区域1引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11所示;及/或,所述区域2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.14所示;及/或,所述区域3引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.11所示;及/或,所述区域4引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.14所示;及/或,所述区域5引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.11所示;及/或,所述区域6引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.14所示;及/或,所述区域7引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21所示;及/或,所述区域8引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.24、SEQ ID NO.25所示;及/或,所述区域9引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28、SEQ IDNO25所示。
在其中一个实施例中,所述探针包括序列如SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31以及SEQID NO.32所示探针中的至少一条。
在其中一个实施例中,所述试剂盒还包括宫颈脱落细胞保存试剂、核酸提取试剂、核酸转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照样本和阴性对照样本中的至少一种。
本申请提供一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒及其应用。本申请的试剂盒以PCDHGA1基因为靶点,加入DNA甲基化诊断技术,具有更高的灵敏度和特异性,用于癌前病变和早期子宫内膜癌的辅助诊断,优化医疗配置资源,定位早期门诊筛查,提升子宫内膜癌筛查与诊疗效率,为子宫内膜癌的临床诊断和用药提供更可靠的参考依据。
具体实施方式
下面结合实施方式和实施例,对本申请作进一步详细的说明。应理解,这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围,提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解,本申请可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施方式和实施例,本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改,得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外,在下文的描述中,给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解,应理解,本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义,本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
术语
本申请中,以开放式描述的技术特征中,包括所列举特征组成的封闭式技术方案,也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
术语“及/或”或“和/或”均是指包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
术语“基因”是指编码产生氨基酸多肽链的DNA区段,它包括参与基因转录/翻译和转录/翻译调控的位于编码区和非编码区的序列,以及外显子和内含子序列。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子,优选多于三个,并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素,而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生,包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中,术语“引物对”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一,能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后,所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶,而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变,因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物,通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本公开内容中,进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物,若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38),则表明目标序列是甲基化的。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(QMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对,从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来,但是QMSP最终的检测指标为荧光信号,因此,在QMSP反应***中,除加入甲基化检测引物以外,还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比,QMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高,更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段,且该技术不需要凝胶电泳检测,操作更加简便。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时,因为荧光基团附近存在淬灭基团,探针不会发出荧光。在扩增过程中,如果探针与被扩增的链结合,DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针,荧光基团远离淬灭基团,其能量不被吸收,即产生荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步的指数增长的过程。
