CN116515808A - 一种益生菌微胶囊及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种益生菌微胶囊及其应用。本发明利用含有乳清蛋白、***胶、金耳多糖的壁材保护剂与益生菌组合制备得到益生菌微胶囊，制备得到的益生菌微胶囊能够很好的保护益生菌在外界不利条件下的细胞活性，同时制备的菌剂表现出更好的性质及更优良的贮存性能，能显著提高益生菌菌剂的贮存稳定性能和益生菌的肠道粘液的定植能力。同时应用于肉鸡饲养时，能显著提高肉鸡的生长性能。

Description

一种益生菌微胶囊及其应用
技术领域
本发明属于属于微生物工程领域，具体涉及一种益生菌微胶囊及其应用。
背景技术
益生菌是“当给予宿主足够的量时，就可以对宿主起到有益作用的活的微生物”。目前，加工储存过程中细胞失活严重是开发益生菌菌剂的关键难题。微胶囊技术是21世纪兴起的一种益生菌保护技术，它能保护细胞免受加工过程中的热、氧、剪切力等外界不利环境导致的细胞损伤，是一种可行的制备稳态化益生菌菌剂的技术手段。
喷雾干燥是将液体中的细菌及载体材料通过泵输送至雾化器，随后雾化器将物料分散成无数细小的液滴，液滴在下降过程中与热空气接触，发生传热传质，热空气带走物料中的水分，形成固体颗粒并完成细菌脱水过程。喷雾干燥过程中，通过修改喷雾干燥器的配置，工艺参数，可以在一定范围内调节热、渗透压、机械、脱水对细胞的损害，不仅能提高喷雾干燥后的存活率，对于维持细菌在贮藏活菌数的稳定也有帮助。
对益生菌喷雾干燥之前，添加保护剂是必要程序，保护剂对益生菌的贮藏存活率有较大影响，选择合适的保护剂是提高益生菌干燥期存活率和保持贮藏期活菌数、延长贮藏期的关键因素。金耳多糖是一种能调节免疫功能，且具有良好的抗氧化性能和降血糖、抗凝血、抗血拴等功效的多糖。但金耳多糖对益生菌是否具有保护作用尚未有明确的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，为了有效避免益生菌菌种因外界环境破坏菌体的生理活性以及细胞膜而导致的益生菌菌剂在储藏过程中剧烈失活，提供一种益生菌微胶囊。
本发明还要解决的问题是，提供上述益生菌微胶囊的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种益生菌微胶囊，将肠道益生菌与壁材保护剂混合后经喷雾干燥制备得到的；
其中，所述的壁材保护剂包括1-12wt％蛋白或氨基酸载体、1-12wt％糖及糖醇类化合物载体中的任意一种或几种的组合，余量为水。
其中，所述的肠道益生菌包括但不限于嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、丁酸梭菌和植物乳杆菌中的任意一种或几种的组合，优选丁酸梭菌，更优选丁酸梭菌Clostridiumbutyricum CCTCC AB 2017089。
上述肠道益生菌菌种不限于上述分类下的特定菌株，现有技术中满足上述分类的肠道益生菌菌种均适用于本发明。
其中，所述的蛋白或氨基酸载体包括聚谷氨酸钠、谷氨酸钠、明胶、大豆分离蛋白、玉米醇溶蛋白、乳清蛋白和分离乳清蛋白中的任意一种或几种的组合，优选的蛋白或氨基酸载体为大豆分离蛋白、乳清蛋白和/或分离乳清蛋白，更优选乳清蛋白。
其中，所述的糖及糖醇类化合物载体包括甘露醇、金耳多糖、海藻糖、蔗糖、环糊精、***胶中的任意一种或几种的组合，优选的糖及糖醇类化合物载体为金耳多糖和/或***胶。
优选的，所述的益生菌微胶囊，是将丁酸梭菌与乳清蛋白、金耳多糖或***胶中的任意一种或几种混合后经喷雾干燥制备得到的。
