CN114085791A - 一种戊糖片球菌He10-a-1及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)He10‑a‑1及其用途。本发明戊糖片球菌He10‑a‑1用于制备高耐受和高吸附重金属铅乳酸菌微生物制剂，它包括菌种活化、乳酸菌扩大培养、离心分离、配制保护剂、添加保护剂与冷冻干燥等步骤。本发明高耐受和高吸附重金属铅乳酸菌微生物制剂，对重金属铅具备高效的去除能力，并且本发明戊糖片球菌菌液喂养老鼠后行为指标、血清生化指标、肠道指标正常，食用安全可靠。

Description

一种戊糖片球菌He10-a-1及其用途
【技术领域】
本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)He10-a-1，还涉及戊糖片球菌He10-a-1的用途。
【背景技术】
国内外现有一些地区的重金属污染相当严重，并且对人体危害较大，逐渐成为危害 人类健康中的最主要问题之一。目前，人和动物体铅急性中毒通常服用巯基类化合物(二 巯基丙醇(BAL)、二巯基丙磺酸盐(DMPS)等)进行解毒，但是50％的病人会产生 副作用，主要表现是发烧、心跳过速、恶心、呕吐、盗汗，可能引起组胺的释放。乳酸 菌是食品发酵中应用广泛、安全的微生物，且易培养、繁殖速度快，越来越多的报道发 现其对于重金属铅具有良好的耐受性和吸附能力，但对实际应用到人体内作为重金属新 型生物吸附剂的研究尚处于起步阶段。
戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)He10-a-1作为益生乳酸菌被广泛应用到发酵 肉制品、发酵乳制品、发酵蔬菜等食品加工和发酵饲料中，例如CN 112205525 A公开了一种奶牛饲养用生物发酵饲料及其制备工艺，CN 111944732 A公开了一种利用戊糖片球菌C53改善发酵果蔬风味品质的方法，CN 110129219 A公开了一种戊糖片球菌可作 为饲料添加剂来预防玉米赤霉烯酮对动物的毒性影响，CN 109673960 A提供一种包含 戊糖片球菌为复合菌发酵鹿肉干及其制备方法，CN 107099482 A提供一种戊糖片球菌 T036在牛乳发酵中的应用，CN 106222103 A公开了一株产胞外多糖的戊糖片球菌及其 作为益生菌或抗氧化产品用于食品、医药、化妆品等领域的应用。但是，戊糖片球菌在 防治重金属方面未见报道。
因此，本发明人针对现有技术状况，在通过大量实验研究与分析总结的基础之上终 于完成了本发明。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)He10-a-1。
本发明的另一个目的是提供所述戊糖片球菌He10-a-1的用途。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)He10-a-1，该菌株已于2021 年10月19日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.23628。
本发明还涉及所述的戊糖片球菌He10-a-1在制备高耐受和高吸附重金属铅微生物 制剂中的用途。
根据本发明的一种优选方式，高耐受和高吸附重金属铅微生物制剂制备方法的制备 步骤如下：
A、菌种活化
挑取一环甘油保存的戊糖片球菌He10-a-1接种于MRS培养基中，在温度37℃的条件下培养24h，得到含有5～6×107cfu/ml的第一代培养物；
B、扩大培养
按照MRS培养基体积计2～4％的接种量，将步骤A得到的第一代培养物接种于 MRS培养基中，在温度37℃的条件下进行第二代培养24h，得到含有7～9×107cfu/ml 的第二代培养物；
然后，按照MRS培养基体积计2～4％的接种量，将所述第二代培养物接种于MRS 培养基中，在温度37℃的条件下进行第三代培养24h，得到含有2～5×109cfu/ml的第三 代培养物；
C、离心分离
将步骤B得到的第三代培养物在转速3500～4500r/min的条件下离心分离8～12min，得到的上清弃去，得到的沉淀物按照它与无菌生理盐水相同重量用无菌生理盐 水洗涤2～4次，每次洗涤后使用离心机进行离心分离1～3min，得到的沉淀物为含有3～ 4×1010个/克戊糖片球菌He10-a-1的菌泥；
D、配制保护剂
将脱脂乳、蔗糖、谷氨酸钠与甘油溶于蒸馏水中，得到含有以重量计8～12％脱脂乳、8～12％蔗糖、4～6％谷氨酸钠与2～4％甘油的水溶液为保护剂；
E、添加保护剂
按照以克计菌泥与以毫升计保护剂的比为1：8～12，把步骤D得到的保护剂添加到步骤C得到的戊糖片球菌He10-a-1菌泥中，使用振荡搅拌设备将它们混匀，得到含 有保护剂的菌泥；
F、冷冻干燥：
将步骤E得到的含有保护剂的菌泥装入冻存盘，在液氮中预冷冻3～4min，再将其迅速放入真空冷冻干燥机中，在温度-48℃～-53℃与压力65～70×10-3Mb的条件下干燥 16～20h，然后用铝箔袋真空包装，得到所述的高耐受和高吸附重金属铅乳酸菌微生物 制剂。
根据本发明的另一种优选方式，所述的高耐受和高吸附重金属铅的乳酸菌微生物制 剂含有3～4×1010个/克戊糖片球菌He10-a-1。
根据本发明的另一种优选方式，该乳酸菌微生物制剂中的戊糖片球菌He10-a-1在MRS液体培养基介质介质中在温度37℃条件下在6000mg/L Pb2+的胁迫下能够正常生 长，并且100mg/LPb2+的去除率达到90％以上。
根据本发明的另一种优选方式，该乳酸菌微生物制剂中的戊糖片球菌He10-a-1在1mL浓度5mmol/L硫酸亚铁溶液、1mL浓度5mmol/L水杨酸乙醇溶液与1mL3mmol/L 过氧化氢溶液混合介质中在温度37℃条件下对0.2mmol的DPPH自由基清除率达到 39.57％以上，在同样混合介质与温度的条件下对OH·自由基的清除率达到18.30％以上。
根据本发明的另一种优选方式，该乳酸菌微生物制剂中的戊糖片球菌He10-a-1在4.5mL含有2mmol/L EDTA、浓度为0.05mol/L的pH＝8.2 Tris-HCl缓冲液与2.2mL浓度25mmol/L邻苯三酚溶液的混合介质中在50℃条件下的超氧阴离子清除率达到33.62％以上，在1mL亚油酸乳化液、0.5mL pH＝7.2 PBS缓冲液、0.2mL浓度为以重量计0.01％ 的FeSO4与0.2mL浓度为以重量计0.01％的抗坏血酸混合介质中在50℃条件下的抑制 脂质过氧化能力达到61.65％以上。
根据本发明的另一种优选方式，所述的乳酸菌微生物制剂在发酵食品或发酵饲料中 的用途。
根据本发明的另一种优选方式，所述的发酵食品是馒头、面包、果酒或乳饮料；所述的乳酸菌微生物制剂在发酵食品中的用量是以重量计1.0～2.0％。
根据本发明的另一种优选方式，所述的发酵饲料是鱼饲料、鸡饲料、猪饲料或羊饲料；所述的乳酸菌微生物制剂在发酵饲料中的用量是以重量计5.0～8.0％。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)He10-a-1，该菌株已于2021 年10月19日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.23628。
高抗重金属铅乳酸菌筛选与驯化方法如下：
(i)采用常规菌株采集方法从内蒙古包头钢铁厂重金属污染区、包头黄河流段污染 区和白云鄂博矿区采集分离得到26株乳酸菌。
(ii)高耐受重金属铅筛选驯化
采集分离得到的26株乳酸菌采用含重金属铅连续培养方法(李畅，题目“具有潜在益生特性的乳酸菌对铅吸附特性及吸附机制的研究”，内蒙古农业大学，2018年。) 进行了高耐受重金属铅的筛选与驯化，其中12株菌株对铅的耐受量达到3600～ 6000mg/L，它们分别记为植物乳杆菌HeF-a-1、粪肠球菌HeF-e-4、戊糖片球菌HeF-f-2、 食窦魏斯氏菌HeF-e-2-1、粪肠球菌HeE-a-2、食窦魏斯氏菌He8-b-2、戊糖片球菌HeF-e-3、 清酒乳杆菌He6-b-1、戊糖片球菌He10-a-1、动物乳杆菌HeF-h-1、戊糖片球菌He9-b-1、 戊糖片球菌HeF-f-3，这些菌株均保藏于内蒙古农业大学食品科学与工程学院微生物实 验室中。
