CN116515650A - 两株非酿酒酵母及其复合发酵剂和酿造葡萄酒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及葡萄酒生产技术领域，特别涉及两株能够耐受环境胁迫的产香酵母及其复合发酵剂和酿造葡萄酒的方法。该复合发酵剂包括保藏编号为CGMCC NO.24818的葡萄汁有孢汉逊酵母CVE‑HU47和保藏编号为CGMCCNO.24819的美极梅奇酵母CVE‑MP27；酿造葡萄酒时，先接种该复合发酵剂，发酵72～80小时后，接种酿酒酵母CECA，经过200～240小时发酵，可以得到具有我国独特本土风味特征的葡萄酒；本发明可以提升葡萄酒的感官品质，包括酸度和香气品质，有效提升葡萄酒香气的复杂性和多样性。
Description
技术领域
本发明涉及葡萄酒生产技术领域，特别涉及两株非酿酒产香酵母及其复合发酵剂和酿造葡萄酒的方法。
背景技术
葡葡萄酒发酵是一个复杂的微生物反应的过程，其中起关键作用的就是酵母。它们将葡萄汁中的还原糖通过呼吸作用转化为酒精和二氧化碳，同时产生各种次级代谢产物，如酯类、高级醇、有机酸和醛酮类等物质，对葡萄酒的口感和香气贡献突出。葡萄酒的香气是评价葡萄酒的重要指标之一，特别是萜烯类和酯类物质，香气复杂平衡且风味独特的葡萄酒更受到消费者的喜爱。葡萄酒中的挥发性香气成分可以增强葡萄酒的感官特性，提升葡萄酒的感官品质。酸度是葡萄酒重要的品质，赋予葡萄酒清新、清脆的品尝感，是葡萄酒感官的骨架。酸度源于葡萄中的酒石酸和苹果酸以及发酵产生的琥珀酸、柠檬酸、乳酸和乙酸。但乙酸是葡萄酒主要的挥发酸，占95％以上，含量过高使得葡萄酒产生刺鼻的酸味，降低葡萄酒的品质，甚至无法饮用。
在葡萄酒发酵过程中，非酿酒酵母主要出现在发酵前期。但随着发酵进行，营养物质减少，乙醇的浓度升高，非酿酒酵母逐渐消失，而酒精耐受性更高的酿酒酵母开始占据发酵的主导位置，并最终完成酒精发酵。酿酒酵母作为酒精发酵的重要菌株，能够实现快速、完全、高效的酒精发酵，备受葡萄酒企业的青睐。采用酿造特性优良的酿酒酵母菌株不但能够提升葡萄酒的品质，还能够缩短发酵周期，降低生产成本，进而提升葡萄酒的市场竞争力。在很长一段时间内，筛选酿造特性优良的酿酒酵母是葡萄酒研究的主题。然而，长期的研究发现使用商业酿酒酵母会导致葡萄酒同质化严重，缺乏自然发酵所具有的香气复杂性和风格独特性。随着对非酿酒酵母研究的深入，发现非酿酒酵母可以分泌多种水解酶，能够将结合态的葡萄酒香气降解为游离态的香气、并且产生大量的甘油、酯类化合物、高级醇等次级代谢产物，改善葡萄酒的香气品质。但非酿酒酵母发酵能力较弱，很多情况下不能主导整个发酵过程，一般采用酿酒酵母与其混合发酵的方式完成整个发酵过程。筛选不同属种的非酿酒酵母与酿酒酵母进行混合接种能够有效提升各种葡萄酒感官品质，该技术的应用越来越广泛。
在众多的非酿酒酵母当中，葡萄汁有孢汉逊酵母(H.uvarum)和美极梅奇酵母(M.pulcherrima)能够明显改善葡萄酒的香气轮廓和感官品质。其中，葡萄汁有孢汉逊酵母能够高产酯类物质，赋予葡萄酒花果香气特征，明显提升新鲜型葡萄酒的感官品质，但其缺点是会产生高含量的乙酸，限制了其应用；美极梅奇酵母能够分泌多种水解酶，增加葡萄酒中萜类物质和降异戊二烯类物质香气，由于其乙醇产率低，其最大应用是生产低醇葡萄酒。葡萄酒发酵时会添加一定浓度的SO2(一般为60mg/L)，抑制杂菌的污染和繁殖，另一方面，葡萄汁中的高糖浓度抑制了酵母的生长。由于美极梅奇酵母耐受SO2和高糖能力较弱，限制了其在葡萄酒中的应用。因此筛选能够耐受高浓度SO2和糖浓度胁迫的非酿酒酵母菌株是实现工业化应用的前提。在前期研究中我们从宁夏贺兰山东麓产区筛选到一株葡萄汁有孢汉逊酵母CVE-HU47和一株美极梅奇酵母CVE-MP27，其最大的特点是能够耐受高浓度的SO2和糖浓度，并且产香特点突出，其中HU47高产酯类物质，但挥发酸含量低，MP27高产萜烯类物质以及琥珀酸、柠檬酸和乳酸，具有增酸的潜力，为了最大限度地发挥葡萄汁有孢汉逊酵母与美极梅奇酵母组合的优势，我们将两株菌进行组合复配，获得一种复合发酵剂，适用于SO2和糖浓度的葡萄酒发酵环境，提升葡萄酒的感官香气品质和酸度，增加葡萄酒香气的复杂性和多样性。
发明内容
本发明的目的是提供两株产香酵母菌种及其复合发酵剂和酿造葡萄酒的方法，能够耐受高浓度的SO2和糖浓度的葡萄酒发酵环境，同时提升葡萄酒的感官香气品质和酸度，增加葡萄酒香气的复杂性和多样性。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一株非酿酒酵母，具体为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)CVE-HU47，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNO.24818。
该非酿酒酵母分离自宁夏贺兰山东麓产区，能够耐受高浓度二氧化硫和糖胁迫，在葡萄酒发酵过程中低产挥发酸，高产酯类物质、萜烯类和降异戊二烯类物质香气物质。