进一步优选的益生菌微胶囊，是将丁酸梭菌、乳清蛋白、金耳多糖和***胶混合后经喷雾干燥制备得到的或是将丁酸梭菌、乳清蛋白和***胶混合后经喷雾干燥制备得到的。
更优选的是将丁酸梭菌、乳清蛋白、金耳多糖和***胶混合后经喷雾干燥制备得到的。
上述益生菌微胶囊中，所述的肠道益生菌与壁材保护剂混合，其中，所述的肠道益生菌的质量分数为15-30wt％，壁材保护剂的质量分数为70-85wt％；优选的，肠道益生菌的质量分数为25wt％，壁材保护剂的质量分数为75wt％。
其中，所述的肠道益生菌预先经活化、发酵培养和浓缩处理。
具体的，所述的活化，其活化接种量为1-2％v/v，活化条件为：30-37℃恒温厌氧培养20-30h，活化培养基为RCM液体培养基。
具体的，所述的发酵培养，其接种量为1-10％v/v，发酵培养基为：以重量份计，1000g纯净水中包括葡萄糖20g，胰蛋白胨5g，牛肉膏10g，酵母粉50g，硫酸锰0.58g，硫酸镁0.28g，吐温80 1g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二胺2g和乙酸钠10g，发酵培养条件为：30-37℃，pH5.5～6.5，培养20-24h。
具体的，所述的浓缩，其温度为2-6℃。
上述益生菌微胶囊中，所述的喷雾干燥，其条件为：进料温度105～120℃，雾化压力2.25-3.25bar，进风量3-4m3/h，开始喷雾，出口温度55-65℃。
上述益生菌微胶囊在提升益生菌菌剂贮存稳定性能中的应用也在本发明所保护的范围之内。
具体的，所述的益生菌微胶囊贮存稳定性能提高具体表现在：水活度满足益生菌干粉(aw＝0.1～0.25)储存要求，表面光滑、粒径均一、玻璃态转化温度高、细胞酶活性相对升高。
上述益生菌微胶囊在提高益生菌肠道定殖粘附性中的应用也在本发明所保护的范围之内。
具体的，在体外肠黏液黏附实验(肠道液)和体外肠道黏附实验(大鼠肠道)中，所述的益生菌微胶囊能显著增强肠道黏液对丁酸梭菌的黏附性。
上述益生菌微胶囊在肉鸡养殖中的应用也在本发明所保护的范围之内。
具体的，在肉鸡饲喂试验中，益生菌微胶囊能提高肉鸡的生产性能，降低饲料转化率。
有益效果：
(1)本发明以喷雾干燥为益生菌微胶囊制备的技术，通过对多种蛋白或氨基酸载体和糖及糖醇类化合物载体进行筛选，筛选得到乳清蛋白、***胶、金耳多糖，通过复配分别得到负载丁酸梭菌的乳清蛋白-***胶益生菌微胶囊和负载丁酸梭菌的乳清蛋白-***胶-金耳多糖益生菌微胶囊。
(2)相对于乳清蛋白-***胶益生菌微胶囊，添加金耳多糖制备的乳清蛋白-***胶-金耳多糖益生菌微胶囊有更好粒径均一性和更高的玻璃态转化温度，提高了菌剂的储存性能和稳定性。
(3)相对于乳清蛋白-***胶益生菌微胶囊，添加金耳多糖制备的乳清蛋白-***胶-金耳多糖益生菌微胶囊对丁酸梭菌有更强的保护能力，干燥后细胞损伤更小，具体体现为金耳多糖的添加能使干燥后样品中细胞酶活性相对升高，提高了菌剂的储存性能。
(4)相对于乳清蛋白-***胶益生菌微胶囊，添加金耳多糖制备的乳清蛋白-***胶-金耳多糖益生菌微胶囊能显著提高丁酸梭菌在肠道的定植性能，具体体现为金耳多糖添加后，丁酸梭菌在肠黏液和肠道表皮的黏附率显著提高。
(5)相对于乳清蛋白-***胶益生菌微胶囊，添加金耳多糖制备的乳清蛋白-***胶-金耳多糖益生菌微胶囊能提高肉鸡的生产性能，降低饲料转化率。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
下图中所述微胶囊组1即为益生菌微胶囊组1，所述的微胶囊组2即为益生菌微胶囊组2.
