CN116606766A - 一种食淀粉乳杆菌胞外囊泡的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食淀粉乳杆菌胞外囊泡的制备方法，其包括步骤：接种食淀粉乳杆菌进行培养，将发酵菌液离心，去除菌体沉淀，将上清液过滤，将得到的滤液使用高级离心管离心，将超滤液超速离心，将得到的沉淀重悬、过滤，获得所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡。上述制备方法或其制备的食淀粉乳杆菌胞外囊泡可应用于制备预防或治疗胆汁淤积性肝病的制剂、制备胞外囊泡载药***等。本发明以食淀粉乳杆菌的生长曲线为切入点，以特定培养时间扩大菌体产量，结合超滤法滤过小分子蛋白等杂质，再以超速离心法分离出胞外囊泡，从而获得高浓度的菌源胞外囊泡，提供了一种高效、高纯度、低成本的胞外囊泡制备方法，且不会破坏囊泡结构。
Description
技术领域
本发明涉及菌源胞外囊泡提取技术领域，尤其涉及一种食淀粉乳杆菌胞外囊泡的制备方法及其应用。
背景技术
乳酸菌作为微生态制剂的重要菌种，在维护人和动物肠道健康、促进体内微生态平衡方面起着重要的作用，大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制机体内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus，La)是一类能够水解淀粉的乳酸菌，Nakamura最初从牛场玉米的混合发酵物中和废料发现并分离，并将其命名为食淀粉乳杆菌。之后研究人员从动物肠道中也成功分离出了食淀粉乳杆菌，该细菌属于革兰氏阳性菌，凸面，圆形，菌落呈白色，光滑，边缘整齐不透明。镜下呈链状或单个，无芽孢，少数具有周毛，多数不运动，最适pH在5.5～6.0，但pH在3.0～4.5之间也能生存。食淀粉乳杆菌从口腔到达肠道，通过粘附、定植、繁殖形成稳定的菌群，维护肠道环境稳定和健康。食淀粉乳杆菌能够产生抗生素物质，包括过氧化氢、有机酸，多肽和细菌素。
细菌可以主动释放纳米大小的膜囊泡到细胞外环境，这种20～400nm的球形结构被称为胞外囊泡(Extracellularvesicles，EVs)。EVs可携带多种生物遗传信息，例如核酸、酶、效应蛋白和毒力因子等，其结构使EVs在细菌竞争、生存、物质交换、宿主免疫逃逸、调节、感染和入侵中发挥重要作用。基于益生菌存在着许多对健康的促进作用，益生菌衍生的EVs表现出抗炎和抗肿瘤等有益作用，这些作用已在多项研究中得到明确证明。益生菌EVs可以携带细菌的生物活性成分，穿过粘液层直接迁移到其他组织或与宿主免疫***的不同细胞相互作用，发挥其生物学功能。EVs可被视为益生菌发挥其有益效果的安全有效的通信媒介，因此益生菌衍生的EVs有望成为高效、安全性强、可应用于临床实践的生物制剂。胞外囊泡凭借其大小及双分子膜等优势在参与细胞间通讯、疾病诊断、疾病治疗等方面发挥重要作用。近年来，使用EVs作为治疗剂已经成为一个有前景的研究领域。与传统的治疗药物(如小分子和抗体)相比，纳米药物(如EVs)的主要优势在于纳米颗粒的大尺寸能够加入多种成分。例如，几种药物可以以最佳比例装入同一个纳米粒子，以达到提高疗效的目的。
目前存在的分离胞外囊泡的方法主要有以下几种：第一种方法是利用不同的超速离心速度或者是密度梯度离心：目前该方法是被认为是胞外囊泡分离的金标准，用此方法分离的胞外囊泡的纯度高，但此方法提取出的胞外囊泡RNA含量非常低，且超速离心机价格昂贵无法普及，并且此方法提取的胞外囊泡结构可能被破坏；第二种方法是超滤法：此方法虽然操作简单，但是得到的胞外囊泡的纯度不高；第三种方法是商品化的试剂盒，此种方法，可以分为两类：一类是将抽提试剂加入到样品中，离心得到胞外囊泡的沉淀，另一类方法是将样品加入到柱子中，在通过柱子的过程中，样品中的蛋白质等杂质会进入到柱子中，而粒径较大的胞外囊泡会先从柱子中流出，这样能较快速的得到纯度较高的胞外囊泡。对比这三种分离制备方法的优缺点，可以发现，使用密度梯度离心法分离制备的EVs虽然具有较高纯度，但因其产量较低，通常不能用于常规研究。虽然可以在温和条件下采用试剂盒法提取益生菌EVs，无需使用超速离心机，然而单次仅能提取少量菌液，且其中的步骤繁琐。超速离心法是分离制备领域应用最广泛的方法，在前期可通过差速离心、过滤等步骤除去菌体及其碎片、鞭毛等提高EVs纯度。
