CN116083529B - 一种靶向富集基因组目标区域的dna的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向富集基因组目标区域的DNA的方法及其应用。本发明提供一种杂交捕获探针的制备方法，其包括：将目标DNA分子片段化至200bp至800bp后连接第一通用接头；使用带有修饰的与第一通用接头互补的引物进行扩增，得到杂交捕获探针。本发明还提供一种靶向富集基因组目标区域的DNA的方法，其是利用上述杂交捕获探针实施的。本发明还提供上述方法在测序中的应用。本发明实现了对目标区域的富集，提高了测序的准确度，大幅降低了测序成本。
Description
技术领域
本发明属于基因测序技术领域，更具体地，涉及一种靶向富集基因组目标区域的DNA的方法及其应用。
背景技术
Oxford Nanopore的核心技术——纳米孔(nanopore)测序技术。与以往的测序技术皆有不同，它不是通过检测光、荧光信号颜色、或PH来实现碱基序列的读取，而是基于电信号的测序技术。蛋白质纳米孔被嵌在合成膜上，并浸没在电生理溶液中，使离子电流通过纳米孔。在像DNA或RNA这样的分子通过纳米孔时，会对电流产生干扰，引起电流信号的特征性改变。在此过程中，信号被实时分析，用来确定正在通过该孔的DNA或RNA链的碱基序列。可以根据想要的实验结果来选择恰当的样品制备方法，生成最适合的读长长度。
探针捕获测序是常用的目标基因多位点检测方案之一，通过设计合成有效的特异性探针，与基因组DNA进行杂交，将目标区域序列进行捕获并富集后，使用主流的测序平台进行高通量测序。杂交捕获技术适用于全外显子，特定目标区域的测序，在基于NGS的临床诊断和药物开发方面具有巨大的应用前景，同时在农业育种等相关领域研究也有巨大的应用潜力。
目前，开发和验证疾病相关的目标基因集合(panel)和关键位点都依赖于于对大量样品的目标区域研究，仅有序列准确率高的探针，才能与目标区域序列特异性结合，大大提升探针的捕获效率，达到富集目标片段的目的。
目前三代测序技术主要针对gDNA全测序，在测序成本上有很大浪费，并且全测序技术耗时长、通量低，已经难以满足实际需要。
发明内容
为解决上述问题，本发明提出一种靶向富集基因组目标区域的DNA的方法及其应用。
本发明第一方面提供一种制备杂交捕获探针的方法，其包括：
将目标DNA分子片段化至200bp至800bp后连接第一通用接头；使用带有修饰分子、优选为生物素修饰的与第一通用接头互补的引物进行扩增，得到杂交捕获探针。
本发明第二方面提供一种靶向富集基因组目标区域的DNA的方法，其包括：
1)依上述杂交捕获探针的制备方法制备探针；
2)构建基因组DNA文库；
3)使用所述探针捕获并富集基因组目标区域。
本发明第三方面提供上述杂交捕获探针的制备方法或靶向富集基因组目标区域的DNA的方法分别在核酸测序中的应用；
优选地，所述核酸测序包括通过纳米孔测序技术或NGS测序技术进行测序。
本发明第四方面提供一种靶向富集基因组目标区域的DNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
用于将目标DNA分子片段化的试剂；
用于对片段化后的DNA连接第一通用接头的试剂；
带有修饰分子、优选为生物素修饰的与第一通用接头序列互补的引物及扩增试剂；
构建基因组DNA文库所需的试剂；
用于探针进行捕获的试剂；
优选地，所述试剂盒还包括亲和磁珠；优选为链霉素亲和磁珠；
优选地，所述试剂盒还包括用于进行LR-PCR扩增的试剂，其包含特异性引物组，所述特异性引物组通过针对基因组的目标区域每间隔3Kb至10Kb进行设计并合成得到；
优选地，所述试剂盒还包括用于对基因组DNA文库连接第二通用接头的试剂和与第二通用接头互补的通用引物；
优选地，所述试剂盒还包括目标片段筛选及纯化所用的试剂。
本发明第五方面提供上述方法或试剂盒在确定基因突变类型中的应用，优选地，所述基因突变是地中海贫血突变，更优选为致病性α-地中海贫血突变、致病性β-地中海贫血突变、致病性δ-地中海贫血突变或致病性δβ地中海贫血突变。