一株非酿酒酵母，具体为美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)CVE-MP27，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.24819。
该非酿酒酵母分离自宁夏贺兰山东麓产区，能够耐受高浓度二氧化硫和糖胁迫，在葡萄酒发酵过程中低产乙醇，高产柠檬酸、琥珀酸和乳酸，提升葡萄酒的酸度，增加葡萄酒中萜类物质香气。
一种复合发酵剂，包括葡萄汁有孢汉逊酵母CVE-HU47、美极梅奇酵母CVE-MP27，二者的混合接种的体积比为0.8～1:1，接种总浓度为0.1～1×107CFU/mL。
一种采用所述的复合发酵剂酿造桃红葡萄酒的方法，包括以下步骤：
(1)取出保藏在-80℃甘油的各个菌株，解冻后室温下回温，以10％～15％(v/v)的比例接种到YPD液体培养基中，置于恒温振荡培养箱增值培养18h，待菌株生长至菌株密度在107～108CFU/mL，得到单菌液；
(2)采摘后的葡萄经过穗选、粒选和除梗破碎，经过压榨将葡萄自流汁导入发酵罐，加入澄清剂得到澄清葡萄汁，并加入80-100mg/L的SO2；
(3)顺序接种所述复合发酵剂和酿酒酵母完成如下第一发酵和第二发酵：将所述复合发酵剂接入步骤(2)得到的澄清葡萄汁，接种浓度为0.1～1×107CFU/mL，经过72～80小时完成第一发酵；然后接种商业酿酒酵母CECA，接种浓度0.1～1×106CFU/mL，经过200～240小时完成第二发酵；
所述复合发酵剂与酿酒酵母的接种比例为10:1，发酵参数为：pH3.0～3.5，发酵温度20～23℃，残糖含量低于4g/L，得到具有花果类香气特征，酸度适宜，低挥发酸含量的干型桃红葡萄酒。
在步骤(2)中，所述SO2以偏重亚硫酸钾形式加入。
在步骤(3)中，进一步控制以下发酵参数：
糖浓度为250～300g/L，酒精浓度为9～11％(v/v)，氮源浓度为200-300mg/L。
得到的葡萄酒产品中，具有以下香气物质：酯类物质、高级醇、挥发性脂肪酸以及其它香气物质；其中：
所述酯类物质为乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯、十二酸乙酯和辛酸甲酯；
所述高级醇为异丁醇、1-丁醇、异戊醇、1-辛醇、1-癸醇、4-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇、2-苯乙醇；
所述脂肪酸为己酸、辛酸、癸酸；
所述其它香气物质为β-大马士酮、香茅醇、4-萜烯醇、苯甲醛和苯乙烯。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
目前，酿酒酵母与非酿酒酵母的混合发酵技术被广泛的应用于葡萄酒的发酵中，利用发酵性能优良的非酿酒酵母参与发酵已成为国内外研究的热点。由于非酿酒酵母耐受高糖和SO2的胁迫的能力较弱，因此需要筛选到高耐受菌株，这是其应用的前提，另一方面，非酿酒酵母种类众多，特性鲜明，可以通过复配发挥不同酵母菌的特点，综合提升葡萄酒的感官品质。为了提升葡萄酒的香气和酸度，本发明采用葡萄汁有孢汉逊酵母(H.uvarum)CVE-HU47、美极梅奇酵母(M.pulcherrima)CVE-MP27建立混合发酵菌剂(比例为1:1)，接种桃红葡萄酒，发酵3天后再接种商业酿酒酵母(S.cerevisiae)CECA，非酿酒酵母和酿酒酵母的接种比例为10:1。其中葡萄汁有孢汉逊酵母HU47能够耐受高浓度二氧化硫和糖胁迫，在发酵过程中低产挥发酸，高产酯类物质、萜烯类和降异戊二烯类物质香气物质，赋予葡萄酒玫瑰、蜂蜜、水果、花香等香气特征，明显提升葡萄酒的感官品质；美极梅奇酵母MP27能够耐受高浓度二氧化硫和糖胁迫，能够高产柠檬酸、琥珀酸和乳酸，提升葡萄酒的酸度，并增加葡萄酒中萜类物质香气。本发明得到的复合发酵剂和接种工艺能够提升葡萄酒的花果类香气，改善葡萄酒的香气复杂性及品质，并增加葡萄酒的酸度。
附图说明
图1为本发明所测CECA、HU47和MP27酵母菌株的菌落形态；
图2为本发明的所测酵母菌株的生长曲线图；
图3为本发明各实验组的生长曲线图(CO2产量)；
图4为本发明不同实验组的感官评价雷达图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1、2为本发明筛选得到的两种产香非酿酒酵母菌种的发酵能力和产香特性的研究，实施例3为将上述两菌株与酿酒酵母进行组合，得到本发明复合发酵剂和酿造方法的研究。