目前，对食淀粉乳杆菌胞外囊泡及其提取方法的研究和开发尚处于空白阶段。如何获得一种高效、高纯度、低成本的食淀粉乳杆菌胞外囊泡制备方法且在制备过程中不破坏囊泡结构是目前急需解决的。
发明内容
为了克服现有技术中存在的至少一个问题，本发明从低成本、高效、高纯度等方面出发综合优化，以食淀粉乳杆菌的生长曲线为切入点，以特定培养时间扩大菌体产量，结合超滤法滤过小分子蛋白等杂质，再以超速离心法分离出胞外囊泡，从而获得高浓度的菌源胞外囊泡。本发明提供了一种高效、高纯度、低成本地快速提取食淀粉乳杆菌胞外囊泡(LaEVs)且不会破坏囊泡结构的方法，且证明由食淀粉乳杆菌分泌的胞外囊泡具有效浓度，且形态结构完好无损。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种食淀粉乳杆菌胞外囊泡的制备方法，其包括步骤：
A)接种食淀粉乳杆菌进行培养，获得含胞外囊泡的发酵菌液；
B)将步骤A)获得的发酵菌液离心，去除菌体沉淀，将收集的上清液过滤，收集滤液；
C)将步骤B)获得的滤液使用高级离心管离心，收集超滤液；
D)将步骤C)获得的超滤液超速离心，将得到的沉淀重悬、过滤，获得所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡。
进一步地，在步骤A)中，复苏菌种后，挑取菌种于培养基中，放置于恒温培养箱37℃培养4～8h后，以1～4wt％的接种量接种于1～3L培养基中37℃培养12～24h。优选，复苏菌种后，挑取菌种于MRS肉汤，放置于恒温培养箱37℃培养6h后，以2wt％接种量接种于2L的MRS肉汤37℃培养18h，当其他条件保持一致，若降低发酵液体积，则胞外囊泡的产量会降低。上述步骤中，接种量与培养时间结合食淀粉乳杆菌的生长曲线，从而确定：2wt％为最佳接种量，6h为生长期对数前期，18h为生长期对数后期，按此步骤与条件培养，食淀粉乳杆菌的菌体活性与浓度较高，可最大程度提升其分泌的胞外囊泡产量。
进一步地，所述食淀粉乳杆菌的分类命名为Lactobacillus amylovorus，其保藏编号为CCTCC NO：M2023427，保藏日期为2023年3月28日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。
进一步地，所述步骤B)具体包括：将发酵菌液以4000～6000g、4℃离心10～20分钟，弃去菌体沉淀，将收集的上清液使用0.2～0.3μm过滤器过滤，收集滤液。优选，将发酵菌液以5000g、4℃离心15分钟，弃去菌体沉淀，此时所得上清液体积高，保证了胞外囊泡的高产量；将收集的上清液使用0.22μm过滤器过滤，收集滤液，此过滤步骤进一步去除菌体沉淀与相似质量的物质，有利于可提升超滤效率，降低滤膜堵塞造成的损耗。
进一步地，所述步骤C)具体包括：将滤液使用超滤管4000～6000g、4℃离心15～60分钟，收集超滤液。优选，将滤液使用超滤管5000g，4℃离心30分钟。
进一步地，所述超滤管含有可截留大于100kDa囊泡的超滤膜。此时超滤膜可截留大于100kDa的囊泡于超滤液中，小于100kDa的物质例如小型肽、寡核苷酸、核酸、酶等其他相似大分子将被除去，经过超滤步骤，可有效提升制备纯度。
进一步地，所述超滤管包括滤液接收器，所述滤液接收器内置样本池，所述样本池内固定封装膜(超滤膜)，所述滤液接收器的顶部与样本池盖进行可拆卸连接。
进一步地，所述超滤管为高级离心管。可理解的是，所述超滤管的型号及其过滤器的容积均可根据具体需要选择。在一具体实施方式中，所述超滤管的过滤器的容积为15mL。利用所述超滤管浓缩所述含有胞外囊泡的液体中的胞外囊泡的离心力可为5000g。利用所述超滤管浓缩所述含有胞外囊泡的液体中的胞外囊泡的离心时间可为15-60分钟。利用所述超滤管浓缩所述含有胞外囊泡的液体中的胞外囊泡在4℃下进行。