本发明第六方面提供包括如SEQ ID NO.8所示序列的引物和如SEQ ID NO.10所示序列的引物：
SEQ ID NO.8：5’-GGCTGTGACGTTCTACAATAAACTGCTA-3’；
SEQ ID NO.10：5’-CTGTAAAATGCTCCTGTCAGGAAATGGA-3’。
本发明第七方面提供所述的引物在测序中的应用。
本发明的有益效果
本发明主要从三个方面对现有方法进行了改善：
首先，本发明通过将目标DNA分子片段化后连接特殊修饰分子来制备捕获探针；可降低高额的合成探针的费用，且可实现捕获大片段DNA的目的。并且本发明采用的特异性引物进行LR-PCR的步骤，增强了杂交捕获的特异性。
其次，本发明针对所需目标进行捕获，实现了对目标区域的富集，以目标区域测序替换全基因组gDNA测序，大幅降低了测序成本。
另外，由于对目标区域进行了富集，降低了单样本所需测序数据量，对多样本同时上机测序奠定了基础；节省测序所需时间，扩大测序通量。
附图说明
图1为根据本发明的一个实施方式的杂交捕获探针的制备方法的实验方案的示意图。
图2为根据本发明的一个实施方式的靶向富集基因组目标区域的DNA的方法及其在测序中应用的示意图。
图3为本发明实施例1中部分LR-PCR扩增产物电泳图。
图4为本发明实施例1中LR-PCR扩增产物片段化后片段筛选的电泳图(DL15000+100bp Plus)。
图5为本发明实施例1中NGS测序覆盖度汇总结果。
具体实施方式
本发明第一方面提供一种制备杂交捕获探针的方法，其包括：
将目标DNA分子片段化至200bp至800bp后连接第一通用接头；使用带有修饰分子、优选为生物素修饰的与第一通用接头互补的引物进行扩增，得到杂交捕获探针。
根据本发明的具体实施方案，所述目标DNA分子的获得方式包括：化学合成和/或LR-PCR。本领域技术人员可以根据目标DNA分子的大小，选择适用目标DNA分子的制备方式。
根据本发明的具体实施方案，所述目标DNA分子是经LR-PCR扩增得到的；
优选地，所述LR-PCR扩增包括以下步骤：
1)设计并合成PCR特异性引物：针对基因组的目标区域每间隔3Kb至10Kb进行引物设计，并合成得到用于LR-PCR的特异性引物；
2)LR-PCR扩增：使用阴性gDNA作为模板和1)中得到的特异性引物，进行LR-PCR扩增，得到LR-PCR扩增产物。
根据本发明的具体实施方案，所述目标DNA分子片段化包括酶切法片段化或机械打断法片段化；优选地，所述机械打断法包括超声打断；优选地，所述超声打断的条件为45Hz至55HZ下25秒至35秒，更优选为50HZ 29秒。
根据本发明的具体实施方案，所述方法还包括对目标DNA分子片段化之后得到的DNA片段进行筛选；
优选地，所述筛选包括采用磁珠筛选或胶回收筛选方式，得到长度为200bp至800bp的DNA片段；优选地，得到300bp至800bp的DNA片段。
优选地，被片段化后得到的DNA片段长度在500bp左右。本发明优选在将LR-PCR产物片段化时采用超声打断方法，与酶切方法相比，具有更好的随机性，避免了酶的偏好性带来的误差。
根据本发明的具体实施方案，所述方法还包括对连接第一通用接头后的DNA片段进行文库构建。
根据本发明的具体实施方案，所述方法还包括文库构建后进行均一性质检。
本发明第二方面提供一种靶向富集基因组目标区域的DNA的方法，其包括：
1)依本发明所述的杂交捕获探针的制备方法制备探针；
2)构建基因组DNA文库；优选地，本发明所述基因组DNA片段的长度为15kbp至20kbp；
3)使用所述探针捕获并富集基因组目标区域。
根据本发明的具体实施方案，其中，在步骤3)中，所述探针的用量与所述基因组DNA文库的用量之比为0.5:1至2:1；优选为1.5:1；以保证杂交效果。
根据本发明的具体实施方案，在步骤2)中，在构建基因组DNA文库之后，将基因组DNA文库连接第二通用接头。可以理解，本发明所用的第一通用接头和第二通用接头可以相同，也可以不同。
根据本发明的具体实施方案，在将基因组DNA文库连接第二通用接头之后，采用与所述第二通用接头互补的通用引物对目标片段进行富集。优选地，采用与DNA文库第二通用接头互补的通用引物对捕获后得到的目标片段进行扩增富集。
