CN116615231A

CN116615231A - Fab高甘露糖糖型

Info

Publication number: CN116615231A
Application number: CN202180076834.9A
Authority: CN
Inventors: 克劳斯·乔里斯; 内斯利汉·奥兹登; 沃尔夫冈·吕克特; 布丽塔·施密特; 卡斯滕·霍夫曼; 维尔马·刘; 罗兰·斯塔克
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2020-11-16
Filing date: 2021-11-04
Publication date: 2023-08-18
Also published as: MX2023005581A; AU2021376837A1; CR20230253A; EP4244248A1; CA3200954A1; IL302740A; WO2022101088A1; US20240002483A1; JP2023549809A; PE20231556A1; KR20230109674A; CL2023001371A1

Abstract

本发明涉及在单克隆抗体的Fab部分处的糖基化模式以及用于在培养表达具有经调节含量的高甘露糖Fab糖型的单克隆抗体的微生物期间进行调节的方法。

Description

FAB高甘露糖糖型

技术领域

背景技术

单克隆抗体的关键治疗或诊断特性与糖基化的翻译后过程密切相关。对聚糖的确认很重要，因为它们可能影响分泌、溶解度、受体识别、抗原性、生物活性和药代动力学。IgG抗体通常在Fc区上被糖基化，但约20％也包含在可变区中的非保守N-糖基化位点(Zhang等人，Drug Discovery Today 21(2016)740-765)。

IgG的Fc区的N-连接糖基化具有重要的结构功能，包括增强稳定性和影响Fc部分的折叠(Higel等人，European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 100(2016)94-100)。Fc连接的聚糖通过改变蛋白质的三维结构来影响抗体的效应功能，从而影响与Fc-γ受体的结合。

然而，在可变区中的糖基化的作用并不那么明确。Zhang等人(同上)提出，大多数V区糖基化位点位于溶剂暴露环上，并且很容易被内源性凝集素接近。尽管通常含有经完全加工的唾液酸化聚糖，且平分GlcNAc残基的发生率很高，但在CDR抗原结合区也发现了一些低聚甘露糖聚糖。据推测，这些低聚甘露糖聚糖通过与先天免疫***的凝集素结构域结合，阻断其信号传导功能，从而促进病理过程。

通常，Fab的聚糖已被描述为双触角复合型结构，该结构是半乳糖基化的，并且与Fc聚糖相反，是高度唾液酸化的。这些寡糖的功能尚未完全阐明，但有迹象表明，可变区的糖基化可能对抗原结合产生积极、中性或消极的影响(Biermann等人，Lupus 25(2016)934-942和Jefferis,Nature 8(2009)226-234)。

同样，已经进行了各种研究来探究N-糖基化与药代动力学(PK)之间的关系，但研究结果在很大程度上是相互矛盾的。Millward等人，Biologicals 36(2008)41-47发现，在可变区中经糖基化的抗体与在可变区中无糖基化的抗体的清除率没有显著差异，或者在Fc糖基化位点富集复合型寡糖的抗体与富集高甘露糖型寡糖的抗体之间的清除率没有显著差异，因此表明糖基化对单克隆IgG1抗体的药代动力学行为影响很小或没有影响。Finke&Banks.,UW Tacoma Digital Commons,SIAS Faculty Digital Publications(https:// digitalcommons.tacoma.uw.edu/ias_pub/825)注意到，与经相对充分表征的Fc聚糖对IgG效应功能的结构-功能关系相比，Fab糖基化的生物学作用和治疗结果要迟钝得多。他们从对大量研究的评定中得出结论，给定的Fab聚糖对IgG药物的生物学特性和治疗性指标的影响很难预测。Van de Bovenkamp等人，J.Immunology 196(2016)1435-1441得出结论认为，IgG Fab糖基化对抗体的稳定性、半衰期和结合特征有显著影响，是一个重要但鲜为人知的过程。

mAb糖基化是复杂的，因此准确、可重现的糖谱分析可能具有挑战性，特别是当这涉及控制Fc和Fab位点处的糖型保真度时。糖基化模式可以随着不同的表达***、培养条件、过程和制造规模而改变，需要对这些进行优化以便获得并维持所需的糖基化模式。了解细胞生长、细胞代谢、IgG合成和糖基化之间的相互作用以及这些因素在代谢水平上在不同细胞系和培养基成分之间如何变化，将有利于生物过程优化。

Tachibana等人，Cytotechnology 16(1994)151-157使用由C5TN细胞生产的抗体，该抗体对肺腺癌具有特异性并且与念珠菌(Candida)细胞色素C具有交叉反应性，其独特的特征为在轻链的高变区处的N-糖基化。他们发现，在葡萄糖受限的条件下，细胞很难将蛋白质完全糖基化，所生产的糖型比正常情况下要小。因此，作者推荐连续灌注培养而不是传统的分批培养。

Hossler等人，Glycobiology(2009)19(9)936-949描述由细胞介质产生的变量和过程效应与蛋白质糖基化控制之间的复杂关系，Ehret等人，Biotechnol&Bioeng(2019)116816-830描述细胞培养基对蛋白质糖基化的影响。

Fan等人，Biotech&Bioeng(2015)112(3)521-535发现，在使用两种化学成分确定的专有培养基的CHO细胞补料分批过程中，葡萄糖与氨基酸浓度的平衡对于细胞生长、IgG滴度和位于Fc处的N-糖基化很重要，因此由于更平衡的培养物中氨基酸浓度和更高葡萄糖消耗，可以获得更快的细胞生长、更高的活细胞积分和IgG生产–以及更多的成熟糖蛋白。作者决定，应根据具体情况了解培养基和过程优化对Fc糖基化的效应，并从蛋白质加工速率、细胞代谢以及高尔基体驻留蛋白的表达和活性的相互作用中得出结果。

Huang等人，Anal.Biochem.349(2006)197-207分析糖基化对于抗Aβ-IgG1单克隆抗体抗体清除的效应，并且发现了以N-乙酰氨基葡萄糖终止的双触角复合型聚糖的快速清除。

St Amand等人，Biotechnol Bioeng(2014)111(10)1957-70发现，锰、半乳糖和氨中的每一种在用作培养基补充剂时对某些聚糖和聚糖分布有显著影响。

EP 1960428针对抗淀粉样蛋白β的抗体，在可变区中具有糖基化，以清除人体内现有的β-淀粉样蛋白斑块并防止在形成新的β-淀粉样蛋白斑块。V_H区中的糖基化选自以下的糖结构：无核心岩藻糖基化的双触角复合型、双触角杂合型或双触角低聚甘露糖型，其中杂合结构和低聚甘露糖结构被认为是次要的，并且组合起来占组合物的25％或更少。低聚甘露糖结构的特征在于含有Man4、Man5或Man6亚基，包括典型N-连接核心结构中的那些甘露糖单元。没有关于用于调节抗体糖型中相对高的甘露糖含量的需要或方法的公开。

本发明是鉴于上述考虑而策划的。

发明内容

本发明涉及单克隆抗体组合物，其中特定糖型(高甘露糖糖型)在抗体的Fab区中的N-糖基化位点处的相对含量受到调节。还提供用此类抗体组合物的疾病的诊断和治疗方法以及此类抗体组合物的医学用途，以及制备此类抗体组合物的方法和由此生产的抗体组合物。

以下是本发明最广义的方面。在详细描述之后更详细地定义了本发明的特征的性质的替代性和优选实施例。

在整个以下公开中，为了简洁起见，术语“抗体”将用于涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)和抗体片段(如下文定义)，只要它们表现出期望的抗原-结合活性。

在其第一方面，本发明提供一种组合物，该组合物包含单克隆抗体，该单克隆抗体在其一个或多个Fab区中具有N-糖基化，其中相对于组合物中经糖基化的Fab的总量，该组合物中约20％或更少的Fab区具有N-连接的高甘露糖聚糖。

本发明的组合物可以是药物组合物。替代性地，本发明的组合物可以是在抗体的重组生产期间和/或之后可获得的细胞培养物上清液。

一方面，本发明提供一种用于降低抗体从已经施用该抗体的动物的循环中清除的速率的方法，该方法包括调节包含该抗体的组合物中糖基化单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的相对含量。

一方面，本发明设想一种用于调节包含在本发明的组合物中的经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的相对含量的方法，该方法包括：在用于通过在其中对表达该单克隆抗体的真核细胞进行发酵来生产该经糖基化的单克隆抗体的培养基中，历经发酵的全部的或部分的生产阶段，优化葡萄糖的浓度。

在全部的或部分的生产阶段期间优化培养基中真核细胞的碳水化合物源的浓度包括，在全部的或部分的生产阶段期间维持培养基中碳水化合物源的平均浓度，其与发酵产生的高甘露糖Fab糖型的期望相对含量相关。

该方法可进一步包括从培养基中回收单克隆抗体的步骤。

在本发明中，“相对”含量是指组合物中的高甘露糖Fab糖型的含量相对于组合物中的单克隆抗体的全部其他Fab糖型的含量。

在本发明的一个实施例中，在组合物中，高甘露糖Fab糖型占单克隆抗体的总Fab糖型的约20％或更少。因此，本发明提供一种单克隆抗体组合物，该组合物包含一个或多个N-连接的经糖基化的Fab区，其中约20％或更少的该一个或多个N-连接的经糖基化的Fab区为N-连接的高甘露糖糖型。

在本发明的方法中，为了在组合物中实现约20％或更少的单克隆抗体的Fab高甘露糖糖型，葡萄糖为碳水化合物源且葡萄糖的浓度经优化，使得在单克隆抗体的重组生产中，平均葡萄糖浓度(任选地，为历经生产阶段的第-7天至第0天计算的平均值)为约0.50g/L至约18.00g/L，优选约1.50g/L之约14.00g/L且更优选约2.00g/L至约12.50g/L。

另一方面，本发明提供一种单克隆抗体组合物，其通过上述方法可获得。单克隆抗体组合物可以是细胞培养物上清液，或者可以是药物组合物。

另一方面，本发明提供一种治疗疾病的方法，该方法包括向患有该疾病的患者施用包含单克隆抗体的组合物，该单克隆抗体在其一个或多个Fab区中具有N-糖基化，其中相对于组合物中N-糖基化Fab区的总量，该组合物中约20％或更少的Fab区具有N-连接的高甘露糖聚糖。

另一方面，本发明提供一种组合物，该组合物包含单克隆抗体，该单克隆抗体在其一个或多个Fab区中具有N-糖基化，其中相对于组合物中N-糖基化Fab区的总量，该组合物中约20％或更少的Fab区具有N-连接的高甘露糖聚糖，该组合物用于治疗患有疾病的个体的该疾病。

此外，本发明提供一种组合物，该组合物包含单克隆抗体，该单克隆抗体在其一个或多个Fab区中具有N-糖基化，其中相对于组合物中N-糖基化Fab区的总量，该组合物中约20％或更少的Fab区具有N-连接的高甘露糖聚糖，该组合物用于诊断疾病。

在这些方面，该疾病可以是，例如，痴呆、阿尔茨海默病、运动神经病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、瘙痒症、HIV相关痴呆、克雅二氏病(CJD)、遗传性脑出血、唐氏综合征和与衰老相关的神经元障碍；以及癌症，诸如转移性结直肠癌、转移性非小细胞肺癌、卵巢癌和头颈部癌。

附图说明

图1Fab糖基化物质。将物质归纳为几个总和参数，如Fab杂合甘露糖总和(Hybridman)、Fab唾液酸化总和(Sial)、Fab半乳糖基化总和(Gal)、Fab高甘露糖(High man)和Fab甘露糖(Man)。

图2：葡萄糖对Fab高甘露糖生产的影响，显示为Fab高甘露糖相对于从第-7天至第0天的平均葡萄糖浓度[g/L]的面积百分比。显示了给定项目的全部代表性运行的可用数据(不仅是专门针对葡萄糖变化的运行)。发酵运行在规模、罗氏生产地点和微小的过程改变(例如搅拌、通气、细胞库、细胞增殖周期时相)方面各不相同。葡萄糖溶液按需经由推注或连续添加来添加。

图3A和图3B：葡萄糖对Fab高甘露糖生产的影响。作为总和的Fab高甘露糖以及该总和的3个部分(Fab甘露糖5、6和7)相对于第-7天到第0天的平均葡萄糖浓度[g/L]的面积百分比(图3A)。不同葡萄糖平均水平的比较。一个实验装置专用于葡萄糖变化，全部其他参数保持不变。葡萄糖按需每天经由推注添加来添加。此外，在图3B中，对葡萄糖平均值的计算进行了解释：基于每日在推注添加前从样品中测量的葡萄糖浓度和在推注添加后计算的葡萄糖浓度进行该计算。

图4A和图4B：用先前过程(G3过程/高甘露糖高)生产的更汀芦单抗(Gantenerumab)与根据本发明方法(G4过程/高甘露糖低)生产的更汀芦单抗在临床研究中的药代动力学的比较。图4A为线性标度，图4B为半对数标度。

图5：总更汀芦单抗(即材料中全部更汀芦单抗物质的总和)和具有Man5/Man6 Fab聚糖的更汀芦单抗的血浆浓度在向大鼠静脉内施用更汀芦单抗(15mg/kg)后测定(关于更汀芦单抗Man5/Man6 Fab聚糖血浆浓度的测定，见实例4/大鼠，静脉内更汀芦单抗注射研究3)。

图6A和图6B：根据本文的方法(高甘露糖低/G4过程)生产的更汀芦单抗中的Fab糖型百分比。Man5、Man6、Man7和Man8的含量可以与通过不同方法(高甘露糖/G3过程)生产的更汀芦单抗进行比较–图6B。显示本体数据(通过几个纯化步骤完全纯化的)。

图7：用根据本文的方法(G4过程)产生的更汀芦单抗与根据先前方法(G1、G2或G3过程)产生的更汀芦单抗获得的药代动力学数据比较结果。来自本体样品的数据(通过几个纯化步骤完全纯化的)。来自Fab糖型的高甘露糖数据。

图8A和图8B：当向大鼠施用经糖基化的更汀芦单抗的Man5 Fc糖型时，大鼠的清除率不受影响(图80A，B组)，而Fab糖基化中的Man5和Man6水平导致快速清除(图8B，C组和D组)。来自使用G2过程制备的材料的PK大鼠研究的数据。

图9：示出Fab聚糖峰的色谱图，可以从中计算糖型的百分比。

定义

为了可以更容易地理解本发明，首先定义某些术语。

在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施例，因为这样当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而无意于限制本发明，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。

除非本文另有定义，否则与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域中归属于它们的含义。然而，术语的含义和范围应该是清楚的，并且在任何潜在的歧义的情况下，此处提供的定义优先于字典或外部定义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与引用出版物相关的方法和/或材料。

在提供数值范围的情况下，应当理解，介于该范围的上限和下限之间的每个中间值(以下限单位的十分之一为基准，除非上下文另有明确规定)和所述范围内的任何其它所述的或中间值均包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围中，并且也包括在本发明内，但要遵守所述范围内的任何明确排除的限制。当所述范围包括一个或两个极限时，排除那些所包括的极限中的一个或两个的范围也包括在本发明中。

必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括多个指代物，除非上下文另外明确规定。还应注意的是，权利要求书可以撰写为排除任何任选要素。这样，该陈述旨在作为与权利要求要素的叙述相关联地使用诸如“仅”、“唯一”等排他性术语的先行基础，或用作“负”限制。

应当理解，为了清楚起见，在独立实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。属于本发明的实施例的所有组合被本发明具体地包含并且在本文中被公开，就像每一和每个组合被单独地且明确地公开一样。此外，各种实施例及其元素的全部子组合也具体包含在本发明中并且在本文中被公开，就像每一和每个这样的子组合在本文中被单独且明确地公开一样。

在本申请的提交日期之前，提供本文所讨论的出版物仅用于其公开。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于该出版物。此外，提供的公布日期可能与实际公布日期有所不同，实际公布日期可能需要独立确认。

术语“抗人A-β抗体”和“与人A-β特异性结合的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合人A-β(Aβ)，使得所述抗体可用作靶向Aβ肽的诊断和/或治疗剂。值得注意的是，人A-β肽有几种天然存在的形式，其中人类形式称为Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43。最主要的形式是Aβ42。术语“抗人A-β抗体”和“与人A-β特异性结合的抗体”还包括与人A-β多肽的缩短片段结合的抗体。A-β肽也称为淀粉样蛋白-β或Aβ肽，这些肽为阿尔茨海默病患者大脑中淀粉样斑块的主要构成部分。

本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。“分离的”抗体为已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些实施例中，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)方法测定的，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。

“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

“面积百分比”、“Fab的面积百分比”或“％Fab区”是指例如从经分离的聚糖的色谱图计算的每种糖型(即高甘露糖聚糖或其他糖型)的百分比。图9示出了这样的色谱图。为了计算M5至M7 Fab糖型的百分比，绘制了一条基线，例如在图9中，从5分钟至39分钟，然后计算具有该基线的曲线下面积(A1)。然后将峰M5至M7的面积除以A1并乘以100，得到M5至M7的百分比(面积百分比或％)。以这种方式计算组合物中具有N-连接的高甘露糖聚糖的经糖基化的Fab的总量–例如组合物中约20％或更少的Fab区具有N-连接的高甘露糖聚糖。