图1为喷雾干燥设备图。
图2为不同载体对丁酸梭菌干燥存活率的影响。
图3为菌剂显微形貌图，左侧为益生菌微胶囊组1，右侧为益生菌微胶囊组2。
图4为菌剂的粒径分析图，上图为益生菌微胶囊组1，下图为益生菌微胶囊组2。
图5为菌剂的傅里叶红外分析图，红色为益生菌微胶囊组1，绿色为益生菌微胶囊组2。
图6为菌剂的结晶度分析，红色为益生菌微胶囊组1，绿色为益生菌微胶囊组2。
图7为菌剂的玻璃态转化温度，红色为益生菌微胶囊组1，绿色益生菌微胶囊组2。
图8为菌剂的吸湿性能，红色为益生菌微胶囊组1，绿色为益生菌微胶囊组2。
图9为菌剂的PK/PFOR酶活差异，红色为益生菌微胶囊组1，绿色为益生菌微胶囊组2。
图10为菌剂中ATP酶活差异，红色为益生菌微胶囊组1，绿色为益生菌微胶囊组2。
图11菌剂的储存性能，图a为40℃储存温度，图b为室温25℃储存温度。
图12肉鸡的生长性能。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中，所述的RCM液体培养基购自青岛海博生物科技有限公司，RCM固体培养基在此基础上添加琼脂20g/L；所述的丁酸梭菌计数培养基(胰月示-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础)购自青岛海博生物科技有限公司；所述的葡萄糖、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硫酸锰、硫酸镁、吐温、半胱氨酸盐酸盐、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二胺、和乙酸钠购自国药集团；所述的甘露醇、谷氨酸钠、乳清蛋白、分离乳清蛋白、***胶、菊粉及麦芽糊精购自河南旗诺生物科技有限公司；所述的实验用聚谷氨酸和金耳多糖均可购自南京轩凯生物科技有限公司。
下述实施例中，所述的丁酸梭菌，属名：Clostridium，种名：butyricum，学名：Clostridium butyricum，保藏编号：CCTCC AB 2017089。购买自南京安速特生物科技有限公司。
下述实施例中，所述的金耳多糖是将金耳孢子在发酵温度25-37℃，发酵时间3-5d的条件下发酵后(发酵培养基：1000mL水中添加20-50g豆粕粉加热煮沸30min后得到豆粕水，取上层豆粕水，弃下层豆粕残渣。加水补足豆粕水至1000ml后，添加20-50g的葡萄糖，所得为为灭菌的发酵培养基。)，将发酵液经压滤得清液，清液在温度40-60℃，转速30-50rpm，仪器抽真空压力0.1mPa的条件下旋蒸浓缩，用2-3倍糖溶液体积的80-95％的乙醇沉淀，所得沉淀用水复溶、冻干即得制备得到。
实施例1
本实施例以丁酸梭菌为例，制备不同载体的丁酸梭菌微胶囊，具体步骤如下：
(1)制备发酵基料：将发酵基料的原料倒入纯净水中加热溶解，置于灭菌锅内，121℃下灭菌20min，冷却后得到发酵基料。
其中，所述的发酵基料以重量份计，1000g纯净水中的发酵基料原料包括：葡萄糖20g，胰蛋白胨5g，牛肉膏10g，酵母粉50g，硫酸锰0.58g，硫酸镁0.28g，吐温80 1g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二胺2g和乙酸钠10g。
(2)菌种活化：超净工作台紫外杀菌30分钟后，调至工作模式，在其中将益生菌丁酸梭菌从保藏状态恢复到室温状态，然后按2％v/v的接种量接种到RCM培养基中，放入37℃的恒温箱中厌氧培养24h，活化得到种子液备用。
(3)菌体培养：将活化好的种子液按1％v/v的接种量接种到发酵基料中，32℃，pH6.0，培养24h，得到发酵液。