本发明筛选到两株优良的产香非酿酒酵母菌种：葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)CVE-HU47(自筛菌株，于2022年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.24818)和美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)CVE-MP27(自筛菌株，于2022年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.24819)，在此基础上获得了一种由两种酵母组合的复合发酵剂，包括CVE-HU47和CVE-MP27(比例为1:1)，接种桃红葡萄酒，发酵3天后再接种商业酿酒酵母(S.cerevisiae)CECA，非酿酒酵母和酿酒酵母的接种比例为10:1，这种复合发酵剂和接种工艺能够提升葡萄酒的花果类香气，改善葡萄酒的香气复杂性及品质，并增加葡萄酒的酸度，具有很大的应用潜力。
其具体为通过筛选本土野生的非酿酒酵母，获得酿造特性优良的葡萄汁有孢汉逊酵母CVE-HU47和美极梅奇酵母CVE-MP27。在此基础上，将葡萄汁有孢汉逊酵母CVE-HU47和美极梅奇酵母CVE-MP27复配，并与酿酒酵母CECA进行组合接种，以综合利用各种菌的酿造与产香特性，最终发现这种复合发酵剂和接种工艺能够提升葡萄酒的花果类香气，改善葡萄酒的香气品质，增加葡萄酒的多样性与复杂性，增加葡萄酒的酸度。
实施例1
对筛选得到保藏编号为CGMCC NO.24818的葡萄汁有孢汉逊酵母(H.uvarum)CVE-HU47和保藏编号为CGMCC NO.24819的美极梅奇酵母(M.pulcherrima)CVE-MP27进行酿造特性的评估，以商业酿酒酵母(S.cerevisiae)CECA为对照，具体检测方法如下：
(1)菌落形态特征：将保藏在-80℃的葡萄汁有孢汉逊酵母HU47和美极梅奇酵母MP27解冻后接种于装有15mL的YPD液体培养基的50ml离心管中活化，用无菌蒸馏水将菌液稀释后均匀涂布于WLN培养基，于30℃培养至形成形态完整的菌落。
(2)生长曲线：将葡萄汁有孢汉逊酵母HU47和美极梅奇酵母MP27分别以106CFU/mL的浓度接种于25mL YPD液体培养基中，28℃静置培养，每12h测定一次OD600吸光值。以菌株生长时间为横坐标，以测定的OD600吸光值为纵坐标绘制生长曲线，以酿酒酵母CECA作为对照，每个实验组设置3个生物学重复。
(3)耐受性实验：将葡萄汁有孢汉逊酵母HU47和美极梅奇酵母MP27活化后，分别以106CFU/mL的接种量接种至YPD液体培养基中，进行糖度耐受性、酒精度耐受性、SO2耐受性、pH值耐受性、金属Cu2+耐受性、温度耐受性的实验，梯度设计如下：
糖度梯度：以葡萄糖、果糖1:1(w/w)的比例将YPD液体培养基总糖浓度分别调节至100g/L、200g/L、250g/L、300g/L、350g/L；
酒精度梯度：3％v/v、6％v/v、9％v/v、12％v/v、15％v/v；
SO2浓度梯度：以亚硫酸将YPD液体培养基SO2浓度调节至60mg/L、120mg/L、180mg/L、240mg/L、300mg/L；
pH值梯度：以酒石酸将YPD液体培养基pH值分别调节至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0；
金属Cu2+浓度梯度：以0.1mol/L CuSO4溶液将YPD液体培养基Cu2+浓度分别调节至0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L；
温度梯度：10℃、15℃、20℃、25℃、30℃。
所有实验组于28℃下静置培养72h，然后利用紫外分光光度计测定OD600吸光值，以酿酒酵母CECA作为对照，每个实验组设置3个生物学重复。
(4)絮凝性实验：将葡萄汁有孢汉逊酵母HU47和美极梅奇酵母MP27活化后按照106CFU/mL的接种量接种到YPD液体培养基中，于28℃恒温培养箱中静置培养，每隔12h测定一次OD600吸光值，直至菌株生长至对数稳定期时，离心(10000r/min，2min)收集离心管底部菌体沉淀，先用去絮凝缓冲液洗涤两遍后，再用无菌水洗涤两遍；然后将洗涤后的菌体沉淀置于絮凝缓冲液中，测定其OD600吸光值，用A表示；然后将絮凝缓冲液置于50mL锥形瓶中，(30℃，100r/min)振荡培养2h，移取5mL菌体细胞悬浮液置于10mL试管中，垂直静置30min后，在液体凹液面下取350μL，再次测定其OD600吸光值，用B表示。以酿酒酵母CECA作为对照，实验设置3个生物学重复。
絮凝值用以下公式来表示：Flo＝B/A×100％
在公式中，A代表锥形瓶振荡培养前，悬浮于絮凝缓冲液中的菌体细胞的OD600吸光值；B代表菌体细胞经过絮凝沉降30min以后的OD600吸光值；絮凝值用Flo表示，絮凝值越小，表示菌株的絮凝性越强。当Flo大于70％时，判定菌株具有低絮凝性；当Flo在30％～70％之间，判定菌株具有中絮凝性；当Flo在0％～30％之间，判定菌株具有高絮凝性。
(5)产泡沫性实验：在每支试管(15mm×150mm)中加入10mL的YPD液体培养基，然后将待测的各菌株分别以106CFU/mL的接种量接种至YPD液体培养基中，于28℃恒温培养中静置培养，每4h观察并测量一次泡沫高度，直至获得泡沫最大高度。菌株产泡沫能力分为3个等级：当泡沫高度低于2mm，表示菌株具有低产泡沫能力，记为低产泡性；当泡沫高度位于2mm～4mm之间，表示菌株具有中等产生泡沫能力，记为中等产泡性；当泡沫高度高于4mm，表示菌株具有高产泡沫能力，记为高产泡性。以酿酒酵母CECA作为对照，每个实验组设置3个生物学重复。