“平均葡萄糖浓度”是指历经培养过程的长度或部分长度的培养基中葡萄糖浓度的平均值。可以使用下述公式计算该平均值。被细胞消耗的和添加至培养基中的葡萄糖、初始培养基中的葡萄糖浓度(视情况而定)以及发酵的持续时间或其一部分在确定平均葡萄糖浓度时都被考虑在内。平均葡萄糖浓度可以通过历经培养过程对葡萄糖浓度进行常规(例如每天)测量并自其计算来确定，或者可以从先前在相同或相似条件下的发酵运行中假设并相应地设定。葡萄糖浓度与下文所述的在一个或多个Fab区中具有高甘露糖结构的抗体的产生之间的关联可以为发酵运行的平均葡萄糖浓度的选择提供信息。在本公开中，葡萄糖浓度以g/L给出，这意味着纯葡萄糖而不是葡萄糖一水合物等。

如本文所用，“生物量”是指培养基中培养的细胞的数量或重量。可以通过确定活细胞密度、总细胞密度、细胞时间积分(针对活细胞和总细胞密度)、细胞体积时间积分(针对活细胞和总细胞密度)、细胞堆积体积、干重或湿重来直接或间接测量生物量。

如本文所用，“生物反应器”是指用于哺乳动物细胞培养物生长的任何容器。通常，生物反应器将至少为0.25升，并且可以是1、10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或更大，或其间的任何体积。生物反应器的内部条件，包括但不限于pH、溶解氧和温度，在培养期间通常为可控的。生物反应器可由适合于在本发明的培养条件下保持悬浮在培养基中的哺乳动物细胞培养物的任何材料组成，包括玻璃、塑料或金属或其组合。生物反应器可以是多次或单次使用的、可重复使用的、一次性的或可回收的。

如本文所用，“碳水化合物源”为真核细胞在培养物中生长所需的能量。通常，碳水化合物元为选自葡萄糖、半乳糖、果糖和甘露糖的单糖，但当选择适当的培养基时也可以是多糖诸如麦芽糖或淀粉。

“细胞”和“细胞系”在本文中可互换使用，且全部此类名称均包括后代。

如本文所用，“细胞密度”是指存在于给定体积的培养基中的细胞数量。

如本文所用，“细胞活力”是指培养物中的细胞在给定的一组培养条件或实验变化下存活的能力。如本文所用，该术语还指在特定时间存活的细胞部分相对于当时培养物中活的或死亡的细胞总数。

如本文所用，药物“清除率”为粒径特定时间段被清除的药物的血浆体积。因此，药物清除率的测量单位为体积/时间，或者当归一化至体重时，体积/时间/体重。

如本文所用，“连续补料”是指历经整个或部分培养期连续地向细胞培养基提供营养。在培养期间，可根据需要调整所添加的补料的量和组成。

如本文所用，“培养物”或“细胞培养物”是指在适于细胞群存活和/或生长的条件下悬浮在培养基中的细胞群。这些术语也适用于培养基与悬浮在其中的细胞群的组合。

“培养条件”和“发酵条件”在本文中可互换使用，并且是实现成功的细胞培养和糖蛋白生产所必须满足的那些条件。通常这些条件包括提供适当的培养基，以及控制例如温度(应该在约37℃但也可以包括培养过程中的温度变化(例如37℃到34℃))和pH(通常在6.8与7.2之间)，以及提供氧气和二氧化碳。此类条件也包括培养细胞的方式，例如摇床或机器人培养。

当用于浓度、量或测量时，“每日”是指单个24小时的时间段。因此，每日测量意味着例如元素的浓度每24小时测量一次。每日的量，例如添加至培养物中的元素的每日的量，为该元素在24小时的时间段内的总添加量，并且可包括单次或多次添加。

药剂(例如药物组合物)的“有效量”是指能够以必需的剂量在必需的时段内有效地实现期望的治疗或预防结果的量。

本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施例中，人抗AβIgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或者C末端甘氨酸(Gly446)和C末端赖氨酸(Lys447)可能存在，也可能不存在。在一个实施例中，如本文所述的抗Aβ抗体为IgG1同种型的并且包含SEQ ID NO:9的恒定重链结构域。在一个实施例中，它包含SEQ ID NO:9的重链恒定结构域，没有C末端赖氨酸(Lys447)。在一个实施例中，它包含SEQ ID NO:9的重链恒定结构域，没有C末端赖氨酸(Lys447)且没有C末端甘氨酸(Gly446)。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号***，EU编号***也称为EU索引，如在Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中所述。

如本文所用，“补料分批培养”是指一种培养细胞的方法，其中在培养过程开始后一次或多次向培养物提供额外的成分。补料分批培养通常在某一点停止，并且收获培养基中的细胞和/或成分并任选地纯化。

如本文所用的关于糖蛋白的“半乳糖基化”是指包含一个或多个半乳糖残基的糖蛋白，产生G1和G2糖结构。

“聚糖”是指多糖或单糖部分：葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如N-乙酰神经氨酸(NANA或NeuNAc，其中Neu为神经氨酸酸)。糖基团的加工在ER的腔内共翻译地发生，并在N-连接糖蛋白的高尔基体中继续进行。本文中的AβN-聚糖在一个或两个抗原结合位点的重链可变区中位置52处的天冬酰胺(Asn)的酰胺氮处经N-糖基化。

全部N-连接的寡糖/多糖均有一个共同的“五糖核心”Man₃GlcNAc₂。五糖核心也称为“三甘露糖核心”。

N-聚糖在分支(也称为触角)的存在和/或数量方面彼此不同，这些分支包含添加至该五糖核心结构的***糖，诸如GlcNAc、Gal、GalNAc、NANA和Fuc。任选地，该结构还可以包含核心岩藻糖分子和/或核心木糖分子。有关标准糖生物学命名法的综述，参见Essentials of Glycobiology Varki等人，CSHL Press(1999)。

N-聚糖根据其分支的构成部分(例如低聚甘露糖型、复合型或杂化型)进行分类。在核心上具有一个或多个末端Gal残基的半乳糖基化物质包括G0、G1及G2物质。低聚甘露糖N-聚糖在本文中可分类为“甘露糖型”或“高甘露糖型”。高甘露糖型N-聚糖具有每个聚糖(包括任何形成核心的部分)五个或更多甘露糖残基，例如M5、M6或M7。当只有3或4个甘露糖残基时，例如M3或M4，聚糖为甘露糖型的。复合型N-聚糖通常具有至少一个附接至1,3-甘露糖臂的GlcNAc和至少一个附接至五糖核心的1,6甘露糖臂的GlcNAc。复合型N-聚糖也可具有Gal或GalNAc残基，这些残基任选地用NANA或其他唾液酸衍生物进行修饰。复合型N-聚糖也可具有包含“平分”GlcNAc和核心Fuc的链内取代。否则，或此外，它们也可在五糖核心上具有多个触角，并且因此也称为“多触角型聚糖”。杂合型N-聚糖包含在五糖核心的1,3甘露糖臂上的至少一个GlcNAc和在核心的1,6甘露糖臂上的一个或多个甘露糖。也可能存在末端唾液酸残基。因此，杂合甘露糖种类包括hM3、hM4、hM3G1、hM4G1、hM5G1、hM5G1S1、hM4G1S1和hM3G1S1。唾液酸化物质包括一个或多个末端唾液酸残基，此类物质包括G1S1、G2S1、G2S2和三种杂合甘露糖物质hM5G1S1、hM4G1S1和hM3G1S1。

低聚甘露糖结构(高甘露糖型)包括“M5”、“Man5”或“Man5聚糖”；“M6”、“Man6”或“Man6聚糖”；“M7”、“Man7”或“Man7聚糖”；“M8”、“Man8”或“Man8聚糖”和“M9”、“Man9”或“Man9聚糖”。“高甘露糖”是指甘露糖基化或经甘露糖基化的N-聚糖的量或水平，包括例如Man5、Man6、Man7、Man8和Man9。在本发明中，“高甘露糖”旨在包括Man5、Man6和Man7糖型中的一者或混合物，但也可能存在痕量的Man8或Man9。计数聚糖中的全部甘露糖残基，包括核心结构的任何形成部分。

“糖蛋白”是指具有至少一个聚糖部分的蛋白质或多肽。

术语“糖型”是指蛋白质的同种型，例如仅在所附接的聚糖的数量和/或类型方面不同的抗体。糖蛋白通常由许多不同的糖型组成。“高甘露糖糖型”为一种抗体，其中在一个或两个Fab区处的N-连接聚糖具有“高甘露糖”含量，即包括Man5、Man6和Man7聚糖中的一者或混合物(任选地带有痕量Man8)。本发明包括例如使用不同的糖分析方法鉴定的此类高甘露糖糖型的变体。

术语G1、G2、G3和G4在本文中用于描述用于生产更多和更少量的高甘露糖形式的更汀芦单抗的过程版本。G2和G3过程为“高甘露糖高”过程版本–即生产更多量的高甘露糖版本，例如对于完全纯化的材料，高达8％ Fab高甘露糖；而G1和G4过程为“高甘露糖低”过程版本，即生产较低量的高甘露糖版本，例如对于完全纯化的材料，0％至8％ Fab高甘露糖。本文所述的方法为G4过程。

“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”在本文中可互换使用，表示可以被工程化改造以生成糖蛋白的任何种类的细胞***。它们是指已将外源核酸引入细胞内的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于该原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。

“培养介质”、“细胞培养基”和“培养基”在本文中可互换使用，是指含有维持哺乳动物细胞生长和自其产生糖蛋白的营养物的溶液。通常，此类溶液提供细胞最低限度生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能量源、脂质和微量元素。此类溶液也可以含有增强生长和/或存活率使其高于最低生长和/或存活率的补充成分，包括但不限于激素和/或其他生长因子、特定离子(诸如钠、氯、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、微量元素、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其他能量源。有利地，将培养基配制成对于细胞存活和增殖最佳的pH和盐浓度。培养基可以是低血清或无血清培养基，即其中培养基分别含有约1％至5％的血清或当培养基基本上不含任何哺乳动物血清(例如胎牛血清)时。“基本上不含”血清是指培养基包含在0％至5％之间的血清，优选在约0％至1％之间的血清，且最优选在约0％至0.1％之间的血清。可以使用成分明确的无血清培养基，其中该培养基的每种组分的特性和浓度为已知的。培养基可以是不含蛋白质的培养基，即培养基将会不含蛋白质但将会含有例如来自植物水解产物的不明确的肽。培养基可包括人血清白蛋白和人转铁蛋白，但可能包括动物来源的胰岛素和脂质，或含有人血清白蛋白、人转铁蛋白、人胰岛素和化学上明确的脂质的培养基。替代性地，培养基可以是化学上明确的培养基，即其中全部物质都是明确的并以明确的浓度存在的培养基。这些培养基可仅含有重组蛋白和/或激素或不含蛋白质的化学上明确的培养基，即如果需要，仅含有低分子量构成部分和合成肽/激素。化学上明确的培养基也可完全不含任何蛋白质。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的单个抗体具有同一性和/或结合相同表位，但可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产期间产生，此类变体通常以少量形式存在)除外。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。

“单糖基化抗体”是在单个抗体分子的一个重链(V_H)区中包含N-糖基化的抗体。此类抗体可以是，例如更汀芦单抗。例如，更汀芦单抗的单糖基化形式在重链的一个可变区上(例如在位置Asn 52处)包含糖基化，如下所述。这种单糖基化抗体也可在Fc部分中的非常保守的糖基化位点(例如Asn 306)中包含糖基化。

“双糖基化抗体”在重(V_H)区的两个可变区上包含N-糖基化。例如，更汀芦单抗的双糖基化形式在重链的两个可变区上(例如在位置Asn52处)包含N-糖基化，如下所述。这种双糖基化抗体也可在Fc部分中的非常保守的糖基化位点(例如Asn 306)中包含糖基化。

以下公开了组合物中具有N-连接的高甘露糖聚糖的Fab区的百分比。这是指具有期望结构的Fab区相对于制剂中总N-糖基化Fab区的比例。Fab区可形成包含在组合物中的单克隆抗体的一部分，该单克隆抗体可以经单糖基化或双糖基化，或者组合物本身可以是Fab区的组合物。因此，如果组合物中约20％的Fab区具有N-连接的高甘露糖聚糖，则制剂中剩余80％的Fab区为下述糖型，在该糖型中一个或多个Fab区中的N-连接的糖基化具有不同于高甘露糖聚糖的结构，其中该结构的性质对于本公开而言不重要。制剂中每种糖型(例如高甘露糖或不同于高甘露糖)的百分比可以例如从所产生的聚糖的色谱图计算。图9示出了这样的色谱图。为了从图9中计算M5至M7糖型的百分比，从5到39分钟(即最大洗脱时间)绘制基线，然后计算具有该基线的曲线下面积(A1)。然后将峰M5至M7的面积除以A1并乘以100，得到M5至M7的百分比。

当在本文中使用时，“灌注培养”是指一种细胞培养过程，其涉及恒定供给新鲜培养基并去除用过的培养基和产物，同时保留大量活细胞。灌注培养期间不去除细胞。可以使用交替切向流过滤(ATF)和标准切向流过滤(TFF)来去除用过的培养基，同时将细胞保留在培养物中，或者可以通过使细胞与生物反应器中的基底结合来保留细胞。

术语“药物组合物”是指一种制备物，该制备物的形式允许该制备物中所含的活性成分的生物活性有效，并且该制备物不含对制剂将施用至的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。

“药用载体”是指药物配制物或组合物中不同于活性成分的成分，其对受试者为无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

如本文所用，“蛋白质”是指一种或多种充当离散单元的多肽。当蛋白质仅含有一种多肽以发挥作用时，术语多肽和蛋白质可以互换。

如本文所用，“分割”也称为细胞的传代或传代培养。这涉及将少量细胞转移到新鲜培养基中，由此经分割的细胞为新的培养物接种。在悬浮培养中，将含有少量细胞的少量培养物稀释到更大体积的新鲜培养基中。

如本文所用，“治疗性”涉及以治愈疾病为目的的疾病治疗。治疗性抗体可激活、抑制或改变对特定细胞或分子的内源性免疫应答。治疗性单克隆抗体用于治疗疾病，诸如自身免疫性疾病、心血管疾病和传染病、癌症和炎症。

本文使用以下缩写：

Aβ A-β肽

ADCC 抗体依赖性细胞毒性

AUC 曲线下面积

CDC 补体依赖性细胞毒性

CDR 互补决定区

复合物-F GlcNAc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ Gal_0-2

核心 GlcNAc₂ Man₃

Cmax 在药物施用后的最大血清浓度

CTI 细胞时间积分

ECLIA 电化学发光免疫测定

ELISA 酶联免疫吸附测定

Fab 抗原结合片段

Fc 片段可结晶区

FR 框架区

Fuc L-岩藻糖

G0 GlcNAc Fuc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂

G0-F GlcNAc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂

G1 GlcNAc Fuc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ Gal

G1-F GlcNAc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ Gal

G2 GlcNAc Fuc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ Gal₂

G2 1SA GlcNAc Fuc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ Gal₂ NANA₁

Gal D-半乳糖

GlcNAc N-乙酰葡糖胺

HILIC 亲水作用色谱

HPLC 高效液相色谱法

高甘露糖 GlcNAc₂ Man_5-7

HVR 高变区

ICP-MS 电感耦合等离子体质谱

i.v. 静脉内注射

LDH 乳酸脱氢酶

mAb 单克隆抗体

Man D-甘露糖

Man5/M5 GlcNAc₂ Man₅

Man6/M6 GlcNAc₂ Man₆

Man7/M7 GlcNAc₂ Man₇

Man8/M8 GlcNAc₂ Man₈

MCB 主细胞库

NANA N-乙酰神经氨酸

PSB 初级种子库

RSME 均方根误差

s.c. 皮下注射

UHPLC 超高效液相色谱

Vss 平均表观分布容积

WCB 工作细胞库

具体实施方式

现在将参考附图来讨论示出本发明原理的实施例和实验。

1.Fab组合物

根据该方面，本发明提供一种包含单克隆抗体的组合物，该单克隆抗体在其一个或多个Fab区中具有N-糖基化，其中相对于组合物中经糖基化的Fab的总量，该组合物中约20％或更少的Fab区在其一个或多个Fab区中具有N-连接的高甘露糖聚糖。该组合物可以是细胞培养物上清液或药物组合物。

本发明的组合物可包含、含有单克隆抗体或由其组成。在组合物中，单克隆抗体为基本上纯的，因为通常不存在具有不同特异性的抗体。组合物中也可以存在不同于该单克隆抗体的组分，如下文更详细地讨论的。

以下段落也与通过本发明另一方面的方法产生的抗体组合物相关。

在本发明该方面的一个优选实施例中，在包含单克隆抗体的组合物中，具有N-连接的高甘露糖聚糖的Fab区的百分比为约0％至20％，更优选约0％至15％，或约0％至12％，且再更优选约0％至10％。如上所述，具有N-连接的高甘露糖聚糖的Fab区的该百分比是相对于总N-连接的经糖基化的Fab区而言的。在另一优选的实施例中，在组合物中，具有N-连接的高甘露糖聚糖的Fab区的百分比为约15％或更少，优选约12％或更少，且再更优选约10％或更少。在另一优选的实施例中，在组合物中，具有N-连接的高甘露糖聚糖的Fab区的百分比大于约2％，再更优选大于约4％。在另一优选的实施例中，在包含单克隆抗体的组合物中，具有N-连接的高甘露糖聚糖的Fab区的百分比为约2％至20％，或约2％至15％，或约2％至12％，或约2％至10％或约4％至20％、约4％至15％、约4％至12％或约4％至10％。