(iii)高吸附重金属铅菌株筛选
将上述12株高耐受重金属铅菌株接种于MRS培养基中，在温度37℃下培养24h， 得到第一代培养物；第一代培养物按照MRS培养基体积2％的接种量接种于MRS培养 基中，在温度37℃下培养24h，得到第二代培养物；第二代培养物按照MRS培养基体 积2％的接种量接种于MRS培养基中，在温度37℃下培养24h，得到第三代培养物。 第三代培养物在转速4000r/min下离心10min，弃去上清，使用等量的无菌超纯水洗涤 离心分离菌体3次，收集菌泥，使用少量超纯水制成菌悬液。在48孔方形深孔板中加 入1.4mL浓度为50mg/L的pH6.5铅离子水溶液，加入菌悬液，使铅离子水溶液中的菌 体终浓度达到5g/L。利用深孔摇床培养器振荡在温度37℃与转速800r/min的条件下培 养60min，吸取的吸附液在转速14000r/min下离心5min。移取上清液，采用常规火焰原 子吸收光谱法检测分析铅含量。筛选结果表明，其中4株戊糖片球菌(HeF-f-3、HeF-e-3、 He9-b-1、He10-a-1)对铅除率分别高达80.65％～98.61％。
(iv)抗逆性菌株筛选
采用常规抗逆性筛选方法(郝贺等人，题目“羊瘤胃乳酸菌的分离鉴定及抗逆性筛选”，《中国草食动物科学》,41(02)，pp44-48+54(2021))对上述筛选的4株戊糖片 球菌进行抗逆性筛选。筛选结果表明4株戊糖片球菌(HeF-f-3、HeF-e-3、He9-b-1、 He10-a-1)在温度20～37℃下生长良好，在初始pH2.5～6.5、高渗环境0～5％NaCl胁迫 下仍能够达到一个较高的生长量，因此，它们具备良好的抗逆性。
(v)抗生素敏感及无转移耐药基因菌株筛选
采用常规体外安全性菌株筛选方法(高熳熳等人，题目“侗族传统发酵酸肉中乳酸菌的筛选、发酵特性及安全性分析”，《食品工业科技》,41(12)，pp94-99+105(2020)) 对上述4株戊糖片球菌进行了抗生素敏感及无转移耐药基因筛选，结果发现4株戊糖片 球菌(HeF-f-3、HeF-e-3、He9-b-1、He10-a-1)对链霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿莫 西林、青霉素G、四环素、万古霉素显示耐受能力强，对红霉素敏感，无转移耐药基因 的质粒存在。
(vi)不产有害代谢产物菌株筛选
采用常规体外安全性菌株筛选方法(王英等人，题目“具有抗氧化功能的副干酪乳杆菌FM-LP-4和干酪乳杆菌FM-M9-1的安全性初步评价”，《中国乳品工业》,47(11)， pp4-7+13(2019))对上述4株戊糖片球菌(HeF-f-3、HeF-e-3、He9-b-1、He10-a-1) 进行了有害代谢产物菌株筛选，结果显示He10-a-1不分解色氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、酪 氨酸、精氨酸、不还原硝酸盐、无溶血活性、不产生D-乳酸。
(vii)急性毒性安全实验
采用常规急性毒性试验菌株筛选方法(张晓妹等人，题目“长双歧杆菌BB68S体内及体外安全性评价”，《中国奶牛》,(11)，pp43-46(2019))对筛选出的戊糖片球菌He10-a-1进行急性毒性试验筛选，结果显示He10-a-1对小鼠的器官***不会产生毒副作用，且对 小鼠的血清生化指标及脏体比无影响。
(viii)遗传毒性安全实验
采用常规体内安全性菌株筛选方法(刘旭、闫赋琴，题目“度洛西汀对小鼠急性毒性及遗传毒性的研究”，《中国医院用药评价与分析》,21(02)，pp171-174(2021))对筛 选出的戊糖片球菌He10-a-1进行体内安全性筛选，结果显示戊糖片球菌He10-a-1不会 致小鼠骨髓细胞微核率与小鼠***畸形率上升的毒副作用。
(ix)亚慢性毒性安全实验
采用常规体内安全性菌株筛选方法(李金敏等人，题目“3株牛乳源乳酸菌安全性初 步评价”，《乳业科学与技术》,39(02)，pp4-7(2016))对筛选出的戊糖片球菌He10-a-1进行体内安全性筛选，结果显示戊糖片球菌He10-a-1对小鼠的摄食量、血清生化指标、 脏体比、肠粘膜不会产生毒副作用。
下面将详细描述戊糖片球菌He10-a-1。
I、戊糖片球菌He10-a-1鉴定
根据《伯杰氏***细菌学手册》(第九版)和BLAST数据库进行菌株形态观察、 生理生化特征试验与基因片段分析。
戊糖片球菌He10-a-1菌株形态观察结果列于表1与附图1。
表1戊糖片球菌He10-a-1形态观察结果
Figure BDA0003352003460000051
戊糖片球菌He10-a-1的生理生化特征观察结果列于下表2。
表2：戊糖片球菌He10-a-1的生理生化结果
Figure BDA0003352003460000061
注：+阳性，-阴性
试验菌株16S rRNA序列PCR扩增及凝胶电泳试验菌株16SrRNA序列PCR扩增引 物F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'R:5*-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3'。
PCR扩增体系：上下游引物各2μL、模板DNA2μL、Dream Tap Green PCR Master Mix25μL、加无菌水补齐至50μL。
PCR条件参数：预变性94℃3min,变性94℃30s,退火57.4℃30s，延伸72℃90s， 循环35次，最后末端延伸72℃5min。取5μL试验菌株PCR扩增产物与1μL6xLoading buffer混合均匀，上样后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测(110V、30min)，使用凝胶成像系 统观察条带。
戊糖片球菌He10-a-1的16SrRNA分析结果列于表3。
表3：戊糖片球菌He10-a-1的16SrRNA基因片段鉴定结果
Figure BDA0003352003460000062
该基因片段分析确定He10-a-1为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。
II、戊糖片球菌He10-a-1对铅的耐受性和吸附性试验
试验方法：
采用含重金属铅固体划线培养观察方法(贾原博，题目“耐受重金属铅的乳酸菌分离筛选及鉴定”，内蒙古农业大学，2016。)对戊糖片球菌He10-a-1进行耐受性评价；
吸附性试验：
在48孔方形深孔板中加入1.4mL浓度为50mg/L的pH6.5铅离子水溶液，加入菌悬液使铅离子水溶液的菌体终浓度达到5g/L。使用深孔摇床培养器在温度37℃与转速 800r/min的条件下振荡培养60min，移取培养液在转速14000r/min下离心分离5min，得 到的上清液采用常规火焰原子吸收光谱法检测分析铅含量。
试验结果：
戊糖片球菌He10-a-1经过驯化后，在6000mg/L Pb2+胁迫下能够生长，对100mg/LPb2+的去除率分别高达93.74％。
III、戊糖片球菌He10-a-1的抗逆性研究
试验方法：
第二代菌株He10-a-1在转速4000r/min下使用无菌生理盐水进行离心洗涤3次，每次10min，制成1×107CFU/mL供试菌液，然后按照以体积计2％的比例加到浓度为以 重量计0～10％NaCl和浓度为以重量计0～0.3％胆盐的pH2.5～6.5、MRS液体培养基中， 混合均匀，在温度37℃下培养24h，使用酶标仪以相应空白培养基作为对照，测量其 OD595nm值。以pH6.0标准MRS培养液作为对照组，分析不同逆境对菌株生长的影响。
试验结果：