(6)H2S生成能力：将活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母HU47和美极梅奇酵母MP27分别点样于BIGGY培养基中，将点样后的BIGGY培养基平板放置于28℃培养箱内培养4天，记录点样的菌落颜色变化情况。根据菌落颜色可分为5个等级：菌落颜色为白色，表示菌株不产H2S；菌落颜色为浅棕褐色，表示菌株低产H2S；菌落颜色为棕褐色，表示菌株中产H2S；当菌落颜色为深棕褐色，表示菌株高产H2S。以酿酒酵母CECA作为对照，每个实验组设置3个生物学重复。
(7)碳源同化能力：将活化后的葡萄汁有孢汉逊酵母HU47和美极梅奇酵母MP27以106CFU/mL的接种量分别接种于碳源浓度均为50mmol/L的葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、半乳糖的氮源基础培养基中，接种后放置于恒温培养箱(25℃)培养21天，判断结果的方法为：将21天后培养基液体在漩涡振荡器上充分混合均匀。在一张A4白色纸上画一条大概3～4mm宽的黑线，然后将纸紧紧靠近试管，对着自然光观察是否有黑线及其清晰程度，如果完全看不见黑线记为“+++”，如果看见的是模糊的黑线记为“++”，如果看见临界的黑线记为“+”，如果完全看到清晰的黑线记为“-”。以酿酒酵母CECA作为对照，每个实验组设置3个生物学重复。
(8)氮源需求能力：将YPD液体培养基中的无机铵盐与混合氨基酸按一样的比例进行调节，将YPD液体培养基中初始的可同化氮的质量浓度分别调整为100mg/L、200mg/L、300mg/L和400mg/L，将葡萄汁有孢汉逊酵母HU47和美极梅奇酵母MP27分别以106CFU/mL的接种量接种至含有以上不同质量浓度酵母可同化氮源的YPD培养基中，24h测定一次OD600吸光值，绘制酵母生长曲线。以酿酒酵母CECA作为对照，每个实验组设置3个生物学重复。
如图1所示，各菌株在WLN培养基上的菌落形态，从图中可看出：CECA的菌落为奶油色(浅黄色)，中心浅绿色，表面为球形突起、光滑，不透明，边缘整齐；HU47的菌落呈绿色，有球形凸起，有光泽，不透明，边缘光滑；MP27的菌落为白色、表面光滑、边缘平整。
各菌株的生长曲线如图2所示。在132h之前，所测酵母均保持较快的生长速度，生长状态良好；156h左右进入生长末期，168h左右以后进入衰亡期。基于细胞量，酿酒酵母CECA的生长能力最强，之后是HU47和MP27。
在环境耐受性方面，通过测定葡萄汁有孢汉逊酵母HU47和美极梅奇酵母MP27在不同糖浓度、酒精体积分数、二氧化硫质量浓度、pH值、Cu2+质量浓度以及发酵温度下的生长情况来表征这两株非酿酒酵母对不同胁迫环境的耐受性，同时以酿酒酵母CECA作为对照菌株，结果发现：
(1)耐糖能力：两株非酿酒酵母对糖的耐受性要低于酿酒酵母CECA，但都能够耐受250g/L的糖浓度，HU47的耐受能力要高于MP27，当超过300g/L时，两株菌的生长受到抑制。
(2)耐乙醇能力：乙醇是葡萄汁酵母发酵的主要产物，乙醇浓度过高对所有酵母的生长都有一定的抑制作用。随着乙醇浓度的不断提高，各菌株的生长能力均逐渐减弱。HU47和MP27都能够在酒精浓度为9％(v/v)的培养基中生长，但当酒精浓度＞12％(v/v)时，只有CECA能够存活。
(3)耐酸(pH)能力：HU47和MP27都能够在pH3.0～3.5环境中生长良好，其中MP27在pH＝3.0生长要好于HU47。当pH＜2.5时，所测酵母的生长能力均较弱。
(4)耐SO2能力：当SO2质量浓度在100-120mg/L时，HU47和MP27生长良好，表现出良好的SO2耐受性，并且HU47要强于MP27。
(5)耐受Cu2+胁迫：HU47和MP27能够耐受0.5mmol/L Cu2+，两株菌均能正常生长。当Cu2+浓度为1mmol/L时，所测酵母生长活力明显减弱，HU47要强于MP27。
(6)适宜的生长温度：HU47和MP27在18℃的环境下生长较好，当温度＞20℃时，所测酵母的生长能力明显增强，并且HU47＞MP27，但不能超过30℃。
(7)絮凝能力：酵母良好的絮凝性有助于发酵后期葡萄酒的澄清。HU47、MP27和CECA的絮凝值分别为53.86％，31.26和59.71％之间，均属于中絮凝性。
(8)产气泡能力：在葡萄酒发酵过程中，酵母利用葡萄汁中的糖生成酒精的过程中会产生二氧化碳气体和热量，进而使发酵过程产生气泡，如果产生的气体量过大，容易引起“冒罐”现象的发生。酿酒酵母CECA的产气能力较高，最大泡沫高度为为4.32mm，属于高产泡沫性；葡萄汁有孢汉逊酵母HU47的最大泡沫高度分别为2.75mm，属于中产泡沫性；美极梅奇酵母MP27的最高泡沫高度最小为1.12mm，属于低产泡沫性。
