CN116515654B - 酿酒酵母及其在龙眼葡萄酒酿造中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物及酿酒技术领域，公开了一株酿酒酵母及其在龙眼葡萄酒酿造中的应用。本发明提供的酿酒酵母具有较好的抗胁迫能力，而且发酵速度快，在较宽的发酵温度下均可完成葡萄酒发酵，此外，采用该酿酒酵母酿造的葡萄酒还含有丰富的香味物质，使其口感更具有复杂性。该酿酒酵母尤其适合用于以怀涿产区葡萄为原料进行葡萄酒酿造，获得的葡萄酒具有更浓郁丰富的香气物质，具有品质高、风味好、产区风格突出等特点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物以及酿酒技术领域，具体涉及一株酿酒酵母及其在龙眼葡萄酒酿造中的应用。
背景技术
酿酒酵母作为主要的微生物发酵菌种，对于葡萄酒品质、产量和发酵生产管理等方面均有很大影响，而且，酿酒酵母菌种的选择对于葡萄酒产品特色和风格的形成也非常重要。酿酒酵母参与葡萄酒酿造过程，可通过代谢产生多种葡萄酒风味物质，主要包括醇类、酯类、醛类、酮类、酸类、萜烯类和其他一些微量成分。葡萄酒的香气影响葡萄酒产品的风格和特征差异，是评价葡萄酒品质的重要感官指标。
当前我国葡萄酒厂在酿造中普遍采用商业活性干酵母进行发酵，本土酵母菌株的选育与应用仍处于起步阶段，能应用到葡萄酒工业生产之中的国内本土选育而来的酵母菌株严重缺乏。而对于进***性酿酒酵母的过分依赖一方面提高了酿造成本，限制了产业自主发展空间，另一方面还导致葡萄酒品质的严重同质化，制约了我国葡萄酒产业的发展。虽然近年来随着经济的发展，葡萄酒酿造菌种筛选的工作也逐步展开，但是，目前对于菌种筛选的工作主要集中在发酵速度和香味物质产量等方面，对于葡萄酒香气品质的改善以及特色优质葡萄酒的酿造等内容涉及较少。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺乏改善葡萄酒香气品质、酿造特色优质葡萄酒的优良酿酒菌株等问题，提供一株酿酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用。本发明提供的酿酒酵母具有较好的抗胁迫能力，而且发酵速度快，在较宽的发酵温度下均可完成葡萄酒发酵，此外，采用该酿酒酵母酿造的葡萄酒还含有丰富的香味物质，使其口感更具有复杂性。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），所述酿酒酵母的保藏编号为CGMCC No.25847。
本发明第二方面提供第一方面所述的酿酒酵母在葡萄酒酿造中的应用。
本发明第三方面提供一种酿造葡萄酒的方法，所述方法包括将第一方面所述的酿酒酵母接种至葡萄汁和/或葡萄果浆中，在酿酒条件下进行发酵，获得葡萄酒。
本发明第四方面提供根据第三方面所述的方法制备获得的葡萄酒。
通过上述技术方案，本发明至少能够取得如下有益效果：
（1）本发明提供的酿酒酵母具有较高的抗胁迫能力，可在18体积%酒精、500g/L葡萄糖、pH1.5、350mg/L二氧化硫的条件下正常生长发酵。而且，该酿酒酵母还能在较低的温度下启动发酵，在发酵过程中不产生硫化氢，并且在较宽的温度范围下均可实现葡萄酒的发酵生产，降低了对葡萄酒酿造条件的控制和管理的要求。
（2）本发明提供的酿酒酵母酿造的葡萄酒中所含的香气物质种类丰富，且其中乙酸酯、脂肪酸乙酯、C6醇等含量较高，还含有具有浓郁花香的萜烯类物质，且其中高级醇的含量适中，在增加葡萄酒的复杂性的同时，远低于对葡萄酒香气产生负面影响的浓度，使其具有较高的风味品质。而且与现有的商业菌株相比，采用本发明提供的酿酒酵母酿造的葡萄酒的更具复杂性。
（3）本发明提供的酿酒酵母特别适合怀涿盆地龙眼葡萄酿酒使用。采用该酿酒酵母酿造的龙眼干白葡萄酒具有更浓郁的花香和果香味，具有品质高，产区风格突出，口感好的特点。