戊糖片球菌He10-a-1对酸碱、高渗、胆盐等均具有良好的耐受性，具体地，戊糖片球菌He10-a-1在pH值4.5～6.5范围内均能良好生长，其中最适生长pH值为pH6.5，因 此，它对酸碱均具有一定的耐受能力；
NaCl高渗环境对戊糖片球菌He10-a-1菌株有不同程度的抑制作用，在NaCl浓度为以重量计0％～8％的范围内均能生长，其中在浓度为以重量计0～5％的范围内生长不受影响，而在浓度为以重量计5％时开始受到抑制，差异显著(p<0.05)，在浓度达到以重 量计8％时，该菌株维持较低的生长量，差异极显著(p<0.01)；该菌株在胆盐浓度为 以重量计0～0.3％范围内的生长不受其影响(p>0.05)。
本发明还涉及所述的戊糖片球菌He10-a-1在制备高耐受和高吸附重金属铅微生物 制剂中的用途。
根据本发明，高耐受和高吸附重金属铅微生物制剂制备方法的制备步骤如下：
A、菌种活化
挑取一环甘油保存的戊糖片球菌He10-a-1接种于MRS培养基中，在温度37℃的条件下培养24h，得到含有5～6×107cfu/ml的第一代培养物；
本发明使用的MRS培养基是根据CN107488604A描述的制备方法制备的，或者是 使用目前市场上销售的产品，例如由广东环凯微生物科技有限公司以商品名MRS培养 基(Malt Extract Medium)销售的产品。
第一代培养物的戊糖片球菌He10-a-1活细胞数是采用GB 4789.35-2016《食品安全 国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》规定的检测方法检测的，第一代培养物含有 5～6×107CFU/mL戊糖片球菌He10-a-1活细胞。
这个步骤以及后续步骤使用的生化培养箱都是目前市场上销售的产品，例如由上海 一恒科学仪器有限公司以商品名LRH-150生化培养箱销售的产品；
B、扩大培养
按照MRS培养基体积计2～4％的接种量，将步骤A得到的第一代培养物接种于 MRS培养基中，在温度37℃的条件下进行第二代培养24h，得到含有7～9×107cfu/ml 的第二代培养物；
在本发明中，第二代培养的基本目的是增强细胞的活力和增殖速度；第三代培养的 基本目的是获得大量处于对数末期的较强活力菌体细胞。
然后，按照MRS培养基体积计2～4％的接种量，将所述第二代培养物接种于MRS 培养基中，在温度37℃的条件下进行第三代培养24h，得到含有2～5×109cfu/ml的第三 代培养物；
第二代培养物与第三代培养物都是采用前面描述的方法进行检测的。
C、离心分离
将步骤B得到的第三代培养物在转速3500～4500r/min的条件下离心分离8～12min，得到的上清弃去，得到的沉淀物按照它与无菌生理盐水相同重量用无菌生理盐 水洗涤2～4次，每次洗涤后使用离心机进行离心分离1～3min，得到的沉淀物为含有3～ 4×1010个/克戊糖片球菌He10-a-1的菌泥；
第三代培养物在转速3500～4500r/min的条件下离心分离8～12min。离心分离时间 为8～12min时，如果离心机转速低于3500r/min，则菌体与培养基不能完全分离；如果离心机转速高于4500r/min，则菌泥与离心管底部粘合过紧不利于旋涡震荡；因此，离 心机转速为3500～4500r/min是合理的；离心机转速为3500～4500r/min时，如果离心 分离时间少于8min，则则菌体与培养基不能完全分离；如果离心分离时间长于12min， 则菌泥与离心管底部粘合过紧不利于旋涡震荡；因此，离心分离时间为8～12min是恰 当的；
根据本发明，得到的沉淀物使用无菌生理盐水洗涤的主要作用是洗掉培养液带来的 试验误差。
所述沉淀物的戊糖片球菌He10-a-1数量是根据文献Wesley Morovic etal.Safety evaluation of HOWARU
Figure BDA0003352003460000081
Restore(Lactobacillus acidophilus NCFM,Lactobacillus paracasei Lpc-37,Bifidobacterium animalis subsp.lactis Bl-04and B.lactis Bi-07)for antibiotic resistance,genomic risk factors,and acutetoxicity[J].Food and Chemical Toxicology,2017,110:316-324描述的方法进行检测的。
所述沉淀物的戊糖片球菌He10-a-1数量超过3～4×1010个/克是不可取的，因为按照最适的培养条件、最高离心转速和时间，1g戊糖片球菌He10-a-1最多有3～4×1010个菌体。
本发明使用的离心机是目前市场上销售的产品，例如由德国艾本德股份公司以商品 名Centrifuge 5810 R离心机的产品。
D、配制保护剂
将脱脂乳、蔗糖、谷氨酸钠与甘油溶于蒸馏水中，得到含有以重量计8～12％脱脂乳、8～12％蔗糖、4～6％谷氨酸钠与2～4％甘油的水溶液为保护剂；
本发明使用保护剂的主要目的在于在菌泥真空冷冻干燥过程中，降低菌体细胞因急 剧温度降低与脱水作用所造成的死亡，并且为后续应用提供细胞生长所必需的营养物质。
在保护剂中，脱脂乳的基本作用是它与细胞壁表面基团结合，能够防止因温度急剧 降低所造成的细胞膜冻伤，同时为后续应用提供细胞生长所必需的氮源和其它微量营养 物质；
蔗糖在保护剂中的基本作用是它是由葡萄糖和果糖通过异构体羟基缩合而形成的 非还原性二糖，具有较高的玻璃化转变温度，对阻止蛋白质二级结构的改变、冻干处理过程中及贮藏期内蛋白质多肽链的伸展及聚集起着明显作用，能够降低细胞因冻伤所造成的死亡，并为后期的应用提供细胞生长所必需的碳源；
谷氨酸钠在保护剂中的基本作用是它在干燥过程中与水密切作用使干粉保留了适 量的水分满足了维持微生物生命活动的最低需求，同时还有抑制三酰甘油的氧化和自由 基形成，以防止对细胞膜造成不可逆破坏，能够降低细胞因冻伤所造成的死亡；
甘油在保护剂中的基本作用是它进入细胞内能渗透入细胞内部，利用自身的羟基基 团与细胞内的大分子物质形成氢键，从而取代了与水分子形成的氢键，降低细胞脱水皱缩的程度和速度。这可使得生物体中蛋白质，脂肪等生物大分子在干燥缺水的条件下， 也能在一定的程度上保持一定的结构和特性，从而提高其活性，能够降低细胞发生强烈 的脱水作用，从而保护了细胞。
在本发明中，脱脂乳、蔗糖、谷氨酸钠与甘油浓度可以高些或低些，但这些浓度通常不能超过所述浓度范围的5％，否则会出现菌粉活细胞数明显下降等问题。
本发明使用的脱脂乳、蔗糖、谷氨酸钠与甘油都是目前市场上销售的产品，例如由英国碧迪公司以商品名Skim Milk的脱脂乳，由国药集团化学试剂有限公司以商品名蔗 糖的蔗糖，由国药集团化学试剂有限公司以商品名L-谷氨酸钠的谷氨酸钠，由国药集团 化学试剂有限公司以商品名丙三醇的甘油。
E、添加保护剂
按照以克计菌泥与以毫升计保护剂的比为1：8～12，把步骤D得到的保护剂添加到步骤C得到的戊糖片球菌He10-a-1菌泥中，使用振荡搅拌设备将它们混匀，得到含 有保护剂的菌泥
根据本发明，菌泥与保护剂的比为1:8～12。如果菌泥与保护剂的比大于1:8，则接种后的活菌数不足；如果菌泥与保护剂的比小于1:12，则活菌死亡较多，后续试验活 菌数不足；因此，菌泥与保护剂的比为1:8～12是合适的，优选地是1:9～11；
本发明使用的振荡搅拌设备是本技术领域里通常使用的、在目前市场上销售的产品，例如由北方同正公司以商品名旋涡混合器HQ-60-II销售的产品。
F、冷冻干燥：
将步骤E得到的含有保护剂的菌泥装入冻存盘，在液氮中预冷冻3～4min，再将其迅速放入真空冷冻干燥机中，在温度-48℃～-53℃与压力65～70×10-3Mb的条件下干燥 16～20h，然后用铝箔袋真空包装，得到所述的高耐受和高吸附重金属铅乳酸菌微生物 制剂。
根据本发明，含有保护剂的菌泥在冻存盘中在液氮中预冷冻的基本目的在于保持菌 体成份原状，利于菌体存活。