(4)菌体浓缩：将发酵液在4℃下，6000rpm离心分离10min，得到益生菌菌泥。
(5)配制壁材保护剂：将壁材保护剂的原料用40℃热水剪切溶解，90℃杀菌30min后冷却至25℃备用。
其中，采用单一的蛋白或氨基酸载体(1％聚谷氨酸钠、2％谷氨酸钠、10％乳清蛋白、10％分离乳清蛋白、10％大豆分离蛋白)或糖及糖醇类化合物载体(1％甘露醇、1％环糊精、2％甘露醇、1％金耳多糖、10％蔗糖、10％***胶及10％海藻糖)作为壁材保护剂，以1000g重量计。
(6)制备混合悬液：将菌泥和壁材保护剂混合，25℃，50rpm下搅拌20min，得到混合悬液，混合悬液中菌泥质量分数为25wt％，壁材保护剂质量分数75wt％。
(7)喷雾干燥：将喷雾干燥机(图1)充分预热后，将混合悬液通入喷雾干燥机的进料口，开始喷雾，控制进料温度设置为115℃，雾化压力2.5bar，进风量3.5m3/h，开始喷雾，出口温度60℃，干燥后得到益生菌剂，干燥的粉末微观条件下为微胶囊形态，计算不同组益生菌微胶囊的存活率。
结果如图2所示，通过测量不同组益生菌微胶囊的丁酸梭菌存活率，发现使用蛋白或氨基酸载体中的谷氨酸钠、乳清蛋白、分离乳清蛋白或大豆分离蛋白，或使用糖及糖醇类化合物载体中的金耳多糖、蔗糖、***胶或海藻糖这些单一载体作为壁材保护剂时，丁酸梭菌存活率较高。考虑到海藻糖作为载体制备菌剂时吸水率高，蔗糖和谷氨酸钠作为载体制备的菌剂易结块不利于储存。相对于乳清蛋白，分离乳清蛋白作为载体制备菌剂价格昂贵，且存活率并未出现显著的提高，因此上述载体不被考虑用作干燥用的壁材保护剂。乳清蛋白和***胶在一些益生菌的喷雾干燥过程中已经表现出良好的热保护能力，但其保护能力还有待提升。多糖-蛋白微胶囊存在静电相互作用、二硫键、疏水相互作用和氢键等多种作用力，被广泛应用应用于活性成分的递送。天然植物多糖已然成为构建和递送益生菌的新型材料，其中金耳多糖是一种多功能活性多糖，具有改善胃肠道、调节免疫等生理功能，且金耳多糖发酵生产工艺成熟。从图中看，金耳多糖在实施例1所示的条件下能提供31.77％的存活率，相较于空白7.59％提升了24.18％，单一组分的分离乳清蛋白和***胶分别能提供41.04％、42.35％的存活率，相较于空白组分别提高了33.45％、34.76％。因此，综合以上分析，以金耳多糖为活性成分，开发一种基于乳清蛋白-***胶的益生菌微胶囊是可行的。
实施例2
本实施例以丁酸梭菌为例，参照实施例1所述的方法分别制备乳清蛋白-***胶为复合壁材保护剂的益生菌微胶囊组1，其中复合壁材保护剂为1000g水中，包含乳清蛋白100g，***胶100g；以及乳清蛋白-***胶-金耳多糖为复合壁材保护剂的益生菌微胶囊组2，其中复合壁材保护剂为1000g水中，包含乳清蛋白100g，***胶100g、金耳多糖10g。通过测量不同益生菌微胶囊组的丁酸梭菌存活率，菌剂含水率及水分活度(含水率采用水分测量仪器进行测量，菌剂的水活由水分活度测量仪进行测量)，结果如表1所示。
表1不同益生菌微胶囊组别的干燥质量
从表1可知，额外添加金耳多糖作为活性保护成分的益生菌微胶囊组2能在相同干燥条件下，保护丁酸梭菌免受加工储存过程中热损伤的同时，也很好的避免了丁酸梭菌的细胞损伤，为丁酸梭菌提供更高的存活率，相对于益生菌微胶囊组1中丁酸梭菌45.38％的存活率，益生菌微胶囊组2的存活率为58.61％，提高了13.23％；两组益生菌微胶囊之间的含水量不存在显著差异，水活度都满足益生菌干粉(aw＝0.1～0.25)储存要求，益生菌微胶囊组2的水活度为0.14，低于益生菌微胶囊组1的水活度0.17，水活度更低能拥有更好的储存性能。