附图说明
图1是实施例1中，酿酒酵母CGMCC No.25847在YPD培养平板上进行培养的菌落形态图。
图2是实施例1中，酿酒酵母CGMCC No.25847在WL营养琼脂培养平板上进行培养的菌落形态图。
图3A至图3E中分别为实施例2中绘制的酿酒酵母CGMCC No.25847的乙醇抑制率曲线、葡萄糖抑制率曲线、二氧化硫抑制率曲线、pH抑制率曲线和温度抑制率曲线。
图4为实施例3中酿酒酵母CGMCC No.25847和商业酵母VL2的生长曲线对比图。
图5为实施例4中酿酒酵母CGMCC No.25847和商业酵母VL2发酵获得的龙眼干白葡萄酒的香气雷达图。
生物保藏
本发明提供的酿酒酵母，分类命名为Saccharomyces cerevisiae，已于2022年09月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25847。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明中，未作特殊说明的情况下，“（本发明提供的）酿酒酵母”是指酿酒酵母CGMCC No.25847，酿酒酵母BC 60771（简称为60771）发明人在研究过程中对该菌株的编号，其二者是同一菌株，其保藏编号和（研究过程中的）编号在后文中可以互换使用。
怀涿盆地位于北纬40°附近，是我国最理想的葡萄原料基地之一。由于其独特的地质地貌特性，造成了盆地内独特的气候特点，为葡萄的生长提供了绝佳的生存条件。盆地内热量丰富，昼夜温差大，太阳光辐射强，无霜期长，年降雨量偏低等气候特点及完美的土壤渗透性、排水性和土壤自然肥力，都有利于葡萄生长，加之海拔较高，紫外线和蓝紫光丰富，与良好的通风条件相结合，对葡萄的光合作用十分有力，尤其是利于葡萄花青素的合成，所以怀涿盆地栽培的葡萄果实色泽艳丽，香气浓郁，是我国酿酒葡萄的优良产区之一。
龙眼葡萄是中国古老的葡萄栽培品种，广泛分布在西北、华北等地，其果实呈***，含糖量含酸量较高，酸甜爽口，是鲜食葡萄中佳品的同时也是酿造高级白葡萄酒的主要原料。由于长期的栽培驯化，河北怀涿盆地已成为龙眼葡萄的最适栽培区之一。
本发明的发明人在研究的过程中，从怀涿盆地沙城产区自然发酵的酿酒葡萄醪中分离获得一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），该酿酒酵母的发酵性能良好，产香能力突出，能够凸显产区风格。该酿酒酵母的推广应用不仅能够丰富葡萄酒酿造菌株市场，提高我国葡萄酒产业自主发展进程，还能避免我国不同产区葡萄酒同质化的问题，提高葡萄酒品质，凸显怀涿盆地产区葡萄酒的特色。经过进一步研究，发明人还发现，采用该酿酒酵母进行龙眼干白葡萄酒酿造时，具有能够在较低温度下启动发酵，且发酵速度快的特点。而且，酿造获得的龙眼干白葡萄酒口感好，且其中具有丰富的香气物质，使其香气复杂性较高，极大突出了产区特色，提高了葡萄酒的品质。
基于上述发现，本发明第一方面提供一株酿酒酵母，所述酿酒酵母的保藏编号为CGMCC No.25847。
本发明第二方面提供第一方面所述的酿酒酵母在葡萄酒酿造中的应用。尤其是在（怀涿产区）龙眼（干白）葡萄酒酿造中的应用。
本发明第三方面提供一种酿造葡萄酒的方法，所述方法包括将第一方面所述的酿酒酵母接种至葡萄汁和/或葡萄果浆中，在酿酒条件下进行发酵，获得葡萄酒。
本发明提供的方法中，对于用于葡萄酒酿造的原料（酿酒葡萄）的来源没有特别限制，任意可以用于葡萄酒酿造的葡萄制成的果汁或葡萄果浆均可适用于本发明提供的方法。经过大量研究，发明人发现，本发明提供的酿酒酵母CGMCC No.25847特别适合以怀涿盆地产区的酿酒葡萄为原料进行葡萄酒酿造。根据该产区葡萄的特点，上述方法特别适合糖、酸含量较高的酿酒葡萄为原料进行葡萄酒酿造。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述葡萄汁和/或葡萄果浆中，还原糖含量为150-500 g/L，总酸含量为1-10 g/L。
