CN116515853B - 一种黑麦草耐盐基因LpNAC022及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种黑麦草耐盐基因LpNAC022及其应用，基因LpNAC022在植物中进行表达，以提高植物耐盐性，所述基因LpNAC022为序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列，基因LpNAC022能够用于培育耐盐碱的黑麦草等植物新品种。本发明基于全基因组关联分析结合转录组测序结果，发现一个对盐胁迫具有显著抗性的基因LpNAC022。本发明提供的黑麦草耐盐基因LpNAC022能够通过调控盐胁迫相关基因的表达，从而提高植物耐盐性，有助于培育适宜盐碱地生长的黑麦草品种，同时降低育种工作量、缩小育种规模、缩短育种年限、提高育种效率，加速耐盐碱黑麦草品种的选育。

Description

一种黑麦草耐盐基因LpNAC022及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及耐盐基因，特别涉及黑麦草耐盐基因，以及所述耐盐基因的应用。

背景技术

多年生黑麦草(Lolium perenne L.)是世界著名的优质牧草和草坪草，具有生长迅速、抗病性强、耐践踏、恢复生长快、营养丰富、适口性好等特点，是草坪建植的重要先锋草种和人工草地重要的优质牧草组成之一，也常被作为沿海滩涂地改良、生态治理和土壤盐碱化改良的最佳先锋草种。

不同来源的黑麦草种质资源对盐分的耐受性差异较大。初步的基因表达研究表明，其中一些基因可能与黑麦草耐盐性具有较强的联系，目前正在进行进一步的基因功能研究。

加强对多年生黑麦草种质资源筛选、评价和育种利用，挖掘有益变异的耐盐关键基因，选育耐盐性多年生黑麦草新品种并在生产实际中的推广利用，对建立“改良盐碱地—种植牧草—发展畜牧业—有机肥还田—盐碱地改善”的循环农业经济模式具有重要的参考价值。多年生黑麦草具有较强的耐盐碱能力，大量研究已证明其耐盐能力与盐土条件下的产量和草品质呈正相关，加强多年生黑麦草耐盐机制研究，加快耐盐品种选育，对改善和合理利用盐碱地，保障粮食安全，改善生态环境等有重要意义。

黑麦草是异花授粉牧草，其遗传转化困难，生长周期长，基因功能验证较为滞后。目前对于多年生黑麦草耐盐分子机制尚不明确，仅少数研究在其盐胁迫生理生化指标的变化进行了初步探索，育种研究进展缓慢。

植物盐胁迫是一个有复杂调控网络控制的性状，目前对于黑麦草耐盐响应分子机理不是很清楚，在黑麦草分子辅助育种中很难对相关基因及位点进行应用。截至目前，在黑麦草中还没有通过功能分析验证能够调控黑麦草耐盐的基因。

发明内容

鉴于此，本发明目的之一在于提供一种能够提高多年生黑麦草耐盐性的基因片段。

本发明目的之二在于提供一种黑麦草耐盐基因编码的蛋白质。

本发明目的之三在于提供一种用于克隆黑麦草耐盐基因的引物对。

本发明目的之四在于提供一种含有黑麦草耐盐基因的过表达载体。

本发明目的之五在于提供一种含有黑麦草耐盐基因的宿主细胞。

本发明目的之六在于提供一种黑麦草耐盐基因的用途。

发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种黑麦草耐盐基因LpNAC022，在植物中进行表达，以提高植物耐盐性，所述基因LpNAC022为下列核苷酸序列中的一组：

A、序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列；

B、与A所述序列互补的核苷酸序列。

进一步地，所述植物为黑麦草。

本发明还提供了一种由前述黑麦草耐盐基因LpNAC022编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种用于克隆前述黑麦草耐盐基因LpNAC022的引物对，所述引物对的碱基序列如下：

上游引物F：5’-ATGATCATGTCCGATCCGGC-3’；

下游引物R：5’-TTAGAAAGGGAGCAGCGTGTG-3’。

本发明还提供了一种含有前述黑麦草耐盐基因LpNAC022的过表达载体，所述全长植物耐盐基因LpNAC022被***载体pCambia1301，其中包含CaMV 35S启动子，获得过表达载体pCambia1301-35S-LpNAC022。