实施例3
本实施例对实施例2制备得到的益生菌微胶囊组1和2分别进行了表征和性质分析。
1、扫描电镜分析
利用扫描电镜(SEM)对制备得到的益生菌微胶囊组1和2分别进行微观状态观察，结果如图3，左侧为益生菌微胶囊组1，右侧为益生菌微胶囊组2。
从图3可以看到，实施例2制备得到的的益生菌微胶囊组2表面未发现益生菌外泄的情况，说明益生菌被全部封装在微胶囊内部。与益生菌微胶囊组1相比，益生菌微胶囊组2在大小上没有显著变化，但益生菌微胶囊组2表面的褶皱明显更少，表面更加光滑，说明干燥过程中，金耳多糖的加入使得喷雾干燥过程中益生菌微胶囊失水速率减缓，包裹在胶囊内部的细菌受到较小的外界压力，从而使益生菌微胶囊组2的细胞存活率更高。
2、粒径分析
利用微米粒径分析仪对制备得到的益生菌微胶囊组1和2分别进行检测，结果如图4所示，上图为益生菌微胶囊组1，下图为益生菌微胶囊组2。
从图4可知，益生菌微胶囊组1的粒径存在2个峰，益生菌微胶囊组2的粒径显示更加均匀。通过计算“质量矩体积平均粒径”D[4,3]反映不同益生菌微胶囊组的粒径，发现益生菌微胶囊组1的D[4,3]为30.80um，益生菌微胶囊组2的D[4,3]为33.68um。两种益生菌微胶囊的粒径都满足细菌封装的条件(粒径＞5um)，但益生菌微胶囊组2具备均匀的粒径分布，这使得益生菌微胶囊组2具备更优良的储存性能。
3、红外光谱扫描
利用红外光谱对制备得到的益生菌微胶囊组1和2分别进行检测，结果如图5所示，其中红色为益生菌微胶囊组1，紫色为益生菌微胶囊组2。
由图5可知，相较于益生菌微胶囊组1而言，额外添加金耳多糖的益生菌微胶囊组2未出现新的特征峰，可能是由于壁材中的碳水化合物的特征峰掩盖了多糖的特征峰，但益生菌微胶囊组1的部分特征峰向小波段偏移，相比于益生菌微胶囊组2在3416.53cm-1、1652.60cm-1处的特征峰，益生菌微胶囊组1偏移至3395.11cm-1、1647.47cm-1处，说明金耳多糖添加后成为了益生菌微胶囊壁材的一部分，并竞争性的与乳清蛋白结合，造成***胶与乳清蛋白的共价结合力减弱。
4、X-衍射分析
使用X-衍射仪对制备得到的益生菌微胶囊组1和2分别进行结构态的分析，结果如图6所示，其中红色线条为益生菌微胶囊组1，绿色线条为益生菌微胶囊组2。
从图6可知，两组益生菌微胶囊的衍射图均显示低强度和宽峰，且只有单一衍射峰，益生菌微胶囊组2和益生菌微胶囊组1的衍射性能2θ分别为20.2°和23.2°，衍射峰强度基本无差异，即喷雾干燥制备的益生菌微胶囊组1和2的结晶度无显著差异。
5、差示扫描量热分析法
通过DSC差示扫描仪对益生菌微胶囊组1和2的玻璃态转化温度(Tg)分别进行测量和计算，结果如图7所示，红色为益生菌微胶囊组1，绿色益生菌微胶囊组2。
从图7可知，益生菌微胶囊组2的玻璃态转化温度在74.4℃，相较于益生菌微胶囊组1的玻璃态转化温度70.4℃，金耳多糖的添加使得菌剂的玻璃态转化温度得到了一定程度的提高。食品聚合物科学理论认为，食品在玻璃态下，造成食品品质变化的一切受扩散控制的反应速率十分缓慢，因此食品采用玻璃态保存，可以最大限度的保留其原有的色香等性质。玻璃化转变温度对低含水量(小于20％)干燥食品的贮藏稳定性具有重要作用，实际研究表明，在其他储存条件一致，同一菌株的益生菌制剂中玻璃态转化温度越高(且玻璃态转化高于实际储存温度40℃时)，菌剂具有最好储存性能。从实验结果可以发现，金耳多糖的添加，使得同一条件下制备的菌剂的玻璃态转化温度有所提高，说明金耳多糖的添加提高了益生菌菌剂的稳定性。
实施例4