优选地，所述葡萄汁和/或葡萄果浆中，还原糖含量为150-350g/L，总酸含量为3-10g/L。
更优选地，所述葡萄汁和/或葡萄果浆中，还原糖含量为160-200 g/L，总酸含量为3-8g/L。
本发明提供的方法可以采用任意品种的具有上述特征的酿酒葡萄为原料进行葡萄酒酿造。根据本发明的优选实施方式，其中，用于制备所述葡萄汁和/或葡萄果浆的葡萄品种选自龙眼、马瑟兰、赤霞珠、梅鹿辄、品丽珠、西拉、黑比诺、丹菲特、长相思、贵人香和霞多丽中的至少一种。
根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，用于制备所述葡萄汁和/或葡萄果浆的葡萄为产自怀涿盆地的龙眼葡萄。
本发明提供的酿酒酵母特别适合干白葡萄酒的酿造，因此，本发明提供的方法中，优选采用去皮葡萄汁和/或去皮葡萄果浆。
本发明提供的方法中采用的葡萄汁或葡萄果浆可以采用任意本领域现有方法制备获得，也可以直接从商购途径购买获得，只要其原料符合前述特征即可。
本发明提供的方法中，对于酿酒酵母的接种量没有特别限制，可以根据实际情况（例如原料来源、发酵条件、产品要求等）进行调整。根据本发明的优选实施方式，其中，所述酿酒酵母的接种量为105-1010CFU/mL。所述105-1010CFU/mL是指接种后发酵体系中酿酒酵母的含量在105-1010CFU/mL的数量级水平，例如105CFU/mL的数量级水平代表的是大于等于1×105CFU/mL至小于1×106CFU/mL的范围，也即，如1×105CFU/mL、5×105CFU/mL、9.9×105CFU/mL等均属于105CFU/mL的数量级水平。因此，本发明提供的方法中，酿酒酵母的接种量在大于等于1×105CFU/mL至小于1×1011CFU/mL的范围内。
优选地，所述酿酒酵母的接种量为106-108CFU/mL。更优选为106-107CFU/mL。
任意本领域现有的适用于葡萄酒酿造的酿酒条件均可适用于本发明提供的方法。为了进一步适应糖含量高且酸度低的酿酒葡萄的特点，提高葡萄酒品质，根据本发明的优选实施方式，其中，所述酿酒条件包括：温度10-40℃（优选为12-38℃，更优选为13-32℃），时间5-25天（优选为5-20天，更优选为10-20天）。
本发明提供的方法中，出于提升葡萄酒品质的目的，在酿造葡萄酒的原料（即葡萄汁和/或葡萄果浆）中还可以添加辅料，例如，用于帮助酵母发酵的辅料，进一步改善葡萄酒香气和风味的辅料等。根据本发明的优选实施方式，其中，所述葡萄汁和/或葡萄果浆中还包括果胶酶、单宁、氮源、酵母多糖和橡木制品中的至少一种。本发明提供的方法中对于所述辅料的用量没有特别限制，可以根据实际情况（例如原料特性、辅料特性、产品需要等）进行调整。氮源可以为本领域常见的氮源，例如蛋白胨、酵母提取物等。橡木制品用于进一步改善葡萄酒的香气和风味。
本发明的方法中，在发酵前还可以采用常规的方法对菌株进行活化。优选所述活化的条件可以包括：温度为25-35℃，时间可以为10-30h（优选15-25h）。
本发明第四方面提供根据第三方面所述的方法制备获得的葡萄酒。
任意根据本发明提供的上述方法制备获得的葡萄酒均属于本发明的内容，对于其中的具体成分没有特别限制。
由于葡萄酒的成分与酿酒原料和酿酒条件等均有关联，因此，采用不同来源和品种的酿酒葡萄，或采用不同的酿酒条件获得的葡萄酒中的成分均会有所差别。