术语“不伴有非典型性的增生”是指腺体和内膜间质的比例失调,子宫内膜腺体增多,腺体形状不规则,管状,分支和/或囊状扩张,类似于增生性子宫内膜;但没有细胞学的非典型性。
术语“伴有非典型性的增生”是指指腺体和内膜间质的比例失调的基础上,腺体上皮细胞与周围的子宫内膜的非肿瘤性腺体明显不同,具有细胞学上的非典型性。
本申请一方面提供一种用于检测靶核酸分子的甲基化水平的试剂在制备用于检测子宫内膜癌的试剂盒中的用途,其特征在于,所述靶核酸分子包括来源于PCDHGA1基因的全长或部分区域的核苷酸序列,所述靶核酸分子包括至少一个CpG位点。
在一个具体的示例中,以GRCh38.p14为参考基因组,所述部分区域选自Chr5:141431876-141432274的负链DNA区域、Chr5:141417405-141417806的正链DNA区域和Chr5:141417468-141417963的负链DNA区域中的一种或多种。需要说明的是“Chr5:141431876-141432274”的部分区域是指在Chr5:141431876-141432274范围内的一步分区域,例如Chr5:141431961-141432134、Chr5:141431961-141432143、Chr5:141432026-141432134等,其他类似处理。
可选地,所述靶核酸分子是从生物样本中分离的核酸分子,或者是人工合成的核酸分子。
本申请另一方面提供一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒,所述试剂盒包括检测靶核酸分子甲基化水平的试剂,所述靶核酸分子包括来源于PCDHGA1基因的全长或部分区域的核苷酸序列,所述靶核酸分子包括至少一个CpG位点。
在一个具体的示例中,以GRCh38.p14为参考基因组,所述部分区域选自Chr5:141431876-141432274的负链DNA区域、Chr5:141417405-141417806的正链DNA区域和Chr5:141417468-141417963的负链DNA区域中的一种或多种。
可选地,所述部分区域包括区域1~6中的一个或多个、区域7和区域8~9中的一个或者多个,其中:所述区域1为Chr5:141431961-141432134;所述区域2为Chr5:141431961-141432143;所述区域3为Chr5:141432026-141432134;所述区域4为Chr5:141432026-141432143;所述区域5为Chr5:141432055-141432134;所述区域6为Chr5:141432055-141432143;所述区域7为Chr5:141417583-141417733;所述区域8为Chr5:141417612-141417817;所述区域9为Chr5:141417647-141417817。
进一步可选地,所述试剂包括引物对和探针中的至少一种。
在一个具体的示例中,所述引物对包括所述区域1引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11所示;及/或,所述区域2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.14所示;及/或,所述区域3引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.11所示;及/或,所述区域4引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.14所示;及/或,所述区域5引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.11所示;及/或,所述区域6引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.14所示;及/或,所述区域7引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21所示;及/或,所述区域8引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.24、SEQ ID NO.25所示;及/或,所述区域9引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.25所示。
在其中一个实施例中,所述探针包括序列如SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32以及SEQID NO.33所示探针中的至少一条。
可选地,检测探针上连接有荧光基团。在一些实施例中,检测探针为Taq man探针。进一步地,检测探针上连接有荧光基团和淬灭基团。可选地,荧光基团位于探针的5’端,淬灭基团位于探针的3’端。可选地,检测探针上连接的荧光基团分别独立的选自FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、Texsa Red、JOE及Quasar 705中的一种。当然,在同一个反应体系中有两种以上的探针时,不同探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是,目标区域的检测探针和内参基因的检测探针上连接的荧光基团不限于上述,还可以是其他荧光基团。