预冷冻菌泥在真空冷冻干燥机中冷冻干燥温度、压力与时间超过所述范围是不可取 的，因为菌体干燥度过低不利于菌体的存活。
预冷冻菌泥在真空冷冻干燥机中冷冻干燥直至达到水含量为以重量计5％以下，因 为如果水分含量高于5％，菌种在保存过程中容易造成菌株的死亡，降低菌种的存活率。
本发明使用的真空冷冻干燥机是目前市场上销售的产品，例如由美国LABCONCO公司以商品名
Figure BDA0003352003460000101
的产品。
采用GB 4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》规定的检测方法检测确定，所述高耐受和高吸附重金属铅的乳酸菌微生物制剂含有3～ 4×1010个/克戊糖片球菌He10-a-1。
根据本发明，所述高耐受和高吸附重金属铅的乳酸菌微生物制剂中的戊糖片球菌He10-a-1在MRS液体培养基介质中在温度37℃条件下在6000mg/LPb2+的胁迫下能够正 常生长，并且100mg/LPb2+的去除率达到90％以上。
根据本发明，所述高耐受和高吸附重金属铅的乳酸菌微生物制剂中的戊糖片球菌He10-a-1在1mL浓度5mmol/L硫酸亚铁溶液、1mL浓度5mmol/L水杨酸乙醇溶液与 1mL3mmol/L过氧化氢溶液混合介质中在温度37℃条件下对0.2mmol的DPPH自由基清 除率达到39.57％以上，在同样混合介质与温度的条件下对OH·自由基的清除率达到 18.30％以上。
根据本发明，所述高耐受和高吸附重金属铅的乳酸菌微生物制剂中的戊糖片球菌He10-a-1在4.5mL含有2mmol/LEDTA、浓度为0.05mol/L的pH＝8.2Tris-HCl缓冲液与 2.2mL浓度25mmol/L邻苯三酚溶液的混合介质中在50℃条件下的超氧阴离子清除率达 到33.62％以上，在1mL亚油酸乳化液、0.5mLpH＝7.2PBS缓冲液、0.2mL浓度为以重 量计0.01％的FeSO4与0.2mL浓度为以重量计0.01％的抗坏血酸混合介质中在50℃条 件下的抑制脂质过氧化能力达到61.65％以上。
具体地，本发明涉及所述高耐受和高吸附重金属铅的乳酸菌微生物制剂在发酵食品 或发酵饲料中的用途。
根据本发明，所述的发酵食品是馒头、面包、果酒或乳饮料；所述的乳酸菌微生物制剂在发酵食品中的用量是以重量计1.0～2.0％。如果乳酸菌微生物制剂在发酵食品中的用量低于1.0％，则菌种量不够，发酵速度慢，不足以达到适宜的酸度和芳香味道等； 如果乳酸菌微生物制剂在发酵食品中的用量高于2.0％，则发酵速度快，酸度过高不利 于控制；因此，乳酸菌微生物制剂在发酵食品中的用量为1.0～2.0％，优选的是1.2～ 1.8％；
所述的乳酸菌微生物制剂添加到发酵食品中的方式是兼性厌氧发酵。
根据本发明，所述的发酵饲料是鱼饲料、鸡饲料、猪饲料或羊饲料；所述的乳酸菌微生物制剂在发酵饲料中的用量是以重量计5.0～8.0％。如果乳酸菌微生物制剂在发酵饲料中的用量低于5.0％，则发酵速度慢，多糖、单糖、小肽、氨基酸不足；如果乳酸 菌微生物制剂在发酵饲料中的用量高于8.0％，则发酵速度过快不利于工业化控制；因 此，乳酸菌微生物制剂在发酵饲料中的用量为5.0～8.0％，优选地是5.8～7.2％；
所述的乳酸菌微生物制剂添加到发酵饲料中的方式是直投式。
[有益效果]
本发明的有益效果在于：本发明筛选得到的具有吸附重金属铅能力的戊糖片球菌He10-a-1耐人工胃液和胆盐，具有清除DPPH和OH·羟基自由基、超氧阴离子、抑制脂 质过氧化的能力；无有害代谢产物，无耐药基因转移的质粒；对小鼠无毒，将其用于制 备重金属解毒制剂具有广泛的应用前景。
【附图说明】
图1是戊糖片球菌He10-a-1单菌落形态(×2倍)图；
图2是KM小鼠红细胞微核图；
图中：
a为正常组；b为环磷酰胺诱导组；c为戊糖片球菌灌胃组；
图3是KM小鼠***图；
图中：
a为正常组；b为环磷酰胺诱导组；c为戊糖片球菌灌胃组；
图4是KM小鼠肠道图；
图中：
a为正常组；b为戊糖片球菌灌胃组；
图5是质粒提取电泳图；
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：本发明戊糖片球菌株分离与鉴定
试验方法：
纯化戊糖片球菌He10-a-1采用甘油保存与真空冷冻保存。活化3代的戊糖片球菌He10-a-1进行了葡萄糖产气试验、过氧化氢酶试验、pH值生长试验、温度生长试验、 耐盐试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、糖发酵试验等生理生化试验。
下面将分别描述这些生理生化试验。
(i)葡萄糖产气试验
取1滴第三代戊糖片球菌He10-a-1菌液接种于内置杜氏小导管的生化鉴定管中，在 温度37℃下培养18～24h。观察发现，如果杜氏小导管内有气泡为阳性，即为异型发酵；如果杜氏小导管内无气泡为阴性，即为同型发酵。该葡萄糖产气试验结果表明，戊糖片 球菌He10-a-1为同型发酵。
(ii)pH值生长试验
取100μL第三代戊糖片球菌He10-a-1菌液分别接种于pH 4.2、pH 8.5、pH 9.6的MRS液体培养基中，在培养箱中在温度37℃下培养3天，通过酶标仪测定595nm波长 处的OD595nm的值观察其第三代戊糖片球菌He10-a-1生长状况，如果其菌株生长则为阳 性，如果其菌株不生长则为阴性，第三代戊糖片球菌He10-a-1在pH4.2为阳性。
(iii)过氧化氢酶试验
戊糖片球菌He10-a-1菌株采用上述MRS液体培养基活化，划线至MRS固体平板 培养基上，在培养箱中在温度37℃下培养24h，移取浓度为以体积计30％的过氧化氢溶 液滴至平板培养基菌落上，通过酶标仪测定595nm波长处的OD595nm的值观察是否有气 泡产生，如果有气泡产生则为阳性，如果无气泡产生则为阴性，第三代戊糖片球菌 He10-a-1为过氧化氢酶阴性。
(iv)温度生长试验
移取100μL第三代戊糖片球菌He10-a-1菌液接种于MRS液体培养基中，分别置于温度10℃、15℃、40℃、45℃与50℃下培养3天，通过酶标仪测定595nm波长处的 OD595nm的值观察其菌株生长情况，如果该菌株生长则为阳性，如果该菌株不生长则为 阴性，第三代戊糖片球菌He10-a-1在10℃、15℃、40℃、45℃与50℃为阳性。
(v)耐盐试验
移取一滴第三代戊糖片球菌He10-a-1菌液接种于浓度为以重量计6.5％的高盐肉汤 中，在培养箱中在温度37℃下培养24-48h，通过酶标仪测定595nm波长处的OD595nm的值观察其菌株生长情况，如果该菌株生长则为阳性，如果该菌株不生长则为阴性，第 三代戊糖片球菌He10-a-1在6.5％的高盐肉汤中为阳性。
(vi)硝酸盐还原试验
移取一滴第二代戊糖片球菌He10-a-1菌液接种于硝酸盐还原生化鉴定管中，在培养 箱中在温度37℃下培养24-48h，然后加2滴硝酸盐还原试剂甲与2滴硝酸盐还原试剂乙，混匀，立即通过眼睛观察，如果该菌液为深红色则为阳性，如果该菌液为略带淡粉 红色则为阴性，第三代戊糖片球菌He10-a-1在硝酸盐还原生化鉴定试验为阴性。
(vii)明胶液化试验
移取第三代戊糖片球菌He10-a-1菌液，用接菌针蘸取新鲜菌液穿刺接种于明胶液化 生化鉴定管中，在培养箱中在温度37℃下培养48-72h，然后置于冰箱中在温度4℃下停留10分钟，通过眼睛观察，如果在温度4℃下呈液态则为阳性，如果在温度4℃下呈固 态则为阴性，第三代戊糖片球菌He10-a-1在明胶液化生化鉴定试验中为阴性。
(viii)糖发酵试验
移取一滴第二代戊糖片球菌He10-a-1菌液分别接种于不同糖发酵生化鉴定管中，在 培养箱中在温度37℃下培养18-24h，通过眼睛观察，如果菌液颜色为黄色则为阳性， 如果菌液颜色为紫色则为阴性，第三代戊糖片球菌He10-a-1在糖发酵生化鉴定试验中为 阴性。
实施例2：本发明菌株的耐酸试验
该实施例的实施方式如下：