本发明还提供了一种含有前述过表达载体的宿主细胞，将所述过表达载体pCambia1301-35S-LpNAC022转入根癌农杆菌菌株，获得宿主细胞。

本发明还提供了一种前述黑麦草耐盐基因LpNAC022的用途，用于培育耐盐碱的植物新品种。

与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：

1、本发明基于全基因组关联分析结合转录组测序结果，发现一个对盐胁迫具有显著抗性的基因LpNAC022。本发明提供的黑麦草耐盐基因LpNAC022能够通过调控盐胁迫相关基因的表达，从而提高黑麦草耐盐性，有助于培育适宜盐碱地生长的黑麦草品种，同时降低育种工作量、缩小育种规模、缩短育种年限、提高育种效率，加速耐盐碱黑麦草品种的选育。

2、本发明仅需一对引物，进行一轮扩增，便可克隆耐盐基因LpNAC022，所需时间大大缩短。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明黑麦草耐盐基因LpNAC022编码的蛋白亲水性/疏水性预测图。

图2是本发明黑麦草耐盐基因LpNAC022编码的蛋白二级结构预测图。

图3是本发明黑麦草耐盐基因LpNAC022编码的蛋白三级结构预测图。。

图4是盐胁迫下酿酒酵母的功能验证结果图。图4中，CK代表对照组，1.4M NaCl代表加入1.4M NaCl的处理组；pYES II-LpNAC022为连接目的基因LpNAC022的酵母，pYES II为不连外源基因的空载酵母。

图5是拟南芥发芽盐胁迫实验及分析结果图。图5中，(A)为拟南芥发芽盐胁迫实验结果，(B)为拟南芥发芽盐胁迫实验第2、8、14天发芽率统计结果；CK为对照组，150mM NaCl为处理组。

图6是拟南芥幼苗期盐胁迫实验。图6中，1/2MS为对照组，1/2MS+150mM NaCl为处理组。

图7是拟南芥幼苗期盐胁迫7天生长指标数据。图7中，(A)为鲜重(fresh weight)，(B)为根长(root length)，(C)为侧根数量(lateral root number)。

具体实施方式

下面结合附图与一个具体实施例进行说明。

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中可以不对其进行进一步定义和解释。

实验材料为黑麦草品种‘绅士’，种植于四川农业大学温江校区。取其成熟叶片为材料提取总RNA。选用天根(北京)生化科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒进行RNA提取，操作参考内附说明书进行。提取到的RNA质粒用于生物信息学分析和功能分析。

黑麦草耐盐基因LpNAC022基因克隆与生物信息学分析

RNA质粒用1％琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测，使用超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度。反转录选用ABM公司的5X All-In-One RT MasterMix with AccuRT，操作流程参考内附说明书。

以黑麦草参考基因组为模板，通过全长cds序列设计引物：

上游引物F1：5’-ATGATCATGTCCGATCCGGC-3’，如序列表Seq ID NO.3所示；

下游引物R1：5’-TTAGAAAGGGAGCAGCGTGTG-3’，如序列表Seq ID NO.4所示。

以cDNA为模板进行扩增，扩增选用TaKaRa公司的PrimeSTAR Max DNA Polymerase试剂盒进行，操作流程参考内附说明书，PCR扩增体系见表1。

表1 PCR扩增体系

反应条件为94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃运行5min，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

本实施例中，只需一对引物、一次扩增，即可克隆得到LpNAC022基因，LpNAC022基因序列见序列表Seq ID NO.1。LpNAC022基因编码得到的蛋白序列见序列表Seq ID NO.2。

紫外灯下切胶，用TaKaRa公司的MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit回收纯化目的片段，具体操作参考内附说明书。用TaKaRa公司的DNAA-TailingKit在目的片段DNA的3’末端添加“A”尾。完成后取上述DNA溶液4μl，加入1μlpMD18-T载体和5μlSolution(含连接酶)混匀，在16℃反应30min。反应完成后将上所述溶液加入100μlDH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃加热45s后，再在冰上放置1min。将转化好的感受态细胞中加入890μl SOC培养基，37℃培养60分钟，涂于含有氨苄(Amp)的LB培养基上倒置过夜培养，培养后挑选单菌落培养并用菌液PCR验证目的片段是否***成功。能通过菌液PCR扩增得到目的条带进行双端测序，测序引物M13，以验证是否克隆成功。

