CN110257401B - 毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明研究发现，将毛果杨PtrMYB119基因转入烟草叶片，获得的转基因烟草中的花青素含量显著提升，可有效提高烟草的抗旱性。

Description

毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用。

背景技术

干旱会导致植物细胞含水量下降，活性氧自由基爆发，破坏植物细胞膜***，导致植物生长发育迟缓，甚至死亡从而造成植物减产。目前，世界上有三分之一以上的土地属于干旱和半干旱地区，干旱一直是影响农业发展的主要原因之一，如今干旱灾害范围、程度和频次均呈增加趋势，使农作物的生长发育受到严重阻碍，作物产量降低造成巨大的经济损失。提高植物的抗旱能力已经成为现代植物研究工作中的关键问题之一，抗旱机理的研究是抗旱育种的基础，也是育种的关键因素之一。因此，挖掘具有抗旱作用的基因对于培育抗旱性植物具有重要的意义。

花青素是一种具有天然生物活性的植物色素，其在营养器官中的合成和积累对植物适应和抵抗恶劣的环境条件至关重要，可以增强植物对不同生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力，比如，干旱、高温、低温盐胁迫、病虫害等。花青素在植物组织中的呈色机理、花青素的生物合成调控方面的研究较多，而其在植物抗性方面的研究较少，越来越多研究表明花青素在植物应对非生物胁迫和生物胁迫中发挥着重要作用。

发明内容

有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用。

优选的，所述应用包括如下步骤：

(1)提取毛果杨总RNA，反转录获得cDNA，以所述cDNA为模板，PCR扩增得到PtrMYB119基因；

(2)将所述PtrMYB119基因***原始载体中，得到重组植物表达载体；

(3)将所述重组植物表达载体转化到根瘤农杆菌中，得到重组根瘤农杆菌转化子；

(4)将所述重组根瘤农杆菌转化子侵染烟草叶片，得到T0代转基因植物。

优选的，步骤(1)所述PCR扩增用引物对为PtrMYB119-F和PtrMYB119-R；所述PtrMYB119-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述PtrMYB119-R的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

优选的，步骤(1)所述PCR扩增的反应体系为20μL：cDNA模板1μL、上下游引物各0.4μL(10μM)、10×Buffer 2μL、dNTPs 1.6μL、rTaq酶0.1μL，ddH₂O14.5μL。

优选的，步骤(1)所述PCR扩增的程序为：94℃，3min；30个循环，每个循环94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min；72℃终延伸10min。

优选的，步骤(2)所述原始载体为pCAMBIA2300、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301或pCAMBIA3300。

优选的，步骤(3)所述转化和/或步骤(4)所述转染后，还包括阳性鉴定的步骤。

优选的，步骤(4)得到T0代转基因植物后，还包括将所述T0代转基因植物移栽到温室的步骤。

进一步的，本发明还提供了含毛果杨PtrMYB119基因的重组植物表达载体在提高烟草耐旱性中的应用。

进一步的，本发明还提供了含毛果杨PtrMYB119基因的重组根瘤农杆菌转化子在提高烟草耐旱性中的应用。

有益效果：本发明提供了毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用。本发明研究发现，将毛果杨PtrMYB119基因转入烟草叶片，获得的转基因烟草中的花青素含量显著提升，可有效提高烟草的抗旱性。

附图说明：

图1为本发明实施例1所述转基因植株鉴定结果，其中，图1-A为染色鉴定结果；图1-B为PCR鉴定结果。

图2为转基因烟草干旱处理下的表型变化，其中，图2-A为干旱处理0天时的表型；图2-B为干旱处理10天时的表型；图2-C为干旱处理30天时的表型；图2-D为干旱处理30天时的根长统计结果；图2-E为干旱处理30天时的根长表型；图2-F为干旱处理30天时茎的表型；图2-G为干旱处理30天时茎横截面的表型。