使用无菌生理盐水将第二代戊糖片球菌He10-a-1培养物在转速4000r/min条件下进 行离心洗涤10min，洗涤3次，使用0.85％生理盐水将其菌株制成1×107CFU/mL供试 菌液，以MRS液体培养基体积计2％的比例接入pH为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5的MRS 液体培养基，在培养箱中在温度37℃下培养24h，取样，采用紫外可见分光光度分析法 测量其OD595nm值，按照两次平行三次重复进行试验，通过分析酸度对戊糖片球菌 He10-a-1生长的影响。
该实施例的实施结果列于表4中。
表4：戊糖片球菌He10-a-1菌株在不同pH值下的OD595nm值
Figure BDA0003352003460000131
Figure BDA0003352003460000141
表4列出的结果表明戊糖片球菌He10-a-1对酸具有较好的耐受性，具体地，戊糖片球菌He10-a-1在pH值4.5～6.5范围内均能良好生长，其中最适生长pH值为pH6.5，因 此它对酸具有一定的耐受能力。
实施例3：本发明菌株的耐人工胆盐试验
该实施例的实施方式如下：
利用无菌生理盐水将第二代戊糖片球菌He10-a-1培养物在转速4000r/min条件下进 行离心洗涤10min，洗涤3次，将其菌株制成1×107CFU/mL供试菌液，以MRS液体培 养基体积计2％的比例接入含有以克/升计0.1％、0.2％、0.3％胆盐的MRS液体培养基记 为试验组，以MRS液体培养基体积计2％的比例接入无胆盐的MRS液体培养基记为对 照组，在培养箱中在温度37℃下培养24h，取样，利用酶标仪以相应空白培养基为对照， 采用常规紫外可见分光光度分析法测量其OD595nm值，按照两次平行三次重复进行试验， 分析试验组OD595nm值与无胆盐组OD595nm值的比，分析胆盐对戊糖片球菌He10-a-1生 长的影响。
该实施例的实施结果列于表5中。
表5：戊糖片球菌He10-a-1在不同胆盐浓度下的OD595nm值
Figure BDA0003352003460000142
注：标有不同字母表示不同菌株同一胆盐浓度间具有显著性差异，p<0.05。
表5列出的结果表明戊糖片球菌He10-a-1对胆盐具有较好的耐受性，具体地，戊糖片球菌He10-a-1在胆盐浓度为0％～0.3％的范围内均可生长，该菌株在胆盐浓度为0.1％时耐受性最好，可达27.48±1.82％，与胆盐浓度为0.2％和0.3％相比差异较为显著 (p>0.05)。
实施例4：本发明菌株的耐NaCl试验
该实施例的实施方式如下：
使用无菌生理盐水将第二代戊糖片球菌He10-a-1培养物在转速4000r/min条件下进 行离心洗涤10min，洗涤3次，使用0.85％生理盐水将其菌株制成1×107CFU/mL供试菌液，以MRS液体培养基体积计2％的比例接入至含有不同质量分数为0％～10％NaCl的MRS液体培养基，在培养箱中在温度37℃下培养24h，然后利用酶标仪以相应空白培 养基为对照，采用常规紫外可见分光光度分析法测量其OD595nm值，按照两次平行三次 重复进行试验，分析NaCl对戊糖片球菌He10-a-1生长的影响。
该实施例的实施结果列于表6中。
表6戊糖片球菌He10-a-1在不同NaCl浓度下的OD595nm值
Figure BDA0003352003460000151
注：相同字母的同列数据表示差异不显著(P>0.05)，不同字母的同列数据表示差异显著(P<0,05)
表6列出的结果表明，NaCl高渗环境对戊糖片球菌He10-a-1有不同程度的抑制作用。在NaCl浓度为0～7％范围内均能生长，其中在浓度1～4％范围内生长受影响较小， 而在浓度达到5％后NaCl抑制戊糖片球菌He10-a-1生长，差异显著(p<0.05)，在浓度 达到8％时，戊糖片球菌He10-a-1基本生长停止，差异极显著(p<0.01)。
实施例5：本发明菌株体外抗氧化能力试验
该实施例的实施方式如下：
将戊糖片球菌He10-a-1菌株活化至3代，制备完整细胞悬浮液，通过测定清除羟自由基能力、清除DPPH自由基能力、清除超氧阴离子和抑制脂质过氧化能力，评价该高 吸附铅菌株在体外抗氧化能力。
(i)完整细胞悬浮液制备
按照菌种活化步骤将戊糖片球菌He10-a-1菌株活化至三代，将第三代戊糖片球菌He10-a-1培养物在转速4000r/min条件下进行离心洗涤10min，，收集菌体细胞沉淀， 并用PBS在4℃无菌条件下洗涤3次，然后使用PBS将乳酸菌细胞重新悬浮，利用紫 外可见分光光度计将菌悬液OD595nm值调整至1.0左右，得到完整细胞悬浮液。
(ii)清除二苯基三硝基苯肼自由基(DPPH)能力的测定
取2mL戊糖片球菌He10-a-1完整细胞菌悬液，加入1mL浓度为0.2mmol/L的 DPPH无水乙醇溶液进行溶解，混合均匀，然后在温度37℃、遮光的条件下反应30min, 再在转速6000r/min条件下离心10min；移取上清液，测定其在波长517nm处的吸光度 Ai；空白组样品是以等体积无水乙醇代替DPPH无水乙醇溶液样品；对照组样品是以等 体积蒸馏水代替DPPH无水乙醇溶液样品；等体积超纯水和无水乙醇混合液空白调零， 进行两次平行三次重复试验。
按照下述公式计算DPPH清除率：
DPPH清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)]/A0*100％
式中：
A0为对照组吸光度；
Ai为样品组吸光度；
Aj为空白组吸光度。
试验数据结果列于表7中。
表7戊糖片球菌He10-a-1对DPPH自由基的清除率
Figure BDA0003352003460000161
试验结果：表7列出的结果表明戊糖片球菌He10-a-1的菌悬液对DPPH自由基清 除率是39.57％以上。
(iii)清除羟自由基(·OH)能力测定
在10mL具塞试管中依次加入1mL浓度为5mmol/L的硫酸亚铁溶液、1mL浓度为3mmol/L的过氧化氢溶液，混合均匀，接着加入2mL上述乳酸菌完整细胞菌悬液，用 PBS调节至刻度，在恒温水浴中在温度37℃下反应15min,在转速6000r/min条件下进 行离心分离10min，移取上清液，采用常规紫外可见分光光度分析法，以PBS为对照样 品，测定该上清液在波长510nm处的吸光度，按照两次平行三次重复进行试验。
按照下述公式计算羟自由基清除率：
羟自由基清除率(％)＝(A0-Ax)/A0*100％
式中：
A0是对照样品的吸光度；
Ax是样品组的吸光度。
试验数据结果列于表8中。
表8戊糖片球菌He10-a-1对羟自由基清除率
Figure BDA0003352003460000171
试验结果：表8列出的结果表明戊糖片球菌He10-a-1的菌悬液对羟自由基清除率是 18.30％。
(iv)清除超氧阴离子能力测定
移取4.5mL浓度为0.05mol/L的pH＝8.2 Tris-HCI缓冲液，它含有2mmol/L EDTA，置于水浴中，在温度25℃下加热20min，接着加入2.3mL上述完整细胞悬浮液和2.2mL 浓度为25mmo/L的邻苯三酚溶液，混匀，在水浴中在温度25℃下反应4min，接着加入 1mL浓度为10mol/L HCL溶液终止其反应，在转速6000r/min条件下进行离心分离 10min，移取上清液，采用常规紫外可见分光光度分析法测定其上清液在波长320nm处 的吸光值A样，以PBS为空白对照样品，按照两次平行三次重复进行试验。
按照下述公式计算超氧阴离子清除率：
超氧阴离子清除率(％)＝A空-A样/A空*100％
式中：
A空为空白组样品吸光度；
A样为样品组吸光度。
试验数据结果列于表9中。
表9戊糖片球菌He10-a-1对超氧阴离子清除率
Figure BDA0003352003460000172
试验结果：表9列出的结果表明戊糖片球菌He10-a-1的菌悬液对超氧阴离子清除率 是33.62％。
(v)抑制脂质过氧化能力测定
将1mL亚油酸乳状液(亚油酸乳状液的制备：0.1mL的亚油酸，0.2mL的吐温20 加入到19.7mL的去离子水)、0.5mL PBS缓冲液(pH＝7.2)、0.2mL浓度为以重量计0.01％ 的FeSO4溶液、0.2mL浓度为以重量计0.01％的抗坏血酸溶液以及0.5mL戊糖片球菌 He10-a-1完整细胞悬浮液混合均匀，使用PBS作为空白对照。在培养箱中在温度50℃ 下培养12h，然后移取2mL混合液，往其中加入0.2mL浓度为以重量计4％的三氯乙酸 溶液、2mL浓度为以重量计0.8％的TBA(硫代巴比妥酸)溶液以及0.2mL浓度为以重 量计0.4％的丁羟甲苯溶液。该反应液在培养箱中在温度100℃下培养30min，冷却，再 加入2mL三氯甲烷，在转速6000r/min条件下进行离心分离10min，移取上清液，采用 常规紫外可见分光光度分析法测定在波长532nm处的吸光度A样，以PBS为空白对照样 品，按照两次平行三次重复进行试验。
按照下述公式计算抑制脂质过氧化率：
抑制脂质过氧化率(％)＝[1-A样/A空]*100％
式中：
A空为空白组吸光度；
A样为样品组吸光度。
试验数据结果列于表10中。
表10戊糖片球菌He10-a-1对抑制脂质过氧化率
Figure BDA0003352003460000181
试验结果：表10列出的结果表明戊糖片球菌He10-a-1的菌悬液的抑制脂质能力是61.65％。
实施例6：本发明菌株耐受重金属铅能力试验
该实施例的实施方式如下：
按照上述活化方法，将戊糖片球菌He10-a-1活化至3代的菌液划线于铅离子浓度为 3600mg/L的MRS固体培养基中，放入恒温培养箱中，在温度37℃下培养48～72h，接 着挑取生长状况良好的单菌落继续划线至铅离子浓度为4800mg/L的MRS固体培养基 中，以铅离子浓度3600mg/L为起点，以1200mg/L梯度以同样方式重复进行，直至该 菌株达到最高耐受铅离子浓度为止。每隔24h观察平板上该菌生长状况并记录其耐受铅 离子浓度。将该菌株在含相对应耐受铅离子浓度的MRS固体培养基进行多次传代，观 察菌株对铅的耐受性是否发生变化，从而判断稳定性。
试验结果：
通过在MRS固体培养基上设置不同的铅离子浓度对戊糖片球菌He10-a-1进行驯化，戊糖片球菌He10-a-1在铅离子浓度为3600mg/L的平板中培养48-72h，每隔24h 对平板进行观察，发现戊糖片球菌He10-a-1生长状态良好，铅离子浓度升至4800mg/L 与6000mg/L时，培养观察发现戊糖片球菌He10-a-1生长状态良好，铅离子浓度升至 7200mg/L时，培养观察发现戊糖片球菌He10-a-1未生长，重复在此浓度划线三次，戊 糖片球菌He10-a-1均未生长，说明戊糖片球菌He10-a-1最大耐受铅离子浓度为6000 mg/L。
实施例7：本发明菌株吸附重金属铅能力试验
该实施例的实施方式如下：
按照上述活化方法，将戊糖片球菌He10-a-1活化至3代，在转速4000r/min条件下进行离心分离获得菌体，使用生理盐水洗涤3次，制成50g/L(湿重)菌悬液。在48孔方 形深孔板中加入1.4mL浓度为50mg/L的pH 6.5铅离子冰溶液，再加入该菌悬液，使铅 离子水溶液中的菌体终浓度达到5g/L，利用深孔摇床培养器在温度37℃与转速800r/min 的条件下振荡培养60min，吸取培养液在转速14000r/min下离心分离5min，得到的上 清液采用火焰原子吸收分光光度计测定其铅离子含量。按照两次平行三次重复进行试 验。
试验数据结果列于表11中。
表11戊糖片球菌He10-a-1对100mg/LPb2+的去除率
Figure BDA0003352003460000191
试验结果：表11列出的结果表明戊糖片球菌He10-a-1对100mg/LPb2+的去除率高达93.74％。
实施例8：本发明菌株有害代谢产物试验
该实施例的实施方式如下：
(i)氨基酸脱羧酶活性检测
按照上述活化方法，将戊糖片球菌He10-a-1活化至2代，将活化至2代的戊糖片球菌He10-a-1与质控菌株用生理盐水洗涤3遍，调OD595值至1，再按照2％接种量分别 接种到含有赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸的肉汤培养基中，在培养箱中在温度37℃下培养 3d，滴加指示剂呈现黄色为阴性，紫色为阳性。
(ii)吲哚试验
将活化至2代的戊糖片球菌He10-a-1与大肠杆菌ATCC25922用生理盐水洗涤3遍后，使用紫外可见分光光度计将OD595nm值调节至1，再按照以肉汤培养基体积计2％接 种量接种至吲哚肉汤培养基中，在培养箱中在温度37℃下培养3d。接着往培养液中滴 入5-10滴***，再缓慢滴入由广东环凯微生物科技有限公司以商品名靛基质试剂销售 的靛基质试剂，如果***层不变色则为阴性，如果***层变为暗红色则为阳性。
(iii)硝酸盐还原酶
将活化至2代的戊糖片球菌He10-a-1与大肠杆菌ATCC25922用生理盐水洗涤3遍，使用紫外可见分光光度计将OD595nm值调节至1，再按照以硝酸盐肉汤培养基体积计2％ 接种量接种至硝酸盐肉汤培养基中，在培养箱中在温度37℃下培养5d，接着往培养液 中加入硝酸盐还原试剂甲液(对氨基苯磺酸0.08g；2.5mol/L乙酸溶液10mL)，再加入 硝酸盐还原试剂乙液(α-萘胺0.05g；2.5mol/L乙酸溶液10mL)，如果培养液呈现淡 粉色则是阴性，呈现暗红色则是阳性。
(iv)D-乳酸检测
将活化至2代的戊糖片球菌He10-a-1用生理盐水洗涤3遍，使用紫外可见分光光度计将OD595nm值调节至1，再按照以脱脂乳培养基体积计2％接种量接种至脱脂乳培养基 中，在培养箱中在温度37℃下培养7d，称取1g脱脂乳，按照D/L-乳酸检测试剂盒进行 操作。
(v)溶血试验
将活化至2代的戊糖片球菌He10-a-1与甲型溶血链球菌BNCC102663、金黄色葡萄球菌 ATCC25923和植物乳杆菌CICC6238。甲型溶血链球菌为α-溶血、金黄色葡萄球菌为β -溶血、植物乳杆菌为γ-溶血，用生理盐水洗涤3遍，使用紫外可见分光光度计将OD595nm值调节至1，再用接种环至5％兔血血琼脂平板，在培养箱中在温度37℃下培养2d观察 结果。
该实施例的实施结果列于表12中。
表12：有害代谢产物试验结果
Figure BDA0003352003460000201
注：+阳性；-阴性
由表12可知，戊糖片球菌He10-a-1不产生吲哚等有害代谢产物。
实施例9：本发明菌株耐药性和耐药基因转移风险试验
该实施例的实施方式如下：
(i)药物敏感性检测
选取常见的链霉素、诺氟沙星、万古霉素、四环素、庆大霉素、青霉素G、阿莫西 林与红霉素8种药敏纸片，采用药敏纸片扩散法(曹英华，题目“乳酸菌与Escherichia coli共培养后对诺氟沙星耐药性变化研究”，内蒙古农业大学，2017。)进行细菌药物 敏感试验。以大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控标准菌。 取100μL戊糖片球菌He10-a-1菌液涂布在MRS固体培养基平板上，待菌液被MRS固 体培养基完全吸收后，将上述药敏纸片贴入平板上，静置5min，在培养箱中在温度37℃ 下培养24h，测量并记录这些药敏纸片的抑菌圈直径。
这些试验结果列于表13中。
表13：药物敏感性试验结果
Figure RE-GDA0003415255670000211
注：R耐药；I中度敏感；S敏感
表13列出的结果表明，质控菌株都在质控范围内试验准确度高，戊糖片球菌He10-a-1对红霉素为中度敏感。
(ii)耐药基因转移风险试验
取0.2g琼脂糖加到20mL 1×TBE电泳缓冲液中，溶解，将其温度降至60℃，接着 加入1μL核酸染料，混匀，倒入电泳槽，在室温条件下制备琼脂糖凝胶。
取3mL活化戊糖片球菌He10-a-1菌液，使用由北京博迈德基因技术有限公司以商品名博迈德生物销售的质粒小提试剂盒提取质粒。用枪吸取5μL提取液体，加入1μL 6×Loading buffer，吹打混勾，吸取5μL混合物，点样于上述制备的琼脂糖凝胶上，使用 1×TBE溶液作为电泳液，在110V电压下跑胶30min。使用由BIO公司以商品名Molecular Imager销售的图像记录分析***对琼脂糖凝胶进行分析，以大肠杆菌作为阳性对照。试 验结果参见附图5。
由附图5可知，戊糖片球菌He10-a-1无转移耐药基因质粒。
实施例10：本发明菌株急性毒性试验
该实施例的实施方式如下：
将适应环境2d的健康昆明小鼠分为2组，每组10只，雌雄各半，分别是对照组， 戊糖片球菌He10-a-1组。对照组用浓度为以重量计0.85％的生理盐水灌胃；戊糖片球菌 10-a-1组用6.667mg/g·BW的菌液灌胃。灌胃前1天让小鼠禁食16h，自由饮水，在灌 胃后第1、3、5、7d记录小鼠一般表现、行为及中毒表现，其中主要包括中枢神经*** 及躯体运动、自主神经***、呼吸***、胃肠***。并在无菌范围内用灭菌手术刀将小 鼠的心、肝、脾、肾切开，用无菌棉签擦拭脏器剖面，涂布于固体MRS培养基上，在 培养箱中在温度37℃下培养48h。如果有菌落生长再在显微镜下检查。根据菌落外观、 细胞形态、液体培养基生长特性、流动性、革兰氏反应等筛选出具有与本研究实验室菌 株相似属性的微生物，提取DNA进行PCR技术扩增。
该实施例的实施结果列于表14中。
表14：急性毒性试验的小鼠表现
Figure BDA0003352003460000221
表14中的器官***，其中包括中枢神经***及躯体运动、自主神经***、呼吸***、胃肠***等指标，试验组与对照组相同且全部正常。
实施例11：本发明菌株遗传毒性试验
该实施例的实施方式如下：
(i)哺乳动物红细胞微核试验
将适应环境2d的健康昆明小鼠，分为2组，每组10只，雌雄各半，分别是对照组， 戊糖片球菌He10-a-1组
选取体重30±2g的7周龄小鼠，雌雄性小鼠各50只，分为高、中、低戊糖片球菌 10-a-1剂量组、阳性对照组、阴性对照组共10组，每组5只。阳性采用40mg/kg·BM 环磷酰胺经口灌胃，高、中、低剂量组采用上述制备的戊糖片球菌10-a-1菌液灌胃。阴 性对照组采用浓度为以重量计0.85％生理盐水灌胃。采用30h受试物给予法(国家卫生 和计划生育委员会，食品安全国家标准哺乳动物红细胞微核试验:GB/15193.5-2014[S]， 北京，中国标准出版社,2015:05-01)，在第一次给予受试物后第24h，再次给予受试物 6h后采集骨髓样本。骨髓样本用生理盐水冲洗出滴于载玻片上与小牛血清混匀推片，晾 干后用甲醇固定，再使用Giesam染色冲片晾干后观察。镜检记录并统计嗜多染红细胞 中微核与正染红细胞数量，计算得到微核率(‰)。目的菌各剂量组微核率、PCE/NCE与 阴性对照组相比，无统计学意义，则结果为阴性，有统计学意义，并有明显的剂量反应 关系，则结果为阳性。
昆明小鼠红细胞微核图参见附图2；昆明小鼠红细胞微核试验结果列于表10中。
表15小鼠红细胞微核试验数据分析表(
Figure BDA0003352003460000222
n＝5)
Figure BDA0003352003460000223
Figure BDA0003352003460000231
注：同列数据字母相同表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0,05)
由表15可以看出，在观察每个剂量组5×1000个PCE后，戊糖片球菌10-a-1各剂 量组中PCE含微核的总数是12-16个，每个个体PCE含微核个数是1-5个，微核率是 1.3-4.7％。目的菌各剂量组与生理盐水对照组比较无显著性差异(P＞0.05)，且微核率都 在正常范围内。
在PCE/NCE中，小鼠个体200个(PCE+NCE)包含NEC为178-194个，目的菌各剂 量组与生理盐水对照组PCE/NCE比较无显著性差异(P＞0.05)。经口环磷酰胺的阳性对 照组微核率极显著高于阴性对照组以及试验组P(＜0.01)。说明在试验组的剂量范围内戊 糖片球菌10-a-1未引起小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率升高，戊糖片球菌10-a-1对小 鼠骨髓细胞未见损伤作用。
(ii)小鼠***畸形试验
选取25只体重(30±2)g的7周龄雄性小鼠，分为阳性、高、中、低与生理盐水对 照组共5组，每组5只。阳性对照采用40mg/k·BM环磷酰胺经口灌胃，高、中、低 剂量组采用上述制备戊糖片球菌10-a-1菌液灌胃，生理盐水对照组(阴性对照组)采用 0.85％生理盐水灌胃。
在处死前3h按照40mg/kg·BM浓度经口灌胃环磷酰胺，将小鼠脱颈处死，小鼠 腹部最下端喷少许75％酒精并将其剪开，剥离腹部脂肪可见黄豆粒大小睾丸，将睾丸侧 下方附睾取下，漂洗，放入含有2mL无酶无菌的离心管中，将其剪碎，并用移液枪吹 打，使***与生理盐水混匀，再用4层擦镜纸过滤，得到的滤液滴于载玻片上，晾干， 用甲醇固定，再用浓度为以重量计2％伊红染液染色1小时，镜检记录，统计目的菌剂 量组畸变率与阴性对照组***畸形形态以及数量，计算得到***畸形率(％)并将其相比， 无统计学意义，则其结果为阴性，有统计学意义，并有明显剂量反应关系，则结果为阳 性。
小鼠***图参见附图3；小鼠***畸形试验结果列于表11中。
表16小鼠***畸形试验数据分析表(
Figure BDA0003352003460000241
n＝5)
Figure BDA0003352003460000242
注：同列数据字母相同表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0,05)
由表16可以看出，阳性对照组总***畸形个数为537，阳性对照的个体畸形率为(11.46±1.37)％，戊糖片球菌10-a-1各剂量组和生理盐水对照组总***畸形数是 126-141，小鼠个体***畸形数是32-35个，个体畸形率是2.52-2.82％，各剂量组与阴性 对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。说明在试验剂量范围内，小鼠***畸形试验结果为 阴性，戊糖片球菌10-a-1对小鼠***不产生畸变作用。
实施例12：本发明戊糖片球菌He10-a-1的亚慢性毒性试验
该实施例的实施方式如下：
选择体重为(26±2)g的健康KM小鼠，雌雄小鼠各20只，随机分为4组，每组10 只。采用经口灌胃法，按照0.2mL/10g·BM的0.85％生理盐水作为灌胃溶剂，对照组 只使用溶剂灌胃，高、中、低剂量组采用所述制备戊糖片球菌He10-a-1菌液灌胃。在喂 养试验开始后，每天09:00进行灌胃，连续28d灌胃并且观察记录小鼠的一般表现、行 为、采食及中毒表现和死亡情况。在试验结束后，进行16h断粮不断水的操作，为下一 步试验做准备。
(i)小鼠血液生化指标
使用***将喂养28d的试验小鼠麻醉，摘眼球与取全血放到EDTA抗凝管中，在转速3500r/min条件下进行离心分离10min，移取抗凝管上层血清，使用血清生化测定试 剂盒测定其血请含有的谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT) 量。
小鼠血液生化指标试验结果列于表12中。
表17小鼠血清生化指标分析表(
Figure BDA0003352003460000251
n＝5)
Figure BDA0003352003460000252
注：同列数据字母相同表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0,05)
表17血液生化指标结果显示，在戊糖片球菌He10-a-1的各剂量组中，血清生化指标ALT、γ-GT与对照组无显著性差异(P＞0.05)，证明戊糖片球菌10-a-1对小鼠肝脏细 胞无损伤。各剂量组AST与对照组无显著性差异(P＞0.05)，证明戊糖片球菌10-a-1对 小鼠心肌细胞无损伤。
(ii)肠粘膜组织学检查