(9)产硫化氢能力：硫化氢(H2S)是葡萄酒中存在的挥发性最强的含硫化合物，具有类似于臭鸡蛋的刺激性气味，人对H2S的感觉阈值为0.12～0.37mg/L，因此即使是非常低的H2S浓度也会影响葡萄酒的香气品质。根据所测酵母在BIGGY培养基上的菌落颜色，酿酒酵母CECA为中产H2S菌株(菌落颜色为棕褐色)，葡萄汁有孢汉逊酵母HU47为低产H2S菌株(浅棕褐色)，美极梅奇酵母MP27为中产H2S菌株(菌落颜色为棕褐色)。
(10)碳源同化能力：所测菌株均能够利用葡萄糖、果糖、蔗糖进行发酵(表1)，且同化能力从强到弱依次是：CECA＞HU47＞MP27；HU47和MP27不能利用木糖、半乳糖进行发酵；酿酒酵母CECA对蔗糖的利用能力最高，HU47次之，MP27对蔗糖的利用能力最弱。
表1所测酵母菌株的碳源同化能力
(11)氮源需求能力：葡萄汁有孢汉逊酵母HU47对氮源的需求量相对较低，能够在200mg/L的氮源浓度条件下生长良好，而美极梅奇酵母MP27对氮源的需求量较高(200-300mg/L)。
综上所述，HU47和MP27具有良好的生长能力和环境耐受能力，包括耐受SO2和高糖浓度等，产H2S能力较低等，具体发酵参数如表2所示，其综合指标符合葡萄酒酿造的基本需求，具有大规模应用的潜力。
表2HU47和MP27酿造特性总结
实施例2
为进一步确定葡萄汁有孢汉逊酵母HU47和美极梅奇酵母MP27在葡萄汁中的发酵及产香能力，对其进行单独发酵实验。采用‘北冰红’葡萄汁进行实验，所测酵母的接种量为106CFU/mL。发酵容器为50mL离心管，每个离心管中装有30mL巴氏灭菌后的葡萄汁，将活化完成的酵母摇床培养(30℃，180r/min)一天，低温(4℃)离心(8000r/min，5min)后，收集离心管底部菌体沉淀，经无菌水洗涤后接入葡萄汁中。各实验组在28℃的恒温培养箱中静置发酵，以酿酒酵母EC1118作为对照，每个实验组设置3个生物学重复。每隔24h测定各实验组的CO2失重变化情况，若连续两天的重量变化小于2g/L，判定发酵结束。发酵结束后，每个实验组取10mL发酵样品，离心(10000r/min，3min)后取上清液，于-20℃条件下冷冻保存，用于主发酵产物的分析。通过比较各菌株的发酵速率、乙醇产量、乙醇产率和挥发性香气组分含量等指标，初步分析比较不同非酿酒酵母的产香水平及酿造特性。
按照下述方法分析发酵液的主要代谢产物：发酵液过滤(PES，0.22μm)后，采用高效液相色谱HPLC1200(Agilent，美国)进行发酵主要代谢产物分析。离子交换色谱柱为HPX-87H Aminex ion-exchange column(300×7.8mm，美国Bio-Rad Laboratories)，流动相为5mM的H2SO4溶液,等度洗脱，流速0.6mL/min。葡萄糖、果糖、乙醇和甘油的测定使用示差折光检测器(RID，refractive index detector，G1362A，Agilent，美国)，进样量为20μL，柱温45℃，分析时间30min；有机酸(酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸和乙酸)的测定采用二极管阵列检测器(DAD，photodiode array detector，G1315D，Agilent，美国)，进样量为10μL，柱温60℃，分析时间25min。
发酵液中酯类、高级醇、有机酸等挥发性香气物质含量的测定：将5mL发酵样品加入到15mL样品瓶中，同时加入1g NaCl、10μL内标(4-甲基-2-戊醇)后迅速用带有聚四氟乙烯(PTFE)隔垫的样品瓶盖拧紧密封，在40℃恒温条件下，180r/min平衡30min。样品瓶中的气-液相香气物质达到平衡后，将已活化或热解析过的聚二甲基硅氧烷/碳筛/二乙烯苯(PDMS/CAR/DVB)萃取头***样品瓶的顶空部分，在40℃恒温下搅拌萃取30min，使样品瓶中的香气物质达到气-固和气-液平衡。用Agilent 6890气相色谱(GC)和Agilent5975质谱(MS)联用仪(Agilent，美国)检测上述获得的酿造葡萄酒中各种挥发性香气物质种类和含量。具体条件为：毛细管柱HP-INNOWAX Polyethylene Glycol 60m×0.25mm×0.25μm(J&Wscientific，美国)载气为高纯氦气，流速1mL/min；顶空固相微萃取自动进样，采用不分流模式，***气相色谱的进样口，进样口温度250℃，热解析25min。柱温箱的升温程序是：40℃保持5min，然后以3℃/min的速度升温至200℃，保持2min。质谱借口温度为280℃，离子源温度为230℃，电离方式EI，离子能量70ev，质量扫描范围20-350m/z。利用质谱全离子扫描(Scan)图谱，对于已有标准品的物质，依据本实验已建立的相同色谱条件下该化合物的保留时间、保留指数和质谱信息进行定性分析，制作其在模拟酒溶液中的标准曲线进行定量(合成酒溶液为2g/L葡萄糖、7g/L酒石酸和12％酒精度的水溶液，NaOH调pH至3.3。将混合香气标准品配制成15个梯度)。没有标准品的物质，利用文献报道中相似色谱条件下该化合物的保留指数以及NIST 11标准谱库(NIST Chemistry WebBook)比对结果进行半定性分析。