在一个具体的示例中,所述试剂盒还包括宫颈脱落细胞保存试剂、核酸提取试剂、核酸转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照样本和阴性对照样本中的至少一种。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解,这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,优先参考本申请中给出的指引,还可以按照本领域的实验手册或常规条件,还可以按照制造厂商所建议的条件,或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中,涉及原料组分的量度参数,如无特别说明,可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数,允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1、筛选甲基化检测引物对和探针
甲基化特异性荧光定量PCR技术(QMSP)通过荧光标记的寡核苷酸探针或嵌入式染料等方法并结合相应的荧光定量PCR仪器获得反应PCR扩增的动力学曲线,通过Ct值(产物的荧光值达到设定阈值所需要的反应循环数)即可获得初始甲基化模板的相对或绝对数量信息,该方法结果准确、操作简单、快速、且可一次性处理大批量的样本,已成为DNA甲基化检测的主流方法。
本实施例以位于Chr5:141431876-141432274的负链DNA区域(SEQ ID NO.1)、位于Chr5:141417405-141417806的正链DNA区域(SEQ ID NO.2)和位于Chr5:141417468-141417963的负链DNA区域(SEQ ID NO.3)作为原始DNA序列,分别获得SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3对应的完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的序列SEQ ID NO.4~6和完全未甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的序列SEQ ID NO.7~9。DNA经亚硫酸氢盐处理后,未甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,通过随后的PCR,将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则保持不变,因而甲基化状态不同的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3序列经亚硫酸氢盐转化后,其序列发生改变。随后将改变后的如SEQ ID NO.4~9所示的DNA序列分别人工合成,并构建至pUC57质粒载体上。
SEQ ID NO.1的核苷酸序列如下所示:
GGACACGTAGGACGATAGGCTTGCCCCTTGGATGGTGTTCTCAGCCAGGGAATAAGTGATCTGGGCGTTCTCTTCACAGTCGGGGTCGTGGGCGGTCACAGAGACGAGGGAAACTCCTCTGGGATTGTTCTCTGGGATATAAGCGGAATAGGAGGCCTGAGGGAAGACCGGCGGGTTGTCGTTGGTGTCTGCCACGTTCAGCGAGATATGAGTTTCCGTGGATAGGGGCGGGGTTCCCCGGTCAGTGGCGGTCACTGTGATGTTGTAGCTAGGAACCTGTTCCCTATCCAAGACTATGTCTGTGACTAAACTATAGTAATTTCCGTAAGATTTTTCTAATTTAAAGGGCAGATTTCCTTGGATGAAACAGATCACCTGTCCGTTTTCCTCAGAATCTTG(SEQ ID NO.1)
SEQ ID NO.2的核苷酸序列如下所示:
TCAAGATATATGTAAATTCAGTAAATAAAAAGATATGATAGTTATGACCAAGTGGAAATATATTTCCTGATGTAAAAGGAATCACTGAGGAAAAAGATTAAAATATTTTGGCTGTCAACTCGTAGTTTAAAAAAAATTCCTTGAAAGAGGTAGAGAAAAGTCAAGTTGCAGTCCCACACAGAGCCTCTGGGCGCCGCCGTCGGCCAGTGCAGAGCAAGCGCTGACGCCGGGGATCCCTCAGCCTCTAGCCTGGGATTCCCTGCGCAGCCAACAACAGAAAAGAAAACCAGCTCCCACACAGAGGCTCCCGGCTGCGCAGACCTTGCCCAGCACACCAGATTGCCAGCTCCGAGACCCGGGACTCCTCCTGTCCTGGGCCGAATGCTCTTTTAGCGCGGTAGA(SEQ ID NO.2)
SEQ ID NO.3的核苷酸序列如下所示:
TAGCGGATCGGCTCACACAGCGTGGGGTAGAACAAAGGCAGCAGCAAAGGAAATAGTACCTGCCGCGGGCCGGCCCGGCGCCTCTGCGCGCAGCTCCCTCCCATCGTTCGCTCGGGTTCTCGCTGGGTCCCCGCTTTTCCAGTTGGAGAAAGTGCACTCTACCGCGCTAAAAGAGCATTCGGCCCAGGACAGGAGGAGTCCCGGGTCTCGGAGCTGGCAATCTGGTGTGCTGGGCAAGGTCTGCGCAGCCGGGAGCCTCTGTGTGGGAGCTGGTTTTCTTTTCTGTTGTTGGCTGCGCAGGGAATCCCAGGCTAGAGGCTGAGGGATCCCCGGCGTCAGCGCTTGCTCTGCACTGGCCGACGGCGGCGCCCAGAGGCTCTGTGTGGGACTGCAACTTGACTTTTCTCTACCTCTTTCAAGGAATTTTTTTTAAACTACGAGTTGACAGCCAAAATATTTTAATCTTTTTCCTCAGTGATTCCTTTTACATCAGGAA(SEQ ID NO.3)
SEQ ID NO.4的核苷酸序列如下所示:
GGATACGTAGGACGATAGGTTTGTTTTTTGGATGGTGTTTTTAGTTAGGGAATAAGTGATTTGGGCGTTTTTTTTATAGTCGGGGTCGTGGGCGGTTATAGAGACGAGGGAAATTTTTTTGGGATTGTTTTTTGGGATATAAGCGGAATAGGAGGTTTGAGGGAAGATCGGCGGGTTGTCGTTGGTGTTTGTTACGTTTAGCGAGATATGAGTTTTCGTGGATAGGGGCGGGGTTTTTCGGTTAGTGGCGGTTATTGTGATGTTGTAGTTAGGAATTTGTTTTTTATTTAAGATTATGTTTGTGATTAAATTATAGTAATTTTCGTAAGATTTTTTTAATTTAAAGGGTAGATTTTTTTGGATGAAATAGATTATTTGTTCGTTTTTTTTAGAATTTTG(SEQ ID NO.4)