进一步地，所述步骤D)具体包括：将超滤液以11000～160000g、4℃超速离心1～3小时；将得到的沉淀用PBS重悬，使用0.2～0.3μm过滤器过滤，获得所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡。优选，将超滤液以160000g，4℃超速离心2小时，此时质量相对较重的胞外囊泡将被沉淀，其他条件保持一致，降低超速离心转速可导致胞外囊泡产量降低；将得到的沉淀用PBS重悬，使用0.22μm过滤器过滤，去除上述过程中可能存在的菌体污染，提高分离制备试验的成功率。
本发明的第二个方面是提供一种任一上述的制备方法制得的食淀粉乳杆菌胞外囊泡，所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡中含有结构完整的有效量的胞外囊泡。
进一步地，在一具体实施方式中，所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡的粒径在100～313nm之间，粒径为170.4nm的囊泡最多，约占59.3％，粒径浓度为2.8×1010particles/mL。
进一步地，在一具体实施方式中，所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡的浓度为3.60～9.16μg/μL。
本发明的第三个方面是提供一种任一上述的制备方法或任一上述的食淀粉乳杆菌胞外囊泡的应用，其选自以下应用中的至少一种：在制备预防或治疗胆汁淤积性肝病的制剂中的应用、在制备胞外囊泡载药***中的应用、在转录组学/蛋白组学/脂质组学关联分析中的应用。
进一步地，在制备预防或治疗胆汁淤积性肝病的制剂中的应用中，所述制剂包括改善胆汁淤积性肝病造成的肝功能损伤、炎性病变和/或肝纤维化的制剂。
进一步地，在制备胞外囊泡载药***中的应用中，其可用于将具治疗性的药物成分运送至中枢神经区域的有效转运体等。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明以食淀粉乳杆菌的生长曲线为切入点，以特定培养时间扩大菌体产量，结合超滤法滤过小分子蛋白等杂质，再以超速离心法分离出胞外囊泡，从而获得高浓度的菌源胞外囊泡，提供了一种高效、高纯度、低成本的胞外囊泡制备方法，且不会破坏囊泡结构。本发明制备的食淀粉乳杆菌胞外囊泡在疾病治疗、抗菌药物靶点及药物开发、工业发酵乳酸菌调控与动物保健等领域均具有潜在应用价值。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明仅用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明一实施例中使用的高级离心管的示意图；
图2为本发明一实施例中高分辨透射电镜下的食淀粉乳杆菌胞外囊泡(LaEVs)的示意图(标尺为200nm)；
图3为本发明一实施例中粒径分析仪测得的食淀粉乳杆菌胞外囊泡(LaEVs)的粒径图(主要粒径为170.1nm，其次为135.4nm)；
图4为本发明一实施例中食淀粉乳杆菌胞外囊泡(LaEVs)对DDC诱导的胆汁淤积性肝损伤和纤维化小鼠ALT、AST、ALP的影响和肝脏总胆酸水平的结果示意图；具体为：血清ALT活性、血清AST活性、血清ALP活性、肝脏TBA水平；
图5为本发明一实施例中食淀粉乳杆菌胞外囊泡(LaEVs)对DDC诱导的胆汁淤积性肝损伤和纤维化小鼠肝内组织病理学变化的影响结果图；其中，H&E、天狼星红(Siriusred)染色(100X)；
图6为本发明一实施例中食淀粉乳杆菌胞外囊泡(LaEVs)对DDC诱导的胆汁淤积性肝损伤和纤维化小鼠肝内IL-1β、IL-6、TNF-α基因表达水平的影响结果图；
图7为本发明一实施例中食淀粉乳杆菌胞外囊泡(LaEVs)对DDC诱导的胆汁淤积性肝损伤和纤维化小鼠肝内α-SMA、Vimentin基因表达水平的影响结果图。
上述附图中各试验结果均以means±SEM表示(n＝5)，数据组之间所标字母不同时表示相互之间差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
下述实施例中，MRS肉汤组成：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉8.0g，酵母浸粉5.0g，磷酸氢二钾2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1mL，柠檬酸氢二胺2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2，硫酸锰0.04，蒸馏水1000mL，118℃高压灭菌15分钟后使用。