可以理解，本发明所述基因组DNA文库连接第二通用接头的步骤可以在探针捕获步骤之前，也可以在探针捕获之后。
本发明第三方面提供上述杂交捕获探针的制备方法或靶向富集基因组目标区域的DNA的方法在核酸测序中的应用；
优选地，所述核酸测序包括通过纳米孔测序技术或NGS测序技术进行测序。可以理解，本发明杂交捕获探针的制备方法或靶向富集基因组目标区域的DNA的方法适用于任何合适的核酸测序技术，并不限于上述纳米孔测序技术及NGS测序技术。
根据本发明的具体实施方案，所述应用包括：
使用本发明所述的杂交捕获探针的制备方法制备得到探针；使用本发明所述的靶向富集基因组目标区域的DNA的方法对目标区域的DNA进行富集；和基于纳米孔测序技术或NGS测序技术对经富集的DNA进行测序。可以理解，在上机测序前应保证样本达到足够测序的浓度。
根据本发明的具体实施方案，所述应用还包括使用经富集的DNA建库，优选为ONT建库，然后进行测序。
优选地，所述基因组的目标区域包含地中海贫血突变相关区域和/或F8、DMD、GJB2、PKD1、SMN1、SLC26A4、OR52Z1、OR51V1、BRCA；
优选地，所述地中海贫血突变相关区域包括HBB、HBD、HBBP1、BGLT3(HS-40)、HBG1、HBG2、HBE1、OR51AB1P、POLR3K、SNRNP25、RHBDF1、MPG、NPRL3、HBZ、LOC107983982、HBZP1、HBM、HBAP1、HBA2、HBA1、HBQ1和LUC7L。
本发明第四方面提供一种靶向富集基因组目标区域的DNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
用于将目标DNA分子片段化的试剂；
用于对片段化后的DNA连接第一通用接头的试剂；优选地，连接第一通用接头的试剂还包括第一通用接头；
带有修饰分子、优选为生物素修饰的与第一通用接头序列互补的引物及扩增试剂；
构建基因组DNA文库所需的试剂；
用于探针进行捕获的试剂；
优选地，所述试剂盒还包括亲和磁珠；优选为链霉素亲和磁珠；
优选地，所述试剂盒还包括用于进行LR-PCR扩增的试剂，其包含特异性引物组，所述特异性引物组通过针对基因组的目标区域每间隔3Kb至10Kb进行设计并合成得到；
优选地，所述试剂盒还包括用于对基因组DNA文库连接第二通用接头的试剂和与第二通用接头互补的通用引物；优选地，还包括使用通用引物进行扩增所需的试剂；
优选地，所述试剂盒还包括目标片段筛选及纯化所用的试剂。
本发明第五方面提供上述方法或试剂盒在确定基因突变类型中的应用，优选地，所述基因突变是地中海贫血突变，更优选为致病性α-地中海贫血突变、致病性β-地中海贫血突变、致病性δ-地中海贫血突变或致病性δβ地中海贫血突变。
本发明第六方面提供包括如SEQ ID NO.8所示序列的引物和如SEQ ID NO.10所示序列的引物：
SEQ ID NO.8：5’-GGCTGTGACGTTCTACAATAAACTGCTA-3’；
SEQ ID NO.10：5’-CTGTAAAATGCTCCTGTCAGGAAATGGA-3’。
本发明第七方面提供所述的引物在测序中的应用。
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
在本发明的一个具体实施方案中，实验方案如图1和图2所示：
1.针对目标区域每间隔约3Kb至10Kb进行引物设计，并合成引物；
2.使用阴性gDNA样本作为模板，进行LR-PCR扩增；
3.LR-PCR扩增产物超声片段化至约500bp；
4.片段筛选及文库构建；
5.使用含生物素修饰的接头互补序列引物进行富集，得到带有生物素修饰的探针；
6.待检测样本gDNA大片段建库；
7.使用制备探针杂交捕获；
8.捕获后的目标片段进行富集；
9.ONT建库(QK-LSK109)及MinION测序(R9.4.1flow cells)；
10.生信分析。
实施例1
本实施例提供采用本发明技术方案富集HBA基因目标区域的方案。
具体步骤如下：