本实施例对实施例2制备得到的含有益生菌微胶囊组1和2分别进行水分吸附性能的测试，得到的结果如图8所示，红色为益生菌微胶囊组1，绿色为益生菌微胶囊组2。
使用动态蒸汽吸附***在25℃±0.2℃下测量冷冻干燥后的两组益生菌微胶囊的水分等温线。分别称取约5mg的样品于样品盘上，放入湿度控制室中进行测量，相对湿度(RH)从0％增加至95％RH，每间隔10％自动测量记录结果。
从图8可知，在整个相对湿度范围内，益生菌微胶囊组1的吸湿性比益生菌微胶囊组2的吸湿性高，在RH＝80％时，两组益生菌微胶囊的相对质量变化相差2.74％，但通过整体吸湿性线趋势分析后发现，在以乳清蛋白和***胶作为壁材时，额外添加金耳多糖不会增加益生菌微胶囊在高湿度条件下的吸湿性能。这一性质表明金耳多糖在菌剂制备过程中作为壁材添加时，吸湿性能不会发生显著变化，即金耳多糖添加不会对菌剂中储存性能产生负面影响。
实施例5
分别称取0.5g实施例2制备的两组益生菌微胶囊，复水离心弃上清，菌泥用0.9％的氯化钠的水溶液清洗2次后，加入2mL PBS缓冲液，进行超声波破碎(超声3s，间隔10s，100个循环)；4℃，15000rpm，离心10min，取上清进行酶活测定。采用丙酮酸激酶(PK)试剂盒、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)试剂盒和ATP酶试剂盒测量两组相关酶活。(PK、ATP酶试剂盒购买自南京建成，PFOR酶联试剂盒购买者上海通蔚实业公司)，酶活差异见图9和10。
其中，丙酮酸激酶(PK)的酶活定义：:在pH 7.4，25℃条件下，每分钟将1μmol PEP转变成丙酮酸所需的酶量定义为一个酶活单位。
丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)的酶活定义：37℃条件下，每分钟还原2μmol甲基紫精的酶活定义为1U。
ATP酶的酶活定义：每小时ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
图9表明，益生菌微胶囊组1和益生菌微胶囊组2的PFOR酶酶活分别7.95U/mL、11.77U/mL，PK酶酶活分别为0.053U/mL、0.056U/mL。相对于益生菌微胶囊组1，益生菌微胶囊组2的PFOR酶显著提高，提高了48.05％。
图10表明，益生菌微胶囊组1和益生菌微胶囊组2的Na+-K+-ATP酶的酶活分别为15.58U/mL、18.31U/mL，Ca2+-ATP酶酶活分别为18.24U/mL、20.14U/mL，Mg2+-ATP酶酶活分别为16.67U/mL、18.95U/mL。相对于益生菌微胶囊组1，益生菌微胶囊组2Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶与Mg2+-ATP酶活分别提高了17.52％、10.42％和13.68％。
整体结果表明，益生菌微胶囊组2能显著提高丁酸梭菌在喷雾干燥过程中细胞酶活性，在一定程度上提高了菌剂的储存性能。
实施例6
称取50g实施例2制备得到的益生菌微胶囊组1和益生菌微胶囊组2分别置于25℃和40℃贮藏，并在0、7、14、21、28、35、42、49d检测益生菌的存活率，结果如图11所示。
从图11可知，在40℃条件下，益生菌微胶囊组2在贮藏49d后菌体存活率下降0.47，显著低于益生菌微胶囊组2的0.57。同时，益生菌微胶囊组2的失活曲线斜率为0.0088，相对于益生菌微胶囊组1的失活曲线斜率0.0103，显著降低了14.56％。室温25℃条件下，益生菌微胶囊组2在贮藏49d后菌体存活率下降0.33，显著低于益生菌微胶囊组1的0.48，同时曲线斜率存在显著差异，益生菌微胶囊组2失活曲线斜率为0.0065，相对于益生菌微胶囊组1的失活曲线斜率0.0094，显著降低了30.86％。说明在25～40℃条件下，金耳多糖是一种有潜力的微胶囊壁材，可以有效的改善丁酸梭菌菌剂的储存性能。