为了确定葡萄汁有孢汉逊酵母HU47和美极梅奇酵母MP27单独发酵特性，我们测定了发酵结束后各实验组主代谢产物及挥发性香气化合物的含量，结果如表3所示。可以看出，葡萄汁有孢汉逊酵母HU47和美极梅奇酵母MP27均不能够单独完成酒精发酵，其残糖含量分别为54.60g/L和54.55g/L。相比于其它两株菌，美极梅奇酵母MP27能够高产甘油(5.72g/L)，改善葡萄酒的口感，提高适口性。美极梅奇酵母MP27的乙醇产率最低，比酿酒酵母低16.7％，表明MP27具有降醇的潜能。另外，MP27产柠檬酸、琥珀酸和乳酸的能力也最高，比酿酒酵母分别高38.7％，105％和50％，这对于增加葡萄酒酸度具有积极作用。HU47和MP27具有低产乙酸的特性，与酿酒酵母CECA相比，分别低了70.6％和54.9％，这对于HU47来说，该特性非常重要，因为已报道的葡萄汁有孢汉逊酵母普遍具有高产乙酸的能力，限制了其在葡萄酒酿造中的应用。在香气方面(表4)，HU47和MP27合成高级醇和脂肪酸的能力要低于酿酒酵母CECA，但两株非酿酒酵母酯类合成能力较高，其中乙酸乙酯，丁酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯浓度都高于酿酒酵母，另外HU47中β-大马士酮含量最高。高产酯类和β-大马士酮能够增加葡萄酒的花果类香气。综上所述，HU47和MP27在单独发酵过程中具有优良的酿造、发酵和产香特性，但由于二者不能单独完成发酵，因此，需要与酿酒酵母进行混合接种。另外，由于MP27具有高产柠檬酸、琥珀酸和乳酸的能力，酯类合成能力也较高，因此我们希望通过HU47和MP27复配，获得一种复合发酵菌剂，通过与酿酒酵母延迟接种(先接入非酿酒酵母，发酵一段时间后再接入酿酒酵母)，实现葡萄酒的酸度和香气物质含量的同时提高。
表3酒精发酵后各实验组主要代谢物质含量
注：表中数据(平均值±相对标准差)；利用独立样本T检验进行显著性方差分析，同一化合物含量后所标识不同的字母表示不同处理组之间存在的显著性差异(p<0.05)。
表4酒精发酵后各实验组香气物质含量
注：表中数据(平均值±相对标准差)。利用独立样本T检验进行显著性方差分析，同一化合物含量后所标识不同的字母表示不同处理组之间存在的显著性差异(p<0.05)。
实施例3
上述结果表明葡萄汁有孢汉逊酵母(H.uvarum)HU47和美极梅奇酵母(M.pulcherrima)MP27具有良好的酿造、发酵和产香特性，并且差异显著，各具优势，因此可以进行复配。由于非酿酒酵母无法独立完成酒精发酵，因此需要采用与酿酒酵母混合接种发酵的方式来完成酒精发酵。为此，我们将HU47和MP27按照1:1体积比复配，先接入葡萄汁中，发酵3天后再接入商业酿酒酵母(CECA)进行酒精发酵，探究这种双菌株复合发酵剂和接种方式对葡萄酒主代谢产物和香气物质的影响，作为对照，我们还研究了CECA单一菌株、HU47+CECA双菌和MP27+CECA的发酵情况，具体接种方式如表5所示。
表5研究所用菌株混合发酵方案
注：HMC代表三株菌混合发酵。
采用澄清的‘北冰红’葡萄汁，添加100mg/LSO2(亚硫酸形式添加)后接种发酵，实验组采用顺序接种：先按照1:1比例接入非酿酒酵母混合菌液，接种量为107CFU/mL，72h后再接入酿酒酵母CECA，接种量为106CFU/mL。发酵容器为250ml锥形瓶，每个锥形瓶中装有200mL葡萄汁，瓶口装有立式发酵栓，并对该装置气体出口用无菌水进行液封。将活化后的酵母摇床培养(30℃，180r/min)一天，低温(4℃)离心(8000r/min，5min)后，收集离心管底部菌体沉淀，经无菌水洗涤后接入锥形瓶中。各实验组在25℃的恒温培养箱中静置发酵，每个实验组设置3个生物学重复。每隔24h测定各实验组的CO2失重变化情况，若连续两天的重量变化小于2g/L，判定实验组发酵结束。发酵结束后，每个实验组取20mL发酵样品，离心(10000r/min，3min)后取上清液，于-20℃条件下冷冻保存，用于主发酵产物的分析。通过测定各实验组中CO2的失重情况监测整个发酵过程。发酵结束后，测定各实验组中主发酵代谢产物、挥发性香气化合物和颜色指标；剩余发酵液经低温离心后4℃保存，用于感官品评。
发酵液的主代谢产物及挥发性香气物质的测定参考实施例2进行。
葡萄酒感官评价：感官品评小组成员由10名经过严格葡萄酒感官品评培训的成员组成，年龄在22～26岁之间之间，5名男性，5名女性。品评通过外观、香气和整体评价三个方面对酒样进行评分。满分为10分，外观(颜色、澄清度)占20％，香气(花香、果香、协调性和浓郁度)占50％，整体评价占30％。进行感官分析之前，品评小组成员首先进行葡萄酒标准香气物质的闻香培训。采取盲品的方式，将4个实验组酒样以随机顺序进行香气感官评价并进行十分制评分。最后对感官品评小组成员的葡萄酒感官评价结果进行汇总统计，依据感官评价结果对葡萄酒质量进行判定。