图3为转基因烟草干旱处理下花青素和叶绿素含量的变化，其中，图3-A为花青素含量的变化；图3-B为叶绿素含量的变化。

图4为转基因烟草干旱处理下ABA含量和MDA含量的变化，其中，图4-A为ABA含量的变化；图4-B为MDA含量的变化。

图5为转基因烟草干旱处理下POD、SOD和CAT活性的变化，其中，图5-A为POD活性的变化；图5-A为SOD活性的变化；图5-C为CAT活性的变化。

图6为转基因烟草干旱处理下抗氧化基因、多胺生物合成基因和干旱响应基因的相对表达量，其中，图6-A为抗氧化基因的相对表达量；图6-B为多胺生物合成基因的相对表达量；图6-C为干旱响应基因的相对表达量。

具体实施方式

本发明提供了毛果杨PtrMYB119基因(序列号为：Potri.017G125600)在提高烟草耐旱性中的应用。本发明研究发现，将毛果杨PtrMYB119基因转入烟草叶片，获得的转基因烟草中的花青素含量显著提升，可有效提高烟草的抗旱性。

在本发明中，所述应用优选包括如下步骤：

(1)提取毛果杨总RNA，反转录获得cDNA，以所述cDNA为模板，PCR扩增得到PtrMYB119基因；

(2)将所述PtrMYB119基因***原始载体中，得到重组植物表达载体；

(3)将所述重组植物表达载体转化到根瘤农杆菌中，得到重组根瘤农杆菌转化子；

(4)将所述重组根瘤农杆菌转化子侵染烟草叶片，得到T0代转基因植物。

本发明先提取毛果杨总RNA，反转录获得cDNA，以所述cDNA为模板，PCR扩增得到PtrMYB119基因。在本发明中，所述PCR扩增用引物对优选为PtrMYB119-F和PtrMYB119-R；所述PtrMYB119-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述PtrMYB119-R的核苷酸序列如SEQID No.2所示。在本发明中，步骤(1)所述PCR扩增的反应体系优选为20μL：cDNA模板1μL、上下游引物各0.4μL(10μM)、10×Buffer 2μL、dNTPs 1.6μL、rTaq酶0.1μL，ddH₂O14.5μL。步骤(1)所述PCR扩增的程序优选为：94℃，3min；30个循环，每个循环94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min；72℃终延伸10min。

得到所述PtrMYB119基因后，本发明将所述PtrMYB119基因***原始载体中，得到重组植物表达载体。在本发明中，所述原始载体优选为pCAMBIA2300、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301或pCAMBIA3300；更优选为pCAMBIA2300。

本发明将所述重组植物表达载体转化到根瘤农杆菌中，得到重组根瘤农杆菌转化子。在本发明中，所述根瘤农杆菌优选为根瘤农杆菌EHA105。本发明优选对所述重组根瘤农杆菌转化子进行阳性鉴定。在本发明中，所述阳性鉴定优选挑取白色单菌落(重组根瘤农杆菌转化子)，接种在含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，250rpm，28℃摇菌培养4小时，用引物PtrMYB119-F和PtrMYB119-R进行PCR检测阳性克隆。

得到重组根瘤农杆菌转化子后，本发明将所述重组根瘤农杆菌转化子侵染烟草叶片，得到T0代转基因植物。在本发明中，所述侵染优选使用浸泡法：将切成小片的烟草叶片浸泡在含所述重组根瘤农杆菌转化子的LB液体培养基中1～3min。本发明优选对所述T0代转基因植物进行阳性鉴定。在本发明中，所述阳性鉴定优选采用染色法或PCR法。

得到T0代转基因植物后，本发明优选还包括将所述T0代转基因植物移栽到温室的步骤。

本发明从毛果杨中克隆花青素生物合成相关基因PtrMYB119，构建过表达载体，然后用农杆菌转化法转入烟草叶片。本发明通过对该基因在烟草株系中过表达，并对其功能进行分析。结果表明：PtrMYB119基因的过表达可以提升烟草中花青素和ABA含量、抗氧化酶活性以及相关基因的表达量，并且能降低MDA浓度，从而提高转基因烟草的耐旱性。