SEQ ID NO.5的核苷酸序列如下所示:
TTAAGATATATGTAAATTTAGTAAATAAAAAGATATGATAGTTATGATTAAGTGGAAATATATTTTTTGATGTAAAAGGAATTATTGAGGAAAAAGATTAAAATATTTTGGTTGTTAATTCGTAGTTTAAAAAAAATTTTTTGAAAGAGGTAGAGAAAAGTTAAGTTGTAGTTTTATATAGAGTTTTTGGGCGTCGTCGTCGGTTAGTGTAGAGTAAGCGTTGACGTCGGGGATTTTTTAGTTTTTAGTTTGGGATTTTTTGCGTAGTTAATAATAGAAAAGAAAATTAGTTTTTATATAGAGGTTTTCGGTTGCGTAGATTTTGTTTAGTATATTAGATTGTTAGTTTCGAGATTCGGGATTTTTTTTGTTTTGGGTCGAATGTTTTTTTAGCGCGGTAGA(SEQ ID NO.5)
SEQ ID NO.6的核苷酸序列如下所示:
TAGCGGATCGGTTTATATAGCGTGGGGTAGAATAAAGGTAGTAGTAAAGGAAATAGTATTTGTCGCGGGTCGGTTCGGCGTTTTTGCGCGTAGTTTTTTTTTATCGTTCGTTCGGGTTTTCGTTGGGTTTTCGTTTTTTTAGTTGGAGAAAGTGTATTTTATCGCGTTAAAAGAGTATTCGGTTTAGGATAGGAGGAGTTTCGGGTTTCGGAGTTGGTAATTTGGTGTGTTGGGTAAGGTTTGCGTAGTCGGGAGTTTTTGTGTGGGAGTTGGTTTTTTTTTTTGTTGTTGGTTGCGTAGGGAATTTTAGGTTAGAGGTTGAGGGATTTTCGGCGTTAGCGTTTGTTTTGTATTGGTCGACGGCGGCGTTTAGAGGTTTTGTGTGGGATTGTAATTTGATTTTTTTTTATTTTTTTTAAGGAATTTTTTTTAAATTACGAGTTGATAGTTAAAATATTTTAATTTTTTTTTTTAGTGATTTTTTTTATATTAGGAA(SEQ ID NO.6)
SEQ ID NO.7的核苷酸序列如下所示:
GGATATGTAGGATGATAGGTTTGTTTTTTGGATGGTGTTTTTAGTTAGGGAATAAGTGATTTGGGTGTTTTTTTTATAGTTGGGGTTGTGGGTGGTTATAGAGATGAGGGAAATTTTTTTGGGATTGTTTTTTGGGATATAAGTGGAATAGGAGGTTTGAGGGAAGATTGGTGGGTTGTTGTTGGTGTTTGTTATGTTTAGTGAGATATGAGTTTTTGTGGATAGGGGTGGGGTTTTTTGGTTAGTGGTGGTTATTGTGATGTTGTAGTTAGGAATTTGTTTTTTATTTAAGATTATGTTTGTGATTAAATTATAGTAATTTTTGTAAGATTTTTTTAATTTAAAGGGTAGATTTTTTTGGATGAAATAGATTATTTGTTTGTTTTTTTTAGAATTTTG(SEQ ID NO.7)
SEQ ID NO.8的核苷酸序列如下所示:
TTAAGATATATGTAAATTTAGTAAATAAAAAGATATGATAGTTATGATTAAGTGGAAATATATTTTTTGATGTAAAAGGAATTATTGAGGAAAAAGATTAAAATATTTTGGTTGTTAATTTGTAGTTTAAAAAAAATTTTTTGAAAGAGGTAGAGAAAAGTTAAGTTGTAGTTTTATATAGAGTTTTTGGGTGTTGTTGTTGGTTAGTGTAGAGTAAGTGTTGATGTTGGGGATTTTTTAGTTTTTAGTTTGGGATTTTTTGTGTAGTTAATAATAGAAAAGAAAATTAGTTTTTATATAGAGGTTTTTGGTTGTGTAGATTTTGTTTAGTATATTAGATTGTTAGTTTTGAGATTTGGGATTTTTTTTGTTTTGGGTTGAATGTTTTTTTAGTGTGGTAGA(SEQ ID NO.8)
SEQ ID NO.9的核苷酸序列如下所示:
TAGTGGATTGGTTTATATAGTGTGGGGTAGAATAAAGGTAGTAGTAAAGGAAATAGTATTTGTTGTGGGTTG
GTTTGGTGTTTTTGTGTGTAGTTTTTTTTTATTGTTTGTTTGGGTTTTTGTTGGGTTTTTGTTTTTTTAGTTGG
AGAAAGTGTATTTTATTGTGTTAAAAGAGTATTTGGTTTAGGATAGGAGGAGTTTTGGGTTTTGGAGTTGGT
AATTTGGTGTGTTGGGTAAGGTTTGTGTAGTTGGGAGTTTTTGTGTGGGAGTTGGTTTTTTTTTTTGTTGTTG
GTTGTGTAGGGAATTTTAGGTTAGAGGTTGAGGGATTTTTGGTGTTAGTGTTTGTTTTGTATTGGTTGATGGT
GGTGTTTAGAGGTTTTGTGTGGGATTGTAATTTGATTTTTTTTTATTTTTTTTAAGGAATTTTTTTTAAATTATGAGTTGATAGTTAAAATATTTTAATTTTTTTTTTTAGTGATTTTTTTTATATTAGGAA(SEQ ID NO.9)
甲基化特异性PCR的引物设计需要满足普通引物设计的原则,如1)引物的长度一般为15~30bp;2)引物中GC碱基含量在40%~60%之间;3)引物具有特异性;4)尽量避免引物3’端出现3个以上的相同碱基;5)引物二聚体及发卡结构的能值尽量不超过4.5kcals/mol。
并且,甲基化特异性PCR的引物设计还需要考虑:其上、下游引物中分别至少包含一个CpG位点,CpG位点越多则引物的特异性越高,为了避免非特异性扩增,其3’端至少有一个CpG位点,且引物的扩增依赖于模板的甲基化水平。