(1)使用Primer3软件，对HBA基因chr16:60001-120000目标区域，每间隔约3Kb至10Kbp进行设计引物，并合成引物。本发明所用部分引物示例如下：
(2)用HBA阴性样本gDNA作为模板，NEB试剂(货号：M0323L)进行LR-PCR扩增，具体程序如表1所示：
表1
※多个退火温度。
部分LR-PCR扩增产物电泳结果如图3所示。
(3)对LR-PCR产物进行纯化、定量及等量混合(pooling)。
1)纯化：
a.加入0.5×Beckman AMPure XP磁珠；
b.混匀后室温静置5分钟；
c.瞬离后，放置与磁力架上，约5分钟；
d.待溶液变澄清后，吸取上清液，并加入200微升新鲜配置的80％乙醇，静置30秒；
e.重复上步操作；
f.弃去上清，待管内液体挥发完，磁珠龟裂时，加入20微升无核酸酶水进行洗脱。
2)定量：
a.取199微升Qubit试剂，加入1微升待测样本；
b.旋涡混匀，瞬离后进行测定浓度。
3)等量混合(Pooling)：将扩增产物使用无核酸酶水，稀释至同一浓度，等体积混合。
注：此时可使用NGS平台对pooling样本进行均一性检测。
(4)使用Covaris M220对pooling样本进行超声打断：50HZ 29秒。或使用酶切进行DNA片段化。
(5)0.55-0.75×XP磁珠进行片段筛选。筛选得到约500bp长度的探针片段，其电泳结果如图4所示。
(6)使用常规Illumina平台建库试剂盒对pooling样本连接第一通用接头后进行建库，并进行测序做均一性质检。NGS测序覆盖度汇总结果如图5所示。
(7)使用0.2mL EP管，加入20ng文库样本作为模板，使用含生物素修饰的引物(5'-biotin-AATGATACGGCGACCACCGA)(SEQ ID NO.13)进行PCR扩增；本步骤使用NEB Q5酶进行探针制备(货号：M0491)，反应体系如表2所示，PCR程序如表3所示。
表2
表3
注：可对pooling样本所建NGS文库进行富集，做后续扩大生产使用。
(8)1×Beckman AMPure XP磁珠纯化。
(9)样本基因组DNA文库(大片段，约15kbp至20kbp)构建；反应体系如表4所示：
表4
| 试剂 | 体积 |
| DNA CS | 1μl |
| DNA(约1μg) | 47μl |
| NEBNext FFPE DNA修复缓冲液 | 3.5μl |
| NEBNext FFPE DNA修复混合物 | 2μl |
| Ultra II End-prep反应缓冲液 | 3.5μl |
| Ultra II End-prep酶混合物 | 3μl |
反应程序：20℃5分钟，65℃5分钟。
(10)1×Beckman AMPure XP磁珠纯化。
(11)基因组DNA文库(大片段，约15kbp-20kbp)连接第二通用接头；连接反应体系如表5所示：
表5
| 试剂 | 体积 |
| 上一步得到的DNA样本 | 60μl |
| 连接缓冲液(Ligation Buffer，LNB) | 25μl |
| NEBNext快速T4 DNA连接酶 | 10μl |
| 接头 | 5μl |
| 总计 | 100μl |
反应条件：室温10分钟。
(12)杂交捕获：
将步骤(11)得到的带有第二通用接头的基因组DNA文库(大片段，约15kbp至20kbp)与步骤(8)得到的探针按质量比为1:1放于0.2ml EP管中，吹打混匀，95℃，5分钟，并立即置于冰上5分钟。
(13)使用链霉亲和素磁珠(life M280)进行筛选及纯化。
(14)捕获目的文库富集：对纯化后的捕获片段使用与第二通用接头互补的通用引物，进行富集。
(15)ONT建库；反应体系如表6所示：
表6
| 试剂 | 体积 |
| 上一步得到的DNA样品 | 60μl |
| 连接缓冲液(Ligation Buffer，LNB) | 25μl |
| NEBNext快速T4 DNA连接酶 | 10μl |
| 接头混合物(Adapter Mix，AMX) | 5μl |
| 总计 | 100μl |
室温10分钟。
(16)0.4×Beckman AMPure XP磁珠及长片段缓冲液(Long Fragment Buffer，LFB)进行纯化。
(17)15μL EB洗脱。
(18)Minion上机测序及生信分析。
上述三代测序靶向富集方法，可替换设计引物区域，或针对目的区域进行合成探针，不限于HLA、F8、DMD、GJB2、PKD1、SMN1、SLC26A4、OR52Z1、OR51V1、BRCA、HBB、HBD、HBBP1、BGLT3(HS-40)、HBG1、HBG2、HBE1、OR51AB1P、POLR3K、SNRNP25、RHBDF1、MPG、NPRL3、HBZ、LOC107983982、HBZP1、HBM、HBAP1、HBA2、HBA1、HBQ1、LUC7L地中海贫血突变相关区域，包含chr11:5167971-5295261(hg38)以及chr16:48994-210817(hg38)区域内的任意类型突变，参照LOVD-China、HbVar、Ithanet和LOVD地贫数据库，统计的与地贫相关的突变，最少可以检测至少359种致病性α-地中海贫血突变，451种致病性β-地中海贫血突变，60种致病性δ-地中海贫血突变以及致病性38种δβ地中海贫血突变，以及遗传性肿瘤相关基因：BRCA、KRAS、TP53、EGFR、KRAS等等。
本实施例是基于牛津纳米孔公司(Oxford Nanopore Technologies,ONT)平台技术进行测序实验，但本发明不限于此。本发明可以应用于多种NGS平台。
应当指出的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (30)
1.一种制备杂交捕获探针的方法，其包括：
将目标DNA分子片段化至200bp至800bp后连接第一通用接头；使用带有修饰分子修饰的与第一通用接头互补的引物进行扩增，得到杂交捕获探针，
其中，所述目标DNA分子是经LR-PCR扩增得到的，所述LR-PCR扩增包括以下步骤：
1)设计并合成PCR特异性引物：针对基因组的目标区域每间隔3Kb至10Kb进行引物设计，并合成得到用于LR-PCR的特异性引物，所述特异性引物的序列为SEQ ID NO.1-12。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述LR-PCR扩增还包括以下步骤：
2)LR-PCR扩增：使用阴性gDNA作为模板和步骤1)中得到的特异性引物，进行LR-PCR扩增，得到LR-PCR扩增产物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述修饰分子为生物素。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述目标DNA分子片段化包括酶切法片段化或机械打断法片段化。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述机械打断法包括超声打断。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述超声打断的条件为45Hz至55HZ下25秒至35秒。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述方法还包括对目标DNA分子片段化之后得到的DNA片段进行筛选。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述筛选包括采用磁珠筛选或胶回收筛选方式，得到长度为200bp至800bp的DNA片段。
9.根据权利要求4所述的方法，其中，所述方法还包括对连接第一通用接头后的DNA片段进行文库构建。
10.一种靶向富集基因组目标区域的DNA的方法，其包括：
1)根据权利要求1至9中任一项所述方法制备探针；
2)构建基因组DNA文库；