本发明还提供了含毛果杨PtrMYB119基因的重组植物表达载体以及含毛果杨PtrMYB119基因的重组根瘤农杆菌转化子在提高烟草耐旱性中的应用。本发明对含毛果杨PtrMYB119基因的重组植物表达载体以及含毛果杨PtrMYB119基因的重组根瘤农杆菌转化子的具体应用方式不作特别限定。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1：

(1)提取毛果杨总RNA，反转录后获得cDNA，并以PCR技术从杨树cDNA中扩增出扩增出PtrMYB119基因编码序列。具体过程为：以如下核苷酸序列为引物：PtrMYB119-F：5’-CTAAGGAAGTGCGTTGAGAA-3’，PtrMYB119-R：5’-GCCAAGCAACTTGTGTAGTC-3’，进行PCR扩增。扩增条件为94℃，3min；30个循环，每个循环94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min；72℃终延伸10min；反应体系为20μL：cDNA模板1μL、上下游引物各0.4μL(10μM)、10×Buffer 2μL、dNTPs1.6μL、rTaq酶0.1μL，ddH₂O14.5μL。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶提取试剂盒进行割胶回收，回收产物测定浓度后储存于-20℃，或直接进行酶切，连接等反应。

(2)将所获得PtrMYB119基因***载体pCAMBIA2300中获得植物表达载体pCAMBIA2300-PtrMYB119。具体过程为：通过gateway重组***将步骤1所得基因PtrMYB19扩增产物克隆入过表达载体pCAMBIA2300(卡那霉素抗性)中获得植物表达载体pCAMBIA2300-PtrMYB119(参考文献：Karimi,M.,Inze,D.,Depicker，A.,Gateway vectors forAgrobacterium-mediated planttransformation.Trends Plant Sci.2002 May:7(5):193-195)。

(3)将所得植物表达载体转化到根瘤农杆菌EHA105中。具体过程为：

①取-80℃保存的农杆菌感受态细胞于手心片接待其部分融化，处于冰水混合状态时***冰中；

②取100μL感受态细胞加入0.01～1.0μg质粒，手指轻敲管底混匀，依次于冰上、液氮中、37℃水浴和冰浴中各静置5min；

③加入无菌LB液体培养基，于28℃度震荡培养2～3小时；

④6000rpm离心1min收菌，取50μL上清液轻轻吹打重悬菌块涂布于含100mg/L卡那霉素的LB平板上，倒置于28℃摇床上培养2～3天。

⑤阳性克隆检测：挑取白色单菌落，接种在含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，250rpm，28℃摇菌培养4小时，用引物进行PCR检测阳性克隆，鉴定无误后，摇菌待用于转化K326普通烟草。

(4)将所得农杆菌转化子侵染烤烟类K326烟草叶片，获得T0代转基因植物。具体过程为：将鉴定无误的农杆菌转化子pCAMBIA2300-PtrMYB119接种于30mL LB液体培养基中(含50mg/ml卡那霉素)在温度设置成28℃的摇床中培养直至OD₆₀₀为0.5～0.8，离心收集菌体，用30ml转化培养基MSo重悬农杆菌，采用浸泡法转化烟草叶片，取鲜嫩叶片，切成小片状，浸泡在农杆菌培养基中两分钟左右。取出叶片，置于不含抗生素的MS固体培养基上28℃暗培养2～3天，2～3天后移到含有卡那霉素的MS分化培养基上等待分化，一周换一次培养基，等待叶片分化长出抗性芽后进行检测。

转基因植株鉴定：

①染色鉴定：剪取上述试管苗叶片0.2cm，置于GUS染液中，37℃染色12h以上。之后使用无水乙醇进行脱色。叶片出现蓝色则表明报告基因成功的整合到植物基因组中，该植物即为转基因植株(图1A)。

②PCR鉴定：采用宝日生物技术(北京)有限公司生产的PCR试剂盒，对染色成蓝色的植株进行转基因植株的PCR验证(图1B)。以如下核苷酸序列为引物：PtrMYB119-F：5’-CTAAGGAAGTGCGTTGAGAA-3’，PtrMYB119-R：5’-GCCAAGCAACTTGTGTAGTC-3’，进行PCR扩增，扩增条件为94℃，3min；30个循环，每个循环94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min；72℃终延伸10min；反应体系为20μL：DNA模板1μL、上下游引物各0.4μL(10μM)、10×Buffer 2μL、dNTPs1.6μL、rTaq酶0.1μL，ddH₂O14.5μL。

(5)将转基因植株移栽到温室中，得到花青素含量提高以及抗旱性提高的转基因烟草。具体过程为：选取三个过表达转基因株系(A、B和C)以及野生型植株进行干旱处理，每个株系都有5个植株。这些植株在组培瓶中精细培养20天后，放置在光照培养箱中炼苗7天，炼苗结束后移栽至温室中的塑料花盆中培养。温室条件：温度28℃，光暗周期为16h/8h。充分浇水保持植株长势一致后开始干旱处理，每间隔10天进行一次取样和拍照，连续取3次。

(6)对转基因烟草的花青素含量和抗旱性进行测定，具体方法如下：

以过表达PtrMYB119转基因烟草以及野生型烟草作为对照，通过分光光度计发测定植株体内花青素含量，结果表明：在干旱处理下，过表达PtrMYB119转基因烟草的花青素含量显著高于野生型烟草。

在干旱处理下，通过观察表型，测定根长、叶片萎蔫比和茎横截面，测定ABA和MDA含量、测定抗氧化酶活性以及测定抗氧化基因、多胺生物合成基因和干旱响应基因的相对表达等方法验证转基因烟草的抗旱性，结果见图2～图6。图2～图6表明：和野生型烟草相比，过表达PtrMYB119能显著提高转基因烟草的抗旱性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

<120> 毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctaaggaagt gcgttgagaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccaagcaac ttgtgtagtc 20

Claims (10)

1.毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草脱落酸含量、促进烟草多胺生物合成基因和干旱响应基因表达中的应用；所述多胺生物合成基因为ERD10D、ADC1和SAMDC；所述干旱响应基因为NCED3和NAC/RD26。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取毛果杨总RNA，反转录获得cDNA，以所述cDNA为模板，PCR扩增得到PtrMYB119基因；

(2)将所述PtrMYB119基因***原始载体中，得到重组植物表达载体；

(3)将所述重组植物表达载体转化到根瘤农杆菌中，得到重组根瘤农杆菌转化子；

(4)将所述重组根瘤农杆菌转化子侵染烟草叶片，得到T0代转基因植物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述PCR扩增用引物对为PtrMYB119-F和PtrMYB119-R；所述PtrMYB119-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述PtrMYB119-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述PCR扩增的反应体系为20μL：cDNA模板1μL、10μM的上下游引物各0.4μL、10×Buffer 2μL、dNTPs 1.6μL、rTaq酶0.1μL，ddH 2O 14.5μL。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述PCR扩增的程序为：94℃，3min；30个循环，每个循环94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min；72℃终延伸10min。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述原始载体为pCAMBIA2300、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301或pCAMBIA3300。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述转化和/或步骤(4)所述转染后，还包括阳性鉴定的步骤。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(4)得到T0代转基因植物后，还包括将所述T0代转基因植物移栽到温室的步骤。

9.含毛果杨PtrMYB119基因的重组植物表达载体在提高烟草脱落酸含量和促进烟草多胺生物合成基因以及干旱响应基因表达中的应用；所述多胺生物合成基因为ERD10D、ADC1和SAMDC；所述干旱响应基因为NCED3和NAC/RD26。

10.含毛果杨PtrMYB119基因的重组根瘤农杆菌转化子在提高烟草脱落酸含量和促进烟草多胺生物合成基因以及干旱响应基因表达中的应用；所述多胺生物合成基因为ERD10D、ADC1和SAMDC；所述干旱响应基因为NCED3和NAC/RD26。

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