黑麦草基因LpNAC022基因片段全长1050bp，序列如SEQ ID NO.1所示，可编码的蛋白含349个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。第10～136位是NAM(No apical meristemprotein)蛋白的保守结构域。对所编码氨基酸序列利用ProtParam在线软件分析表明，蛋白分子量为38.19402kD，理论等电点(pI)为8.88，亲水性总平均值为-0.549，不稳定系数为39.28，属于稳定的碱性蛋白。

LpNAC022基因编码蛋白亲水性/疏水性预测结果如图1所示。蛋白质的二级结构在蛋白质肽链快速折叠成具有特定功能的构象方面有重要意义，蛋白质二级结构的预测不仅有助于了解蛋白质的功能及其作用机制，对于正确预测蛋白质的空间结构更具有非常重要的意义。并且蛋白质二级结构信息广泛应用到蛋白质分子可视化、蛋白质比对以及蛋白质结构预测中。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html)预测多年生黑麦草LpNAC022蛋白的二级结构，参见图2，结果表明，该蛋白含约17.48％的α－螺旋，13.47％的延伸主链，3.15％的β-转角结构和65.90％的无规卷曲。图3示出了LpNAC022基因编码蛋白质的三级结构预测结构，亚细胞预测显示基于LpNAC022基因编码的蛋白质定位在细胞核内。

LpNAC022基因酵母表达功能分析

为初步鉴定LpNAC022的功能，选择前期克隆的LpNAC022片段，以Hind III和Xba I为酶切位点进行酶切，采用诺唯赞生物(南京)的ClonExpress Ultra One Step Cloningkit试剂盒将酶切后的片段连入线性化后的pYES II酵母表达质粒。将重组pYES II-LpNAC022质粒通过Carrier DNA(酷来搏，中国)转入酿酒酵母株系(INVScI)，以空白pYESII质粒为对照。转化后的酵母以含20mg/mL葡萄糖的酵母缺陷型培养基(SD-Ura)于28℃培养48h，选取单克隆进行PCR确认。

引物为：

正向引物F2：5’-ttggtaccgagctcggatccatgatcatgtccgatccggc-3’；如序列表SeqID NO.5所示；

反向引物R2：5’-acatgatgcggccctctagattagaaagggagcagcgtgtg-3’；如序列表Seq ID NO.6所示。

正向引物F2和反向引物R2在正向引物F1和反向引物R1的基础上增加了连接载体的同源臂。

选取阳性转化酵母于含2mg/mL半乳糖的液体酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPG)培养后，150rpm离心后以10的倍数进行稀释。稀释后的酵母悬浮液涂布于1.4M NaCl的YPG培养基上28℃培养。

酵母培养结果如图4所示。图4中，CK代表对照组，1.4M NaCl代表加入1.4M NaCl的处理组。pYES II-LpNAC022为连接目的基因LpNAC022的酵母，pYES II为不连外源基因的空载酵母。

结果表明，转入LpNAC022使酵母细胞在盐胁迫下生长速度得更快，说明LpNAC022基因具有耐盐性，可以提高酵母对盐胁迫的耐受性。

LpNAC022基因转入拟南芥功能分析

1.过表达载体构建

以pCAMBIA1301-35SN为载体，选择XbaI和SalI两个酶切位点设计LpNAC022特异引物(表2)，以前述RNA质粒作为模板，使用高保真酶扩增目的基因并将产物进行纯化回收。然后使用XbaI和SalI限制性内切酶(NEB)对pCAMBIA1301-35SN进行线性化处理，并对产物进行纯化回收。利用ClonExpress IIOne Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)分别将纯化回收的目的片段与线性化的pCAMBIA1301-35SN进行连接，连接产物分别转化Trelief^TM5α Chemically Competent Cell感受态细胞中，涂布于卡那霉素(Kan,50mg/L)的LB琼脂固体培养基中，挑选阳性单菌落使用通用引物M13(表4-2)进行PCR和测序验证后，正确菌液分别进行质粒提取，获得过表达载体pCambia1301-35S-LpNAC022。

构建过表达拟南芥植株相关的引物设计：

LpNAC022(1301)F：5′-aagcttatcgataccgtcgacatgatcatgtccgatccggc-3′，如序列表Seq ID NO.7所示，

LpNAC022(1301)R：5′-gggggatccactagttctagattagaaagggagcagcgtgtg-3′，如序列表Seq ID NO.8所示，

M13F：5′-cgccagggttttcccagtcacgac-3′，如序列表Seq ID NO.9所示，

M13R：5′-agcggataacaatttcacacagga-3′，如序列表Seq ID NO.10所示，

2.过表达载体转化农杆菌

将1中的重组质粒pCambia1301-35S-LpNAC022分别根据说明书转入GV3101Chemically Competent Cell(上海唯地生物技术有限公司)，将其加入不含抗生素的LB液体培养基培养4h，离心重悬后，涂布于含Kan(50mg/L)和利福平(50mg/L)的LB固体培养基上，倒置于28℃培养箱2-3天。挑选单克隆菌落，于含有Kan和利福平的液体LB培养基中，置于28℃，200r/min的摇床中震荡培养24h后，进行菌液PCR检测，阳性单克隆菌为宿主细胞。将宿主细胞加甘油置于-80℃保存。

3.拟南芥的转化与功能验证

拟南芥种植：将野生型种子种于1/2MS培养基，春化两天后，放于植物生长室光照时间14h/天，湿度40-60％培养约2周，然后将其移栽至花盆中(9cm×9cm×11cm)，每盆播种4棵。播种以后浇水并覆保鲜膜，在植物生长室培养；

去顶：移栽后隔两天浇一次水，隔一周浇一次霍格兰营养液，在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉；

配制浸染液：在5％的蔗糖溶液中重悬农杆菌使OD＝0.8。在浸染之前加入表面活性剂silwet-77至浓度0.02％(200uL/L)，混匀后在室温放置1h；

浸染：盛花期拟南芥去除结荚花朵后将植株地上部浸泡在宿主细胞悬浮液中20-30s；

暗培养：浸染后将植株套袋并暗培养48h；

浸染后培养：浇水方式同侵染前；

种子收集：角果自然开裂时收种；

转基因种子筛选：在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上培养浸染后所得种子，春化后正常培养7-10天。根据生长状况判断是否为转基因种子：成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养基上正常生长，非转基因种子不能正常生长；

转基因植株移栽及阳性检验：转基因种子在平板上萌发2周后，将阳性植株转入土壤继续培养，待植株长势良好时取阳性植株叶片进行DNA提取并使用目的基因序列引物进行PCR验证。

对T3代转基因植物种子进行发芽盐胁迫实验，盐胁迫浓度为150mM NaCl，在第2、8、14天统计发芽率。

实验结果如图5所示，图5中，(A)为拟南芥发芽盐胁迫实验结果，(B)为拟南芥发芽盐胁迫实验第2、8、14天发芽率统计结果；CK为对照组，150mM NaCl为处理组；WT为未转基因野生型拟南芥植株，OE1和OE2为拟南芥转基因植株。结果表明，转LpNAC022基因的拟南芥在盐胁迫条件下发芽率显著优于野生型拟南芥。

待T3代转基因植物生长至2对叶时期，将部分拟南芥转基因植株(OE1和OE2)和未转基因野生型拟南芥(WT)植株放入1/2MS培养基作为对照，处理组则将部分拟南芥转基因植株(OE1和OE2)和未转基因野生型拟南芥(WT)植株放入1/2MS+150mM NaCl培养基模拟高盐胁迫。7天后测定鲜重、根长和侧根数目，结果如图6和图7所示。

参见图6，在对照处理中，WT、OE1和OE2植株均正常生长，在盐胁迫条件下，WT、OE1和OE2植株的生长受到抑制，但OE1与OE2的根系与地上部分生长状况均好于WT。根据图7示出的拟南芥幼苗期盐胁迫7天指标数据，OE1与OE2经过150mM NaCl处理7天后的鲜重、根长和侧根数量均显著大于WT，差异达到显著水平，而对照组(1/2MS)中没有差异。

研究结果表明，转LpNAC022基因的拟南芥耐盐性显著优于野生型拟南芥。

基于本实施例的结果，LpNAC022基因能够用于多年生黑麦草耐盐碱品种的培育。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种黑麦草耐盐基因LpNAC022的用途，其特征在于，在植物中进行表达，用于提高植物耐盐性；所述基因LpNAC022为序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述黑麦草耐盐基因LpNAC022的用途，其特征在于，用于培育耐盐的黑麦草新品种。