实施例7
本实施例通过体外黏附实验来确定额外添加金耳多糖这一活性多糖是否能提升细菌的黏附定植能力。
1、体外肠黏液黏附实验(肠道液)
在96孔细胞培养板中加入调整好浓度的肠黏液后(以牛血清蛋白为标准，肠黏液蛋白浓度为1.0mg/mL左右)，分别加入100-200μL生理盐水/丁酸梭菌(空白组)、益生菌微胶囊组1、益生菌微胶囊组2(都含有108-109CFU/mL丁酸梭菌活菌数)，密封置于4℃冰箱过夜，吸取缓冲液洗涤2次。再加入1％SDS-NaOH的裂解液，释放黏附的细菌。再进行平板活菌计数，根据以下公式计算肠黏液对益生菌的黏附率，结果如表2所示。
表2不同组的体外肠黏液黏附率
空白组 益生菌微胶囊组1 益生菌微胶囊组2
黏附率(％) 15.43±5.37 40.31±4.54 53.37±4.73
从表2可知，添加金耳多糖的益生菌微胶囊组2的体外肠黏液黏附率达到53.37％，显著高于益生菌微胶囊组1和空白组，相对于益生菌微胶囊组1，益生菌微胶囊组2的肠黏液黏附率提升了24.95％。说明益生菌微胶囊组2中金耳多糖表面一些活性基团与益生菌和肠道黏液之间形成黏附作用，能显著增强肠道黏液对丁酸梭菌的黏附性。
2、体外肠道黏附实验(大鼠肠道)
在无菌操作台中，将雄性Sprague-Dawley大鼠肠道刨开，取4份1.5cm×1.5cm×2mm的肠道于无菌载玻片上，分别滴加10-100μL生理盐水/丁酸梭菌(空白组)、益生菌微胶囊组1、益生菌微胶囊组2(都含有108-109CFU/mL丁酸梭菌活菌数)，并将其分别置于灭菌的离心管中轻微振荡2h后取出，用100-500μL生理盐水冲洗，收集冲洗液进行梯度稀释，并计数活菌数，根据以下公式计算黏附率，结果如表3所示。
表3不同组的体外肠道黏附率
空白组 益生菌微胶囊组1 益生菌微胶囊组2
黏附率(％) 18.73±4.85 67.11±7.82 80.45±6.28
从表3可知，添加金耳多糖的益生菌微胶囊组2的体外肠道黏附率达到80.45％，显著高于益生菌微胶囊组1和空白组，相对于益生菌微胶囊组1，益生菌微胶囊组2的肠道黏附率提升了19.88％。说明金耳多糖能显著增强肠道黏液对这种丁酸梭菌的黏附性。
实施例8
将实施例2制备得到的益生菌微胶囊组1和益生菌微胶囊组2应用于肉鸡养殖，评价菌剂对肉鸡生长性能的影响。
(1)肉鸡饲养与分组
选用1日龄的肉鸡60只，随机分3组，每组20只。1)空白对照组：全程基础饲粮饲养；2)实验组1：全程基础饲粮+0.1g菌剂/天的益生菌微胶囊组1；3)实验组2：基础饲粮+0.1g菌剂/天的益生菌微胶囊组2；；
(2)饲养管理
实验在动物房进行，所有肉鸡在鸡笼中饲养，自由采食和饮水，驱虫和消毒按鸡场常规饲养规定进行。
(3)动物生长性能测试
全程以组为单位记录采食量，42日龄分别对每个实验组的肉鸡空腹称重，计算平均采食量(ABW)、平均日增重(ADG)及饲料转化率(FCR)。具体计算公式如下：ABW(g)＝组采食总质量/组只数；ADG(g)＝(末重-始重)/实验天数；FCR(g/g)＝总耗料/肉鸡增重总重量。
实验结果如图12所示，相对来说，两组益生菌微胶囊都能显著提高日采食量(ABW)和日增重(ADG)，降低饲料转化率(FCR)。其中，相对于空白组，益生菌微胶囊组1提高日采食量(ABW)1.6％和日增重(ADG)3.3％，降低饲料转化率(FCR)1.25％；添加金耳多糖的益生菌微胶囊组2，提高日采食量(ABW)1.9％和日增重(ADG)4.5％，降低饲料转化率(FCR)1.71％。同时，其组间均存在显著差异(p＜0.05)，说明，金耳多糖这一活性多糖的加入，能提高肉鸡日采食量(ABW)和日增重(ADG)和降低饲料转化率(FCR)。最终降低肉鸡的生产成本，提高企业的经济效益。