对照组与试验组试验小鼠用上述物料喂养28d，然后截取2cm回肠、盲肠与结肠，用生理盐水将肠道内容物清理干净，放入浓度为以重量计4％的多聚甲醛固定液中，由 爱博试剂公司进行苏木精-伊红染色和切片，使用光学显微镜上的目镜测微计测量形态 学参数。记录上皮细胞高度、绒毛高度、黏膜厚度，每个样本每个参数随机进行10次 测量，并将这些测量值的平均值用于统计分析。
小鼠肠道参见附图4；肠粘膜组织学检查结果列于表13中。
表18戊糖片球菌10-a-1对肠道形态的影响(
Figure BDA0003352003460000253
n＝5)
Figure BDA0003352003460000261
注：同行数据字母相同表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0,05)
表18肠粘膜组织学检查结果显示。在戊糖片球菌He10-a-1的各剂量组中，试验组回肠绒毛高度与生理盐水对照组回肠绒毛高度无显著性差异(P＞0.05)，试验组与生 理盐水对照组回肠、盲肠、结肠的粘膜厚度与上皮细胞高度无显著性差异(P＞0.05)， 并且粘膜厚度是30-40μm。说明戊糖片球菌10-a-1不会对小鼠的肠道组织产生损伤，表 明它对肠道无害。
实施例13：使用本发明微生物制剂生产发酵乳食品
该实施例的实施方式如下：
根据GB 19302-2010公开的发酵乳生产流程，使用全脂乳为原料，在第一步发酵步骤按照以全脂乳重量计2.0％的量添加本发明微生物制剂，生产得到全脂乳发酵食品。
根据GB14923-2010试验动物国家标准使用全脂乳发酵食品进行了试验，试验数据结果列于表19中。
表19全脂乳发酵食品降低小鼠血液中铅含量
Figure BDA0003352003460000262
试验结果：表19列出的结果表明小鼠饲用所述的酸乳发酵食品能够降低其血液中铅含量分别达到未干预组的46.70％。
实施例14：使用本发明微生物制剂生产发酵猪饲料
该实施例的实施方式如下：
根据CN 102228129 B公开的发酵饲料生产流程，使用玉米(45％)、黄(35％)、豆(10％)、菜籽饼(9.6％)和盐(0.4％)为原料，在半固态发酵步骤按照以原料总重量计5.0％量添加本发明微生物制剂，得到所述的发酵猪饲料。
根据GB14923-2010试验动物国家标准，使用玉米(45％)、黄(35％)、豆(10％)、菜籽 饼(9.6％)和盐(0.4％)为原料的发酵猪饲料进行了试验，试验数据结果列于表20中。
表20发酵猪饲料降低小鼠血液中铅含量
Figure BDA0003352003460000271
试验结果：表20列出的结果表明，喂用所述的发酵猪饲料能够降低其血液中铅含量达到未干预组的45.3％。

Claims (10)

1.一种戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)He10-a-1，该菌株已于2021年10月19日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.23628。
2.根据权利要求1所述的戊糖片球菌He10-a-1在制备高耐受和高吸附重金属铅微生物制剂中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于高耐受和高吸附重金属铅微生物制剂制备方法的制备步骤如下：
A、菌种活化
挑取一环甘油保存的戊糖片球菌He10-a-1接种于MRS培养基中，在温度37℃的条件下培养24h，得到含有5～6×107cfu/ml的第一代培养物；
B、扩大培养
按照MRS培养基体积计2～4％的接种量，将步骤A得到的第一代培养物接种于MRS培养基中，在温度37℃的条件下进行第二代培养24h，得到含有7～9×107cfu/ml的第二代培养物；
然后，按照MRS培养基体积计2～4％的接种量，将所述第二代培养物接种于MRS培养基中，在温度37℃的条件下进行第三代培养24h，得到含有2～5×109cfu/ml的第三代培养物；
C、离心分离
将步骤B得到的第三代培养物在转速3500～4500r/min的条件下离心分离8～12min，得到的上清弃去，得到的沉淀物按照它与无菌生理盐水相同重量用无菌生理盐水洗涤2～4次，每次洗涤后使用离心机进行离心分离1～3min，得到的沉淀物为含有3～4×1010个/克戊糖片球菌He10-a-1的菌泥；
D、配制保护剂
将脱脂乳、蔗糖、谷氨酸钠与甘油溶于蒸馏水中，得到含有以重量计8～12％脱脂乳、8～12％蔗糖、4～6％谷氨酸钠与2～4％甘油的水溶液为保护剂；
E、添加保护剂
按照以克计菌泥与以毫升计保护剂的比为1：8～12，把步骤D得到的保护剂添加到步骤C得到的戊糖片球菌He10-a-1菌泥中，使用振荡搅拌设备将它们混匀，得到含有保护剂的菌泥；
F、冷冻干燥：
将步骤E得到的含有保护剂的菌泥装入冻存盘，在液氮中预冷冻3～4min，再将其迅速放入真空冷冻干燥机中，在温度-48℃～-53℃与压力65～70×10-3Mb的条件下干燥16～20h，然后用铝箔袋真空包装，得到所述的高耐受和高吸附重金属铅乳酸菌微生物制剂。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于所述的高耐受和高吸附重金属铅的乳酸菌微生物制剂含有3～4×1010个/克戊糖片球菌He10-a-1。
5.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于该乳酸菌微生物制剂中的戊糖片球菌He10-a-1在MRS液体培养基介质介质中在温度37℃条件下在6000mg/LPb2+的胁迫下能够正常生长，并且100mg/LPb2+的去除率达到90％以上。
6.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于该乳酸菌微生物制剂中的戊糖片球菌He10-a-1在1mL浓度5mmol/L硫酸亚铁溶液、1mL浓度5mmol/L水杨酸乙醇溶液与1mL3mmol/L过氧化氢溶液混合介质中在温度37℃条件下对0.2mmol的DPPH自由基清除率达到39.57％以上，在同样混合介质与温度的条件下对OH·自由基的清除率达到18.30％以上。
7.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于该乳酸菌微生物制剂中的戊糖片球菌He10-a-1在4.5mL含有2mmol/L EDTA、浓度为0.05mol/L的pH＝8.2Tris-HCl缓冲液与2.2mL浓度25mmol/L邻苯三酚溶液的混合介质中在温度50℃条件下的超氧阴离子清除率达到33.62％以上，在1mL亚油酸乳化液、0.5mLpH＝7.2PBS缓冲液、0.2mL浓度为以重量计0.01％的FeSO4与0.2mL浓度为以重量计0.01％的抗坏血酸混合介质中在50℃条件下的抑制脂质过氧化能力达到61.65％以上。
8.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于所述的乳酸菌微生物制剂在发酵食品或发酵饲料中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述的发酵食品是馒头、面包、果酒或乳饮料；所述的乳酸菌微生物制剂在发酵食品中的用量是以重量计1.0～2.0％。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述的发酵饲料是鱼饲料、鸡饲料、猪饲料或羊饲料；所述的乳酸菌微生物制剂在发酵饲料中的用量是以重量计5.0～8.0％。
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CN117106666A (zh) * 2023-09-25 2023-11-24 贵州大学 戊糖片球菌ll-07、戊糖片球菌ll-07胞外多糖及其生产方法和应用

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