在本发明的该方面，包含单克隆抗体的组合物中约20％或更少的Fab区具有N-连接的高甘露糖聚糖。高甘露糖聚糖可以是总共具有5至9个甘露糖残基的聚糖。本文所用的“总”包括构成核心结构一部分的甘露糖残基(GlcNAc₂ Man₃)。高甘露糖聚糖可以是任意两种或更多种总共具有5至9个甘露糖残基的聚糖中的一种聚糖或聚糖的混合物。换言之，包含单克隆抗体的组合物可包含多个带有具有5个甘露糖残基的高甘露糖聚糖的Fab区、多个带有具有6个甘露糖残基的高甘露糖聚糖的Fab区、多个带有7个高甘露糖残基的Fab区、多个带有具有8个甘露糖残基的高甘露糖聚糖的Fab区和/或多个带有具有9个甘露糖残基的高甘露糖聚糖的Fab区。在某些情况下，可能没有8个甘露糖糖型或9个甘露糖糖型。包含单克隆抗体的组合物中每种高甘露糖糖型(即M5、M6、M7、M8和M9)的数量对本发明而言不重要，只要组合物中高甘露糖Fab区的相对含量，即相对于组合物中经糖基化的Fab区的总数，为约20％或更少。

通常，高甘露糖聚糖因此具有附接至GlcNAc₂ Man₃核心的2至6个甘露糖残基。因此，高甘露糖聚糖可以是Man5(GlcNAc₂ Man₅)；Man6(GlcNAc₂ Man₆)；Man7(GlcNAc₂ Man₇)；Man8(GlcNAc₂ Man₈)或Man9(GlcNAc₂ Man₉)。本公开的高甘露糖聚糖可以是Man5、Man6、Man7、Man8和Man9糖型中的一者或混合物。

在本发明的优选实施例中，高甘露糖聚糖为Man5、Man6和Man7糖型中的一者或混合物。通常，Man5、Man6和Man7糖型中的每一种糖型均存在于高甘露糖聚糖组合物中。这些糖型如图1所示。可能存在可忽略量(即0.1％或更少)的Man8或Man9糖型。通常，在该实施例中，Man8和Man9均不以任何显著量存在。

每种高甘露糖糖型的相对量，例如组合物中单克隆抗体经糖基化的Fab区的Man5、Man6和Man7中的每一者都不重要，只要组合物中单克隆抗体的经糖基化的Fab区中的高甘露糖糖型总量为约20％或更少或落在上述百分比范围内。因此，本发明设想，在包含单克隆的抗体组合物中，约0％至10％、约0％至12％、约0％至15％或约0％至20％的Fab高甘露糖聚糖包含Man5、Man6或Man7中的一者或多者，优选约2％至10％、约2％至12％、约2％至15％或约2％至20％或约4％至10％、约4％至12％、约4％至15％或约4％至20％的Fab高甘露糖聚糖包含Man5、Man6或Man7中的一者多者。“一者/个或多者/个”在这方面是指Man5、Man6和Man7中的一者、两者或三者，其中组合可以是Man5和Man6、Man5和Man7、Man6和Man7或者Man5、Man6和Man7。

在本发明的该方面，少于80％，优选少于约85％、约88％或约90％，更优选约80％至约98％、约85％至约98％、约88％至约98％或约90％至约98％，或约80％至约96％、约85％至约96％、约88％至约96％或约90％至约96％的Fab区中的N-连接的糖基化包含不同于高甘露糖的聚糖结构，并且该聚糖结构选自半乳糖基化结构、唾液酸化结构、杂合甘露糖结构或甘露糖型结构。该组合物可含有小百分比(例如少于约5％)的不含任何N-连接糖基化的抗体。

杂合甘露糖或甘露糖/甘露糖型结构不包括上述高甘露糖糖型。也可能存在“未鉴定的”聚糖形式。不是高甘露糖的糖型的确切性质对于本发明而言不是必需的。通常，此类糖型结构包括G1、G2、G1S1、G2S1、G2S2、hM3G1、hM4G1、hM5G1、hM3、hM4、hM4G1S1、hM3G1S1、hM5G1S1、M3和M4。这些结构在图1中示出。在优选的实施例中，包含单克隆抗体的组合物中少于80％的Fab区具有选自半乳糖基化和唾液酸化的N-连接的聚糖结构。特别优选的此类结构包括G1、G2、G1S1、G2S1、G2S2、hM3G1S1、hM4G1S1和hM5G1S1。本发明设想一种包含单克隆抗体的单克隆抗体组合物，该单克隆抗体在其一个或多个Fab区中具有N-糖基化，其中相对于组合物中经糖基化的Fab区的总量，组合物中约20％或更少的Fab区具有N-连接的高甘露糖聚糖，且组合物中约80％或更多的Fab区具有N-连接的半乳糖基化聚糖、唾液酸化聚糖、杂合甘露糖聚糖或甘露糖聚糖。高甘露糖聚糖、半乳糖基化聚糖、唾液酸化聚糖、杂合甘露糖聚糖和甘露糖/甘露糖型聚糖的结构可以是本文所述的任何一种或多种结构。

在本发明的该方面，单克隆抗体为特异性靶向抗原上单个表位的同质抗体群体。单克隆抗体在其一个或多个Fab区中经N-糖基化。众所周知，单克隆抗体由一个Fc片段和两个Fab片段组成。本发明该方面的组合物中的单克隆抗体可以在一个或两个抗原结合片段处具有N-糖基化，即抗体可以经单糖基化或双糖基化。因此，在一个实施例中，本发明组合物中的单克隆抗体经双糖基化，即它在两个抗原结合片段(Fab区)处均经N-糖基化，并且在另一个实施例中，组合物中的单克隆抗体经单糖基化，即它仅在一个抗原结合片段(Fab区)处经N-糖基化。本发明的组合物可含有基本上纯的单糖基化抗体、基本上纯的双糖基化抗体或者单糖基化抗体和双糖基化抗体的混合物。

Fab区中在该处存在N-糖基化的位点将取决于组合物中的单克隆抗体。N-糖基化通常发生在重链(V_H)区的可变区中的天冬酰胺(Asn)处。潜在的糖基化位点包含抗体的一条或多个重链中的氨基酸序列中的Asn-X-Ser/Thr基序，并且包含在本发明组合物中的单克隆抗体可以天然地含有此类糖基化位点，或可以经工程化改造以引入此类糖基化位点，从而促进抗体多样化。

包含在本发明该方面的组合物中的单克隆抗体可以是治疗性抗体或诊断性抗体，优选治疗性单克隆抗体。在另一实施例中，抗体为嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。

在某些实施例中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体在以下文献中描述：例如，美国专利号4,816,567和Morrison等人，P.N.A.S.81(1984)6851-6855。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(诸如猴)的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体为其中类别或亚类已经与亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施例中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，而FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。

可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

在某些实施例中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。

可以通过以下方式来制备人抗体：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座，或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSE^TM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M/>技术的美国专利号7,041,870，以及描述/>技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。可以进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。

人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人，J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)所述。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。

人抗体还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的可变结构域序列产生。然后可以将此类可变结构域序列与预期的人恒定结构域结合。

尽管本发明该方面的组合物通常含有完整抗体，但本发明也拓展至抗体片段，该抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、Fv、单链Fab(scFab)；单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(dAb)，并且拓展至生物仿制药。

在某些实施例中，本文提供的抗体为包含Fab N-糖基化位点的抗体片段。术语“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包括保留与抗原特异性结合能力的完整抗体的一部分。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、Fv、单链Fab(scFab)；单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(dAb)。关于某些抗体片段的综述，请参见Holliger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136(2005)。

在一个实施例中，抗体片段为Fab、Fab'、Fab'-SH或F(ab')₂片段，特别是Fab片段。木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段，每个“Fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域(分别为VH和VL)以及轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，术语“Fab片段”是指包括包含VL结构域和CL结构域的轻链以及包含VH结构域和CH1结构域的重链片段的抗体片段。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于Fab'片段在CH1结构域的羧基端添加残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是Fab’片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')₂片段，该片段具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')₂片段的讨论，请参见美国专利号5,869,046。

在另一个实施例中，抗体片段是双体抗体、三体抗体或四体抗体。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。Hudson等人在《自然医学》(Nat.Med.)9:129-134(2003)中还描述了三体抗体和四体抗体。

在又一实施例中，抗体片段是单链Fab片段。“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中抗体结构域和接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL、b)VL-CL-接头-VH-CH1、c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL。特别地，所述接头是至少30个氨基酸，优选地在32个与50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab片段可以通过经由***半胱氨酸残基(例如，根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)生成链间二硫键，而进一步稳定化。

在另一实施例中，抗体片段为单链可变片段(scFv)。“单链可变片段”或“scFv”是抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的融合蛋白，是通过接头连接的。特别地，接头是10个至约25个氨基酸的短多肽，并且通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可以将VH的N-末端与VL的C-末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并且引入了接头，但该蛋白质仍保留了原始抗体的特异性。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，载于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑(Springer-Verlag,New York)，第269至第315页(1994)；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。

在另一实施例中，抗体片段为单结构域抗体。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利6,248,516B1)。

在本公开中，抗体片段不同于完整抗体，包含Fab N-糖基化位点并且包含保留与抗原特异性结合的能力的完整抗体的一部分。

抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如CHO)重组产生，如本文所述。

在某些实施例中，本文提供的抗体为多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点(即，不同抗原上的不同表位或相同抗原上的不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，结合特异性中的一种特异性是针对人A-β的，并且另一种特异性是针对任何其他抗原的。在某些实施例中，该另一种特异性是针对转铁蛋白受体的，如EP 3356400中所述。此类抗体可用于诊断或治疗阿尔茨海默病。在一个实施例中，对人A-β的结合特异性由更汀芦单抗或其一部分提供。在某些实施例中，双特异性抗体可与A-β上的两个(或更多个)不同表位结合。多特异性(例如，双特异性)抗体也可用于将细胞毒性剂或细胞定位到表达A-β的细胞。可以将多特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。

用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983))及“杵臼结构”工程化(参见例如，美国专利5,731,168，以及Atwell等人，J.Mol.Biol.270:26(1997))。多特异性抗体还可以通过以下方式来制备：工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电操纵效应(参见例如，WO 2009/089004)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如，美国专利号4,676,980，以及Brennan等人，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用用于避免轻链错配问题的常用轻链技术(参见例如，WO 98/50431)；使用用于制备双特异性抗体片段的“双体抗体”技术(参见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。

双特异性抗体或其抗原结合片段也包括“双重作用Fab”或“DAF”，其包含与A-β上的构象表位以及另一种不同抗原结合或与A-β上的两个不同表位结合的抗原结合位点(参见，例如，US 2008/0069820和WO 2015/095539)。

本发明涉及在其一个或多个Fab区中具有糖基化的任何单克隆抗体，特别是治疗性抗体。

治疗性抗体包括西妥昔单抗(Cetuximab)，它在V_H CDR2中具有N-糖基化位点，在V_H区的Asn 99处含有N-聚糖；索拉珠单抗(Solanezumab)，它在V_H CDR2中具有N-糖基化位点；和人A-β抗体诸如更汀芦单抗，它在V_H区的Asn 52处含有N-聚糖。

索拉珠单抗为一种针对Aβ肽的中间结构域的人源化单克隆IgG1抗体。它识别可溶性单体Aβ而非纤维状Aβ。

西妥昔单抗为一种表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂，用于治疗转移性结直肠癌、转移性非小细胞肺癌和头颈部癌。它是以商品名Erbitux^TM销售的嵌合单克隆抗体。

更汀芦单抗为一种完全人IgG1单克隆抗体，旨在以亚纳摩尔亲和力结合Aβ原纤维上的构象表位，用于治疗阿尔茨海默病。更汀芦单抗也称为RO4909832和RG1450。更汀芦单抗在EP 1960428 B1中有所描述。一般而言，更汀芦单抗IgG-Fc区的重链恒定结构域2(CH2)通过寡糖在天冬酰胺306(对应于Kabat***中的Asn 297)处的共价附接而经N-糖基化。此外，更汀芦单抗在V_H(Fab)区的CDR2(SEQ ID NO:2)中的天冬酰胺52处经N-糖基化。

在一个优选实施例中，本发明组合物中的单克隆抗体是人A-β抗体，优选更汀芦单抗。

更汀芦单抗的重链包含V_H结构域，该结构域包含：

CDR1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；

CDR2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和

CDR3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

更汀芦单抗的轻链包含V_L结构域，该结构域包含：

CDR1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；

CDR2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和

CDR3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

在特定实施例中，更汀芦单抗的V_H结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；且更汀芦单抗的V_L结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

在本发明的特定实施例中，更汀芦单抗的重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在本发明的特定实施例中，更汀芦单抗的轻链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

在特别优选的实施例中，单克隆抗体为更汀芦单抗、包含更汀芦单抗的双特异性抗体或包含经糖基化的Fab区并保留结合抗原的能力的更汀芦单抗片段。在这些实施例中，单克隆抗体具有如上文SEQ ID No:1至6所示的V_H和V_L CDR氨基酸序列，以及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的V_H和V_L结构域氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:9和10的氨基酸序列的重链和轻链。

因此，本发明提供一种包含单克隆抗体的组合物，该单克隆抗体包含：包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的V_H CDR1；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的V_H CDR2；包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的V_H CDR3；包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的V_L CDR1；包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的V_L CDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的V_L CDR3，所述组合物包含相对于该组合物中V_H糖基化的Fab区的总量的约20％或更少的高甘露糖Fab糖型，其中所述糖基化为在抗体的CDR2中Asn52处的N-糖基化。

替代性地，或另外，本发明提供包含单克隆抗体的组合物，该单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的V_H结构域，和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的V_L结构域；所述组合物包含相对于组合物中V_H糖基化的Fab区总量的约20％或更少的所述抗体的高甘露糖Fab糖型，其中所述糖基化为在SEQ ID NO:7中Asn52处的N-糖基化。

替代性地，或另外，本发明提供包含单克隆抗体的组合物，该单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链；所述组合物包含相对于组合物中V_H糖基化的Fab区总量的约20％或更少的所述抗体的高甘露糖Fab糖型，其中所述糖基化为在SEQ ID NO:9中Asn52处的N-糖基化。

在任何或全部上述方面中，单克隆抗体更汀芦单抗也可以在其Fc区中经N-糖基化。

在替代性的优选实施例中，单克隆抗体为包含更汀芦单抗的双特异性抗体。在该实施例中，双特异性抗体包含与人转铁蛋白受体结合的额外Fab片段。在该实施例中，双特异性抗体包含：

-氨基酸序列为SEQ ID NO:9的重链；

-氨基酸序列为SEQ ID NO:10的轻链；

-氨基酸序列为SEQ ID NO:11的重链Fab片段；和

-氨基酸序列为SEQ ID NO:12的轻链。

各种研究已经表明，糖基化特征的性质(诸如与治疗性或诊断性单克隆抗体的Fab区N-连接的高甘露糖糖型的相对含量)对药代动力学(PK)有影响。特别地，动物研究表明，Fab高甘露糖物质在体内可快速清除。这种如图10所示。

mAb在体内的“清除率”将决定人体对于mAb的“暴露”–这进而决定抗体药效学(PD)效应的程度。暴露-应答(PK-PD)关系决定了药物对于身体的效应的结果。先前研究已经表明，在抗体的Fc区处的糖基化可能与PK相关，其中聚糖与其受体的结合引起聚糖介导的清除和组织分布。已经被归因于体内糖蛋白去除的聚糖受体包括甘露糖受体(ManR)和脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，两者均为碳水化合物特异性内吞受体。如Liu等人，J.Pharmaceutical Sciences(2015)104:1866-1884所报道，经糖基化的mAb(仅具有Fc糖基化)以及故意制造的具有末端高甘露糖聚糖的mAb已被证明可以迅速从血液中清除并定位于肝脏中。

通过控制单克隆抗体，且特别是人A-β抗体诸如更汀芦单抗的V_H N-连接的聚糖中甘露糖的相对量，本发明人已经证明，他们可以控制抗体清除并因此控制身体对于抗体效应的暴露。其中在一个或多个Fab N-糖基化位点处的特定糖型的相对量受到控制的均质抗体群体的生产因此导致具有一致的药理学特征的治疗。换句话说，调节Fab糖型分布影响抗体的药理学特征。

在本文的一个实施例中，根据本文的方法产生的更汀芦单抗，特别是具有约2％至10％，优选约4％至10％的高甘露糖的更汀芦单抗，在循环中停留更长时间并且具有比通常根据不同方法生产的具有更高的高甘露糖聚糖相对量的更汀芦单抗更好的生物利用度。如本文的实例所示，使用其中在Fab N-糖基化位点处的高甘露糖(M5至M7)相对量在约5％与6％之间的抗体(例如当根据本文的方法生产抗体时)，与根据不同方法生产的更汀芦单抗(其中高甘露糖的相对含量为约13％(Man5至Man7))相比，可以在sc施用更汀芦单抗后在人体内实现约18％的生物利用度增加。