针对SEQ ID NO.4~6所示的完全甲基化的片段设计甲基化特异性引物对,针对SEQ ID NO.7~9所示的完全未甲基化的片段设计非甲基化引物对。为了能够尽可能多地检测脱落细胞中的目标区段,同时提高PCR扩增的效率,在SEQ ID NO.4~6、SEQ ID NO.7~9所示的区域内在不同位置分别设计不同引物进行检测,扩增子的片段长度均小于200bp。其中位于Chr5:141417405-141417806的正链DNA区域(SEQ ID NO.2)转化后的序列基于引物的设计的基本原则,只能设计一对甲基化和非甲基化引物。具体如表1所示。
表1针对目标区域的非甲基化引物对、甲基化引物对和探针的核苷酸序列
/>
将表1中的引物对分别人工合成,并稀释至合适的浓度备用。为了保证荧光定量PCR反应的扩增效率位于95%-105%之间,且没有非特异性扩增和引物二聚体出现,分别以亚硫酸氢盐转化后的目标区域的质粒载体作为模板,使用SYBR Green体系进行荧光定量PCR反应。
设计多对用于甲基化荧光定量PCR反应的引物对。在PCR反应管中加入稀释好的模板的甲基化引物对和非甲基化引物对,设计各个序列特异性的甲基化引物对和非甲基化引物对。所述甲基化引物对和非甲基化引物对均具有良好的扩增特异性,即甲基化引物对不会扩增非甲基化的模板,且非甲基化引物对不会扩增甲基化的模板;另外,所述甲基化引物对具有良好的检测灵敏性,即当模板中含有大于等于1%的甲基化DNA序列时,扩增产物仅为甲基化的DNA序列。筛选满足上述要求的甲基化引物对和非甲基化引物对。并以含甲基化序列SEQ ID NO.4~6和未甲基化序列SEQ ID NO.7~9的质粒载体作为模板,每种模板浓度均为103copies/μL,二者等体积混合均匀,再加入SYBR Green PCR mix,即可进行扩增反应,PCR配置体系如表2所示,反应程序如表3所示。然后对所述引物对进行验证,使用SYBRGreen PCR体系扩增目的片段,通过溶解曲线和标准曲线分析,筛选到满足上述要求的1对用于扩增Chr5:141431876-141432274、1对用于扩增Chr5:141417405-141417806和1对用于扩增Chr5:141417468-141417963的部分区域的引物对,检测目标区域最佳引物对如表4所示。
表2 SYBR Green PCR体系配置
2×SYBR Green PCR mix | 12.5μL |
上游引物 | 1μL |
下游引物 | 1μL |
模板 | 5μL |
超纯水 | 补足25μL |
表3 SYBR Green PCR反应程序
表4最佳的甲基化检测引物对
目标区域 | 上游引物序列(5’-3’) | 下游引物序列(5’-3’) |
SEQ ID NO.4 | SEQ ID NO.18 | SEQ ID NO.11 |
SEQ ID NO.5 | SEQ ID NO.20 | SEQ ID NO.21 |
SEQ ID NO.6 | SEQ ID NO.28 | SEQ ID NO.25 |
设计用于QMSP检测且与每对甲基化检测引物对相匹配的TaqMan检测探针SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32。TaqMan探针5’端连接有荧光基团,如FAM、ROX、CY5、VIC等,其3’端连接有荧光淬灭基团,如BHQ、BHQ1等。在PCR过程中,TaqMan检测探针与待检测的模板特异性结合,若甲基化引物对进行延伸时,具有5’-3’外切酶活性的Taq酶可以切下探针5’端的荧光基团,此时3’端淬灭基团失去了对荧光基团的淬灭作用,荧光基团发出荧光,测定每个循环中报告的荧光强度即可得到该区域特定位点的甲基化水平。检测各个子区域的荧光探针其5’端荧光报告基因均为FAM,其3’端荧光淬灭基团均为MGB,将设计的荧光探针人工合成,并在TaqMan PCR体系中分析甲基化检测引物与检测探针联用的效果。要求针对目标区域的扩增曲线呈S型,未加入模板的阴性对照管无扩增,而加入含103copies/μL的目标区域的质粒载体时,Ct值小于30。最终得到的用于TaqMan PCR体系的甲基化检测引物对和检测探针的序列以及可检测的甲基化胞嘧啶位点如表5所示。
表5引物和探针可识别的甲基化胞嘧啶位点
收集子宫内膜癌细胞Hec-1A,以及人永生化角质形成细胞Hacat,使用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取培养细胞的基因组DNA备用。使用天根DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(DP215)进行DNA的转化和纯化。随后以回收的基因组DNA为模板,使用表5中提供的甲基化检测引物对和探针进行QMSP反应,具体的PCR反应体系如表6所示,PCR反应程序如表7所示。除检测目标区域以外,还需在扩增体系中加入内参基因ACTB的扩增引物对和检测探针,用以监测样本质量,扩增ACTB基因的上游引物、下游引物及检测探针的序列分别为5’-AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG-3’(SEQ ID NO.33)、5’-AATAACACCCCCACCCTGC-3’(SEQ ID NO.34)、5’-GGAGTGGTTTTTGGGTTTG-3’(SEQ ID NO.35)。ACTB基因检测探针5’端的荧光基团均为ROX,其3’端的荧光淬灭基团均为BHQ。经QMSP实验发现,当以转化后的子宫内膜癌细胞系的基因组DNA为模板时,表5中的甲基化检测引物对和探针扩增各个子目标区域的Ct值都低于34;当以转化后的人正常皮肤永生化表皮细胞系的基因组DNA为模板时,表5中的甲基化检测引物对和探针扩增各个子目标区域的Ct值都高于38;以上结果表明表5中各个子目标区域在子宫内膜癌细胞系的甲基化水平高于其人正常上皮细胞系的甲基化水平。
表6TaqMan PCR扩增体系
表7QMSP反应程序
实施例2QMSP法检测目标区域的甲基化水平诊断子宫内膜癌组织样本的性能
申请人发现,通过检测子宫内膜癌患者的肿瘤组织样本,选自通过检测位于Chr5:141431876-141432274的负链DNA区域、位于Chr5:141417405-141417806的正链DNA区域和位于Chr5:141417468-141417963的负链DNA区域可以有效区分子宫内膜癌样本和健康组织样本,具体的检测过程如下所示。
1.组织样本的收集