由图3可以看出，在没有接种酿酒酵母CECA之前，所有实验组的发酵速率均低于酿酒酵母CECA的发酵速率。在接种酿酒酵母CECA后，各实验组的发酵速率明显加快，CECA在第8天后发酵结束，此时HC发酵变慢，其余实验组的发酵过程仍在进行，发酵第10天MC和HMC结束发酵。
结合表7可以看出，HC残糖量最高(25.55g/L)，表明HC没有完成酒精发酵，可能跟延迟接种时HU47和CECA菌株的相互作用有关。其余组都完成酒精发酵，表明加入MP27可以消除HU47与CECA的拮抗作用，使发酵顺利完成，这也是我们进行MP27和HU47复配的一个主要原因。由于单菌发酵时MP27和HU47的酒精产率都低于CECA，与CECA混合时都表现出降醇的潜能，HC和MC组的乙醇浓度分别比CECA组降低了15.6％和7.7％，但将三株菌混合在一起，即HMC组并没有表现出降醇的能力。各处理组乙酸浓度(0.65～0.80g/L)均低于酿酒酵母单独发酵对照组(1.18g/L)，其中HC和HMC比CECA低44.9％和37.3％，表明HU47具有很强的降低乙酸含量的能力，这对于今后HU47用于葡萄酒发酵生产至关重要。由于MP27的参与，HMC组柠檬酸和琥珀酸浓度得到了提高，分别比CECA对照组提高了17.2％和17.3％，比HC组提高了36％和90.1％，比MC组提高了9.7％和6.5％。在乳酸合成方面，HMC组最终乳酸浓度比CECA对照组和MC组分别提高了18.1％和29.2％。酸度的增加会降低pH，因此生产中可以通过测定葡萄酒的pH值来表征葡萄酒酸度的变化。结果发现CECA单独接种和HU47+CECA混合接种发酵葡萄酒最终pH为3.62和3.60，MP27+CECA混合接种pH为3.55，而HU47+MP27+CECA三株菌混合接种时pH为3.47，与CECA单独发酵相比pH值降低了0.15，表明MP27与HU47复合发酵剂接种能够增加葡萄酒的酸度。
表6酒精发酵后各实验组混合发酵时主要代谢物质含量(其中HU47+MP27+CECA表示三株菌混合发酵，HU47+CECA、MP27+CECA均表示两株菌混合接种)
注：表中数据(平均值±相对标准差)；利用独立样本T检验进行显著性方差分析，同一化合物含量后所标识不同的字母表示不同处理组之间存在的显著性差异(p<0.05)。
在香气方面，共检测出了28种关键风味物质，主要包括12种酯类物质，8种高级醇，3种脂肪酸以及5种其它物质(β-大马士酮、香茅醇、4-萜烯醇、苯甲醛和苯乙烯)。
由表7可知，各实验组高级醇总量都低于阈值300mg/L，与酿酒酵母CECA单独发酵(31.50mg/L)、两株菌混合接种HC(23.74mg/L)和MC(34.48mg/L)相比，三株菌混合接种HMC的高级醇含量最高，为35.06mg/L，含量较高的高级醇包括异戊醇和2-苯乙醇，提升了葡萄酒的茉莉、玫瑰花和蜂蜜香气。三个实验组中2-苯乙醇含量均明显高于酿酒酵母单独发酵，含量在6688.89-8660.76μg/L之间，其中MC实验组的2-苯乙醇含量最高、HMC次之，比酿酒酵母CECA高64.8％，表明MP27的接入增加了2-苯乙醇含量。
酯类物质是葡萄酒中最重要的一类物质，能够赋予葡萄酒浓郁的花果类香气。HMC组酯类物质总含量最高(27.8mg/L)，与酿酒酵母单独发酵(24.0mg/L)、HC(24.6mg/L)和MC(23.9mg/L)相比，分别提高了15.8％，13.0％和16.3％。HMC组中含量最高的物质为乙酸乙酯、丁酸乙酯和辛酸乙酯，含量较高的为己酸乙酯、乙酸异戊酯和辛酸甲酯，而这三种酯在MP27组中含量最高，表明MP27在HMC中的对这两种物质的促进作用，特别要指出的是MC和HMC实验组辛酸甲酯、辛酸乙酯和己酸乙酯三者之和分别为215.87μg/L和214.47μg/L，分别是酿酒酵母CECA(158.42μg/L)的1.36倍和1.35倍，这些酯类物质含量的增加提升了葡萄酒中的柑橘花果香气。
共检测出3种挥发性脂肪酸，分别为己酸、辛酸、癸酸，上述三种酸在低于阈值时可以增加葡萄酒香气的复杂性。HMC组脂肪酸总浓度要高于CECA对照组和HC组，分别高30.9％和18.2％，与MC相比没有显著性差异。β-大马士酮是一种重要的类异戊二烯产物，能够为葡萄酒提供非常好的花香和甜香，由于其阈值低(50ng/L)，其含量细微的变化能够显著影响葡萄酒的品质。HC实验组中β-大马士酮含量要高于CECA单独发酵，这与其他研究的结果是一致的，而我们的研究发现，将MP27和HU47进行复配接种，能够进一步增加β-大马士酮含量，最终HMC组与酿酒酵母CECA单独发酵相比提高了42.7％，提高了葡萄酒的香气品质，表明MP27和HU47两种菌的互作对β-大马士酮合成具有协同促进作用，因此将MP27和HU47复配，与酿酒酵母进行延迟接种发酵是一种提高葡萄酒中β-大马士酮浓度的有效方法。
表7酒精发酵后各实验组香气物质含量
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注：表中数据(平均值±相对标准差)；利用独立样本T检验进行显著性方差分析，同一化合物含量后所标识不同的字母表示不同处理组之间存在的显著性差异(p<0.05)。