在本发明的该方面，可以单独或组合地采取以下特征中的任何特征或全部特征：

-动物为哺乳动物，优选是人；和/或

-单克隆抗体为抗人A-β抗体；和/或

-单克隆抗体为更汀芦单抗或双特异性更汀芦单抗，优选地其中双特异性更汀芦单抗对A-β和转铁蛋白受体具有结合特异性；和/或

-抗体组合物中高甘露糖糖型的相对含量为约2％至10％，优选4％至10％，且更优选5％至9％；和/或

-抗体根据本文所述的方法生产；和/或

-与通常根据不同方法生产的高甘露糖糖型相对含量为约13％的相同抗体相比，抗体的生物利用度增加约18％。

用于确定聚糖一级结构的技术是众所周知的并且在例如Montreuil,Polysaccharides in Medicinal Applications(1996)273-327中详细描述。因此，分离由细胞产生的肽群体并确定接附至该肽群体的聚糖的结构对于本领域一般技术人员来说是常规的事情。例如，有效的方法可用于(i)通过化学裂解诸如水解、乙酰解、肼解或通过亚硝基脱氨作用来分割糖苷键；(ii)完全甲基化，然后是水解或甲醇解，以及经部分甲基化的单糖的气液色谱和质谱分析；和(iii)使用外切糖苷酶限定单糖之间的端基异构连接，这也通过连续降解提供对一级聚糖结构的洞察。荧光标记和随后的高效液相色谱(HPLC)，例如正相HPLC(NP-HPLC)、质谱和核磁共振(NMR)光谱，例如高场NMR，也可用于确定一级聚糖结构。

用于碳水化合物分析的试剂盒和设备也是商业上可获得的。荧光团辅助碳水化合物电泳(FACE)可从Glyko.Inc.(Novato,California).获得。在FACE分析中，在用于N-连接的聚糖的Endo H或N-聚糖酶(PNGase F)的作用下，糖缀合物通过从肽中释放出来。然后以非结构区分方式用荧光团在还原端标记聚糖。然后基于糖的荷质比以及流体力学体积，在聚丙烯酰胺凝胶中分离荧光团标记的聚糖。在UV光下拍摄凝胶图像，且聚糖的组成通过与标准品相比的迁移距离来确定。可以通过分析由于通过外切糖苷酶消化来连续去除糖类而导致的迁移变化，以这种方式对寡糖进行测序。

本文所述的方法包括糖基化变体的生产，例如通过不同于本文所述方法的方法鉴定的，只要这些变体落入本文关于高甘露糖的定义下。

对于具有Fc和Fab糖基化两者的抗体，分析N-聚糖的相对分布可以包括使用例如内切糖苷酶PNGaseF从抗体骨架裂解Fc聚糖，并通过超滤将释放的碳水化合物与蛋白质分离。然后可以通过快速PNGaseF消化来释放Fab聚糖，并且也通过超滤将其与蛋白质分离。Fc和Fab聚糖可以例如使用2-氨基苯甲酰胺独立地进行标记，然后通过带有荧光检测的HILICUHPLC(亲水相互作用色谱/超高效液相色谱)进行分析。

包含在本发明该方面的组合物中的单克隆抗体通常也将会在其Fc区中经N-糖基化。一般而言，Fc糖基化发生在C_H2结构域的Asn 297(或对应于Kabat***中Asn 297的等效保守Fc位置Asn)处。Fc区中的聚糖通常为复合双触角类型，且可包含七糖核心，其中臂糖的添加量可变。在一个实例中，Fc V_H区中的糖基化选自：

(a)没有核心岩藻糖基化的双触角复合型结构；

(b)双触角杂合型；或

(c)双天线低聚甘露糖型。

对Fc糖基化的控制在现有技术中有所描述并且在本领域技术人员的技能范围内。

2.生产在Fab区中具有N-连接的糖基化的Mab的高甘露糖糖型

在生物制药行业，补料分批CHO细胞培养为最常用的IgG生产过程。如Fan等人，Biotechnol.Bioeng.(2015)112(3)521-535所述，氨基酸和葡萄糖消耗、细胞生长、代谢、抗体滴度和IgG Fc区中的N-糖基化模式一直是上游过程优化期间的主要关注点，其中培养物中葡萄糖和葡萄糖浓度的平衡对于细胞生长、IgG滴度和N-糖基化很重要。

不受任何特定理论的束缚，本发明人已经发现，在被表达的抗体的生物利用度与抗体组合物中相对于总N-连接的经糖基化的Fab的高甘露糖Fab糖型的含量之间存在关系。此外，本发明人已经发现，抗体聚糖中所需的相对高甘露糖含量可以通过在细胞的培养和生长以及抗体在培养物中的生产期间调节培养基中细胞的碳水化合物源的平均浓度来实现。

由于重组细胞的生长和所生产的抗体的糖基化两者均需要营养物质诸如葡萄糖，因此历经部分或全部发酵过程，培养基中葡萄糖的平衡非常重要。例如，如果存在的葡萄糖过多，细胞可能生长良好，但所产生的抗体的高甘露糖Fab糖型的相对含量可能高到对于抗体组合物的生物利用度产生有害效应。在另一实例中，允许葡萄糖浓度在培养时间段内显著或实质性波动也可能影响细胞生长和所表达的抗体中的相对聚糖含量中的任一者或两者。当制定以下方法时，本发明人已经考虑了这些因素。

如在涉及Fab组合物的公开中，以下方面的单克隆抗体在其一个或多个Fab区中具有N-连接的高甘露糖聚糖。在整个以下公开中，对“高甘露糖Fab糖型”的引用与早先描述的Fab组合物一样，是指N-连接的此类糖型。

在该方面，本发明提供一种用于降低抗体从已施用该抗体的动物的循环中清除的速率的方法，该方法包括调节在包含抗体的组合物中经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的相对含量。

在该方面，本发明也提供一种用于增加经糖基化的单克隆抗体在已施用该抗体的动物的循环中的生物利用度的方法，该方法包括调节在包含抗体的组合物中经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的相对含量。

通常，在上述方法中，该调节将导致，相对于包含抗体的组合物中经糖基化的Fab区的总数，该组合物中经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型为20％或更少。

通常，与通过其中包含在组合物中的抗体中的高甘露糖Fab糖型的相对含量未以本文公开的方式进行调节的方法生产的相同抗体相比，其中抗体的高甘露糖Fab糖型的相对含量根据本文所述的方法进行调节的抗体从已施用该抗体的动物的循环中清除的速率降低至少约4个百分点，优选至少约5个百分点。

用于调节包含在本发明的组合物中的经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的相对含量的方法可包括：历经发酵的全部的或部分的生产阶段，在用于通过在其中对表达单克隆抗体的真核细胞进行发酵来生产经糖基化的单克隆抗体的培养基中，优化该真核细胞的碳水化合物源的浓度。也可以优化培养基中其他营养素的浓度。

该方法可进一步包括从培养基中回收单克隆抗体的步骤。

在本发明的这些实施例中且如上所定义，“相对”含量意为组合物中单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的含量相对于全部其他Fab糖型的含量。如上所述，糖型的含量通常表示为百分比。

在本发明的一个实施例中，在组合物中，高甘露糖Fab糖型占单克隆抗体的总Fab糖型的约20％或更少。这是优选的糖型分布。

抗体组合物本身(即上述方法的产物)的特征如上一节所述。单克隆抗体组合物本身的任何特征或特征的组合同样适用于本发明该方面的方法的产物，并且读者参考说明书的以上部分以避免在此重复。

在下面的描述中，葡萄糖为示例性的碳水化合物源。然而，葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖或麦芽糖中的任何一种或其组合都可以是培养细胞的碳水化合物源。

在本发明方法的一个优选方面，优化培养基中的葡萄糖浓度以便实现组合物中单克隆抗体的Fab高甘露糖糖型的期望相对含量(期望糖型分布)。一方面，葡萄糖浓度的优化涉及监测和控制培养基中的葡萄糖浓度。监测和控制培养基中葡萄糖和任选使用的一种或多种其他营养素的浓度可在整个培养过程中进行，或在培养过程的一部分期间进行，或可在培养过程的一个或多个阶段期间进行，通常仅在生产阶段或生产阶段的一部分期间进行，按需要进行。在替代性情况下，平均葡萄糖浓度和任选使用的其他营养素的浓度可以基于例如来自早前发酵的经验进行优化，以实现期望的糖型分布。在这种情况下，可能不需要监测发酵/生产的全部或部分过程中的浓度。

在本发明方法的优选方面，培养基中的葡萄糖浓度经优化以实现期望的、任选地优选的糖型分布。

在上述方面，浓度在全部或部分的发酵过程中，通常是在生长和/或生产的全部或部分阶段经优化。在一种情况下，葡萄糖浓度历经全部生长阶段或历经部分生长阶段经优化。在一种情况下，葡萄糖浓度历经全部生产阶段或历经部分生产阶段经优化。在一种情况下，葡萄糖浓度历经全部的或部分的生长阶段及历经全部的或部分的生产阶段经优化。

在本发明的方法和/或上述优选的方面中，为了在组合物中实现约20％或更少的单克隆抗体的Fab N-连接的高甘露糖糖型，在单克隆抗体生产中培养过程的生产阶段，培养基中葡萄糖的平均量为约0.50g/L至约18.00g/L，优选约1.50g/L至约14.00g/L，且更优选约2.00g/L至约12.50g/L。

通常，为了在单克隆抗体组合物中实现约2％与约15％之间的相对Fab高甘露糖糖型含量，在单克隆抗体的生产中、在培养过程的生产阶段，培养基中葡萄糖的平均浓度抗体在约1.50g/L与约14.00g/L之间。

如本文所述，培养的生产阶段可以是5至约18天，例如约10、11、12、13、14、15、16、17或18天，视情况而定。在本公开中，收获日被认为是第0天，生产阶段的天数从收获日倒数。因此，对于14天的过程，接种日将会是第-14天。由于发酵结束是生产阶段并且为在此期间形成抗体的时间，因此从收获开始计数导致平均葡萄糖浓度的更具代表性的计算。

在该方面，包含葡萄糖和任选使用的细胞培养和生长以及抗体表达所需的其他营养素的营养素补料在整个生产阶段以分次剂量、经由连续机制或如本文所述的定期推注补料提供至培养基。

对于上述方法，葡萄糖的平均浓度考虑了细胞对葡萄糖的消耗。

一方面，本发明设想一种用于调节包含在本发明的组合物中的经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的相对含量的方法，该方法包括在发酵的生产阶段期间，在用于通过在其中对表达单克隆抗体的真核细胞进行发酵来生产经糖基化的单克隆抗体的培养基中，优化葡萄糖的浓度。在标准发酵条件下，也可以优化其他营养素的浓度。在全部的或部分的生产阶段期间，优化培养基中的葡萄糖浓度。

另一方面，本发明提供一种单克隆抗体组合物，其通过上述方法可获得。

葡萄糖补充

在本发明的方法中，葡萄糖的浓度可经优化，任选地通过历经整个或部分培养期，例如历经整个或部分生产阶段，监测和控制培养基中的浓度，使得葡萄糖的平均浓度导致所表达抗体的Fab部分中期望的糖型分布。

根据实现期望的高甘露糖糖型分布所需的适当葡萄糖浓度的经验，可能不需要监测葡萄糖浓度。在这种情况下，根据需要历经整个或部分培养过程将葡萄糖和任选的其他组分包含在或添加至初始培养基和/或补料中将会实现期望的糖型分布。

在一个实施例中，葡萄糖浓度的监测和控制在生产阶段期间进行，通常在生产阶段的第-14天至第0天(收获)，例如第-13天至第0天、第-12天至第0天、第-11天至第0天、第-10天至第0天、第-9天至第0天、第-8天至第0天、第-7天至第0天、第-6天至第0天、第-5天至第0天或第-4天至第0天进行。

在一个实施例中，葡萄糖浓度的监测和控制在生产阶段期间进行，通常在生产阶段的第-14天至第-1天、第-2天、第-3天、第-4天或第-5天中的任一天，例如，第-14天至第-1天、第-14天至第-2天、第-14天至第-3天、第-14天至第-4天、第-14天至第-5天；第-13天至第-1天、第-13天至第-2天、第-13天至第-3天、第-13天至第-3天、第-13天至第-4天、第-13天至第-5天；第-12天至第-1天、第-12天至第-2天、第-12天至第-3天、第-12天至第-4天、第-12天至第-5天；第-11天至第-1天、第-11天至第-2天、第-11天至第-3天、第-11天至第-4天、第-11天至第-5天；第-10天至第-1天、第-10天至第-2天、第-10天至第-3天、第-10天至第-4天、第-10天至第-5天；第-9天至第-1天、第-9天至第-2天、第-9天至第-3天、第-9天至第-4天、第-9天至第-5天；第-8天至第-1天、第-8天至第-2天、第-8天至第-3天、第-8天至第-4天、第-8天至第-5天；第-7天至第-1天、第-7天至第-2天、第-7天至第-3天、第-7天至第-4天、第-7天至第-5天；第-6天至第-1天、第-6天至第-2天、第-6天至第-3天、第-6天至第-4天、第-6天至第-5天；第-5天至第-1天、第-5天至第-2天、第-5天至第-3天、第-5天至第-4天；或第-4天至第-1天、第-4天至第-2天或第-4天至第-3天进行。

在优选的实施例中，从生产阶段的第-7天至第0天监测和控制葡萄糖浓度。

在优选的实施例中，培养基中的葡萄糖浓度经优化，任选地通过在生产阶段的第-7天至第0天监测和控制该浓度来进行。如果需要，可以每天一次、每天两次或更频繁地监测葡萄糖浓度和任选使用的其他营养物的浓度。替代性地，监测可以在生产阶段每2天、每3天、每4天、每5天进行，或进行一次或两次。当监测超过一种营养素时，它们全部可以在相同或不同的日子、相同或不同的时间进行监测。

下文描述了用于监测葡萄糖浓度的方法。对培养基中葡萄糖浓度的控制通常通过向培养基中添加葡萄糖来进行。调节葡萄糖的浓度以历经生产阶段达到期望的平均值，任选地，通过将葡萄糖包含在培养基例如基础培养基中及/或通过将其添加至培养基中，例如通过本领域的典型方法和/或如下所述来仅。如果需要，可以使用本领域的典型方法在相同时间或不同时间监测其他营养素的浓度以监测葡萄糖浓度和按需要调整的那些其他营养素的浓度。

因此，本公开包括一种用于调节包含在本发明的组合物中的经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的相对含量的方法，该方法包括在发酵的生产阶段期间将葡萄糖添加至包含能够表达经糖基化的单克隆抗体的真核细胞的培养基中。

在该方面，可以在全部的或部分的生产阶段期间将葡萄糖添加至培养基中，通常在生产阶段的至少第-7天至第0天添加。如下所述，添加至培养基中的葡萄糖的量取决于基础培养基中的葡萄糖的量、细胞对葡萄糖的消耗以及历经全部或部分生产阶段的平均葡萄糖浓度，该平均葡萄糖浓度与所生产的抗体中期望的相对Fab高甘露糖含量相关。这些特征在下面有更详细的说明。

本公开显示历经全部的或部分的生产阶段的培养基中的平均葡萄糖浓度与所生产的抗体中的相对Fab高甘露糖含量之间的相关性。因此，在优选方面，其如图2中所示：

-如果发酵产生的经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型(即Man5、Man6和Man7)的期望相对含量为约7％，则培养基中葡萄糖的平均浓度在约第-7天与收获(第0天)之间可以为在约3.00g/L与约6.00g/L之间；

-如果发酵产生的经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型(即Man5、Man6和Man7)的期望相对含量为约10.5％，则培养基中葡萄糖的平均浓度在约第-7天与收获(第0天)之间可以为在约6.00g/L与约9.00g/L之间；

-如果发酵产生的经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型(即Man5、Man6和Man7)的期望相对含量为约13％，则培养基中葡萄糖的平均浓度在约第-7天与收获(第0天)之间可以为在约9.00g/L与约11.00g/L之间；且

-如果发酵产生的经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型(即Man5、Man6和Man7)的期望相对含量为约15％，则培养基中葡萄糖的平均浓度在约第-7天与收获(第0天)之间可以为在约11.00g/L与约14.00g/L之间。

在替代性方面：

-如果发酵产生的经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型(即Man5、Man6和Man7)的期望相对含量为约0％至6％，则培养基中葡萄糖的平均浓度在约第-7天与收获(第0天)之间可以为在约0g/L与约3.00g/L之间；

-如果发酵产生的经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型(即Man5、Man6和Man7)的期望相对含量为约6％至8％，则培养基中葡萄糖的平均浓度在约第-7天与收获(第0天)之间可以为在约3.00g/L与约6.00g/L之间；

-如果发酵产生的经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型(即Man5、Man6和Man7)的期望相对含量为约8％至10％，则培养基中葡萄糖的平均浓度在约第-7天与收获(第0天)之间可以为在约4.00g/L与约8.00g/L之间；

-如果发酵产生的经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型(即Man5、Man6和Man7)的期望相对含量为约10％至12％，则培养基中葡萄糖的平均浓度在约第-7天与收获(第0天)之间可以为在约6.00g/L与约10.00g/L之间；且

-如果发酵产生的经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型(即Man5、Man6和Man7)的期望相对含量为约12％至15％，则培养基中葡萄糖的平均浓度在约第-7天与收获(第0天)之间可以为在约9.00g/L与约14.00g/L之间。