共收集了50例经病理检测确诊为子宫内膜癌患者的癌组织样本和对应的癌旁正常组织样本50例,以及非典型性子宫内膜增生患者病理组织样本65例。所有的样本均为***浸泡、石蜡包埋的组织样本。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
2.样本DNA的提取
使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat:56404)提取组织样本的DNA,具体操作按照试剂盒。
3.样本DNA的转化和纯化
样本DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号),具体操作步骤见试剂盒说明书。
4.QMSP
以经过亚硫酸氢盐转化和纯化的组织样本DNA为模板,分别加入表5中特异性的甲基化检测引物对和检测探针,同时加入内参基因ACTB的检测引物对和检测探针,再按照表6加入QMSP的必要成分配置扩增体系。此时,还需设置阳性对照和阴性对照。阴性对照的扩增体系与实验管类似,但模板为等体积的超纯水;阳性对照的扩增体系也与实验管类似,但模板为103copies/μL含待测目标区域(转化后序列)的质粒和103copies/μL含转化后ACTB序列的质粒等体积混合而成。随后在荧光定量PCR仪器上按照表7设置的程序进行反应。PCR反应结束后,调整基线,将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值,将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处,得到样本各个基因的Ct值。根据质量控制的要求剔除检测不成功的样本,读取合格样本的Ct值。所述质量控制的标准为:1)阴性对照无扩增;2)阳性对照管扩增曲线呈S型,且所有基因的Ct值在26-30之间;3)实验管内参基因的Ct值小于等于34。若不满足上述质量控制要求,则此样本需重新检测。
5.结果分析
根据各个目的区域检测的Ct值来判断待测样本的甲基化水平。对于组织样本,若扩增区域的Ct值≤38,则认为该样本中此区域为甲基化阳性,若扩增某一区域的Ct值>38,则认为该样本中此区域为甲基化阴性。在检测单一区域时,若待测样本在该区域为甲基化阳性,则该样本为癌症阳性样本,若待测样本在该区域为甲基化阴性,则该样本为癌症阴性样本。利用甲基化荧光定量PCR检测的方法,检测目标区域的甲基化水平诊断子宫内膜组织样本的性能如表8所示。
表8子目标区域诊断子宫内膜癌组织样本的性能
从表8可以看出,通过检测基因PCDHGA1的子目标区域SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6的甲基化水平,可以有效检出子宫内膜癌前病变和早期子宫内膜癌的组织样本。
从检测组织样本的性能上得出,各个子目标区域的诊断性能良好,其检测早期子宫内膜癌组织样本的灵敏性范围为92%~96%;其检测子宫内膜癌前病变的不伴分典型增生组织样本的灵敏性范围为76.92%~84.62%。
实施例3 QMSP法检测目标区域的甲基化水平诊断子宫内膜癌患者宫颈脱落细胞样本的性能
为进一步提升子宫内膜癌诊断试剂盒的检测性能,本实施例基于宫颈脱落细胞样本采用QMSP法检测子宫内膜癌的单个标记物甲基化水平,可有效提升检测的便捷性和患者依从性。
通过检测位于Chr5:141431876-141432274的负链DNA区域、位于Chr5:141417405-141417806的正链DNA区域和位于Chr5:141417468-141417963的负链DNA区域,可以有效检出早期子宫内膜癌及其癌前病变,具体的检测过程如下所示。
1.脱落细胞样本的收集
共收集了41例经病理检测确诊为子宫内膜癌患者的宫颈脱落细胞样本,153例常规体检的健康人的宫颈脱落细胞样本,子宫内膜癌前病变患者的宫颈脱落细胞样本50例,女性其他生殖***的良性疾病的宫颈脱落细胞10例以及女性其他生殖***的恶性肿瘤的宫颈脱落细胞样本10例。41例子宫内膜癌患者中,I期患者23例,Ⅱ期患者18例。50例子宫内膜癌前病变患者中,不伴有非典型性的增生患者15例,伴有非典型性的增生患者35例。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。本申请所称的I期、II期、III期和IV期的子宫内膜癌可以是参考国际妇产科学联合会所定义的FIGO分期***。
2.样本DNA的提取
使用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210836号)进行脱落细胞样本DNA的提取,具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.样本DNA的转化和纯化
样本DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号),具体操作步骤见试剂盒说明书。
4.QMSP
以经过亚硫酸氢盐转化和纯化的脱落细胞样本DNA为模板,分别加入表5中特异性的甲基化检测引物对和检测探针,同时加入内参基因ACTB的检测引物对和检测探针,再按照表6加入QMSP的必要成分配置扩增体系。此时,还需设置阳性对照和阴性对照。阴性对照的扩增体系与实验管类似,但模板为等体积的超纯水;阳性对照的扩增体系也与实验管类似,但模板为103copies/μL含待测目标区域(转化后序列)的质粒和103copies/μL含转化后ACTB序列的质粒等体积混合而成。随后在荧光定量PCR仪器上按照表7设置的程序进行反应。PCR反应结束后,调整基线,将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值,将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处,得到样本各个基因的Ct值。根据质量控制的要求剔除检测不成功的样本,读取合格样本的Ct值。所述质量控制的标准为:1)阴性对照无扩增;2)阳性对照管扩增曲线呈S型,且所有基因的Ct值在27-30之间;3)实验管内参基因的Ct值小于等于34。若不满足上述质量控制要求,则此样本需重新检测。
5.结果分析
根据各个目的区域检测的Ct值来判断待测样本的甲基化水平。对于脱落细胞样本,若扩增区域的Ct值≤38.6,则认为该样本中此区域为甲基化阳性,若扩增某一区域的Ct值>38.6,则认为该样本中此区域为甲基化阴性。在检测单一区域时,若待测样本在该区域为甲基化阳性,则该样本为癌症阳性样本,若待测样本在该区域为甲基化阴性,则该样本为癌症阴性样本。利用甲基化荧光定量PCR检测的方法,检测目标区域的甲基化水平诊断宫颈脱落细胞样本的性能如表9所示。
