CN116162631A

CN116162631A - 一种PvHKT1蛋白及其相关生物材料与应用

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Publication number: CN116162631A
Application number: CN202211506719.3A
Authority: CN
Inventors: 王志勇; 郝江珊; 胡旭; 唐敏强; 廖丽
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2022-11-29
Filing date: 2022-11-29
Publication date: 2023-05-26

Abstract

本发明公开了一种PvHKT1蛋白及其相关生物材料与应用，所述PvHKT1蛋白来源于海雀稗且其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因如SEQ ID NO.2所示。实验证明，在野生型拟南芥中过表达PvHKT1基因可以提高拟南芥的耐盐性，耐盐性提高表现为干重和根长增加，且植株体内K离子积累显著增加；PvHKT1蛋白可以调控植物耐盐性。本发明对于促进新型耐盐作物的培育和开发，打破传统农业对淡土和淡水植物的依赖，使沿海滩涂、海水能够直接用于农业生产，改良破坏生态环境，维持粮食安全生产等方面具有重要的应用价值。

Description

一种PvHKT1蛋白及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种来源于海雀稗的PvHKT1蛋白及其相关生物材料和在提高植物耐盐及盐含量中的应用。

背景技术

盐碱土是全球陆地分布广泛的一种土壤类型，全球盐碱地面积约9.5亿公顷，约占世界总土地的2.1％，占灌溉土地的19.5％。而且，耕地次生盐碱化和草场盐碱化面积呈增加趋势，是威胁世界各地农业生产力的一个重大问题。我们赖以为生的大多数作物包括其野生近缘种都对盐高度敏感，面对全球对粮食需求增加的现状，作物种植面积已经扩大到海水入侵形成的滨海盐土地区和干旱盐渍地区，培育耐盐作物是改善盐碱地生长的一种经济有效的方法。

海雀稗(Paspalum vaginatum)是禾本科(Graminea)雀稗属(Paspalum)的多年生暖季盐生草本植物，具有耐盐、耐旱、耐重金属等特性，原产于世界各地的热带和沿海地区。在中国主要分布在台湾、云南、广东、海南等盐碱化或沙质贫瘠化土壤中。

海雀稗是一种很有前途的谷类植物耐盐***研究模型，是作物耐盐基因的潜在来源。阐明海雀稗的相关耐盐机制及功能基因，并应用基因工程技术将适应盐胁迫的基因导入目标植物体内，进行基因重组和表达，从而提高目标植物的耐盐性。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种来源于海雀稗的K离子转运蛋白，过量表达该基因可显著增强转基因植物对盐的耐受性。

本发明的技术方案具体如下：

一种来源于海雀稗的K离子转运蛋白，名称为PvHKT1蛋白质，该蛋白质为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

A2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过≤10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示蛋白质具有相同耐盐活性的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。

与PvHKT1蛋白质相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明提供的与PvHKT1蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码PvHKT1蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

进一步地，在上述相关的生物材料中，B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的所述蛋白质的编码基因：

b1)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

b2)核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示序列具有90％以上一致性的序列，且该序列能够编码相同功能的蛋白质。

在上述相关的生物材料中，B2)所述的含有编码PvHKT1蛋白质的核酸分子的表达盒(即PvHKT1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达PvHKT1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动PvHKT1基因转录的启动子，还可包括终止PvHKT1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

在上述相关的生物材料中，可用现有的植物表达载体构建含有所述PvHKT1基因表达盒的重组表达载体，重组微生物具体可以为酵母、细菌或真菌等。

上述蛋白质、或上述生物材料在提高植物耐盐性，或培育高耐盐性植物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种培育耐盐植物的方法，具体为：提高目的植物中PvHKT1蛋白质或其编码基因的表达量，得到耐盐植物。

进一步地，在培育耐盐植物的方法中，提高目的植物中PvHKT1蛋白质或其编码基因的表达量是通过将PvHKT1蛋白质的编码基因导入目的植物实现的。在实际应用过程中，可先对PvHKT1蛋白质的编码基因进行修饰后，在导入目的植物中，以达到更好的表达效果。