根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，所述葡萄酒为采用还原糖含量为150-300g/L（优选为150-200g/L），总酸含量为5-8g/L的龙眼葡萄汁（去皮）为原料，采用如前所述的酿酒条件酿造获得的葡萄酒。优选所述葡萄酒中，乙酸酯的含量不低于50mg/L，高级醇的含量不超过250mg/L，脂肪酸乙酯的含量不低于12mg/L，萜烯类物质的含量不低于0.001mg/L。乙酸酯是由乙醇或者高级醇与乙酰辅酶A在醇酰基转移酶催化作用下形成的，可以为葡萄酒提供花香和果香。“高级醇”通常指C原子数在3个以上的醇类物质，是葡萄酒中重要的香气物质之一，但其浓度过高（通常总浓度超过400mg/L）会对葡萄酒的香气产生负面影响，而在浓度不超过300mg/L时，可以提高葡萄酒香气的复杂性。脂肪酸乙酯是葡萄酒中另一类重要的酯类化合物，是由酵母脂肪酸代谢过程中产生的酯酰辅酶A醇解产生的，不同的脂肪酸乙酯具有不同的风味，例如，己酸乙酯可以为酒体增添苹果香和草莓香，乳酸乙酯则可以提供奶油香气。
优选地，所述葡萄酒中含有：乙醇5-20体积%，乙酸酯50-70mg/L，高级醇150-250mg/L，脂肪酸乙酯12-25mg/L，C6醇1.8-2mg/L，脂肪酸1-10mg/L，萜烯类物质0.001-0.01mg/L。C6醇通常能使葡萄酒增加生青味和青草味。脂肪酸在葡萄酒中通常表现出奶酪香和脂肪香，萜烯类物质一般具有浓郁的花香味。
更优选地，所述葡萄酒中含有：乙醇5-15体积%，乙酸酯60-70mg/L，高级醇180-220mg/L，脂肪酸乙酯15-20mg/L，C6醇1.8-2mg/L，脂肪酸4-7mg/L，萜烯类物质0.005-0.01mg/L。
本发明提供的葡萄酒中：乙醇含量可以为5体积%、6体积%、7体积%、8体积%、9体积%、10体积%、11体积%、12体积%、13体积%、14体积%、15体积%，或者也可以为任意两个上述值的任意中间值。
乙酸酯的含量可以为60mg/L、61mg/L、62mg/L、63mg/L、64mg/L、65mg/L、66mg/L、67mg/L、68mg/L、69mg/L、70mg/L，或者也可以为任意两个上述值的任意中间值。
高级醇的含量可以为180mg/L、185mg/L、190mg/L、195mg/L、200mg/L、205mg/L、210mg/L、215mg/L、220mg/L，或者也可以为任意两个上述值的任意中间值。
脂肪酸乙酯的含量可以为15mg/L、16mg/L、17mg/L、18mg/L、19mg/L、20mg/L，或者也可以为任意两个上述值的任意中间值。
C6醇的含量可以为1.8mg/L、1.85mg/L、1.9mg/L、1.95mg/L、2mg/L，或者也可以为任意两个上述值的任意中间值。
脂肪酸的含量可以为4mg/L、4.5mg/L、5mg/L、5.5mg/L、6mg/L、6.5mg/L、7mg/L，或者也可以为任意两个上述值的任意中间值。
萜烯类物质的含量可以为0.005mg/L、0.006mg/L、0.007mg/L、0.008mg/L、0.009mg/L、0.01mg/L，或者也可以为任意两个上述值的任意中间值。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
以下实施例中用作对比菌株的商业菌株VL2购自法国laffort公司。未进行说明的情况下，采用的试剂和材料均为购自正规化学或生物用品供应商，试剂纯度均为分析纯。
以下实施例中采用的培养基配制方法如下：
YPD培养基：
酵母提取物10 g/1000 mL，葡萄糖20 g/1000 mL，蛋白胨20 g/1000 mL。按照上述用量称取试剂，溶于去离子水中，无需调节pH，即得液体YPD培养基。按照1.5g/1000mL的比例在液体YPD培养基中加入琼脂，即得固体YPD培养基。将获得的培养基121℃高压灭菌15min，冷却后备用。
将灭菌后的固体YPD培养基冷却至不烫手（约45-50℃），倒入平板培养皿中，冷却凝固后即得YPD培养平板。
WL营养琼脂培养基：