表9子目标区域的宫颈脱落细胞的甲基化水平诊断子宫内膜癌
由表9可以看出,目标基因PCDHGA的三个不同区域,通过甲基化特异性荧光定量PCR的方法检测宫颈脱落细胞样本中目标区域的甲基化水平,可以有效区分子宫内膜癌患者和非子宫内膜癌患者。具体地,所述目标区域检测子宫内膜癌前病变患者宫颈脱落细胞样本的灵敏性范围58%-62%,其检测早期子宫内膜癌患者宫颈脱落细胞样本的灵敏性范围为80.49%~85.37%;所述目标区域检测女性其他生殖***的良性疾病患者宫颈脱落细胞样本的特异性为90%,其检测女性其他生殖***的恶性肿瘤宫颈脱落细胞样本的特异性范围为80%~90%,其检测健康女性宫颈脱落细胞样本的特异性范围为92%~93.33%。此外,所述目标区域对***患者细胞样本的检出率不高,因此,虽然检测的样本为宫颈脱落细胞,但是不会造成误诊。
基于此,本实施例提供了基于宫颈脱落细胞分析目标区域的甲基化水平进而诊断子宫内膜癌的体外诊断试剂盒,对子宫内膜癌前病变及早期子宫内膜癌患者有较高的检出率,可以解决患者过度医疗的临床痛点,且无创的取样方式极大提高患者依从性,更方便、更准确地辅助临床诊断。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式,便于具体和详细地理解本申请的技术方案,但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。此外应理解,在阅读了本申请的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改,得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解,本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上,通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案,均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此,本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准,说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.用于检测靶核酸分子的甲基化水平的试剂在制备用于检测子宫内膜癌的试剂盒中的用途,其特征在于,所述靶核酸分子包括来源于PCDHGA1基因的全长或部分区域的核苷酸序列,所述靶核酸分子包括至少一个CpG位点。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,以GRCh38.p14为参考基因组,所述部分区域选自Chr5:141431876-141432274的负链DNA区域、Chr5:141417405-141417806的正链DNA区域和Chr5:141417468-141417963的负链DNA区域中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述靶核酸分子是从生物样本中分离的核酸分子,或者是人工合成的核酸分子。
4.一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括检测靶核酸分子甲基化水平的试剂,所述靶核酸分子包括来源于PCDHGA1基因的全长或部分区域的核苷酸序列,所述靶核酸分子包括至少一个CpG位点。
5.根据权利要求4所述的诊断试剂盒,其特征在于,以GRCh38.p14为参考基因组,所述部分区域选自Chr5:141431876-141432274的负链DNA区域、Chr5:141417405-141417806的正链DNA区域和Chr5:141417468-141417963的负链DNA区域中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述部分区域包括区域1~6中的一个或多个、区域7和区域8~9中的一个或者多个,其中:
所述区域1为Chr5:141431961-141432134;
所述区域2为Chr5:141431961-141432143;
所述区域3为Chr5:141432026-141432134;
所述区域4为Chr5:141432026-141432143;
所述区域5为Chr5:141432055-141432134;
所述区域6为Chr5:141432055-141432143;
所述区域7为Chr5:141417583-141417733;
所述区域8为Chr5:141417612-141417817;
所述区域9为Chr5:141417647-141417817。
7.根据权利要求4~6任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂包括引物对和探针中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述引物对包括所述区域1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示;及/或,所述区域2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.14所示;及/或,所述区域3引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.11所示;及/或,所述区域4引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.14所示;及/或,所述区域5引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.11所示;及/或,所述区域6引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.14所示;及/或,所述区域7引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21所示;及/或,所述区域8引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25所示;及/或,所述区域9引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.25所示。