更进一步地，在培育耐盐植物的方法中，所述将PvHKT1蛋白质的编码基因导入目的植物的过程为：

S1、使用引物对扩增海雀稗基因组，得到含有SEQ ID NO.2所示序列的扩增产物，所得产物经纯化后通过酶切方式构建表达载体；

S2、将表达载体转入宿主菌，再用宿主菌侵染目的植物，获得PvHKT1基因过表达的植株。

其中，引物对的序列如SEQ ID NO.3～4所示，目的植物为海雀稗或拟南芥。

本发明的有益效果为：本发明从海雀稗中获取了PvHKT1基因，在植物体内过表达PvHKT1，能够显著提高植物的耐盐能力，且植物体内K离子含量显著增加，故重组有PvHKT1基因的植株更能适应盐碱地。

附图说明

图1为实施例2中野生型拟南芥(WT)与PvHKT1转基因拟南芥(Line)在高盐生长环境中的表型对比图；

图2为实施例2中野生型拟南芥(WT)与PvHKT1转基因拟南芥(Line)在高盐生长环境中的干重、根长、地上K离子含量和地下K离子含量的差异柱状图。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1PvHKT1基因的获取

(1)PvHKT1基因的定位。

发明人运用开发的2,221,123个SNPs分子标记，结合海雀稗种质的耐盐相关表型，使用EMMAX软件，进行全基因组关联分析(GWAS)。显著性阈值线为0.05/SNPs数量，在显著位点上下游10.9Kb搜索候选基因。初步获得重要盐胁迫相关的标记位点后，结合转录组分析及候选基因的差异表达量，定位到一个与海雀稗耐盐性相关的基因PvHKT1，且其序列如SEQID NO.1所示。

(2)基因全长序列克隆。

利用Premier Primer 5.0软件设计引物序列，所得引物序列具体为：

PvHKT1-F：ATCGCTCTCCTATCTGACCATAGC(SEQ ID NO.3)；

PvHKT1-R：ATCGTTCCATAAGCACTGACAACT(SEQ ID NO.4)。

使用NEB的Q5高保真酶体系克隆基因全长序列，其PCR反应液体系如下表所示：

PCR反应条件为：98℃，30sec；98℃，10sec，60℃，30sec，72℃，45sec，30个循环；72℃，5min；10℃，∞。将PCR反应产物加上5μL的10×Loading Buffer，琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)构建基因入门载体和表达载体。

使用添加有保护碱基和酶切位点序列的基因引物重新克隆基因片段。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR的目的基因，在凝胶成像仪中观察和回收片段。纯化回收目的条带，使用TaKaRa公司的限制性内切酶双酶切回收纯化的基因片段，并且纯化双酶切的反应产物。使用TaKaRa公司的T4连接酶将上述步骤中基因片段连接到同样酶双酶切纯化的入门载体pND载体中。连接产物直接转化大肠杆菌感受态TOP10菌株，涂在含抗生素的LB培养基平板上，37℃过夜培养。挑取单一克隆测序验证其序列的正确性，最终获得有目的基因的pND载体和p1305.2过表达载体质粒。

实施例2耐盐的转PvHKT1基因拟南芥的获得与鉴定

(1)电转法转化根癌农杆菌EHA105。

取出农杆菌感受态和电转杯，放置冰上，在解冻的感受态中加入实施例1制备的目标质粒DNA，冰上静置5min。电击转化(0.1cm规格的电击杯，电击时间约为3.5～5ms，Bio-Rad)，加入1mL LB培养液，28℃摇床，200r/min震荡复苏30min。取100μL均匀涂在LB+50mg/mL Rif+50mg/mL Kan的培养基平板上，28℃恒温培养2～3天。

(2)拟南芥转基因遗传转化。

首先对拟南芥种子消毒均匀撒播于MS培养基平板上，放到4℃冰箱中放置2天，然后将MS培养基放置在23℃/20℃光照培养箱16h/8h培养，在有3～5片成熟叶片后，移栽生长良好的拟南芥幼苗至用营养液浇灌过的营养土和蛭石(4:6)中生长，营养土和蛭石分装在25cm³的小培养皿中，保湿7天左右，湿度为60％～80％。在生长期间适当浇灌营养液，按需要每3-4周一次(或者时间更长)。待每个植株上得到较多的花芽后，剪去第一个花序，解除顶端优势，促使多个次生花序的同步出现，当大多数花序约1～10cm高(剪主序后4～8d)时准备浸润。

取出保种的农杆菌菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接入10mL无菌LB液体培养基中(含75mg/L利福平、100mg/L链霉素和100mg/L卡那霉素)，28℃恒温下250r/min振摇过夜培养。再将所得到的菌液按1％～2％接入200mL同样含上述抗生素LB液体培养基中，28℃恒温振摇使农杆菌的浓度达到OD600＝1.8，然后在4℃下3000r/min离心15min，弃去上清液后用浸润培养基(该浸润培养基只含有5.0％的蔗糖和0.05％[500μL/L]的Silwet L-77，不用调节PH值)重新悬浮农杆菌，悬浮至OD600约0.80。

将种菌加入大口容器中，每2～3个口径9cm的容器用400～500mL用于浸染。将植株倒转，使地上组织全部浸没在农杆菌悬浮液中3～5s，并要轻轻搅动。浸润后植株上应该有一层液体膜。浸润过的植株放在塑料盘中，用干净的塑料或保鲜膜覆盖以保湿，然后放置在弱光或暗处过夜，注意小心防止阳光直射植株。处理后约12～24h去掉覆盖。正常培养植株，植株进一步生长3～5周，直至角果变褐变干。收获种子，并将种子用离心管在4℃下干燥贮存。

将转化植株的T1代二次抗性筛选后，收获T2代认为可能转化成功的植株进行分子水平上的鉴定。随机挑取T2代幼苗多株，分别移栽到外加80mM NaCl的1/2MS培养基中培养48小时。抽提RNA并反转录，用RT-PCR验证PvHKT1基因表达量，结果获得了3株基因表达量较WT(野生型)高的多的过量表达植株(即Line1、Line2和Line4)。

将WT、Line1、Line2和Line4分别在CK和含有80mM NaCl的1/2MS培养基中培养3周，各类植株的表型如图1中A所示；进一步对各类植株的根长和鲜重进行分析，结果如图1中B图所示。从图1可知：PvHKT1基因过表达的植株的根长和鲜重都要显著高于WT，说明PvHKT1基因的过表达显著增强了拟南芥对盐的耐受性。

进一步对盐处理的WT和转基因植株体内的盐含量进行测定，结果如图2所示：发现过量表达植株体内的K离子积累显著高于WT。

综上所述，在植物体内过表达PvHKT1能够显著提高植物的耐盐能力，故培育转PvHKT1基因的植株对盐碱地作物有重要意义。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种PvHKT1蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子的序列如SEQ IDNO.2所示。

4.如权利要求1所述的蛋白质、或如权利要求2或3所述的生物材料在提高植物耐盐性中的应用。

5.如权利要求1所述的蛋白质、或如权利要求2或3所述的生物材料在培育高耐盐植物和/或盐富集植物中的应用。

6.一种培育耐盐植物的方法，其特征在于，提高目的植物中如权利要求1所述蛋白质或其编码基因的表达量，得到耐盐植物。

7.根据权利要求6所述培育耐盐植物的方法，其特征在于，所述提高目的植物中如权利要求1所述蛋白质或其编码基因的表达量是通过将权利要求1所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现的。

8.根据权利要求7所述培育耐盐植物的方法，其特征在于，所述将权利要求1所述蛋白质的编码基因导入目的植物的过程为：

9.根据权利要求8所述培育耐盐植物的方法，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ IDNO.3～4所示。

10.根据权利要求8所述培育耐盐植物的方法，其特征在于，所述目的植物为海雀稗或拟南芥。