3)使用所述探针捕获并富集基因组目标区域。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，在步骤3)中，所述探针的用量与所述基因组DNA文库的用量之比为0.5:1至2:1。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，在步骤2)中，在构建基因组DNA文库之后，将基因组DNA文库连接第二通用接头。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，在将基因组DNA文库连接第二通用接头之后，采用与所述第二通用接头互补的通用引物对目标片段进行富集。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法在核酸测序中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其中，所述核酸测序包括通过纳米孔测序技术或NGS测序技术进行测序。
16.根据权利要求14所述的应用，其中，所述应用包括：
使用权利要求10至13中任一项所述的方法对目标区域的DNA进行富集；和基于纳米孔测序技术或NGS测序技术对经富集的DNA进行测序。
17.根据权利要求16所述的应用，所述应用还包括使用经富集的DNA建库，然后进行测序。
18.根据权利要求17所述的应用，其中，所述建库为ONT建库。
19.根据权利要求14或15所述的应用，其中，所述基因组目标区域包括地中海贫血突变相关区域和/或F8、DMD、GJB2、PKD1、SMN1、SLC26A4、OR52Z1、OR51V1、BRCA。
20.根据权利要求19所述的应用，其中，所述地中海贫血突变相关区域包括HBB、HBD、HBBP1、BGLT3(HS-40)、HBG1、HBG2、HBE1、OR51AB1P、POLR3K、SNRNP25、RHBDF1、MPG、NPRL3、HBZ、LOC107983982、HBZP1、HBM、HBAP1、HBA2、HBA1、HBQ1和LUC7L。
21.一种靶向富集基因组目标区域的DNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
用于将目标DNA分子片段化的试剂，其包括序列为SEQ ID NO.1-12的特异性引物；
用于对片段化后的DNA连接第一通用接头的试剂；
带有修饰分子修饰的与第一通用接头序列互补的引物及扩增试剂；
构建基因组DNA文库所需的试剂；
用于探针进行捕获的试剂。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中，所述修饰分子是生物素。
23.根据权利要求21所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括亲和磁珠。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中，所述亲和磁珠为链霉素亲和磁珠。
25.根据权利要求21所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括用于进行LR-PCR扩增的试剂，其包含特异性引物组，所述特异性引物组通过针对基因组的目标区域每间隔3Kb至10Kb进行设计并合成得到。
26.根据权利要求21所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括用于对基因组DNA文库连接第二通用接头的试剂和与第二通用接头互补的通用引物。
27.根据权利要求21所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括目标片段筛选及纯化所用的试剂。
28.通过权利要求1至9中任一项所述的方法制备的探针或权利要求21至27中任一项所述的试剂盒在制备确定基因突变类型的试剂中的应用。
29.根据权利要求28所述的应用，其中，所述基因突变是地中海贫血突变。
30.根据权利要求28所述的应用，其中，所述基因突变是致病性α-地中海贫血突变、致病性β-地中海贫血突变、致病性δ-地中海贫血突变或致病性δβ地中海贫血突变。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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