在一较佳实施方式中，一种食淀粉乳杆菌胞外囊泡的制备方法，包括步骤：复苏食淀粉乳杆菌菌种后，挑取菌种于培养基中，放置于恒温培养箱37℃培养4～8h后，以1～4wt％的接种量接种于1～3L培养基中37℃培养12～24h；将发酵菌液以4000～6000g、4℃离心10～20分钟，弃去菌体沉淀，将收集的上清液使用0.2～0.3μm过滤器过滤，收集滤液；将滤液使用超滤管4000～6000g、4℃离心15～60分钟，收集超滤液；将超滤液以120000～160000g、4℃超速离心1～3小时；将得到的沉淀用PBS重悬，使用0.2～0.3μm过滤器过滤，获得所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡。
实施例1-食淀粉乳酸菌(Lactobacillus amylovorus)的分离、筛选与鉴定
本实施例采用下述方法获得食淀粉乳酸菌：
(1)食淀粉乳酸菌的分离和筛选
称取仔猪、母猪等不同来源的粪便(0.1g)加入到0.9mL的灭菌生理盐水中，吹打混匀后用生理盐水倍比稀释10-5-10-7倍，每个稀释倍数各取100μL涂布于MRS琼脂平板，倒置于恒温培养箱37℃培养48h；再用无菌接种环挑取具乳酸菌形态特征的菌落，接种于MRS肉汤，37℃培养48h；之后取液体菌液进行MRS琼脂平板划线，划线后倒置于恒温培养箱37℃培养48h；再次挑取单菌落接种于MRS肉汤，重复以上步骤3次，得到纯化的初筛菌。经过革兰氏染色阳性进一步筛选，经鉴定为食淀粉乳杆菌。
主要生物学特性：显微镜下观察，呈蓝紫色，长杆状，大多单个存在，不呈链状；在MRS平板上37℃培养24h后，呈现为表面光滑的黄色菌落，略微凸起，粉状不透明，质地均匀，边缘整齐，直径约2-3mm。
(2)食淀粉乳酸菌的鉴定
筛选出的菌株经MRS琼脂平板和MRS肉汤培养活化后，送至生工生物公司进行菌种测序。将测序结果与美国国立生物技术信息中心(NCBI)GenBank数据库进行对比，找出同源性99％以上菌株进行对比确定测定乳酸菌种类，该菌株测得的序列(5’-3’)如下所示，与NCBI上现有食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)的碱基序列同源性达到100％。
上述食淀粉乳杆菌已进行保藏，其分类命名为Lactobacillus amylovorus，其保藏编号为CCTCC NO：M2023427，保藏日期为2023年3月28日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。
实施例2-食淀粉乳酸菌胞外囊泡(LaEVs)的制备及表征分析
本实施例通过一较佳的方法制备食淀粉乳酸菌胞外囊泡并对其进行表征分析，包括步骤：
(1)含胞外囊泡发酵液的获得
本实施例中采用的食淀粉乳杆菌为从猪粪中筛选出乳酸菌所得，其保藏编号为CCTCCNO：M2023427。复苏菌种后，挑取菌种于MRS肉汤，放置于恒温培养箱37℃培养6h，以2％接种量接种于2L的MRS肉汤37℃培养18h。
(2)含胞外囊泡发酵液预处理
将菌液分装到50mL EP管中以5000g转速，4℃离心15分钟，去除菌体沉淀。接种量与培养时间综合考虑食淀粉乳杆菌的生长曲线，2％为最佳接种量，6h为生长期对数前期，18h为生长期对数后期，按此步骤与条件培养，食淀粉乳杆菌菌体活性与浓度较高，可最大程度提升其分泌的胞外囊泡产量。将上清液用0.22μm过滤器过滤，彻底去除菌体及其碎片等大分子物质，此过程可提升超滤效率，降低滤膜堵塞造成的损耗。
(3)发酵液的浓缩
过滤后使用高级离心管5000g离心30分钟，超滤浓缩至320mL，收集超滤液。上述方法中，所述利用截留分子量为100kDa的滤膜对含有胞外囊泡的液体中的胞外囊泡进行浓缩，可通过利用含有所述滤膜的超滤管进行。此时超滤膜可截留大于100kDa的囊泡于超滤液中，小于100kDa的物质例如小型肽、寡核苷酸、核酸、酶等其他相似大分子将被除去。经过超滤步骤，可有效提升制备纯度。
所述超滤管具体为高级离心管(颇尔，美国)，其结构为：所述超滤管包括内置样本池的滤液接收器，样本池内固定封装膜(超滤膜)，滤液接收器的顶部与样本池盖进行可拆卸连接。所述超滤管的过滤器的容积可根据具体需要选择。在本实施例中，所述超滤管的过滤器的容积为15mL。利用所述超滤管浓缩所述含有胞外囊泡的液体中的胞外囊泡的离心力可为5000g。利用所述超滤管浓缩所述含有胞外囊泡的液体中的胞外囊泡的离心时间可为15-60分钟。利用所述超滤管浓缩所述含有胞外囊泡的液体中的胞外囊泡在4℃下进行。
(4)胞外囊泡的分离
得到的超滤液以160000g，4℃超速离心2小时，此时质量相对较重的胞外囊泡将被沉淀。得到的沉淀用少量PBS重悬，将多管悬液混合，使用0.22μm过滤器过滤，去除上述过程中可能存在的菌体污染，提高分离制备试验的成功率，最终即得食淀粉乳杆菌胞外囊泡。
实施例3-食淀粉乳酸菌胞外囊泡(LaEVs)的表征分析
本实施例对实施例2中制备的食淀粉乳酸菌胞外囊泡进行表征分析，包括步骤：
首先将收集好的胞外囊泡使用BSA试剂盒进行总蛋白含量测定，然后使用高分辨透射电镜观察其形态，使用粒径分析仪测定其粒径。
高分辨透射电镜观察胞外囊泡形态的步骤为：取收集的胞外囊泡15μL，加入15μLPBS进行稀释，再将溶液滴至铜网，静置吸附2分钟，用滤纸吸去铜网多余溶液。使用2％的磷钨酸染液15μL负染色2-3分钟，用滤纸吸去多余染液，烘干20-30分钟，上机进行透射电子显微镜镜检，观察其形态。
粒径分析仪测定胞外囊泡粒径的步骤为：取收集的胞外囊泡，使用ParticleMetrix’ZetaView纳米颗粒跟踪分析仪，校准仪器后将胞外囊泡样品稀释至合适浓度，.使胞外囊泡样品在仪器检测界面内显示的颗粒数目介于50-400之间，最好是200左右；在软件界面输入样品的稀释倍数，观察检测位置所显示的颗粒数目在50-400之间。并用Zeta View软件对获取的数据进行分析。仪器检测参数设置如下：温度为21.25℃，pH为7.0，激光波长：520nm，滤波器波长：散射，其它参数采用默认参数。其中，胞外囊泡颗粒浓度计算公式：
EVs颗粒浓度＝检测所得浓度×样品稀释倍数
对提取的胞外囊泡稀释后测量总蛋白浓度，测得为9.16μg/μl。将获得的胞外囊泡使用高分辨透射电镜观察其形态(图2)，使用粒径分析仪检测其分子大小(图3)。经表征分析鉴定可知制备溶液中为食淀粉乳杆菌胞外囊泡。见图2，这些囊泡呈现典型的含有磷脂双分子层的泡状结构，为球形粒子，直径在135nm左右，这也和纳米粒径仪(Zeta ViewS/N22-779)的结果一致。采用NTA技术表征LaEVs的典型图如图3所示，从图中可以看出LaEVs颗粒分布均匀，出峰比较整齐均一，这表明本试验制备的LaEVs的浓度较高，含有的杂质较少，这也保证了我们后续试验的可靠性。最后，通过NTA软件分析得出LaEVs的粒径分布及浓度，结果显示LaEVs粒径在100～313nm之间，粒径为170.4nm的囊泡最多，约占59.3％，粒径浓度为2.8×1010particles/ML。这与电镜观察到的结果相符，与其它文献报道的细菌EVs粒径分布范围是一致。
实施例4–制备高浓度胞外囊泡的最佳方案筛选
本实施例改变实施例2所述的制备方法中发酵液的体积为1L，或降低超速离心机的转速为120000g，其他条件保持一致，得到的胞外囊泡溶液使用BCA测定其总蛋白浓度，对比提取效率。其结果见下表1，当发酵液体积为1L，超速离心机转速为160000g时，蛋白浓度为3.60μg/μL，当发酵液体积为2L，超速离心机转速为120000g时，蛋白浓度为3.94μg/μL。且随着离心转速适度增加，胞外囊泡产量可增加，但盲目增加可能难以保证胞外囊泡完整性与功能。
表1-不同方案获得的总蛋白浓度
实施例5-食淀粉乳酸菌胞外囊泡(LaEVs)对肝脏胆汁淤积性肝损伤的缓解作用
本实施例验证了根据实施例2的步骤(其中：发酵液体积为2L，超速离心机转速为120000g)制备的食淀粉乳酸菌胞外囊泡在缓解胆汁淤积性肝损伤方面的作用，其包括步骤；
(1)材料与方法
1.1-化学试剂；
主要试剂：碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)、RNAtrizol(南京诺唯赞生物技术有限公司)、RT-PCR试剂盒(艾瑞科生物)。
1.2-动物试验方法；
购买于集萃药康的18只7周龄无特定病原体(Specific-pathogenfree，SPF)级雄性C57BL/6小鼠用于次试验(体重22.27±0.40g)。小鼠随机分为3组，每组6只：对照组；DDC组；DDC+LaEVs组。小鼠每6只1笼，饲养于SPF级环境中(12h光照、12h黑暗交替，自由采食饮水，温度湿度恒定适宜自动控制)，适应性饲养1周后开始试验。对照组饲喂正常鼠粮，连续14d。第1d，将DDC纯化粮与正常鼠粮按1：2给予DDC组和DDC+LaEVs组；第2d，将DDC纯化粮与正常鼠粮按2：1给予DDC组和DDC+LaEVs组；第3-14d，对DDC组和DDC+LaEVs组，仅给予DDC纯化粮。每天同一时间给DDC+LaEVs组小鼠按1.2μg/kg灌胃食淀粉乳杆菌胞外囊泡，连续14天。试验进行2周，整个试验过程中，小鼠自由采食饮水。
1.3-样品采集
试验结束后，小鼠在安乐死前禁食12h，通过眼球摘除采集小鼠血液，3500rpm×25min离心，分离获得血清，于-80℃保存；小鼠死后打开腹腔，采集肝脏组织样本，一部分组织用4％多聚甲醛溶液进行组织固定，用于后续组织形态学分析，另一部分用液氮快速冷冻，于-80℃保存用于后续分子生物学分析。
1.4-血清生化指标和肝脏总胆酸测定
碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和肝脏总胆酸使用试剂盒进行检测。
1.5-肝脏组织H&E和天狼星红染色
肝脏组织样本经4％多聚甲醛固定后用石蜡包埋，剪下一块组织(1.5cm×1cm×0.5cm)置于包埋盒中，通过脱水、浸蜡、包埋、冰冻等操作后，用组织切片机将肝脏组织切成3μm厚的薄片。制作好的组织切片用HE染色和天狼星红后，进行脱水、透明、封片等操作，以便在镜下观察。使用正置光学显微镜对切片进行观察和拍摄。
1.6-Real-Time PCR检测肝组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、α-SMA、Vimentin的相对表达量
根据GenBank中C67BL/6鼠GAPDH、IL-1β、IL-6、TNF-α、α-SMA、Vimentin序列，遵循定量PCR引物设计原则，利用Premier5.0设计引物，各引物由生工生物工程股份有限公司合成，具体序列如表2所示。总RNA的提取采用TRIZOL试剂盒，按照说明书操作进行，最后通过Nanodrop2000(Thermoscientific，USA)测定仪检测所提取的RNA的浓度。Real-time PCR反应体系与PCR扩增条件参照迈瑞科公司PrimeScript RT-PCR Kit试剂盒说明书。Real-timePCR扩增在美国应用生物***公司(ABI)生产的7300Real-time PCR System上进行。
表2-引物序列
(2)结果
2.1-食淀粉乳杆菌胞外囊泡对血清ALP、AST、ALT、肝脏TBA的影响；
血清肝酶指标的变化如图4所示(C为血清ALT活性，D为血清AST活性，E为血清ALP活性，F为肝脏TBA水平)：与对照组相比，DDC组中血清ALP、AST、ALT显著上升(P＜0.05)，与DDC组相比，DDC+LaEVs组ALP、AST、ALT显著下降(P＜0.05)。在LaEVs的影响下，肝脏总胆酸水平显著下降(P＜0.05)。
2.2-食淀粉乳杆菌胞外囊泡对肝内组织病理学变化的影响；
H&E染色表明(图5，H&E、天狼星红(Siriusred)染色(100×))：对照组中，肝脏切片表现为由正常的中央静脉和细胞结构组成的肝小叶。DDC组中，肝脏内可见明显的点状出血坏死，坏死处以大量炎性粒细胞及淋巴细胞浸润为主，大部分肝小叶结构紊乱，肝细胞索形态消失，肝小叶内细胞肿胀，细胞胞质淡染疏松，呈气球样变。LaEVs可改善DDC诱导的肝脏病变。
天狼星红染色用于检测肝内胶原蛋白的沉积(图5)，DDC组中，在肝门静脉区和汇管区有大量的胶原蛋白的沉积。LaEVs可明显降低由DDC诱导的胶原蛋白的沉积。
2.3-食淀粉乳杆菌胞外囊泡对肝内炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α基因表达水平的影响；
