CN106086063B - 一种基于同尾酶构建的RNAi载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于同尾酶构建的RNAi载体，其特征在于所述载体构建方法为：将靶向基因的目的片段导入过渡载体，构建获得可以产生发夹结构RNA的RNAi载体；本发明方法利用同尾酶的特性，只需要通过一次PCR扩增获得一段DNA片段，对该片段酶切一次，可以简化构建流程，提高构建效率。同时，该方法构建的RNAi载体中形成发夹结构(目的片段‑内含子‑反向重复目的片段)的部分只需要两个同尾酶酶切位点，这样可以预留出更多的单克隆位点，提高载体构建的灵活性。利用本方法构建的RNAi载体可被广泛用于多个物种基因的功能研究、遗传改造以及分子育种等，在基础研究和农业生产上都具有十分重要的价值。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种RNAi载体，特别涉及一种基于同尾酶构建的RNAi载体及其应用。
(二)背景技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由靶基因同源双链RNA引发的在动植物中普遍存在的序列特异性转录后基因沉默(Hannon,(2002)Nature,418:244-251)。最早在植物体中发现，现已成为后基因组时代的重要研究手段。RNAi在植物功能基因组、生长发育、抗病毒、品质改良等方面都有重要的应用价值。
在植物中，RNAi一般是通过具有双链RNA(dsRNA)的发夹结构RNA(hairpin RNA(hpRNA))来实现的(Waterhouse and Helliwell,(2003)Nat Rev Genet,4:29-38)。虽然，反义RNA介导的基因沉默作为一种RNAi现象已经广泛应用于植物基因功能分析，hpRNA介导的RNAi具有更高的效率(Chuang and Meyerowitz,(2000)P Natl Acad Sci USA 97:4985-4990)。产生hpRNA的载体通常是从靶标基因上克隆到一组反向互补的核苷酸序列，这一组序列中间由一段无关的间隔序列连接，然后用强启动子驱动表达。启动子可以是35S CaMV(多用于双子叶植物)或者maize ubiquitin 1(多用于单子叶植物)。反向互补序列中间的无关的间隔序列最好是内含子(Intron)，这对反向重复序列在Escherichia coli中的稳定性以及在植物中的基因沉默效率的提高都十分重要(Smith et al.,(2000)Nature 407:319-320；Wesley et al.,(2001)Plant J 27:581-590)。上述产生hpRNA的载体稳定性和效率都比较高，但是载体构建起来也相对复杂，简单高效的产生hpRNA的载体构建方法亟待发现。
同尾酶是指能酶切产生相同的粘性末端的限制性内切酶。常用的同尾酶包括：BglII和BamHI，NheI和XbaI，SalI和XhoI等。这些同尾酶的特性可以用于简化产生hpRNA的RNAi载体的构建。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种基于同尾酶构建的RNAi载体及其应用，解决目前构建产生发夹RNA载体需要克隆多个目标片段(正向序列、反向序列、内含子)的技术问题。该方法只需要用PCR的方法克隆一个目的片段就可以构建出具有高干扰效率的RNAi载体。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种基于同尾酶构建的RNAi载体，所述载体构建方法为：将靶向基因的目的片段导入过渡载体，构建获得可以产生发夹结构RNA的RNAi载体；
所述过渡载体中预置一个内含子和一个终止子，内含子的5’端依次设置同尾酶酶切位点A1、B1，3’端依次设置同尾酶酶切位点B2、A2，其中A1、A2为一组同尾酶酶切位点，B1、B2为另一组同尾酶酶切位点，字母本身没有含义，为了便于表述内含子两端设计的酶切位点来自两组同尾酶而命名；所述目的片段的5’端和3’端分别设置A1、B1或者A2、B2酶切位点；通过两次酶切、连接和转化反应，把目的片段分别连入内含子的5’端和3’端，形成“目的片段-内含子-反向重复目的片段-终止子”结构的DNA片段，再通过一次酶切、连接和转化反应把上述DNA片段连入预置有启动子的终载体中，或者DNA片段跟设计的启动子通过三段连接连入终载体，获得RNAi载体。
进一步，所述同尾酶为下列之一：(1)BglII和BamHI，(2)NheI和XbaI，(3)SalI和XhoI。也可以是其它具有类似属性的限制性内切酶。
进一步，所述内含子核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述终止子核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述载体为pGEM-T easy Vector。
进一步，所述终载体为双元载体pCambia1300-pZmUbi-G10。
进一步，所述基于同尾酶构建的RNAi载体构建方法为：
(1)以pGEM-T easy Vector为骨架，把内含子和终止子连入该载体中，同时在内含子两端分别依次设置A1、B1和B2、A2酶切位点，形成过渡载体1；(2)对PCR扩增获得两端分别设置有A1、B1或者A2、B2酶切位点的目的基因进行酶切回收，获得目的片段；
(3)然后用设置在目的基因上的两个同尾酶对过渡载体1进行酶切回收，获得载体；
(4)把步骤(2)和步骤(3)回收的目的片段和载体连接、转化，获得含有一段目的基因的过渡载体2；
(5)再用设置有同目的基因酶切位点的对应同尾酶对过渡载体2进行酶切回收，并与步骤(2)中回收的目的片段进行连接转化，获得具有“目的片段-内含子-反向重复目的片段”结构的过渡载体3；
(6)最后将过渡载体3中的“目的片段-内含子-反向重复目的片段”结构连同终止子酶切回收后连入对应的终载体中，即获得RNAi载体。
本发明还提供一种所述基于同尾酶构建的RNAi载体在基因转化中的应用。可以利用该方法构建产生发夹结构RNA的RNAi载体，通过转基因的方法导入植物或者动物细胞中，实现靶标基因的沉默。
本发明还提供一种所述基于同尾酶构建的RNAi载体在制备转基因植物中的应用。可以利用该方法构建RNAi载体，通过转基因的方法导入植物细胞中，获得靶标基因被沉默的转基因植株。该方法可以用于基因功能的研究，也可以用于抑制和沉默靶标基因的表达，改良作物性状。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
与目前已有的产生hpRNA的RNAi载体构建方法相比，本发明方法利用同尾酶的特性，只需要通过一次PCR扩增获得一段DNA片段，对该片段酶切一次，可以简化构建流程，提高构建效率。同时，该方法构建的RNAi载体中形成发夹结构(目的片段-内含子-反向重复目的片段)的部分只需要两个同尾酶酶切位点，这样可以预留出更多的单克隆位点，提高载体构建的灵活性。利用本方法构建的RNAi载体可被广泛用于多个物种基因的功能研究、遗传改造以及分子育种等，在基础研究和农业生产上都具有十分重要的价值。
(四)附图说明
图1：基于同尾酶的RNAi载体构建技术方案示意图。
图2：pGEM-T-LOG-intron-Ter载体结构示意图。LOG-Intron为水稻LOG基因第二个内含子。LOG-Intron 5’端设置有4个酶切位点，分别为EcoRI、HindIII、BamHI、XhoI，其中EcoRI、HindIII用于终载体构建，BamHI、XhoI分别为两组同尾酶中的一个，用于连接目的片段；3’端依次设置有SalI和BglII酶切位点，SalI和BglII分别为XhoI和BamHI的同尾酶。ApaI和SacI之间为人工合成的终止子Ter。
图3：接入目的片段的RNAi终载体中产生发夹结构的RNA部分的结构示意图。p35S：35S启动子；F：靶向目的基因的目的片段；LOG-Intron：水稻LOG基因第二个内含子；R：靶向目的基因的目的片段的反向重复序列；Ter：人工合成的终止子。把片段R连入载体后，酶切位点SalI和XhoI，BglII和BamHI连接后被钝化。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、RNAi过渡载体构建
水稻LOG基因(gene＝"Os01g0588900")第2个内含子序列(核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示)的获得：设计PCR引物LOG-intron-F:(5’GAATTCAAGCTTGGATCCCTCGAGTCAAGGATTTCGGGATGACC)和LOG-intron-R(5’ACATGGGCCCAGATCTGTCGACTGGTCGCCATGTCA TTGG)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得大小为0.7kb的基因组片段。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，66℃15秒，72℃1分钟，重复33个循环；然后72℃10分钟。然后，把该片段克隆到pGEM-T easy Vector中，测序验证后保存，用于接下来的过渡载体构建。该载体命名为pGEM-T-LOG-intron。上述PCR获得的片段的5’端依次设置有EcoRI、HindIII、BamHI、XhoI酶切位点，其中EcoRI、HindIII用于终载体构建，BamHI、XhoI分别为两组同尾酶中的一个，用于连接目的片段；3’端依次设置有SalI、BglII、ApaI酶切位点，其中SalI和BglII分别为XhoI和BamHI的同尾酶，用于连接目的片段，ApaI用于接入终止子。
终止子为人工合成序列Ter(SEQ ID NO.2)，5’端设置有ApaI酶切位点，3’端设置有KpnI和SacI酶切位点。
含有内含子和终止子的过渡载体的构建：用EcoRI和ApaI对pGEM-T-LOG-intron进行双酶切，回收大小约为0.7kb的LOG-intron片段；用EcoRI和SacI对pGEM-T-LOG-intron进行双酶切，回收大小约为3.0kb的pGEM-T载体；用ApaI和SacI对人工合成后连入pUC57载体中的Ter进行酶切，回收终止子。然后，把上述回收到的载体和片段进行三段连接，获得的载体命名为pGEM-T-LOG-intron-Ter(图2)，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2、沉默水稻OsTEL基因的RNAi载体的构建
水稻中的OsTEL(又命名为PLASTOCHRON2)基因编码一个RNA结合蛋白。Taiji等发现OsTEL基因发生功能缺失突变的水稻的叶片起始生长的速率加快，叶片成熟加快，且植株矮小，说明其有调控叶片起始和成熟的功能(Kawakatsu,(2006)The Plant Cell 18:612-625；Xiong et al.,(2006)Cell Research 16:267-276)。但是，由于上述突变体中OsTEL基因的功能完全缺失，无法观察OsTEL基因表达下调的表型，以及不同下调程度与表型的对应关系。因此，构建沉默OsTEL基因的RNAi载体可以帮助我们进一步研究OsTEL基因的功能。
OsTEL基因(gene＝"Os01g0907900")中靶标片段(核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示)的获得：设计PCR引物OsTEL-RNAi-F:(5’GACCTCGAGGGCTTCAGCATCGTCGTCTACC)和OsTEL-RNAi-R(5’CTTGGATCCGTCCGTGAGCAGCT TGCCGT)，以商业水稻品种秀水-134的总cDNA为模板，通过PCR扩增获得大小为0.7kb的片段。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，66℃15秒，72℃1分钟，重复33个循环；然后72℃10分钟。然后，把该片段克隆到pGEM-T easyVector中，测序验证后保存，用于接下来的过渡载体构建。上述PCR获得的片段的5’端设置有XhoI酶切位点，3’端设置有BamHI酶切位点。
含有靶向OsTEL基因的目的片段的过渡载体的构建：
第一步：用BamHI和XhoI对连有靶向OsTEL基因的目的片段的pGEM-T easy Vector进行双酶切，回收该目的片段；
第二步：用BglII和SalI对实施例1中构建好的pGEM-T-LOG-intron-Ter载体进行双酶切，回收载体片段；
第三步：把上述回收到的目的片段和载体进行连接，构建好的载体命名为pGEM-T-LOG-intron-目的片段(反向重复)-Ter；
第四步：BamHI和XhoI对pGEM-T-LOG-intron-目的片段(反向重复)-Ter载体进行双酶切，回收该载体片段，并与第一步中的片段进行连接，构建好的过渡载体命名为pGEM-T-目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重复)-Ter。
靶向OsTEL基因的RNAi终载体的构建：
双元载体pCambia1300-pZmUbi-G10(Internationl Pat.No.PCT/CN2012/087069:SEQ ID NO.49)是基于pCambia1300修改而来的，该载体包含一个耐草甘膦基因(EPSPS)，作为转化的标记基因。用BamHI和KpnI对pGEM-T-目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重复)-Ter载体进行双酶切，获得含有“目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重复)-Ter”结构的片段。人工合成35S启动子p35S(SEQ ID NO.5，经过HindIII和BamHI酶切)，用于驱动上述片段的转录。把经过BamHI和KpnI双酶切的pCambia1300-pZmUbi-G10载体、以及酶切回收的“目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重复)-Ter”结构片段、p35S进行三段连接，构建成终载体。载体T-DNA中包含如下基因结构：“p35S-目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重复)-Ter-启动子-耐草甘膦基因”。这个载体命名为：pCambia1300-G10-OsTEL-RNAi(图3)。
实施例3、沉默玉米Ms45基因的RNAi载体的构建
玉米的Ms45基因在顶花中特异性表达，该基因发生功能缺失突变的玉米植株雄性不育(Cigan et al.,2001)。只有构建一个高效的RNAi载体，把Ms45基因完全沉默，才能达到生产使用的标准。
Ms45基因(GenBank：AF360356.1)中靶标片段(核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示)的获得：设计PCR引物MS45-RNAi-F:(5’GGTGCTCGAGCTCTAGATTAGTAAAAAGGGAGAGAGAGAG)和MS45-RNAi-R(5’TGGATCCTGCAGGTTCCTCTTCTCCATGCTGGTGGAC)，以商业玉米品种郑丹958的基因组为模板，通过PCR扩增获得大小为0.4kb的片段。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，66℃15秒，72℃30秒，重复33个循环；然后72℃10分钟。然后，把该片段克隆到pGEM-Teasy Vector中，测序验证后保存，用于接下来的过渡载体构建。上述PCR获得的片段的5’端设置有XhoI酶切位点，3’端设置有BamHI酶切位点。
含有靶向Ms45基因的目的片段的过渡载体的构建：
第一步：用BamHI和XhoI对连有靶向Ms45基因的目的片段的pGEM-T easy Vector进行双酶切，回收该目的片段；
第二步：用BglII和SalI对实施例1中构建好的pGEM-T-LOG-intron-Ter载体进行双酶切，回收载体片段；
第三步：把上述回收到的目的片段和载体进行连接，构建好的载体命名为pGEM-T-LOG-intron-目的片段(反向重复)-Ter；
第四步：BamHI和XhoI对pGEM-T-LOG-intron-目的片段(反向重复)-Ter载体进行双酶切，回收该载体片段，并与第一步中的片段进行连接，构建好的过渡载体命名为pGEM-T-目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重复)-Ter。
靶向Ms45基因的RNAi终载体的构建：
双元载体pCambia1300-pZmUbi-G10(Internationl Pat.No.PCT/CN2012/087069:SEQ ID NO.49)是基于pCambia1300修改而来的，该载体包含一个耐草甘膦基因(EPSPS)，作为转化的标记基因。对pGEM-T-目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重复)-Ter载体进行酶切，获得含有“目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重复)-Ter”结构的片段。人工合成35S启动子p35S(SEQ ID NO.5，经过HindIII和BamHI酶切)，用于驱动上述片段的转录。把经过BamHI和KpnI双酶切的pCambia1300-pZmUbi-G10载体、以及酶切回收的“目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重复)-Ter”结构片段、p35S进行三段连接，构建成终载体。载体T-DNA中包含如下基因结构：“p35S-目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重复)-Ter-启动子-耐草甘膦基因”。这个载体命名为：pCambia1300-G10-Ms45-RNAi(图3)。
实施例4、水稻的转化
转基因水稻的获得方法是采用现有技术(卢雄斌，龚祖埙(1998)生命科学10：125-131；刘凡等(2003)分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满的“秀水134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。取实施例2中构建好的载体分别进行农杆菌划板。挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入OD为0.6左右的重组农杆菌菌液中(重组农杆菌菌液的制备：将重组农杆菌接种至培养基，28℃培养至OD为0.6左右；培养基组成：3g/L K2HPO4、1g/L NaH2PO4、1g/L NH4Cl、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.15g/L KCl、0.01g/LCaCl2、0.0025g/L FeSO4·7H2O、5g/L蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮，溶剂为水，pH＝5.8)，让重组农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮)中，28℃共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到筛选培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮+2mM草甘膦(Sigma))上，28℃筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基(MS+0.1g/L肌醇+5mg/L ABA+1mg/L NAA+5mg/L 6-BA+20g/L山梨醇+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上28℃培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基上，每天14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基(1/2MS+0.2mg/L NAA+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，选择产量高、种子大或者生物量高等能够提高水稻产量的转基因株系，培育新品种。获得含上述转化载体的转基因水稻植株。
实施例5、转基因水稻的鉴定
水稻是自交系，我们用获得的目标基因转基因水稻品系和空载体对照品系的纯合子进行表型的分析和比较。
将实施例4获得的转基因水稻品系和非转基因受体品系的叶片数目和株高进行比较分析。
我们获得的60个转pCambia1300-G10-OsTEL-RNAi载体的转基因品系(命名为OsTEL-i)中有45个品系和非转基因对照相比叶片起始发育速率和叶片成熟加快、株高变矮。
其中两个典型品系的叶片数目和株高的变化如下表所示。
表1：两个典型品系与非转基因对照品系的比较
| OsTEL-i-20 | OsTEL-i-55 | |
| 叶片数目 | 21％ | 32％ |
| 株高 | -32％ | -49％ |
*表格中的参数都经过F-Test检验(P≤0.05)，并且都是和对照相比差异在5％以上的。OsTEL-i为载体pCambia1300-G10-OsTEL-RNAi的T-DNA转化植株，其中OsTEL-i后面的编号(20，55)是对不同品系随机编号，用于区分不同的转化事件。
实施例6、玉米的转化
玉米的转化技术已经比较成熟。参考文献如:Vladimir Sidorov&David Duncan(in M.Paul Scott(ed.),Methods in MolecularBiology:TransgenicMaize,vol:526；Yuji Ishida,Yukoh Hiei&Toshihiko Komari(2007)Agrobacterium-mediatedtransformation of maize.Nature Protoc ols 2:1614-1622。基本方法如下：
取授粉后8-10天的Hi-II玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。将实施例3中构建的含有T-DNA载体转化农杆菌获得的重组农杆菌与未成熟胚在共培养培养基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+40mg/L乙酰丁香酮)共培养2-3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(MS+2mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+5mg/L AgNO3+200mg/L乙酰丁香酮)，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有2mM草甘膦的筛选培养基(与愈伤诱导培养基相同)上，28℃暗培养2-3周。转移所有的组织到新鲜含2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基(MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L kinetin+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基(1/2MS+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，26℃光照培养直到根发育完全。获得含上述转化载体的转基因玉米植株。
实施例7、转基因玉米的鉴定
我们使用人工授粉的方法对实施例6中获得的转基因玉米进行授粉和收获，然后对收获的T1代种子进行种植，用于观察和统计分析。
我们获得的58个转pCambia1300-G10-Ms45-RNAi载体的转基因品系(命名为Ms45-i)中有28个品系完全雄性不育，20个部分雄性不育，10个育性与非转基因对照相当。
Claims (5)
1.一种基于同尾酶构建的RNAi载体，其特征在于所述载体构建方法为：将靶向基因的目的片段导入过渡载体，构建获得可以产生发夹结构RNA的RNAi载体；
所述过渡载体中预置一个内含子和一个终止子，内含子的5’端依次设置同尾酶酶切位点A1、B1，3’端依次设置同尾酶酶切位点B2、A2，其中A1、A2为一组同尾酶酶切位点，B1、B2为另一组同尾酶酶切位点；所述目的片段的5’端和3’端分别设置A1、B1或者A2、B2酶切位点；通过两次酶切、连接和转化反应，把目的片段分别连入内含子的5’端和3’端，形成“目的片段-内含子-反向重复目的片段-终止子”结构的DNA片段，再通过一次酶切、连接和转化反应把上述DNA片段连入预置有启动子的终载体中，或者DNA片段跟设计的启动子通过三段连接连入终载体，获得RNAi载体；所述内含子核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述同尾酶为下列之一：(1)BglII和BamHI，(2)NheI和XbaI，(3)SalI和XhoI；所述终载体为双元载体pCambia1300-pZmUbi-G10；所述目的基因为水稻OsTEL基因或玉米Ms45基因。
2.如权利要求1所述基于同尾酶构建的RNAi载体，其特征在于所述终止子核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述基于同尾酶构建的RNAi载体，其特征在于所述构建方法为：
(1)以pGEM-T easy Vector为骨架，把内含子和终止子连入该载体中，同时在内含子两端分别依次设置A1、B1和B2、A2酶切位点，形成过渡载体1；
(2)对PCR扩增获得的两端分别设置有A1、B1或者A2、B2酶切位点的目的基因进行酶切回收，获得目的片段；
(3)然后用设置在目的基因上的两个同尾酶对过渡载体1进行酶切回收，获得载体；
(4)把步骤(2)和步骤(3)回收的目的片段和载体连接、转化，获得含有一段目的基因的过渡载体2；
(5)再用设置有同目的基因酶切位点的对应同尾酶对过渡载体2进行酶切回收，并与步骤(2)中回收的目的片段进行连接转化，获得具有“目的片段-内含子-反向重复目的片段”结构的过渡载体3；
(6)最后将过渡载体3中的“目的片段-内含子-反向重复目的片段”结构连同终止子酶切回收后连入对应的终载体中，即获得RNAi载体。
4.一种权利要求1所述基于同尾酶构建的RNAi载体在基因转化中的应用。
5.一种权利要求1所述基于同尾酶构建的RNAi载体在制备转基因植物中的应用。
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