为了实现历经全部的或部分的生产阶段的平均葡萄糖浓度，可以例如每天确定培养基中的葡萄糖浓度，并根据所确定的浓度胺需要将葡萄糖添加至培养基中。葡萄糖在培养期间被消耗。如图3C所示，对于5.60g/L的历经生产阶段第-7天至第0天的期望葡萄糖平均浓度，在测量培养基中的葡萄糖浓度后每天将一定量的葡萄糖添加至培养物中以带至每日浓度为7.00g/L。因此，为了实现期望的平均浓度而添加至培养物中的葡萄糖的量取决于测得的浓度。低于检测限的葡萄糖浓度将会记为0g/L。

上述相对Fab高甘露糖含量和相关的平均葡萄糖浓度特别适用于更汀芦单抗的生产方法。

葡萄糖和其他营养素通常将会存在于或添加至培养基中，即，将单克隆抗体生产细胞转移到其中以用于生产阶段的基础培养基。例如，可以从为细胞生长定制的培养基转移。基础培养基的确切性质对于本发明不是必需的。化学上明确的培养基在近年得到了广泛的开发和发布，包括用于培养哺乳动物细胞的此类培养基。成分明确的培养基的全部成分均经充分表征，且此类培养基不含复杂添加剂诸如血清和水解产物。通常，这些培养基包括明确数量的经纯化的生长因子、蛋白质、脂蛋白和其他可能以其他方式由血清或提取物补充剂提供的物质。生产此类培养基的唯一目的是支持高产细胞培养。如果不包括低蛋白培养基的典型组分，即胰岛素和转铁蛋白，某些成分明确的培养基可称为低蛋白培养基或可以是不含蛋白质的。无血清培养基可以其他方式用于本发明的方法中。此类培养基在正常情况下不含血清或蛋白质成分，但可能含有不明确的组分。

市售培养基的实例包括Ham's F10(Sigma)、基本必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM，Sigma)以及Life Technologies销售的化学上明确的培养基和补料补充剂。此类介质中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)；盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、氨基酸、缓冲剂(诸如HEPES)；核苷(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM)和葡萄糖或等效能量源。这些培养基中的任何一种都可以用作基础培养基，按需要添加葡萄糖和其他营养素以遵循本文所述的方法。

在优选的实施例中，细胞在化学上明确的培养基中培养，该培养基包含葡萄糖和细胞培养以及抗体的生长和表达通常需要的其他营养素。

培养基的必需营养素，包括用于特定细胞系的它们的浓度，是根据经验确定的，且无需进行过多的实验，如在例如以下文献中所述：Mammalian Cell Culture,Mather(Plenum Press:NY 1984)；Barnes and Sato,Cell 22(1980)649或Mammalian CellBiotechnology:A Practical Approach M.Butler(IRL Press,1991)。合适的培养基含有基础培养基组分，诸如基于DMEM/HAM F12的配制物，其中一些组分(诸如氨基酸、盐、糖和维生素)的浓度有所改变，并且任选地含有甘氨酸、次黄嘌呤、胸苷、重组人胰岛素、水解的蛋白胨诸如PRIMATONE HS^TM或PRIMATONE RL^TM(Sheffield,England)或等效物、细胞保护剂诸如PLURONIC F68^TM或等效的pluronic多元醇和抗生素诸如GENTAMYCIN^TM。

葡萄糖可以作为营养素补料的一部分添加至发酵过程中，既可以作为推注添加，也可以连续添加。通常在本发明的方法中，三种营养素补料将在生产阶段期间通过推注给予。根据细胞的要求和所使用的生产方案，这些推注补料可能含有或可能不含葡萄糖和其他营养素。例如，如果葡萄糖是营养素补料的一部分，则通常在给予营养素补料的那一天不需要单独添加葡萄糖。如果给予超过一次推注，则每次推注可包含相同或不同浓度的葡萄糖。推注或连续补料的体积基于培养需要来确定。这样做的方法为本领域中常规的。营养素补料可以由与接种培养物相同的培养基组成，或者可以专门为特定培养物配制。通常，此类营养补料将会含有其他组分，该其他组分是例如通过细胞代谢从细胞培养基中耗尽的并且是确保生物量生成和抗体生产所需的。此类补充组分可包括例如激素、生长因子、离子、维生素、核苷、微量元素、氨基酸或脂质。替代性地，可以将葡萄糖作为单个营养素添加至发酵过程中。补充组分可以组合或单独地添加，根据需要一次性地或在一系列添加中添加以补充耗尽的营养素。

当使用上述平均浓度方法时，向细胞培养基中添加葡萄糖的频率或体积或模式对本发明不是特别重要，只要培养物中葡萄糖的平均浓度(以实现期望的糖型分布)历经生产阶段得以维持。

可以通过连续添加将葡萄糖与其他营养素结合或单独地添加至发酵过程中。当使用连续补料时，在生产阶段添加至培养基中的葡萄糖和/或那些营养素的量可以通过调整补料速率和/或体积而变化，例如每天、每2天、每3天等或在整个24小时的时间段内定期变化，取决于历经该培养的期望平均浓度。

当根据本发明的方法添加至培养物以影响高甘露糖Fab生产时，可以在生产(n)阶段的任何一天或每一天将葡萄糖添加至发酵过程。生产阶段的持续时间可能取决于所使用的培养方法和/或可能取决于用于接种培养基的细胞密度，例如约1x10⁵至约20x10⁵个细胞/mL的接种细胞密度通常将会需要长达10至18天的生产阶段。然而，当使用更高的接种细胞密度时，例如从大约21x10⁵至大约200x10⁵个细胞/ml，生产阶段的持续时间可以减少到例如6至10天。高接种细胞密度可以通过例如强化过程来达到，例如培养第n-1步的灌注过程。在本发明的一个实施例中，生产阶段从接种开始长达7至18天，优选7至10天或10至18天或14至17天。

在本公开中，收获日被认为是第0天，并且因此，对于14天的生产过程，该天数是倒数的，这样接种日将会是第-14天。由于发酵结束是生产阶段并且为在此期间形成并表达抗体的时间，因此从收获开始计数导致平均葡萄糖浓度的更具代表性的计算。因此，计算第-7天至第0天之间的平均葡萄糖浓度与培养持续时间和生产阶段的接种细胞密度无关。在本发明中，计算从第7天至第14天的平均值(其中收获是在第14天并且是“向前”计数的)等于计算从第-7天至第0天的平均值，其中收获是在第0天并且是“向后”计数的。

在本发明方法的一方面，将葡萄糖添加至培养基中以实现历经生产阶段或其一部分的期望平均葡萄糖浓度，从而导致单克隆抗体的高甘露糖糖型的期望相对百分比。为其计算平均值的生产阶段的时间段可能取决于用于对培养基进行接种的细胞密度，并因此取决于生产阶段的持续时间。因此，随着生产阶段的缩短，计算/维持平均值所历经的天数也会缩短。例如，接种细胞密度为约1x10⁵至约20x10⁵个细胞/ml且生产期为10至18天，则平均葡萄糖浓度通常从第-18天、第-17天、第-16天、第-15天、第-14天、第-13天、第-12天、第-11天、第-10天、第-9天、第-8天或第-7天中的一天与第0天、第-1天、第-2天、第-3天、第-4天或第-5天中的任一天组合来计算。例如，平均葡萄糖浓度可以历经生产阶段的第-18天至第0天、第-18天至第-1天、第-18天至第-2天、第-18天至第-3天、第-18天至第-4天、第-18天至第-5天；历经第-17天至第0天、第-17天至第-1天、第-17天至第-2天、第-17天至第-3天、第-17天至第-4天、第-17天至第-5天；历经第-16天至第0天、第-16天至第-1天、第-16天至第-2天、第-16天至第-3天、第-16天至第-4天、第-16天至第-5天；历经第-15天至第0天、第-15天至第-1天、第-15天至第-2天、第-15天至第-3天、第-15天至第-4天、第-15天至第-5天；历经第-14天至第0天、第-14天至第-1天、第-14天至第-2天、第-14天至第-3天、第-14天至第-4天、第-14天至第-5天；历经第-13天至第0天、第-13天至第-1天、第-13天至第-2天、第-13天至第-3天、第-13天至第-3天、第-13天至第-4天、第-13天至第-5天；历经第-12天至第0天、第-12天至第-1天、第-12天至第-2天、第-12天至第-3天、第-12天至第-4天、第-12天至第-5天；历经第-11天至第0天、第-11天至第-1天、第-11天至第-2天、第-11天至第-3天、第-11天至第-4天、第-11天至第-5天；历经第-10天至第0天、第-10天至第-1天、第-10天至第-2天、第-10天至第-3天、第-10天至第-4天、第-10天至第-5天；历经第–天至第0天、第-9天至第-1天、第-9天至第-2天、第-9天至第-3天、第-9天至第-4天、第-9天至第-5天；历经第-8天至第0天、第-8天至第-1天、第-8天至第-2天、第-8天至第-3天、第-8天至第-4天、第-8天至第-5天；历经第-7天至第0天、第-7天至第-1天、第-7天至第-2天、第-7天至第-3天、第-7天至第-4天、第-7天至第-5天计算。

如果接种细胞密度大于约21x10⁵个细胞/ml且高达约200x10⁵个细胞/ml，生产阶段通常将会为6至10天，且平均葡萄糖浓度通常从第-9天至第0天、第-8天至第0天或第-7天至第0天、第-9天至第-1天、第-8天至第-1天或第-7天至第-1天、第-9天至第-2天、第-8天至第-2天或第-7天至第-2天、第-9天至第-3天、第-8天至第-3天或第-7天至第-3天或第-9天至第-4天、第-8天至第-4天或第-7天至第-4天计算。

在优选的实施例中，当细胞在已经含有葡萄糖的培养基(即，用于生产阶段的基础培养基含有葡萄糖)中培养并且将补充的葡萄糖添加至培养物中以影响根据本发明方法的高甘露糖Fab生产时，可以在生产阶段的第-18天至第0天、第-17天至第0天、第-16天至第0天、第-15天至第0天或第-14天至第0天、第-18天至第-1天、第-17天至第-1天、第-16天至第-1天、第-15天至第-1天或第-14天至第-1天、第-18天至第-2天、第-17天至第-2天、第-16天至第-2天、第-15天至第-2天或第-14天至第-2天、第-18天至第-3天、第-17天至第-3天、第-16天至第-3天、第-15天至第-3天或第-14天至第-3天、第-18天至第-4天、第-17天至第-4天、第-16天至第-4天、第-15天至第-4天或第-14天至第-4天或第-18天至第-5天、第-17天至第-5天、第-16天至第-5天、第-15天至第-5天或第-14天至第-5天中的任何一天或每一天，优选在生产阶段的第-8天或第-7天至第0天中的任何天或每一天，将葡萄糖添加至发酵过程中。

当本发明的方法包括历经培养的时间段，通常历经全部的或部分的生产阶段优化培养基中的葡萄糖浓度时，一种或多种其他营养素，例如细胞生长和重组糖蛋白生产所需的氨基酸可能存在于基础培养基和/或补充补料中，但该方法不需要优化培养基中这些营养素的浓度以实现期望的糖型分布。

在更优选的实施例中，“按需”补充葡萄糖，即维持培养基中的平均浓度(通常从生产阶段的约第-7天至收获，即第0天)，该平均浓度取决于Fab高甘露糖所需要的量。在该替代性方案中，“按需”添加葡萄糖意为当培养基中葡萄糖的测量浓度处于或降至低于特定水平时，补充葡萄糖。在该方面，监测和控制培养基中的葡萄糖浓度以实现历经全部的或部分的生产阶段的平均葡萄糖浓度，该平均葡萄糖浓度与正在生产的单克隆抗体的Fab高甘露糖糖型的期望相对含量相关。在一个实施例中，在生产阶段的第-11天、第-8天和第-5天给予含葡萄糖的营养素补料。

一方面，在整个或部分过程中，细胞通过灌注培养来培养，任选地与补料分批过程一起使用。整个培养过程的培养基灌注使平均葡萄糖浓度在整个培养过程中维持在优化范围内。

如果不需要监测葡萄糖浓度，例如因为从早前发酵运行的经验中已知葡萄糖消耗和添加的速率，则葡萄糖可以按需或按照先前规定的方案补充。

当使用超过一种补充补料时，添加至发酵(基础)培养基中的和每次补充/推注补料中的葡萄糖的量可以相同或不同。通常，在每次补充/推注补料中添加至发酵培养基中的葡萄糖的量将取决于细胞的需要和当时发酵培养基中那些营养素的测量浓度。

在一个实施例中，本公开提供一种用于生产从在包含葡萄糖的细胞培养基中培养的真核细胞表达的单克隆抗体的方法，该抗体的Fab高甘露糖糖型的相对含量小于20％，例如约15％，该方法包括：

-在包含葡萄糖的细胞培养基中培养真核细胞；

-在细胞培养的生产阶段期间每天测量细胞培养基中的葡萄糖浓度；以及

-每天向细胞培养基中添加葡萄糖以在所述添加后实现约15g/L的葡萄糖浓度。

在本文的一个实施例中，例如，为了获得约9％或更低的更汀芦单抗的Fab N-连接的高甘露糖糖型(如上所述)的相对浓度，当培养基中葡萄糖的测量浓度小于约2.00g/L时，则添加约5.00g/L的葡萄糖，或者当培养基中葡萄糖的测量浓度在约2.00g/L与约5.50g/L之间时，则将约4.00g/L的葡萄糖添加至培养基。如上所述，不需要确定培养基中的葡萄糖浓度，并且可以基于以前的经验按照设定的计划进行补充。

如图2和图3A所示，历经生产阶段第-7天至第0天的平均葡萄糖浓度与组合物中抗体(更汀芦单抗)中N-连接的高甘露糖Fab区相对于经糖基化的Fab区总数的百分比之间存在关系。因此，如图3A所示，为了获得约9％的高甘露糖Fab区，每天向培养基中添加葡萄糖以在添加葡萄糖后实现培养基中的葡萄糖浓度为约7.00g/L，使得历经生产阶段的第-7天至第0天，培养基中的平均葡萄糖浓度为约4.00至7.00g/L。为了获得大致约10.5％的高甘露糖Fab区，每天向培养基中添加葡萄糖以在添加葡萄糖后实现培养基中的葡萄糖浓度为约9.00g/L，使得历经生产阶段的第-7天至第0天，培养基中的平均葡萄糖浓度为约6.00至约9.00g/L。为了获得大致约13％的高甘露糖Fab区，每天向培养基中添加葡萄糖以在添加葡萄糖后实现培养基中的葡萄糖浓度为约12.00g/L，使得历经生产阶段的第-7天至第0天，培养基中的平均葡萄糖浓度为约9.00至约11.00g/L。为了获得大致约15％的高甘露糖Fab区，每天向培养基中添加葡萄糖以在添加葡萄糖后实现培养基中的葡萄糖浓度为约15g/L，使得历经生产阶段的第-7天至第0天，培养基中的平均葡萄糖浓度为约11.00至约14.00g/L。

因此，为了获得约3％至10％的更汀芦单抗的Fab N-连接的高甘露糖糖型(如上所述)的相对浓度，历经生产阶段的第-7天至第0天，培养基中的平均葡萄糖浓度可以是约0g/L至约8.00g/L。

一方面，上述平均葡萄糖浓度用于获得约3％至10％的更汀芦单抗的Fab N-连接的高甘露糖糖型的相对浓度。

在特别优选的实施例中，单克隆抗体为更汀芦单抗或包含更添孤单看的双特异性抗体。在这些实施例中，单克隆抗体具有如上文SEQ ID No:1至6所示的V_H和V_L CDR氨基酸序列，和SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的V_H和V_L结构域氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:9和10的氨基酸序列的重链和轻链，并且，为了获得约5％至9％的更汀芦单抗的Fab N-连接的高甘露糖糖型的相对浓度，一方面，历经生产阶段的第-7天至第0天，培养基中的平均葡萄糖浓度可以是约4.00g/L至约6.10g/L，优选约4.50g/L至约5.60g/L，且更优选约5.00g/L。

通常，当生产阶段期间培养基中葡萄糖的测量浓度小于约2.00g/L时，则将约5.00g/L的葡萄糖添加至培养基中，或者当生产阶段期间培养基中葡萄糖的测量浓度在约2.00g/L与约5.50g/L之间，则将约4.00g/L葡萄糖添加至培养基中，其中葡萄糖添加物来自储备溶液(500g/L)。培养基中葡萄糖浓度的测量和必要时随后的葡萄糖添加可以以本文规定的频率进行，目的是降低或消除葡萄糖浓度的波动。通常，对于如本文概述的葡萄糖添加，约0g/L的任何葡萄糖测量值将通过连续添加或推注添加来解决，以防止对细胞的负面影响。如上所述，不需要确定培养基中的葡萄糖浓度，并且将会基于以前的经验按照设定的计划进行补充。

在替代性实施例中，例如当在12K(12,000升)发酵罐中培养时，如果培养基中葡萄糖的测量浓度低于约4.00g/L，则将葡萄糖添加至培养基中。这可以通过添加例如来自含有500g/L葡萄糖的储备溶液的约80L葡萄糖来实现。可以每天进行一次或两次取样以确定葡萄糖浓度。

通常将葡萄糖作为50％的储备溶液添加，且用于计算所需储备溶液量的公式为：

公式1：V_bolus[ml]＝c_Glc[mg/L]*Vferm[L]/500mg/ml

公式2：M_bolus[g]＝V_bolus[ml]*1,224g/ml

V_bolus为待作为推注添加的补料体积，c_Glc为待添加至发酵罐中的目标浓度，Vferm为发酵罐体积，且M_bolus为待作为推注添加的补料的重量。

在一个实例中，鉴于1L发酵罐和测量为1.80g/L的葡萄糖，因此需要添加约5.00g/L葡萄糖，添加的葡萄糖/50％葡萄糖储备溶液的量/体积可计算为：

V_bolus[ml]＝5000mg/L*1L/500mg/mL＝10mL葡萄糖

M_bolus[g]＝10ml*1,224g/ml＝12,24g葡萄糖。

如果在所讨论的单克隆抗体的补料分批生产期间作为标准补料过程的一部分将葡萄糖添加至培养基中，则可能需要或可能不需要额外补料，取决于培养基中所包括的葡萄糖的浓度和/或历经生产阶段所测量的平均葡萄糖浓度。例如，在提供标准推注补料之日，该推注补料的葡萄糖部分通常会提供足够的葡萄糖，以确保历经培养至收获的平均葡萄糖浓度保持在期望的浓度，取决于期望的高甘露糖糖型百分比，如上所述。

本发明的方法也包括监测培养基中的平均葡萄糖浓度。通常，培养基中的葡萄糖浓度通过测量来监测。在优选的实施例中，在确定是否需要进行补充之前，每天、每两天、每三天等，或每天两次，或每天三次等测量培养基中的葡萄糖浓度。最优选每天一次或每天两次测量葡萄糖浓度。测量是在每24小时的同一时间进行还是在每个24小时时间段期间的不同时间进行并不重要。最优选地，每天在添加推注补料(营养素补料、葡萄糖补料等)之前进行该测量。可以仅监测培养基中的葡萄糖浓度，即可能不需要监测其他营养素的浓度，或反之亦然。如果需要，在测量培养基中相应的营养素浓度后补充葡萄糖和任选使用的其他营养素。

在一个实施例中，培养过程中平均葡萄糖浓度的计算可以使用以下等式进行：

(i)对于连续添加葡萄糖和在快速添加之前和之后采集样品的推注添加：

其中，例如，n＝培养样品数(考虑第-7天至第0天的样品)，i为求和指数(样品的索引数)，a_i为来自样品i到n(第-7天到第0天)的培养基中葡萄糖的测量浓度(例如，以g/L计)。不添加含葡萄糖的推注营养素补料。通常，每天采集一个样品。

(ii)对于在推注添加后不取样推注葡萄糖添加：

其中，例如，n＝培养样品数(考虑从第-7天至第0天的样品)，m为通过葡萄糖或营养饲料添加的葡萄糖数量(考虑从第-7天至第0天的添加)，i为样品数量的求和指数，k为葡萄糖添加数量的求和指数，a_i为来自样品i至n(第-7天至第0天)培养基中葡萄糖的测量浓度(例如，以g/L计)，a_k为来自葡萄糖添加k至m(第-7天至第0天)的在葡萄糖推注添加前不久取样的培养基中葡萄糖的测量浓度(例如，以g/L计)，b_k为来自添加k至n(第-7天至第0天)的添加(推注)至培养基中的葡萄糖(例如，以基于添加当天发酵罐体积的g/L计)，f_k为来自添加k至m(第-7天至第0天)的经由营养素补料添加(推注)而添加至培养基的葡萄糖(例如，以基于添加当天发酵罐体积的g/L计)。通常每天采集一个样品，在添加营养素补料或葡萄糖推注之前采集。

因此，在本发明的方法中，测量培养基中的葡萄糖浓度，并且根据所测量的浓度，调节培养基中的葡萄糖浓度以实现历经生产阶段的平均葡萄糖浓度。调整量取决于历经生产阶段的平均葡萄糖浓度，该平均葡萄糖浓度根据抗体组合物中期望的Fab高甘露糖糖型的相对量来确定。

葡萄糖浓度的测量可以是离线的，即在培养基样品中进行，或者可以是在线的或原位的，即直接在培养物中进行。离线测量葡萄糖浓度的方法为本领域技术人员熟悉的，并且可以包括使用Cedex Bio HT。将细胞培养液样品离心以分离细胞，然后在Bio HT中进行分析。Bio HT测定的工作原理如下：葡萄糖在己糖激酶(HK)存在的情况下被ATP磷酸化以产生6-磷酸葡萄糖(G-6-P)，其在6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PDH)存在的情况下被NADH氧化。NADPH形成的速率通过UV光度法测量，且与葡萄糖浓度成正比。

当在线/原位测量时，可以使用探针和分析***确定葡萄糖浓度，从而允许在线监测。此类***的一个实例为Trace(Sartorius)技术。

光谱方法，诸如拉曼光谱，可以以其他方式用于测量葡萄糖浓度，或者可以基于例如耗氧量对葡萄糖浓度/消耗进行估计。

如果需要，也可以在从培养基中取出的样品中或直接在培养基本身中确定培养基中任何其他营养素的浓度。通常在培养基样品中确定例如氨基酸的浓度，其可以使用例如Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000快速分离LC***或通过拉曼光谱进行分析。

在本发明的方法中，当所测量的葡萄糖浓度在特定限度之间时，培养基补充有葡萄糖，这取决于实现组合物中期望的Fab高甘露糖糖型的相对量所需的平均葡萄糖浓度。

替代性地，可以采用每日葡萄糖添加程序，其中添加至培养物中的葡萄糖的量(以g/L计)取决于期望的高甘露糖Fab相对于所需总糖基化的Fab的百分比以及历经生产过程的第-7天至第0天的平均葡萄糖浓度。

因此，在一个实例中：

(a)在生产阶段期间每天向培养基中添加葡萄糖以实现历经生产阶段第-7天至第0天的平均浓度为约3.00至6.00g/L，从而获得约7％的高甘露糖Fab区；

(b)在生产阶段期间每天向培养基中添加葡萄糖以实现历经生产阶段第-7天至第0天的平均浓度为约4.00至7.00g/L，从而获得约9％的高甘露糖Fab区；

(c)在生产阶段期间每天向培养基中添加葡萄糖以实现历经生产阶段第-7天至第0天的平均浓度为约6.00至9.00g/L，从而获得约10.5％的高甘露糖Fab区；

(d)在生产阶段期间每天向培养基中添加葡萄糖以实现历经生产阶段第-7天至第0天的平均浓度为约9.00至11.00g/L，从而获得约13％的高甘露糖Fab区；且

(e)在生产阶段期间每天向培养基中添加葡萄糖以实现历经生产阶段第-7天至第0天的平均浓度为约11.00至14.00g/L，从而获得约15％的高甘露糖Fab区。

虽然上述需要每天添加葡萄糖，但是每个日补充剂可以一个或多个剂量添加，或者可以经由连续添加来添加。

通常将葡萄糖以溶液形式添加至培养基中。该溶液形式可以是储备溶液或营养素补料。溶液中营养素的浓度可以变化，例如取决于在待添加的体积，且反之亦然。

一方面，为了实现小于约20％ N-连接的高甘露糖更汀芦单抗，表1A示出观察到的葡萄糖平均浓度，历经生产阶段的第-7天至第0天取得(即考虑到基础培养基、补料培养基和推注添加物中存在的葡萄糖)。

表1A–观察到的平均值

在全部上述方法中，最优选由培养物中的细胞表达的抗体为抗人Aβ抗体，例如更汀芦单抗。

我们的结果表明：

1.(参见例如图2和图3A)历经生产阶段第-7天至第0天的平均葡萄糖浓度与单克隆抗体的Fab高甘露糖糖型的相对含量之间存在强烈的相关性。这些效应可以从小型生物反应器转移到大型生物反应器。

2.(参见例如图4和图5)在Fab N-糖基化位点处的特定糖型的相对量受到控制的同质抗体群体的产生导致具有一致药理学特征的治疗。

3.可以来，与包含两倍之多的Man5-7并且根据不同方法制备的高甘露糖糖型相比，使用根据本文方法制备的包含约5％与6％之间的Man5-7的Fab高甘露糖糖型可以实现约18％的单克隆抗体的生物利用度的增加(参见图6B)。

细胞、生产培养基、方法等

根据本发明的方法，经糖基化的单克隆抗体是在真核细胞中生产的。根据本发明，可以使用对细胞培养和经糖基化的单克隆抗体的表达敏感的任何真核细胞。通常，真核细胞为葡萄糖应答性的。真核细胞优选为真核细胞系，该真核细胞系当被放置在含有适当营养素和生长因子的培养基中悬浮培养时能够生长和存活，并且通常能够表达大量感兴趣的特定经糖基化的单克隆抗体并将该单克隆抗体分泌至培养基中。

在优选实施例中，真核细胞为哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。

当真核细胞为哺乳动物细胞时，它可以是例如NSO鼠骨髓瘤细胞系、由SV40转化的猴肾CVI细胞系(COS-7，CRL 1651)；人胚肾系293S(Graham等人，J.Gen.Virol.36(1977)59)；幼仓鼠肾细胞(BHK，/>CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23(1980)243)；猴肾细胞(CVI-76，/>CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，/>CRL 1587)；人***细胞(HELA，/>CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，CCL 34)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A，/>CRL 1442)；人肺细胞(W138，/>CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562，CCL 5I)；大鼠肝癌细胞(HTC，MI.54，Baumann等人，J.Cell Biol.,85(1980)1)；和TR-1细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44)、PER.C6细胞系(PerciviaLLC)和杂交瘤细胞系。

中国仓鼠卵巢细胞(CHO，Urlaub和Chasin P.N.A.S.77(1980)4216)或PER.C6为用于实施本发明的优选细胞系。适用于本文的已知CHO衍生物包括，例如CHO/-DHFR(Urlab&Chasin，同上)、CHOK1SV(Lonza)、CHO-K1 DUC B11(Simonsen和Levinson P.N.A.S.80(1983)2495-2499)和DP12 CHO细胞(EP 307,247)。

当真核细胞为酵母细胞时，它可以是例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)。

当真核细胞为昆虫细胞时，它可以是例如Sf-9。

中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和小鼠骨髓瘤细胞(NS0、SP2/0)已成为生产治疗性抗体的黄金标准哺乳动物宿主细胞，并且这些细胞系中的大多数已经过调适以在悬浮培养中生长并且表现良好，即适用于反应器培养、放大和大批量生产，且生产率范围为1至8g/L。

最优选地，在本发明中，细胞为CHO细胞，例如CHOK1细胞。

选择或操纵用于本发明的真核细胞以产生重组经糖基化的单克隆抗体。操纵包括一种或多种遗传修饰，诸如引入一种或多种编码待表达的单克隆抗体的异源基因。异源基因可编码单克隆抗体，该抗体正常情况下在该细胞中表达或对于宿主细胞而言是外来的。操纵可以另外地或替代性地为上调或下调一种或多种内源基因。通常，通过例如引入编码抗体的基因和/或通过引入调节编码抗体的基因表达的控制元件来操纵细胞以生产单克隆抗体。编码单克隆抗体的基因和/或控制元件可以通过载体(例如质粒、噬菌体或病毒载体)引入宿主细胞内。某些载体能够在它们被引入其中的宿主细胞中复制或自主复制，而其他载体可以被整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。各种载体为可公开获得的，并且载体的确切性质对于本发明不是必需的。载体组分通常包括信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、启动子和转录终止序列中的一者或多者。此类组分如WO 97/25428中所述。

在优选的方面，根据本发明的方法生产的经糖基化的单克隆抗体为更汀芦单抗，如上所述。

根据本发明的方法，通过在发酵条件下培养细胞实现来自真核细胞的生物量生成和糖蛋白表达。适用于细胞生长以进行生物量生成和单克隆抗体表达的任何发酵细胞培养方法或***均可用于本发明。例如，细胞可以在分批或补料分批或灌注培养中生长，其中在已经发生单克隆抗体的充分表达后终止培养，之后收获糖蛋白并且，如果需要，进行纯化。如果使用补料分批培养，培养物的补料可以连续进行，或在培养期间定期进行。当给予多次补料时，可以每天给予、每隔一天给予、每两天给予等，每天超过一次给予或每天少于一次给予等，其中每次补料使用相同或不同的补料溶液。在优选实施例中，本发明中使用的细胞培养方法为补料分批的。

用于生物量生成和糖蛋白生产的细胞发酵培养的反应器、温度和其他条件，诸如氧浓度、二氧化碳和pH、搅拌、温度和湿度，为本领域中已知的。在整个发酵过程中可以使用不同的反应器体积。例如，通过接种摇瓶或20L生物反应器并培养约21天来建立细胞培养物。之后，可将细胞转移至80L生物反应器约3天、400L反应器约3天和2,000L反应器约2天(阶段n-1)。用于生产抗体(n阶段)的主要发酵发生在例如12,000L生物反应器中。

可以使用本领域可获得的信息来选择适合所选真核细胞培养的任何条件。培养条件诸如温度、pH值等，通常为先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，对于本领域技术人员而言是显而易见的。如果需要，可以在培养过程中改变温度和/或pH和/或CO₂以增加产量和/或增加期望单克隆抗体质量的相对量。

本发明提供发酵培养条件下的细胞培养。这通常是一个多步骤培养过程，其中细胞在多个步骤或阶段中培养。根据该优选程序，发酵培养过程(例如从细胞的冷冻小瓶)通常涵盖三个不同的阶段，即：

i)种子期，用于在解冻应力后恢复细胞并使细胞倍增时间正常化，这可以持续14与例如超过60天之间，取决于细胞恢复速度和生产规模。该阶段可以在摇瓶或生物反应器(例如20L生物反应器)中进行。

ii)生长阶段或接种期，包括n-x个阶段，其中x通常为1至5，优选1或2或1、2或3。这些阶段也可称为生长阶段，其中将细胞接种到适合促进生长和生物量生成的培养基中。因此，该n-x个阶段通常用于拓展培养以进行更大的培养规模并洗出所选化合物。当该n-x个阶段由3个阶段n-1、n-2和n-3组成时，每个阶段需要例如2至8天，通常各自持续2、3或4天；和

iii)生产阶段，或适当数量和/或质量的重组糖蛋白的生产。该阶段的持续时间可能取决于，例如，重组细胞的性质以及所表达的糖蛋白的数量和/或质量。通常，该阶段将持续约11至约20天。通常，该主要发酵阶段将在12,000L生物反应器中进行。可以在生产阶段期间和/或结束时收获蛋白质和/或细胞。在本公开中，收获通常被指定为第0天。

通常，在12,000L生物反应器中生产时，收获时的细胞年龄为48至62天。

也可以包括过渡阶段，即在生长阶段与生产阶段之间的一段时间。通常，过渡阶段为可以控制培养条件以从生长转变为生产的时间。可以控制的各种细胞培养参数包括温度、渗透压、维生素、氨基酸、糖、蛋白胨、铵和盐。

细胞可以在种子期或生长阶段中维持一段合适的时间，例如通过向现有培养基中添加新鲜培养基或营养补充剂(视情况而定)。

种子期、生长阶段和生产阶段中的任一者或全部可以是连续的，或者来自一个阶段的细胞可以用于接种下一阶段，例如在新鲜的培养基中。

在本发明方法的一方面，从细胞培养物上清液中回收所表达的单克隆抗体。可以使用本领域已知的方法实现在培养时间段(优选生产阶段)期间或结束时，回收所表达的单克隆抗体。必要时，可以使用本领域已知的技术，例如蛋白A柱、离子交换柱纯化和/或尺寸排阻柱纯化来例如从细胞培养物上清液中分离和/或纯化所表达的单克隆抗体。通过本发明的方法制备的单克隆抗体的糖基化特征可以使用本领域技术人员熟知的和上文描述的方法进行分析，或者例如通过去除和衍生化N-聚糖然后进行例如正相(NP)HPLC分析、弱阳离子交换色谱(WCX)、毛细管等电聚焦(cIEF)、体积排阻色谱、POROS^TMA HPLC测定、宿主细胞蛋白ELISA、DNA测定和蛋白质印迹分析。此类纯化步骤不影响所表达的抗体的糖型含量。

另一方面，本公开的单克隆抗体组合物直接通过发酵产生，即是培养物上清液。

3.治疗方法/治疗和诊断用途

本文提供的组合物特别可用作药物或诊断组合物。此类组合物通常包含药用载体。

经糖基化的单克隆抗体的治疗或诊断效用在本发明的组合物中保持不变。因此，本发明的包含单克隆抗体的组合物可用于治疗包含在该组合物中的抗体所适用的受试者的任何病症，该单克隆抗体在其一个或多个Fab区具有N-糖基化，其中相对于组合物中Fab经糖基化的抗体的总量，约20％或更少的单克隆抗体在其一个或多个Fab区中具有N-连接的高甘露糖聚糖。

因此，例如，更汀芦单抗被称为检测阿尔茨海默病患者脑切片中真正的人淀粉样蛋白斑块的诊断试剂，并且也作为预防或治疗与淀粉样变性和/或斑块形成相关的疾病的治疗剂，该疾病诸如痴呆、阿尔茨海默病、运动神经病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、瘙痒症、HIV相关痴呆和克雅二氏病、遗传性脑出血伴荷兰型淀粉样变性、唐氏综合征和与衰老相关的神经元障碍，并且在本发明的组合物中，效用将保持不变。

因此，单克隆抗体可能是更汀芦单抗。因此，本发明在一个实施例中提供一种治疗患有与淀粉样变性和/或斑块形成相关的疾病的个体的方法，该疾病诸如痴呆、阿尔茨海默病、运动神经病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、瘙痒症、HIV-相关的痴呆和克雅二氏病、遗传性脑出血伴荷兰型淀粉样变性、唐氏综合症和与衰老相关的神经元障碍，优选阿尔茨海默病，该方法包括向个体施用单克隆抗体，该单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的V_H CDR1；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的V_H CDR2；包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的V_H CDR3；包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的V_L CDR1；包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的V_L CDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的V_L CDR3，所述组合物包含相对于组合物中V_H糖基化的抗体总量约20％或更少的所述抗体的高甘露糖糖型，所述糖基化为在抗体的CDR2中Asn52处的N-糖基化。

在该方法的优选方面，所述组合物包含相对于组合物中V_H糖基化的抗体总量约15％或约10％或更少的所述抗体的N-连接的高甘露糖Fab糖型。

在一个替代性实施例中，本发明提供一种治疗患有与淀粉样变性和/或斑块形成相关的疾病的个体的方法，该疾病诸如痴呆、阿尔茨海默病、运动神经病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、瘙痒症、HIV-相关的痴呆和克雅二氏病、遗传性脑出血伴荷兰型淀粉样变性、唐氏综合症和与衰老相关的神经元障碍，优选阿尔茨海默病，该方法包括向个体施用包含单克隆抗体的组合物，该单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的V_H结构域；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的V_L结构域；所述组合物包含相对于组合物中V_H糖基化的抗体总量约20％或更少的所述抗体的高甘露糖糖型，其中所述糖基化为在SEQ IDNO:7中Asn52处的N-糖基化。

在该方法的优选方面，所述组合物包含相对于组合物中V_H糖基化的抗体总量约15％或约10％或更少的所述抗体的高甘露糖糖型。

在一个替代性实施例中，本发明提供一种治疗患有与淀粉样变性和/或斑块形成相关的疾病的个体的方法，该疾病诸如痴呆、阿尔茨海默病、运动神经病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、瘙痒症、HIV-相关的痴呆和克雅二氏病、遗传性脑出血伴荷兰型淀粉样变性、唐氏综合症和与衰老相关的神经元障碍，优选阿尔茨海默病，该方法包括向个体施用包含单克隆抗体的组合物，该单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链；所述组合物包含相对于组合物中V_H糖基化的抗体总量约20％或更少的所述抗体的高甘露糖糖型，其中所述糖基化为在SEQ ID NO:9中Asn52处的N-糖基化。

替代性地，本发明提供一种包含单克隆抗体的组合物，该单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的V_H CDR1；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的V_H CDR2；包含SEQID NO:3的氨基酸序列的V_H CDR3；包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的V_L CDR1；包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列的V_L CDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的V_L CDR3，所述组合物包含相对于组合物中V_H糖基化的抗体总量约20％或更少的所述抗体的高甘露糖糖型，其中所述糖基化为在抗体的CDR2中Asn52处的N-糖基化，该组合物用于在治疗患有与淀粉样变性和/或斑块形成相关的疾病的个体的方法中使用，该疾病诸如痴呆、阿尔茨海默病、运动神经病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、瘙痒症、HIV-相关的痴呆和克雅二氏病、遗传性脑出血伴荷兰型淀粉样变性、唐氏综合症和与衰老相关的神经元障碍，优选阿尔茨海默病。

替代性地，本发明提供一种包含单克隆抗体的组合物，该单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的V_H结构域；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的V_L结构域，所述组合物包含相对于组合物中V_H糖基化的抗体总量约20％或更少的所述抗体的高甘露糖糖型，其中所述糖基化为在SEQ ID NO:7中Asn52处的N-糖基化，该组合物用于在治疗患有与淀粉样变性和/或斑块形成相关的疾病的个体的方法中使用，该疾病诸如痴呆、阿尔茨海默病、运动神经病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、瘙痒症、HIV-相关的痴呆和克雅二氏病、遗传性脑出血伴荷兰型淀粉样变性、唐氏综合症和与衰老相关的神经元障碍，优选阿尔茨海默病。

替代性地，本发明提供一种包含单克隆抗体的组合物，该单克隆抗体包含：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链，所述组合物包含相对于组合物中V_H糖基化的抗体总量约20％或更少的所述抗体的高甘露糖糖型，其中所述糖基化为在SEQ ID NO:9中Asn52处的N-糖基化，该组合物用于在治疗患有与淀粉样变性和/或斑块形成相关的疾病的个体的方法中使用，该疾病诸如痴呆、阿尔茨海默病、运动神经病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、瘙痒症、HIV-相关的痴呆和克雅二氏病、遗传性脑出血伴荷兰型淀粉样变性、唐氏综合症和与衰老相关的神经元障碍，优选阿尔茨海默病。

通常，个体是人。阿尔茨海默病的诊断基于美国国家神经和交流障碍研究所和卒中/阿尔茨海默病及相关疾病协会(NINCDS/ADRDA)的诊断标准。

根据本发明的组合物可通过本领域中已知的多种方法来施用。示例性施用途径/模式包括皮下注射、静脉内注射或输注。在某些方面，该组合物可以口服施用。如本领域技术人员将认识到的，施用途径和/或模式将根据期望的结果而变化。

也设想了本发明的组合物的共同疗法。因此，在阿尔茨海默病的情况下，设想与批准的药物诸如美金刚(memantine)、多奈哌齐(doneprezil)、卡巴拉汀(rivastigmine)或加兰他敏(galantamine)联合治疗。

可以调整剂型和方案以提供最佳的期望应答并且可以随着待治疗病症的类型和严重程度而变化。此外，对于任何特定受试者，具体剂量方案可根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断而随时间推移进行调整。剂型和方案本身不构成本发明的一部分。

另一方面，本发明提供一种降低包含单克隆抗体或其部分或片段的组合物的清除率的方法，该方法包括调节组合物中高甘露糖Fab糖型的相对含量。

通常，本发明人已经发现，降低抗体组合物中高甘露糖Fab糖型的相对含量在人类中导致AUC增加。因此，根据该方面，提供一种通过调节组合物中高甘露糖Fab糖型的相对含量将包含单克隆抗体或其部分的组合物的AUC增加至少5个百分点(例如增加6至11个百分点)的方法。

用于调节抗体组合物中高甘露糖Fab糖型的相对含量的方法如上所述。

前述说明书公开的特征，或以下权利要求中，以其特定形式表达或实施公开功能的方式方面，或用于获得公开结果的方法或过程，这些特征可以其多种形式适当地单独使用，或以任何组合的形式使用，以实现本发明。

虽然已经结合上述示例性实施例描述了本发明，但是当给出本公开时，许多等效修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，上述本发明的示例性实施例被认为是说明性的而非限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所描述的实施例进行各种改变。

为避免任何疑问，本文提供的任何理论解释都是为了改进读者的理解。发明人不希望受任何这些理论解释的束缚。

此处使用的章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。

现在将参考附图以举例的方式来示例性说明本发明的方面和实施例。对于本领域技术人员来说，其他方面和实施例将是显而易见的。本文本中提及的全部文件均通过引用并入本文。

实例

以下实施例，包括执行的实验和实现的结果，仅出于示例性说明目的而提供，不应解释为包括全部可能的实施例以及此类权利要求所享有的等效物的完整范围。

材料和化学物质

细胞系

在下文所述的研究中，我们使用了产生更汀芦单抗的重组CHO-K1细胞系。所得抗体在Fc区和Fab区均经糖基化。该细胞系使用专有的化学上明确的无蛋白培养基以补料分批模式培养。

过程中控制-细胞生长和代谢物分析

使用自动化CedexHiRes装置(Roche Innovatis,Bielefeld,Germany)分析细胞生长和活力。为了将产物滴度以及代谢物葡萄糖、乳酸盐和铵定量，将细胞培养液离心以分离细胞并使用Cedex Bio HT***(Roche,Mannheim,Germany)进行分析。葡萄糖Bio HT测定工作的测试原理如下：葡萄糖在己糖激酶(HK)存在的情况下被ATP磷酸化为6-磷酸葡萄糖(G-6-P)，其在6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PDH)存在的情况下被NADH氧化。NADPH形成的速率通过UV光度法测量，且与葡萄糖浓度成正比。

过程中控制–氨基酸

使用UltiMate 3000RSLC(快速分离(RS)HPLC)检测无细胞培养上清液中的游离氨基酸浓度。

糖物质分析

最初收获的细胞培养液必须经离心以分离细胞并获得无细胞上清液。为了在分析某些产品质量属性之前分离主要杂质，执行了蛋白A步骤：

含有Fc的抗体或抗体相关分子使用平台尺寸150cm的Tecan Freedom 液体处理工作站和96阵列格式的Atoll />RoboColumn技术进行蛋白A亲和纯化(例如MabSelect SuRe，GE Healthcare)。在全部步骤中均采用≤5μl/s的缓慢移液速度。简而言之，使用2柱体积(CV)的再生缓冲液(0.2M NaOH)预清洁RoboColumns(CV 200μl，内部尺寸10mm床高和5mm内径)。孵育5分钟后，使用10CV平衡缓冲液(0.025M NaCl、0.025MTris，pH 7.2)调节RoboColumns。条件化的RoboColumns加载每柱最大4mg蛋白质(收获的细胞培养液(HCCF)的负载量相应调整)。用4CV平衡缓冲液洗涤后，结合的蛋白质用4CV洗脱缓冲液(0.05M醋酸盐，pH 3.7)洗脱。通过添加1M Tris，pH 11立即中和洗脱液的pH值。使用Tecan Infinite M200读板器测量280nm处的吸光度。RoboColumns用3CV平衡缓冲液冲洗，然后用2CV再生缓冲液再生，然后孵育10分钟。最后，使用5CV平衡缓冲液和4CV 20％乙醇冲洗RoboColumns，以供在4℃储存。

样品可以以其他方式或另外进行完全纯化(本体样品)。抗体或其部分的纯化方法预计不会对获得的糖型百分比产生任何显著影响，但可能取决于所用纯化步骤的数量。在本文的实例1和实例2以及图2至图3B中，糖型百分比是从蛋白A纯化的级分中确定的。实例3和实例4以及图4A至图8B中提到的值是从完全纯化的样品(本体样品)中获得的。使用几个纯化步骤进行纯化。

对本文所使用的抗体实施的N-聚糖相对分布的分析可描述如下：在第一步中，Fc聚糖被内切糖苷酶PNGaseF从抗体主链上切割下来。通过超滤将所释放的Fc聚糖与蛋白质分离并收集。将蛋白质样品重新缓冲后，将Fab聚糖通过“快速PNGaseF”消化释放，然后通过超滤与蛋白质分离。随后，Fc和Fab聚糖分别用2-AB(2-氨基苯甲酰胺)标记，并去除多余的标记。最后，Fc和Fab聚糖通过HILIC(亲水相互作用色谱)-UHPLC(超高效液相色谱)和荧光检测独立地进行分析。

制剂中每种糖型(即高甘露糖或其他糖型)的百分比可以例如从所产生的聚糖的色谱图计算。图9示出了这样的色谱图。为了计算M5至M7糖型的百分比，绘制了一条基线，例如在图9中，从5分钟至39分钟，然后计算具有该基线的曲线下面积(A1)。然后将峰M5至M7的面积除以A1并乘以100，得到M5至M7的百分比，从而给出百分比数字(％)或面积百分比。

实例1

通过改变葡萄糖添加量来调节Fab糖基化

在图2中，示出了来自代表性运行的全部数据。从不同规模(0.25L、2L、100L、400L和12,000L)的发酵运行中收集数据。发酵是为了不同的目的而执行的，诸如为了优化发酵过程和材料供应，而不是专门用于评估葡萄糖的影响。除了根据过程经验(例如搅拌、通气、细胞库、细胞增殖周期时相)可以忽略的微小变化外，除了添加葡萄糖外，全部运行的参数都是相同的。

以不同方式添加葡萄糖以改变添加至过程中的葡萄糖总量。当采用连续添加葡萄糖溶液时，经由泵和秤进行添加。每天根据培养基中葡萄糖的测量结果调整添加速率–测量可以是外部的，也可以直接在培养基中进行。用于直接测量即在培养基本身中的方法包括使用葡萄糖探针内部地测量部培养物中的葡萄糖水平，或是基于经由废气分析的细胞耗氧量的。

替代性地，基于使用例如Cedex Bio HT仪器的外部测量，将葡萄糖作为推注添加来添加。一定量的50％葡萄糖溶液(500g/L)按一定规律直接添加，例如，如果细胞培养物中测得的葡萄糖浓度降至低于5g/L葡萄糖，则添加6g/L葡萄糖。

通过改变连续过程中的添加速率(例如从0.5到0.7g/h)或通过改变推注添加中的葡萄糖的量，取决于例如培养基中葡萄糖的测量浓度(例如，当葡萄糖水平低于4g/L时添加4g/L葡萄糖，或当葡萄糖水平低于4g/L时添加6g/L)，为了实现历经生产阶段的期望平均值而在过程中添加至细胞培养物中的葡萄糖的量可以变化。

结果显示于图2中。从第-7天至第0天的葡萄糖平均浓度与相对Fab高甘露糖水平之间存在强烈的相关性。

实例1表明，在任何规模下，历经发酵的第-7天至第0天增加培养基中的平均葡萄糖浓度导致细胞所表达的抗体/Fab区的高甘露糖糖型相对于经糖基化的抗体/Fab区总量的百分比增加。

实例2

通过改变葡萄糖添加量来调节Fab糖基化

为了在专门实验中证实实例1的结果，使用本公开的方法在1L生物反应器中进行实验。使用产生具有Fc和Fab糖基化的抗体的CHO-K1细胞系进行培养。用更汀芦单抗的补料分批标准过程，并使用含有葡萄糖的化学上明确的标准培养基来执行发酵。收获在第0天进行，并从经离心和蛋白A纯化的样品中分析糖型分布。

唯一的变化是葡萄糖添加策略。除了根据过程经验(例如搅拌、通气、细胞库、细胞增殖周期时相)可以忽略的微小变化外，除了添加葡萄糖外，全部运行的参数都是相同的。

从生产阶段的第-10天开始，每天使用Cedex Bio HT测量葡萄糖浓度。测量后，每天向每个生物反应器中添加500g/L葡萄糖溶液，添加的浓度有所变化：

-添加葡萄糖溶液至每日浓度为7g/L；

-添加葡萄糖溶液至每日浓度为9g/L；

-添加葡萄糖溶液至每日浓度为12g/L；或

-添加葡萄糖溶液至每日浓度为15g/L。

葡萄糖添加量的计算是基于每日测量的。

历经全部的或部分的生产阶段的培养物中第-7天至第0天的平均葡萄糖浓度(使用本文的公式计算)与所表达的抗体的Fab高甘露糖糖型的相对含量之间存在强烈的相关性。

结果呈现在图3A中，该图清楚地示出从生产阶段的从第-7天至第0天的平均葡萄糖浓度与单克隆抗体的Fab高甘露糖糖型的生产之间的相关性。在图3B中，Fab高甘露糖总和被分为它的甘露糖5、6和7部分。Fab高甘露糖总和的全部单独部分显示出相同的趋势和对反应器中葡萄糖平均水平的依赖性。在图3C中，解释了对从第-7天至第0天的平均葡萄糖水平的计算。计算基于每日测量的来自在葡萄糖添加前取得的样品的培养物中葡萄糖浓度和计算的推注添加后的培养物中葡萄糖浓度(根据添加前的测量值和添加的葡萄糖的量计算)。

结果(也参见图3A)：

-葡萄糖添加至7g/L→第-7天至第0天的葡萄糖平均值为5.7g/L→约9％ Fab高甘露糖

-葡萄糖添加至9g/L→第-7天至第0天的葡萄糖平均值为7.4g/L→约10.5％ Fab高甘露糖

-葡萄糖添加至12g/L→第-7天至第0天的葡萄糖平均值为10.6g/L→约13％ Fab高甘露糖

-葡萄糖添加至15g/L→第-7天至第0天的葡萄糖平均值为12.4g/L→约15％ Fab高甘露糖

实例2表明不同的葡萄糖添加方案对抗体的高甘露糖糖型产生的影响，鉴于每日葡萄糖添加量增加，从第-7天至第0天的葡萄糖平均水平增加，导致聚糖中Fab高甘露糖糖型的百分比增加，特别是Man5和Man6的量增加，而Man7的量的增幅较小。

实例3

更汀芦单抗的药代动力学

临床研究：皮下注射更汀芦单抗，研究1

更汀芦单抗是根据本发明的方法(下文称为G4过程)生产的。G4过程生产的每种Fab糖型的百分比如图6A/6B所示，可以与G3过程生产的Fab糖型进行比较。如上所述，G3过程为一种用于在同一抗体中产生高甘露糖含量(例如超过8％的高甘露糖糖型)的先前过程，而不是本文所述的过程。因此，由G3过程生产的高甘露糖糖型可用作参考产品。