通过感官评价直观展示了不同实验组之间的差异，结果如图4所示。在花香评分方面，HC和HMC的花香评分明显高于其它实验组，MC和CECA相差不大；HMC的果香评分较高，CECA和HC次之。在澄清度方面，酿酒酵母CECA评分最高，HMC次之，MC得分最低。而在香气浓郁度中，实验组HMC得分最高，CECA得分最低。另外在协调性中的酸度方面，综上，HMC和MC的得分较高，并且，HMC的感官的总体得分最好。
因此，采用本土的抗逆特性优良的葡萄汁有孢汉逊酵母CVE-HU47和美极梅奇酵母CVE-MP27进行复配，制成混合发酵菌剂，与酿酒酵母采用延迟发酵的方式(发酵3天后按照10:1的比例接入酿酒酵母)进行葡萄酒发酵，能够充分发挥HU47和MP27各自优点，有效提升葡萄酒感官品质，包括酸度和香气物质浓度(包括酯类、高级醇和β-大马士酮)，从而增加葡萄酒香气的复杂性和多样性，提升我国葡萄酒独特的本土风味特征。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一株非酿酒酵母，其特征在于：具体为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)CVE-HU47，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.24818。
2.根据权利要求1所述的非酿酒酵母，其特征在于：该非酿酒酵母分离自宁夏贺兰山东麓产区，能够耐受高浓度二氧化硫和糖胁迫，在葡萄酒发酵过程中低产挥发酸，高产酯类物质、萜烯类和降异戊二烯类物质香气物质。
3.一株非酿酒酵母，其特征在于：具体为美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)CVE-MP27，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNO.24819。
4.根据权利要求3所述的非酿酒酵母，其特征在于：该非酿酒酵母分离自宁夏贺兰山东麓产区，能够耐受高浓度二氧化硫和糖胁迫，在葡萄酒发酵过程中低产乙醇，高产柠檬酸、琥珀酸和乳酸，提升葡萄酒的酸度，增加葡萄酒中萜类物质香气。
5.一种复合发酵剂，其特征在于：包括葡萄汁有孢汉逊酵母CVE-HU47、美极梅奇酵母CVE-MP27，二者的混合接种的体积比为0.8～1:1，接种总浓度为0.1～1×107CFU/mL。
6.一种采用权利要求3所述的复合发酵剂酿造桃红葡萄酒的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取出保藏在-80℃甘油的各个菌株，解冻后室温下回温，以10％～15％(v/v)的比例接种到YPD液体培养基中，置于恒温振荡培养箱增值培养18h，待菌株生长至菌株密度在107～108CFU/mL，得到单菌液；
(2)采摘后的葡萄经过穗选、粒选和除梗破碎，经过压榨将葡萄自流汁导入发酵罐，加入澄清剂得到澄清葡萄汁，并加入80-100mg/L的SO2；
(3)顺序接种所述复合发酵剂和酿酒酵母完成如下第一发酵和第二发酵：将所述复合发酵剂接入步骤(2)得到的澄清葡萄汁，接种浓度为0.1～1×107CFU/mL，经过72～80小时完成第一发酵；然后接种商业酿酒酵母CECA，接种浓度0.1～1×106CFU/mL，经过200～240小时完成第二发酵；
所述复合发酵剂与酿酒酵母的接种比例为10:1，发酵参数为：
pH3.0～3.5，发酵温度20～23℃，残糖含量低于4g/L，得到具有花果类香气特征，酸度适宜，低挥发酸含量的干型桃红葡萄酒。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述SO2以偏重亚硫酸钾形式加入。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：在步骤(3)中，进一步控制以下发酵参数：
糖浓度为250～300g/L，酒精浓度为9～11％(v/v)，氮源浓度为200-300mg/L。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于：得到的葡萄酒产品中，具有以下香气物质：酯类物质、高级醇、挥发性脂肪酸以及其它香气物质；其中：
所述酯类物质为乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯、十二酸乙酯和辛酸甲酯；
所述高级醇为异丁醇、1-丁醇、异戊醇、1-辛醇、1-癸醇、4-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇、2-苯乙醇；
所述脂肪酸为己酸、辛酸、癸酸；
所述其它香气物质为β-大马士酮、香茅醇、4-萜烯醇、苯甲醛和苯乙烯。
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