本发明提供了一种益生菌胶囊及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种益生菌微胶囊，其特征在于，将肠道益生菌与壁材保护剂混合后经喷雾干燥制备得到益生菌微胶囊；
其中，所述的壁材保护剂包括1-12wt％蛋白或氨基酸载体、1-12wt％糖及糖醇类化合物载体中的任意一种或几种的组合，余量为水。
2.根据权利要求1所述的益生菌微胶囊，其特征在于，所述的益生菌包括嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、丁酸梭菌和植物乳杆菌中的任意一种或几种的组合，优选丁酸梭菌，更优选丁酸梭菌Clostridium butyricum CCTCC AB 2017089。
3.根据权利要求1所述的益生菌微胶囊，其特征在于，所述的蛋白或氨基酸载体包括聚谷氨酸钠、谷氨酸钠、明胶、大豆分离蛋白、玉米醇溶蛋白、乳清蛋白和分离乳清蛋白中的任意一种或几种的组合，优选的蛋白或氨基酸载体为大豆分离蛋白、乳清蛋白和/或分离乳清蛋白，更优选乳清蛋白。
4.根据权利要求1所述的益生菌微胶囊，其特征在于，所述的糖及糖醇类化合物载体包括甘露醇、金耳多糖、海藻糖、蔗糖、环糊精、***胶中的任意一种或几种的组合，优选的糖及糖醇类化合物载体为金耳多糖和/或***胶。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的益生菌微胶囊，其特征在于，所述的益生菌微胶囊，是将丁酸梭菌与乳清蛋白、金耳多糖或***胶中的任意一种或几种混合后经喷雾干燥制备得到的；优选的益生菌微胶囊，是将丁酸梭菌、乳清蛋白、金耳多糖和***胶混合后经喷雾干燥制备得到的或是将丁酸梭菌、乳清蛋白和***胶混合后经喷雾干燥制备得到的；更优选的是将丁酸梭菌、乳清蛋白、金耳多糖和***胶混合后经喷雾干燥制备得到的。
6.根据权利要求1所述的益生菌微胶囊，其特征在于，所述的肠道益生菌与壁材保护剂混合，其中，所述的肠道益生菌的质量分数为15-30wt％，壁材保护剂的质量分数为70-85wt％；优选的，肠道益生菌的质量分数为25wt％，壁材保护剂的质量分数为75wt％。
7.根据权利要求1所述的益生菌微胶囊，其特征在于，所述的肠道益生菌预先经活化、发酵培养和浓缩处理；其中，所述的活化，其活化接种量为1-2％v/v，活化条件为：30-37℃恒温厌氧培养20-30h，活化培养基为RCM液体培养基；所述的发酵培养，其接种量为1-10％v/v，发酵培养基为：以重量份计，1000g纯净水中包括葡萄糖10-20g，胰蛋白胨5-15g，牛肉膏5-15g，酵母粉20-80g，硫酸锰0.5-2g，硫酸镁0.1-0.5g，吐温80 0.5-2g，半胱氨酸盐酸盐0.2-2g，磷酸氢二钾1-10g，柠檬酸氢二胺1-5g和乙酸钠5-20g，发酵培养条件为：30-37℃，pH5.5-6.5，培养20-24h；所述的浓缩，其温度为2-6℃。
8.权利要求1所述的益生菌微胶囊在提升益生菌菌剂贮存稳定性能中的应用。
9.权利要求1所述的益生菌微胶囊在提高益生菌肠道定殖粘附性中的应用。
10.权利要求1所述的益生菌微胶囊在肉鸡养殖中的应用。
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