在一项临床研究中比较了G4过程和G3过程生产的更汀芦单抗糖型的药代动力学。该研究是在健康志愿者中进行的多中心、随机、开放标签、单剂量、平行组研究。

在s.c.施用后，更汀芦单抗被缓慢吸收，对于通过G3和G4过程生产的物质，分别在95.5小时和110小时的中位时间达到峰值血浆浓度。与600mg通过G3过程生产的更汀芦单抗相比，sc施用600mg通过G4过程生产的更汀芦单抗后，以AUC 0-inf表示的血浆暴露量大约高1.18倍，而Cmax结果相似(施用通过G4过程生产的更汀芦单抗后，高出5.1％)(也参见图7)。药代动力学参数是根据标准非房室分析(NCA)方法使用WinNonIin 6.3版(Pharsight,Mountain View,CA,USA)得出的。使用线性模型进行统计分析，其中PK参数(对数尺度)作为因变量和随机化时“治疗”、“研究中心”、“性别”和“体重类别”的独立固定因子。

图4A和图4B进一步表明，G3过程的产物与根据本发明(即G4过程)生产的糖型之间的主要区别发生在更汀芦单抗施用后的前288小时内。与包含12.7％ Man5-7的G3过程产品相比，使用根据本文方法制备的包含5.2％ Man5-7的G4过程产品可以实现约18％的生物利用度增加(参见图7)。

大鼠，皮下注射更汀芦单抗，研究2

12只大鼠(每组n＝6)分别以单剂量皮下地(颈部区)接受通过G4过程生产的材料(5.2％甘露糖5至7)和通过G3过程生产的材料(12.7％Man5至Man7)，该剂量以20mg/kg的标称剂量施用至两组平行的雄性Wistar大鼠。历经4周，从每只动物身上收集系列血样。Wistar大鼠K3-EDTA血浆样品中更汀芦单抗的浓度使用Cobas e411仪器通过合格的ECLIA方法进行分析，该方法对于人Ig/FabCH1/κ域具有特异性。简单地讲，将更汀芦单抗的测试样品、第一检测抗体mAbHFab(κ)M-1.7.10-IgG-Bi、第二检测抗体mAbHFabCH1M1.19.31-IgGRu和SA-珠分步骤添加至检测容器中，并在每一步骤中孵育9分钟。最后，SA-珠结合的复合物被一个测量单元检测到，该测量单元重复地对SA-珠的计数进行编号。计数与测试样品中的分析物浓度成正比。

通过非房室分析进行药代动力学评估。G4过程生产的材料的平均剂量归一化AUC(0-last)较高，约为G3过程生产的材料的228％(图7)。此外，高甘露糖低材料中的Cmax比高甘露糖高材料高44％。这些数据进一步表明，G4过程生产的更汀芦单抗在循环中停留更长时间，即清除率降低，并且具有比G3过程生产的更汀芦单抗更好的生物利用度。

大鼠，静脉注射更汀芦单抗研究3

此外，总更汀芦单抗和更汀芦单抗与Man5/Man6 Fab聚糖的血浆浓度在经更汀芦单抗静脉内施用至大鼠(15mg/kg)后确定。通过ELISA分析更汀芦单抗浓度。此外，为了确定聚糖，在给药后的不同时间通过免疫亲和纯化从血浆中提取更汀芦单抗。所提取的更汀芦单抗的聚糖组成通过LC-MS方法进行确定。所获得的更汀芦单抗Man5/Man6聚糖(FHMG)的总和用来估计含有至少一种Man5/Man6聚糖(HMGant)的更汀芦单抗的分数，假设其具有根据HMGant＝2x(FHMG-(FHMG x FHMG))+(FHMG x FHMG)的高甘露糖聚糖统计学分布。通过将来自ELISA的更汀芦单抗总浓度乘以HMGant来计算具有至少一种Man5/Man6聚糖的更汀芦单抗的浓度。

如图5所示，结果表明更汀芦单抗Man5/Man6聚糖从循环中快速丢失，因此在给药后24小时内不再检测到它们。

大鼠：静脉注射更汀芦单抗，研究4

28只大鼠(每组n＝13至14只)分别以单剂量静脉内接受G4过程生产的材料(5.4％甘露糖5至7)和G3过程生产的材料(12.7％ Man5至Man7)，该剂量以20mg/kg标称剂量施用至两组平行的雄性Wistar大鼠。历经4周，从每只动物身上收集系列血样。Wistar大鼠K3-EDTA血浆样品中更汀芦单抗的浓度使用Cobas e411仪器通过合格的ECLIA方法进行分析，该方法对于人Ig/FabCH1/κ域具有特异性。简单地讲，将更汀芦单抗的测试样品、第一检测抗体mAbHFab(κ)M-1.7.10-IgG-Bi、第二检测抗体mAbHFabCH1M1.19.31-IgGRu和SA-珠分步骤添加至检测容器中，并在每一步骤中孵育9分钟。最后，SA-珠结合的复合物被一个测量单元检测到，该测量单元重复地对SA-珠的计数进行编号。计数与测试样品中的分析物浓度成正比。

通过非房室分析进行药代动力学评估。G4过程生产的材料的平均剂量归一化AUC(0-last)较高，约为G3过程生产的材料的136％(图7)，并且G4过程生产材料的平均清除率(15.1ml/天/kg)为G3过程生产的材料(22.2ml/天/kg)的68％。G3过程生产的材料和G4过程生产的材料的平均表观分布容积(Vss)分别为329和255ml/kg(图7)。这些数据证明，高甘露糖低更汀芦单抗在循环中停留更长时间并且具有比高甘露糖高更汀芦单抗更好的生物利用度。

实例4

大鼠：静脉注射更汀芦单抗，研究5

通过G1和G2过程生产的材料代表通过先前生产过程(这些过程不同于本发明的方法，也不同于G3方法)生产的更汀芦单抗。在G1过程生产的材料中，Man5+Man6含量低于8％，通产为约3.1％，而在G2过程生产的材料中则高于8％，通常为约10％。将提取自免疫沉淀后血浆样品的更汀芦单抗消化后，通过LC-MS分析聚糖组成。

28只大鼠(每组n＝14)以单剂量静脉内接受了通过G1或G2过程生产的材料，该剂量以6mg/kg的标称剂量施用至两组平行的雄性Wistar大鼠。历经4周，从每只动物身上收集系列血样。通过ELISA分析Wistar大鼠血浆样品中更汀芦单抗的浓度。通过非房室方法进行药代动力学评估。

G2过程生产的材料的AUC 0-inf较低，约为G1过程生产的材料的80％。Cmax也较低(也参见图7)，表明当抗体中Man5+Man6含量较低时生物利用度较好。

Fc/Fab糖基化对更汀芦单抗清除率的影响

在大鼠中进行单剂量PK研究。对平行组的大鼠施用单剂量的更汀芦单抗(G2过程生产)。在给药后长达24小时或48小时收集样品。通过免疫沉淀从血浆中提取更汀芦单抗，并在提取物消化后通过LC-MS分析聚糖组成。

图8B示出给药后长达48小时后可测量的更汀芦单抗(由G2过程产生)的特定糖型的百分比，表明Man5和Man6 Fab糖型的清除速度非常快。相反，从图8A可以看出，G2过程生产的材料中的Fc糖结构对单个糖型的清除没有影响。

本公开涉及以下序列：

SEQ ID NO:1＝更汀芦单抗VH CDR1

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

SEQ ID NO:2＝更汀芦单抗VH CDR2

Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

SEQ ID NO:3＝更汀芦单抗VH CDR3

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Val

SEQ ID NO:4＝更汀芦单抗VL CDR1

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

SEQ ID NO:5＝更汀芦单抗VL CDR2

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

SEQ ID NO:6＝更汀芦单抗VL CDR3

Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro Ile

SEQ ID NO:7＝更汀芦单抗V_H结构域

Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser TrpVal Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Asn Ala Ser GlyThr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp AsnSer Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala ValTyr Tyr Cys Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg TyrPhe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO:8＝更汀芦单抗V_L结构域

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly GluArg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala TrpTyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser ArgAla Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr LeuThr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile TyrAsn MetPro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

SEQ ID NO:9＝更汀芦单抗重链

Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser TrpVal Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Asn Ala Ser GlyThr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp AsnSer Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala ValTyr Tyr Cys Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg TyrPhe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys GlyPro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala AlaLeuGly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn SerGly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly LeuTyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr TyrIle Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu ProLys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu GlyGly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser ArgThrPro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val LysPhe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg GluGlu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln AspTrp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala ProIle Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr ThrLeu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu ValLys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro GluAsn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu TyrSer Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys SerVal Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProGly Lys

SEQ ID NO:10＝更汀芦单抗轻链

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly GluArg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala TrpTyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser ArgAla Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr LeuThr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile TyrAsn Met Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val AlaAla Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr AlaSer Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp LysVal Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp SerLys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr GluLys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val ThrLys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

SEQ ID NO:11＝用于抗体与人转铁蛋白受体结合的重链Fab片段

Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr LeuSer Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp IleArg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Trp Ser Gly Gly SerThr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr ThrVal Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys AlaArg Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro TrpGly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val PheIle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Ccy LeuLeu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala LeuGln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr TyrSer Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val TyrAla Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn ArgGly Glu Cys

SEQ ID NO:12＝用于抗体与人转铁蛋白受体结合的轻链

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly AspArg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp TyrGln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu AlaSer Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu ThrIle Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr AlaSer Ser Asn Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser SerAla Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr SerGly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val ThrVal Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val LeuGln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser LeuGly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val AspLys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys。

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司 (F. HOFFMANN-LA ROCHE AG)

罗氏公司 (HOFFMANN-LA ROCHE INC.)

罗氏诊断有限公司 (ROCHE DIAGNOSTICS GMBH)

<120> FAB 高甘露糖糖型

<130> 007976111

<150> EP 20207804.4

<151> 2020-11-16

<160> 12

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 更汀芦单抗 VH CDR1

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 更汀芦单抗 VH CDR2

<400> 2

Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 更汀芦单抗 VH CDR3

<400> 3

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp

1 5 10 15

Val

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 更汀芦单抗 VL CDR1

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 更汀芦单抗 VL CDR2

<400> 5

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 更汀芦单抗 VL CDR3

<400> 6

Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro Ile

1 5

<210> 7

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 更汀芦单抗 VH 结构域

<400> 7

Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr

100 105 110

Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 8

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 更汀芦单抗 VL 结构域

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

<210> 9

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 更汀芦单抗重链

<400> 9

Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr

100 105 110

Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

325 330 335

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

340 345 350

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

355 360 365

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

370 375 380

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 10

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 更汀芦单抗轻链

<400> 10

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 11

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于抗体与人转铁蛋白受体结合的重链 Fab 片段

<400> 11

Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser

50 55 60

Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser

65 70 75 80

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr

85 90 95

Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro

115 120 125

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

130 135 140

Ala Ser Val Val Cys Cys Tyr Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

145 150 155 160

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

165 170 175

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

195 200 205

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

210 215 220

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 12

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于抗体与人转铁蛋白受体结合的轻链

<400> 12

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn

85 90 95

Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

180 185 190

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215

Claims

1.一种组合物，其包含经糖基化的单克隆抗体，其中所述抗体为抗人Aβ抗体、包含抗人Aβ抗体的双特异性抗体、或包含经糖基化的Fab区且能够结合Aβ的抗人Aβ抗体的片段，所述抗体在其一个或多个Fab区中具有N-糖基化，其中相对于所述组合物中经糖基化的Fab的总量，所述组合物中约20％或更少的Fab区具有N-连接的高甘露糖聚糖。

2.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物为在所述抗体的重组生产期间或之后可获得的药物组合物或细胞培养物上清液。

3.一种用于降低经糖基化的单克隆抗体从已经施用所述抗体的动物的循环中清除的速率的方法，其中所述抗体为抗人Aβ抗体、包含抗人Aβ抗体的双特异性抗体、或包含经糖基化的Fab区且能够结合Aβ的抗人Aβ抗体的片段，所述方法包括调节包含所述抗体的组合物中所述经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的相对含量。

4.根据权利要求3所述的方法，其中调节包含所述抗体的组合物中所述经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的相对含量包括：在用于通过在其中对表达所述单克隆抗体的真核细胞进行发酵来产生所述经糖基化的单克隆抗体的培养基中，在所述发酵的全部的或部分的生产阶段期间，维持葡萄糖的平均浓度。

5.一种用于调节组合物中经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的相对含量的方法，其中所述抗体为抗人Aβ抗体、包含抗人Aβ抗体的双特异性抗体、或包含经糖基化的Fab区且能够结合Aβ的抗人Aβ抗体的片段，所述方法包括：在用于通过在其中对表达所述单克隆抗体的真核细胞进行发酵来产生所述经糖基化的单克隆抗体的培养基中，在发酵的生产阶段期间，优化真核细胞的碳水化合物源的浓度。

6.根据权利要求5所述的方法，其包括在全部的或部分的所述生产阶段期间，维持所述培养基中葡萄糖的平均浓度。

7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其进一步包括从所述培养基回收所述抗体的步骤。

8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中所述高甘露糖Fab糖型占所述单克隆抗体的总Fab糖型的约20％或更少。

9.根据权利要求1或2所述的组合物或根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中具有N-连接的高甘露糖聚糖的Fab区的百分比为约0％至20％、约0％至15％、约0％至12％或约0％至10％，任选地其中具有N-连接的高甘露糖聚糖的Fab区的百分比为约2％至20％、约2％至15％、约2％至12％或约2％至10％或约4％至10％、约4％至12％、约4％至15％或约4％至20％。

10.根据权利要求9所述的组合物或方法，其中所述高甘露糖聚糖为Man5、Man6和Man7糖型中的一者或混合物，任选地其中所述高甘露糖聚糖中的甘露糖残基为Man5、Man 6和Man7。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物或方法，其中所述单克隆抗体为更汀芦单抗且包含：

(a)如上文SEQ ID No:1至6中所列的V_H和V_L CDR氨基酸序列，SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8的V_H和V_L结构域氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:9和10的氨基酸序列的重链和轻链；

(b)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的V_H CDR1；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的V_HCDR2；包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的V_H CDR3；包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的V_LCDR1；包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的V_L CDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的V_L CDR3；

(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的V_H结构域；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的V_L结构域；或

(d)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链；

所述组合物包含相对于所述组合物中V_H经糖基化的抗体总量的所述抗体的约20％或更少的高甘露糖糖型，其中所述糖基化为在SEQ ID NO:9中Asn52处的N-糖基化。

12.根据权利要求11所述的组合物或方法，其中当所述单克隆抗体为双特异性抗体时，结合特异性中的一种特异性针对人A-β，且另一种特异性针对转铁蛋白受体。

13.根据权利要求12所述的组合物或方法，其中所述单克隆抗体为包含以下的双特异性抗体：

-氨基酸序列为SEQ ID NO:9的重链；

-氨基酸序列为SEQ ID NO:10的轻链；

-氨基酸序列为SEQ ID NO:11的重链Fab片段；和

-氨基酸序列为SEQ ID NO:12的轻链。

14.根据权利要求3至13中任一项所述的方法，其中历经所述单克隆抗体的重组生产中的所述生产阶段，所述培养基中的平均葡萄糖浓度为约0.5g/L至约18g/L。

15.根据权利要求14所述的方法，其中葡萄糖的所述浓度是历经所述生产阶段的第-7天至第0天所平均。

16.根据权利要求3至15中任一项所述的方法，其中监测并控制所述培养基中的葡萄糖的所述浓度以实现历经全部的或部分的所述生产阶段，任选地历经所述生产阶段的第-7天至第0天的其平均浓度。

17.根据权利要求3至16中任一项所述的方法，其中：

(a)从所述发酵得到的所述经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的期望相对含量为约3％，所述培养基中葡萄糖在约第-7天与第0天之间的所述平均浓度为在约0g/L与约3g/L之间；

(b)从所述发酵得到的所述经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的期望相对含量为约7％，所述培养基中葡萄糖在约第-7天与第0天之间的所述平均浓度为在约3g/L与约6g/L之间；

(b)从所述发酵得到的所述经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的期望相对含量为约10.5％，所述培养基中葡萄糖在约第-7天与第0天之间的所述平均浓度为在约6g/L与约9g/L之间；

(c)从所述发酵得到的所述经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的期望相对含量为约13％，所述培养基中葡萄糖在约第-7天与第0天之间的所述平均浓度为在约9g/L与约11g/L之间；或

(d)从所述发酵得到的所述经糖基化的单克隆抗体的高甘露糖Fab糖型的期望相对含量为约15％，所述培养基中葡萄糖在约第-7天与第0天之间的所述平均浓度为在约11g/L与约14g/L之间。

18.一种单克隆抗体组合物，其通过根据权利要求3至17中任一项所述的方法可获得。

19.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其用于诊断或治疗疑似患有或患有疾病的个体的所述疾病，任选地其中所述疾病为痴呆、阿尔茨海默病、运动神经病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、瘙痒症、HIV相关痴呆、克雅二氏病(CJD)、遗传性脑出血、唐氏综合征和与衰老相关的神经元障碍；以及癌症，诸如转移性结直肠癌、转移性非小细胞肺癌、卵巢癌和头颈部癌。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物或方法，其中所述一个或多个Fab区中的N-连接的高甘露糖聚糖相对于所述组合物中经糖基化的Fab总量的相对量通过亲水相互作用色谱-超高效液相色谱(HILIC-UHPLC)与随后对2-氨基苯甲酰胺标记的聚糖的荧光检测来分析。