酵母浸粉4 g/1000 mL，氯化铁0.0025 g/1000 mL，葡萄糖50 g/1000 mL，硫酸锰0.0025 g/1000 mL，氯化钾0.425 g/1000 mL，溴甲酚绿0.022 g/1000 mL，氯化钙0.125 g/1000 mL，硫酸镁0.125 g/1000 mL，酸水解酪蛋白5 g/1000 mL，磷酸二氢钾0.55 g/1000mL。按照上述用量称取试剂，溶于去离子水中，调节pH至5.5±0.2，即得液体WL培养基。按照20g/1000mL的比例在液体WL培养基中加入琼脂，即得固体WL培养基。将获得的培养基121℃高压灭菌15min，冷却后备用。
将灭菌后的固体WL培养基冷却至不烫手（约45-50℃），倒入平板培养皿中，冷却凝固后即得WL培养平板。
BIGGY培养基：
柠檬酸铋铵5 g/1000 mL，亚硫酸钠3 g/1000 mL，葡萄糖10 g/1000 mL，甘氨酸10g/1000 mL，酵母浸粉1 g/1000 mL。按照上述用量称取试剂，溶于去离子水中，调节pH至6.8±0.2，煮沸不超过1min，即得BIGGY液体培养基。在煮沸前按照16 g/1000 mL的比例加入琼脂，即得固体BIGGY培养基。
待煮沸后的固体BIGGY培养基冷却至不烫手（约45-50℃），倒入平板培养皿中，待冷却凝固后即得BIGGY培养平板。
葡萄汁模拟培养基：
葡萄糖100 g/1000 mL，果糖100 g/1000 mL，酒石酸3 g/1000 mL，柠檬酸0.3 g/1000 mL，L-苹果酸0.3 g/1000 mL，硫酸铵0.3 g/1000 mL，天冬酰胺0.6 g/1000 mL，一水合硫酸锰4 mg/1000 mL，一水合硫酸锌4 mg/1000 mL，磷酸二氢钾2 g/1000 mL，五水合硫酸铜1 mg/1000 mL，碘化钾1 mg/1000 mL，硼酸1 mg/1000 mL，（NH4)6MO7O24·4H2O 1 mg/1000 mL，COCl2·6H2O 0.4 mg/1000 mL，肌醇0.3 g/1000 mL，生物素0.04 mg/1000 mL，维生素B11 mg/1000 mL，维生素B61 mg/1000 mL，烟酸1 mg/1000 mL，泛酸1 mg/1000 mL，对氨基苯甲酸1 mg/1000 mL。按照上述用量称取试剂，溶于去离子水中，调节pH至5.8，过滤除菌即得葡萄汁模拟培养基。
实施例1
本实施例用于说明酿酒酵母CGMCC No.25847的获得和保藏。
（一）菌株筛选和鉴定
使用怀涿盆地产区的龙眼葡萄汁进行实验室小试发酵，将未杀菌的葡萄汁加入发酵容器中，18℃恒温发酵。在发酵过程中检测还原糖含量，根据还原糖的消耗量，在发酵不同阶段进行取样。对样品进行梯度稀释后涂布于WL培养基平板上，待葡萄酒酵母长出后，从中挑选出长势较好且具有明显特征的菌株，进行菌落形态以及分子生物学鉴定（5.8S-rDNAITS方法），后使用高通量平台对鉴定出的酿酒酵母进行抑制率筛选实验，通过对乙醇、葡萄糖、二氧化硫、温度、pH及硫化氢的产量进行评价后，筛选到抑制率较强的5株酿酒酵母。对5株酿酒酵母的酿造特性进行相关研究，将其分别以1×106CFU/mL的接种量接种于葡萄汁模拟培养基中，在500 mL锥形瓶里进行发酵初筛实验，18℃发酵14 d，通过监测生长曲线（OD600 nm）和二氧化碳失重曲线，判断发酵的进程，根据斜率的大小评判发酵能力的强弱及发酵的快慢，综合筛选出发酵能力较强的一株酿酒酵母，编号为BC 60771（简称为60771）。
该菌株经过形态学观察、5.8S-ITS rDNA基因扩增测序，对所有鉴定结果综合分析。具体鉴定结果如下：
（1）形态学观察方法和结果：经过48h培养，菌株60771在YPD培养平板上生长的菌落为圆形、乳白色、有光泽，边缘整齐（具体可参考图1）；在WL营养琼脂培养平板上菌落特征为奶油色，圆形，表面光滑、不透明，奶油状（具体可参考图2）。
（2）ITS鉴定：取菌株总DNA，采用真菌ITS rDNA通用引物，按照表1的PCR体系和扩增程序进行ITS rDNA扩增。
表1
将PCR产物送至生工生物工程（上海）有限公司完成测序。ITS rDNA测序结果与NCBI中数据比对，菌株60771与Saccharomyces cerevisiae具有100%的同源性，结合生理生化鉴定结果，综合认定为酿酒酵母。
（二）菌株保藏
于2022年09月30日，将上述筛选获得的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BC60771保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25847。
实施例2
本实施例用于说明酿酒酵母CGMCC No.25847的抗胁迫能力。
（1）菌株接种评价
将菌株60771单菌落接种于无菌YPD液体培养基的96孔板中，30℃，200 rpm进行过夜培养活化。然后采用如下方法对该菌株的抗胁迫能力进行检测。
乙醇耐受能力：将96孔板中活化的菌株以3%的接种量转接至分别含6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%乙醇浓度的YPD培养基中进行乙醇浓度抑制率实验，30℃、200 rpm过夜培养后，酶标仪测OD600 nm值，绘制酿酒酵母的乙醇浓度抑制率曲线。
葡萄糖耐受能力：将96孔板中活化的菌株以3%的接种量转接至分别含20%、30%、40%、50%、60%葡萄糖浓度的YPD培养基中进行葡萄糖浓度抑制率实验，30℃、200 rpm过夜培养后，酶标仪测OD600 nm值，绘制酿酒酵母的葡萄糖浓度抑制率曲线。
二氧化硫耐受能力：将96孔板中活化的菌株以3%的接种量转接至分别含150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、350 mg/L二氧化硫浓度的YPD培养基中进行二氧化硫浓度抑制率实验，30℃、200 rpm过夜培养后，酶标仪测OD600 nm值，绘制酿酒酵母的二氧化硫浓度抑制率曲线。
pH抑制评价：将96孔板中活化的菌株以3%的接种量转接至分别含pH 1.5、pH 2.0、pH 2.5、pH 3.0、pH 3.5、pH 4.0、pH 4.5、pH 5.0的YPD培养基中进行pH抑制率实验，30℃、200 rpm过夜培养后，酶标仪测OD600 nm值，绘制酿酒酵母的pH抑制率曲线。
温度抑制评价：将96孔板中活化的菌株以3%的接种量转接至YPD培养基中进行温度抑制率实验，10℃、13℃、18℃、32℃、40℃、200 rpm过夜培养后，酶标仪测OD600 nm值，绘制酿酒酵母的温度抑制率曲线。
菌株产硫化氢测试：将96孔板中活化的菌株点板至BIGGY培养基平板上，观察菌落生长情况。高产硫化氢的菌株可还原培养基中的亚硫酸铋，从而使菌落显褐色至黑色。根据菌落颜色评价酿酒酵母的产硫化氢情况。
（2）评价结果
图3A-3E中分别示出了菌株60771的乙醇抑制率曲线、葡萄糖抑制率曲线、二氧化硫抑制率曲线、pH抑制率曲线和温度抑制率曲线。
从图中可以看出，60771可在18体积%乙醇，500 g/L葡萄糖，pH 1.5，350 mg/L二氧化硫的条件下正常生长发酵。该菌株还可在温度较低的条件下（例如10℃）启动发酵，保证葡萄酒的正常酿造生产。
此外，经过产硫化氢测试发现，菌株60771不产硫化氢，不会给葡萄酒带来异味，能够有效提高葡萄酒的香味品质。
实施例3
本实施例用于说明酿酒酵母CGMCC No.25847的发酵效果和产香性能。
采用葡萄汁模拟培养基对实施例1筛选得到的酿酒酵母60771进行小试发酵实验，对其发酵效果及产香性能进行验证，具体方法如下：
将酿酒酵母60771在YPD培养平板上传代，并从YPD培养平板上挑取单菌落分别接入装有30 mL已灭菌液体YPD液体培养基的三角瓶中，摇床（180 rpm，30℃）培养18 h，作为种子液。
按照1×106CFU/mL的接种量，将种子液接种于300 mL葡萄汁模拟培养基中（500mL锥形瓶），初糖浓度200 g/L，以发酵栓液封，18℃条件下静置培养10-14天（至最终糖含量＜4 g/L终止发酵）。
按照下述方法检测葡萄酒的酿造特性：
乙醇、果糖、葡萄糖、甘油、乙酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸：液相色谱法（GB/T15038-2006）；
酯类、高级醇、有机酸等挥发性香气物质含量：用Agilent 6890 气相色谱（GC）和Agilent 5975 质谱（MS）联用仪（Agilent，美国）检测上述获得的酿造葡萄酒中各种挥发性香气物质种类和含量。具体条件包括：毛细管柱HP-INNOWAX Polyethylene Glycol 60 m×0.25 mm×0.25 μm（J&W scientific，美国）载气为高纯氦气，流速1 mL/min；顶空固相微萃取手动进样，采用不分流模式，***气相色谱的进样口，进样口温度250℃，热解析25 min。柱温箱的升温程序是：40℃保持5 min，然后以3℃/min的速度升温至200℃，保持2 min。质谱接口温度为280℃，离子源温度为230℃，电离方式EI，离子能量70 ev，质量扫描范围20-450 amu。
采用商业菌株VL2在上述小试发酵实验条件下进行培养，对比酿酒酵母60771和商业菌株VL2在发酵过程中的生长特性，结果详见图4。从图中可以看出，两个菌株的生长趋势类似，在发酵前期两个菌株的生长速度较为接近，到发酵第9天后，60771的生长速度明显更快。
表2和表3中分别示出了60771采用葡萄汁模拟培养基酿造后的葡萄酒样的理化指标检测结果和挥发性香气物质的检测结果。
表2 测试菌株发酵后葡萄酒样的理化指标
通过酿酒酵母60771进行模拟葡萄汁培养基摇瓶小试试验的结果可以看出该酿酒酵母可完成发酵且残糖小于4 g/L，符合干型葡萄酒的指标要求，发酵性能良好，具有成为葡萄酒新特色商业菌株推广应用的潜力。
表3 测试菌株发酵后葡萄酒样中挥发性香气物质检测结果
通过检测结果可以看出，酿酒酵母60771能够产生较多的高级醇（且含量不超过不良风味最高值400mg/L）和酸类、酯类香气物质，尤其是其中高级醇和酸类物质的含量较多，说明该菌株具有较强的产香能力。由此可见，本发明提供了新的优质特色葡萄酒酿造菌株，丰富了葡萄酒菌株的选择。
另外，值得注意的是，脂肪酸在葡萄酒中通常表现为奶酪香及脂肪香，酿酒酵母60771发酵后的酒体中共计检测到4种脂肪酸，且总含量较高。同时脂肪酸乙酯是另外一类重要的酯类化合物，是由酵母脂肪酸代谢过程中产生的酯酰辅酶A醇解产生。本实验中共检测到4种脂肪酸乙酯，包括：丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯和辛酸乙酯，其中己酸乙酯可以为酒体增添苹果香及草莓香，乳酸乙酯可以为酒体增添奶油香气，为酿造具有特色香气的高品质葡萄酒生产提供了基础。
实施例4
本实施例用于说明酿酒酵母CGMCC No.25847的葡萄酒发酵效果和产香性能。
采用5t发酵罐，对菌株60771和商业酵母VL2在龙眼葡萄汁发酵时的发酵效果和产香性能进行比较。具体方法如下：按照实施例3中的方法进行种子液制备，然后按106CFU/mL的接种量将种子液接种于80 L龙眼葡萄汁（采用怀涿盆地所产龙眼葡萄压榨后去皮，过滤除菌，其中还原糖含量约170±5g/L，总酸含量约7±1g/L）中，静置活化培养24 h，待菌株生长后且温度回温至与发酵罐温差小于10℃时，将活化好的60771和VL2培养液加入5t发酵罐中进行发酵，发酵温度设置为10℃。对发酵过程进行监测，发酵结束（还原糖浓度<4 g/L）后，取样采用液相色谱法（GB/T 15038-2006）对获得的酒样进行理化指标及香气物质检测。其中，60771约20天结束发酵，VL2约15天结束发酵。具体结果详见表4和表5。
表4 龙眼葡萄汁发酵葡萄酒样的理化指标检测结果
根据表4中的结果可以看出：60771发酵后残糖含量为2.36 g/L，VL2发酵后残糖含量为2.2 g/L，两株酵母均可彻底完成酒精发酵阶段。两株酵母发酵后酒体在酒精度、挥发酸、总酸含量等方面基本一致，无明显差异。说明60771具有作为新商业酵母进行葡萄酒规模酿造推广的潜力。
表5 龙眼葡萄汁发酵葡萄酒样的香气物质含量
注：N D表示未检出
根据表5的内容可以看出，菌株60771发酵获得的龙眼葡萄酒中乙酸酯、脂肪酸乙酯、其他酯类以及C6醇的含量均高于采用商业菌株VL2发酵获得的葡萄酒。而且，采用菌株60771发酵获得的龙眼葡萄酒中共检测到5种高级醇，其总浓度小于400 mg/L，给葡萄酒增加了复杂性的同时不会对葡萄酒的香气带来负面影响。此外，采用菌株60771发酵获得的龙眼葡萄酒中还检测到具有浓郁花香的萜烯类物质，进一步提高了葡萄酒的香气品质。
基于OAV香气分类，对菌株60771和VL2发酵获得的龙眼葡萄酒香气分类进行比较，图5中示出了两种龙眼葡萄酒的香气雷达图比较结果。从图中可以看出，由本土酵母60771发酵获得的龙眼干白葡萄酒在香气方面比商业酵母VL2发酵后的酒体具有更浓郁的花香、果香，可以更加充分的体现出怀涿盆地龙眼干白葡萄酒的品质和特色，突出产区风格，改善葡萄酒口感，表现出良好的酿酒品质。
此外，经专业人员品鉴，采用现有商业菌株酿造的龙眼干白葡萄酒的香气较淡，复杂性稍显不足。而采用本土酵母60771酿造获得的龙眼干白葡萄酒口感清新，具有花果香突出，香气复杂度高的特点，极大凸显了怀涿产区龙眼葡萄酒的特色，为开发地区特色葡萄酒，丰富我国葡萄酒产品种类，提高高品质葡萄酒产出具有重要意义。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1. 一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其特征在于，所述酿酒酵母的保藏编号为CGMCC No.25847。
2.权利要求1所述的酿酒酵母在葡萄酒酿造中的应用。
3.一种酿造葡萄酒的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的酿酒酵母接种至葡萄汁和/或葡萄果浆中，在酿酒条件下进行发酵，获得葡萄酒。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述葡萄汁和/或葡萄果浆中，还原糖含量为150-500 g/L，总酸含量为1-10 g/L。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，用于制备所述葡萄汁和/或葡萄果浆的葡萄品种选自龙眼、马瑟兰、赤霞珠、梅鹿辄、品丽珠、西拉、黑比诺、丹菲特、长相思、贵人香和霞多丽中的至少一种。
6. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述酿酒酵母的接种量为105-1010 CFU/mL。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述酿酒条件包括：温度10-40℃，时间5-25天。
8.根据权利要求3所述的方法，其中，所述葡萄汁和/或葡萄果浆中还包括果胶酶、单宁、氮源、酵母多糖和橡木制品中的至少一种。
9.根据权利要求3-8中任意一项所述的方法制备获得的葡萄酒。
10.根据权利要求9所述的葡萄酒，其中，所述葡萄酒中，乙酸酯的含量不低于50mg/L，高级醇的含量不超过250mg/L，脂肪酸乙酯的含量不低于13mg/L，萜烯类物质的含量不低于0.001mg/L。
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