如图6所示，与对照组相比较，DDC组中IL-6、IL-1β、TNF-α基因表达水平显着增加，(P<0.05)。与DDC组相比，LaEVs组的IL-6、IL-1β、TNF-α基因表达水平均显着降低(P<0.05)。
2.4-食淀粉乳杆菌胞外囊泡对肝内α-SMA和Vimentin基因表达水平的影响
如图7所示，与对照组相比较，DDC组中α-SMA和Vimentin基因表达水平显着增加，(P<0.05)。与DDC组相比，LaEVs组的α-SMA和Vimentin基因表达水平均显着降低(P<0.05)。
由上述实施例可知，本发明以分离的食淀粉乳杆菌的生长曲线为切入点，以特定培养时间扩大菌体产量，结合超滤法滤过小分子蛋白等杂质，再以超速离心法分离出胞外囊泡，从而获得高浓度的菌源胞外囊泡，提供了一种高效、高纯度、低成本的胞外囊泡制备方法，且不会破坏囊泡结构，上述制剂可改善胆汁淤积性肝病，也可用于负载其他药物组分，应用前景较好。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种食淀粉乳杆菌胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括步骤：
A)接种食淀粉乳杆菌进行培养，获得含胞外囊泡的发酵菌液；
B)将步骤A)获得的发酵菌液离心，去除菌体沉淀，将收集的上清液过滤，收集滤液；
C)将步骤B)获得的滤液使用高级离心管离心，收集超滤液；
D)将步骤C)获得的超滤液超速离心，将得到的沉淀重悬、过滤，获得所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤A)中，复苏菌种后，挑取菌种于培养基中，放置于恒温培养箱37℃培养4～8h后，以1～4wt％的接种量接种于1～3L培养基中37℃培养12～24h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述食淀粉乳杆菌的分类命名为Lactobacillus amylovorus，其保藏编号为CCTCC NO：M2023427。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B)具体包括：将发酵菌液以4000～6000g、4℃离心10～20分钟，弃去菌体沉淀，将收集的上清液使用0.2～0.3μm过滤器过滤，收集滤液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤C)具体包括：将滤液使用超滤管4000～6000g、4℃离心15～60分钟，收集超滤液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述超滤管内含有可截留大于100kDa囊泡的超滤膜。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述超滤管包括滤液接收器，所述滤液接收器内置样本池，所述样本池内固定封装膜，所述滤液接收器的顶部与样本池盖为可拆卸连接。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤D)具体包括：将超滤液以11000～160000g、4℃超速离心1～3小时；将得到的沉淀用PBS重悬，使用0.2～0.3μm过滤器过滤，获得所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡。
9.一种如权利要求1～8中任一项所述的制备方法制得的食淀粉乳杆菌胞外囊泡，其特征在于，所述食淀粉乳杆菌胞外囊泡中含有结构完整的有效量的胞外囊泡。
10.一种如权利要求1～8中任一项所述的制备方法或如权利要求9所述的食淀粉乳杆菌胞外囊泡的应用，其特征在于，所述应用选自以下应用中的至少一种：在制备预防或治疗胆汁淤积性肝病的制剂中的应用、在制备胞外囊泡载药***中的应用、在转录组学/蛋白组学/脂质组学关联分析中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN117965402A (zh) * | 2024-04-02 | 2024-05-03 | 中国农业大学 | 乳酸菌外膜囊泡的制备方法及应用 |
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