9.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述探针包括序列如SEQ ID NO.30、SEQID NO.31以及SEQ ID NO.32所示探针中的至少一条。
10.根据权利要求4~6任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括宫颈脱落细胞保存试剂、核酸提取试剂、核酸转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照样本和阴性对照样本中的至少一种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310671281.2A CN116694765A (zh) | 2023-06-08 | 2023-06-08 | 用于检测子宫内膜癌的试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310671281.2A CN116694765A (zh) | 2023-06-08 | 2023-06-08 | 用于检测子宫内膜癌的试剂盒及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116694765A true CN116694765A (zh) | 2023-09-05 |
Family
ID=87836844
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310671281.2A Pending CN116694765A (zh) | 2023-06-08 | 2023-06-08 | 用于检测子宫内膜癌的试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116694765A (zh) |
-
2023
- 2023-06-08 CN CN202310671281.2A patent/CN116694765A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110564857B (zh) | 一种用于早期***检测的组合物及试剂盒 | |
EP3341495B9 (en) | Zic1 and ghsr, molecular diagnostic markers for hpv-induced invasive cancers, nonhpv-induced gynaecological and anogenital cancers and their high-grade precursor lesions | |
CN112646882B (zh) | 一种用于宫颈高级别病变及***检测的组合物及诊断试剂 | |
CN113755603A (zh) | 子宫内膜癌早期筛查诊断用标志物、引物探针及试剂盒 | |
CN114672568B (zh) | 一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒 | |
CN116970705B (zh) | 用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用 | |
CN114959030B (zh) | 检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用 | |
EP4130297A1 (en) | Markers, primers, probes and kit for early screening and diagnosis of endometrial cancer | |
CN115820850A (zh) | 一种子宫内膜癌的生物标志物、探针引物组合和试剂盒 | |
CN116694765A (zh) | 用于检测子宫内膜癌的试剂盒及其应用 | |
CN113943810B (zh) | 子宫内膜癌检测的试剂及试剂盒 | |
CN115948561B (zh) | 一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒及其应用 | |
WO2024125308A1 (zh) | 检测分子标志物甲基化水平的试剂及尿路上皮癌检测试剂盒 | |
CN116179693A (zh) | 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备妇科恶性肿瘤诊断产品中的应用 | |
CN116179698A (zh) | 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用 | |
CN116287229A (zh) | 检测食管癌的试剂及试剂盒 | |
CN116397025A (zh) | 用于***甲基化检测的引物探针、试剂盒及检测方法 | |
CN115927610A (zh) | 检测foxo6基因中目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用 | |
CN117144012A (zh) | 一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物、试剂盒及应用 | |
CN116083586A (zh) | 诊断食管癌的核酸产品、试剂盒及用途 | |
CN117344009A (zh) | 检测膀胱癌的试剂盒 | |
CN116162707A (zh) | 检测cyth2基因或/和six3基因中的目标区域的甲基化水平的试剂的新应用 | |
CN117587124A (zh) | 诊断胰腺癌的检测试剂和试剂盒及应用 | |
CN117778572A (zh) | 一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒及应用 | |
CN118166097A (zh) | 用于结直肠癌及癌前病变诊断的dna甲基化水平检测试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |