CN116445641A - 一种梨形虫pcr的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种梨形虫PCR的检测方法，涉及PCR检测技术领域，其技术要点为：包括以下步骤：S1、样品采集：采集24只牛羊的血液共24份分别置于抗凝管中，并将其于‑20℃保存；S2、引物的设计及全血DNA的提取：S3、PCR的扩增：S4、阳性质粒的构建：S5、根据步骤S1‑步骤S4,对采集的牛羊血液临床样品提取DNA，进行梨形虫检测和琼脂糖凝胶电泳。本发明的方法采用梨形虫的18SrRNA设计1对特异性引物，以阳性核酸为模板进行反应条件的优化并进行灵敏度、特异性及临床样品的检测；本发明的方法灵敏、快速、简便、特异性高，能够用于梨形虫的快速检测诊断及流行病学调查。
Description
技术领域
本发明涉及PCR检测技术领域，具体涉及一种梨形虫PCR的检测方法。
背景技术
梨形虫(Piroplasm)包括泰勒虫(Theileria)和巴贝斯虫(Babesia)，是寄生于动物红细胞内的血液原虫，能够引起泰勒虫病和巴贝斯虫病，该病呈全球性分布，热带和亚热带地区多发。临床表现为高热、贫血、黄疸、出血和呼吸困难等症状，死亡率极高。梨形虫病以蜱为传播媒介，因此该病的流行具有一定的季节性和地区性。
梨形虫病的诊断主要依赖于临床检查和血液涂片检测，虽简单易操作，但比较依赖检测人员的经验，不能保证检测的准确性。除此之外，血清学方法也能用于梨形虫的检测，但会受到抗原来源、交叉反应的限制。随着分子生物学方法的兴起，快速准确且灵敏度高的PCR方法逐渐成为主要检测方法。目前国内针对梨形虫的常用检测方法多为巢式PCR，用时较长，不适用于大批量检测样品，大部分普通PCR检测方法不能够同时检测泰勒虫和巴贝斯虫。
因此，建立准确快速的梨形虫PCR检测方法十分重要，本发明旨在提供一种梨形虫PCR的检测方法，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种梨形虫PCR的检测方法，本发明的方法根据泰勒虫18S rRNA设计1对特异性引物，并通过优化PCR方法的条件，建立了特异性强、敏感度高的PCR检测方法，为梨形虫病的监控提供快捷、简便、高效的检测方法。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种梨形虫PCR的检测方法，包括以下步骤：
S1、样品采集：采集24只牛羊的血液共24份分别置于抗凝管中，并将其于-20℃保存；
S2、引物的设计及全血DNA的提取：
A、采用DNAStar7.1软件对检索自NCBI的泰勒虫18S rRNA基因序列进行比对，然后采用Premier6.0软件设计通用引物P-1和P-2；
B、使用基因组DNA纯化试剂盒提取步骤S1中所述的24份牛羊血液的全血DNA，并将其于-20℃中保存，备用；
S3、PCR的扩增：
1)以吕氏泰勒虫全血样本DNA为模板，采用引物P-1/P-2进行PCR扩增，其中，扩增体系为：PCR预混液10μL，dd H2O 6μL，上、下游引物各1μL，模板DNA2μL；扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸8min；
2)用引物P-1/P-2分别扩增中华泰勒虫、环形泰勒虫、尤氏泰勒虫、双芽巴贝斯虫、莫氏巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫和牛巴贝斯虫，并将PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，验证所述引物能否扩增梨形虫；
S4、阳性质粒的构建：
将步骤S3中电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外分析仪中，并将目的条带切下后放入1.5mL的EP管中，然后进行DNA胶回收试剂盒的操作，最后测量胶回收产物的浓度；并将胶回收产物与pMD18-T载体连接后转化到DH-5α感受态细胞中，经过氨苄青霉素阳性LB培养基的筛选，挑取单个菌落，并将其于37℃、200r/min摇床培养3-5h，将获得的浑浊菌液使用试剂盒进行菌液提取质粒，分光光度计测其浓度，并进行测序，鉴别其是否为目的产物，剩余质粒与甘油混合后保存备用；将鉴定为目的产物的质粒命名为pMD-TH；
S5、根据步骤S1-步骤S4,对采集的牛羊血液临床样品提取DNA，进行梨形虫检测和琼脂糖凝胶电泳。
进一步地，步骤S2中所述的引物序列为：
P-1：5＇-CGGCTACCACATCTAAGGAAGG-3＇；
P-2：5＇-CAAGGTGCTGAAGGAGTCGTAA-3＇。
进一步地，步骤S2中对检索自NCBI的泰勒虫18S rRNA基因序列进行比对的基因序列包括东方泰勒虫MH208642.1、环形泰勒虫MF287948.1、尤氏泰勒虫JF719835.1、羊泰勒虫MN493111.1、路氏泰勒虫LC326007.2、分歧巴贝斯虫MT539381.1、双芽巴贝斯虫KY805824.1、牛巴贝斯虫KP710223.1、卵形巴贝斯虫MN900525.1。
与现有技术相比，本方案的有益效果：
1、本发明的方法采用梨形虫的18S rRNA设计1对特异性引物，以阳性核酸为模板进行反应条件的优化并进行灵敏度、特异性及临床样品的检测；
2、本发明的方法灵敏、快速、简便、特异性高，能够用于梨形虫的快速检测诊断及流行病学调查。
附图说明
图1是本发明实施例中的PCR扩增结果(1为阳性样品；2为阴性对照)；
图2是本发明实施例中的梨形虫引物范围的验证(1、中华泰勒虫；2、环形泰勒虫；3、尤氏泰勒虫；4、吕氏泰勒虫；5、东方泰勒虫；6、双芽巴贝斯虫；7、莫氏巴贝斯虫；8、卵形巴贝斯虫；9、牛巴贝斯虫)；
图3是本发明实施例中的退火温度的优化(1.51℃；2.53℃；3.55℃；4.57℃；5.59℃；6.61℃；7.63℃；8.65℃；9.67℃；10.69℃；11.71℃；12.73℃；13.75℃)；
图4是本发明实施例中特异性试验(1.阳性样品；2.伊氏锥虫；3.无浆体；4.肝簇虫；5.弓形虫；6.埃立克体)；
图5是本发明实施例中梨形虫的敏感性试验(1～11依次10倍倍比稀释)；
图6是本发明实施例中PCR的临床样品检测(1-24为24份临床样品)；
图7是本发明实施例中梨形虫对照组临床样品检测(1-24为24份临床样品)。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
实施例：
以下为本发明方案的具体试验实例：
1、材料
1.1、样品来源
采集广西河池地区24只牛羊血液于抗凝管中，-20℃保存。吕氏泰勒虫、东方泰勒虫、伊氏锥虫、山羊无浆体和巴贝斯虫阳性DNA样品，均由广西大学动物科学技术学院寄生虫实验室保存，中华泰勒虫、环形泰勒虫、尤氏泰勒虫、双芽巴贝斯虫、莫氏巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫和牛巴贝斯虫DNA样品，由兰州兽医研究所寄生虫实验室惠赠。
1.2、主要试剂
Dream Taq Green PCR预混液(2×)、GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder、基因组DNA纯化试剂盒，购自Thermo Fisher Scientific公司；DL2000 Plus DNA Marker，购自南宁捷尼斯生物有限公司；质粒提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司；pMD18-T载体，购自宝生物工程大连有限公司。
2、方法
2.1引物的设计和全血DNA的提取
运用DNAStar 7.1软件对检索自NCBI的泰勒虫18S rRNA基因序列(东方泰勒虫MH208642.1，环形泰勒虫MF287948.1，尤氏泰勒虫JF719835.1，羊泰勒虫MN493111.1，路氏泰勒虫LC326007.2，分歧巴贝斯虫MT539381.1，双芽巴贝斯虫KY805824.1，牛巴贝斯虫KP710223.1，卵形巴贝斯虫MN900525.1)进行比对，运用Premier 6.0软件设计通用引物P-1和P-2(见表1)。使用基因组DNA纯化试剂盒提取24份牛羊全血DNA，于-20℃中保存，备用。
表1引物的设计
Table 1Primer design
2.2PCR的扩增
以本实验室保存的吕氏泰勒虫全血样本DNA为模板，用引物P-1/P-2进行PCR扩增，扩增体系：PCR预混液10μL，dd H2O 6μL，上下游引物各1μL，模板DNA2μL。扩增程序：94℃预变性5mi n；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸8min。
用P-1/P-2分别扩增中华泰勒虫、环形泰勒虫、尤氏泰勒虫、双芽巴贝斯虫、莫氏巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫和牛巴贝斯虫，PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，验证该引物能否扩增上述梨形虫。
2.3阳性质粒的构建
将电泳后的琼脂糖凝胶放在紫外分析仪中，把目的条带切下后放入1.5mL EP管中，之后按照DNA胶回收试剂盒的说明书进行操作，最后测量胶回收产物的浓度。将胶回收产物与pMD18-T载体连接后转化到DH-5α感受态细胞中，经过氨苄青霉素阳性LB培养基的筛选，挑取单个菌落，37℃、200r/min摇床培养3-5h，将获得的浑浊菌液使用试剂盒进行菌液提取质粒，分光光度计测其浓度，送往广州华大基因科技有限公司进行测序，鉴别其是否为目的产物，剩余质粒与甘油混合后保存备用。将鉴定正确的质粒命名为pMD-TH。
2.4退火温度的优化
在其他条件保持不变的情况下，选择51℃，53℃，55℃，57℃，59℃，61℃，63℃，65℃，67℃，69℃，71℃，73℃，75℃不同温度下用P-1/P-2进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。
2.5特异性试验
采用本研究建立优化的PCR方法，用引物P-1/P-2进行PCR扩增，扩增样品分别是本实验室所保存的梨形虫阳性样品、伊氏锥虫、无浆体、肝簇虫、弓形虫和埃立克体，扩增后进行琼脂糖凝胶电泳。
2.6敏感性试验
将抽提出的质粒使用超微量分光光度计测量浓度，以原始浓度为起始浓度，10倍倍比稀释10个稀释度，作为模板DNA进行PCR扩增，扩增后进行琼脂糖凝胶电泳。
2.7临床样品检测
将广西百色市采集的牛羊血液提取DNA，使用本研究建立的方法进行梨形虫检测和琼脂糖凝胶电泳。使用Casati,S.等设计的引物作为对照进行PCR检测和琼脂糖凝胶电泳，送往广州华大基因科技有限公司进行测序。
3、结果与分析
3.1PCR扩增
用梨形虫引物(P-1/P-2)扩增阳性样品，在600bp处有明显的特异性条带，符合预期大小，如图1所示。
梨形虫的引物(P-1/P-2)对中华泰勒虫、环形泰勒虫、尤氏泰勒虫、双芽巴贝斯虫、莫氏巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫和牛巴贝斯虫进行扩增，均得到了预期600bp大小的片段，如图2所示。
3.2最适退火温度的优化
退火温度在51℃-69℃之间进行优化，结果显示在退火温度为61℃的时候，条带最亮，扩增效果最好，故选用61℃作为最佳退火温度，如图3所示。
3.3特异性试验
使用最佳条件对梨形虫阳性样品、伊氏锥虫、无浆体、肝簇虫、弓形虫和埃立克体进行分别扩增，发现除阳性样品外，其他均无条带，其中阳性样品条带在600bp，为正确的目的条带，该结果表明该实验建立的方法特异性良好，如图4所示。
3.4敏感性试验
分光光度计测出梨形虫的质粒浓度为54.7ng/μL。将质粒样本十倍倍比稀释后进行PCR扩增，结果显示梨形虫PCR能扩增出的最低浓度为5.47ag/μL，表明该实验所建立的PCR方法敏感性良好，如图5所示。
3.5临床样品检测
将24份临床样品进行PCR扩增，检测出5份梨形虫阳性，与对照检测结果相同，如图6～图7所示，测序结果显示感染梨形虫种类为两个东方泰勒虫和四个吕氏泰勒虫，表明本实验建立的检测方法可用于临床检测。
目前，现有技术中的梨形虫的检测以巢式PCR为主，因其特异性好、灵敏度高，被广泛应用于各病原体的检测。但该方法需要时间较长，不适于大量样品的诊断。本实施例建立了一种梨形虫检测的PCR方法，将以往检测梨形虫的巢式PCR方法的时间减半。通过特异性实验、敏感性实验和临床样品的检测，证实本实施例建立的PCR方法灵敏度高、特异性好且具有重复性，能够用于临床样品的检测。
此外，本实施例所建立的PCR检测方法在检测阳性样品时有明显目的条带，与伊氏锥虫、无浆体、肝簇虫、弓形虫和埃立克体均无交叉反应，且对梨形虫DNA的最低检测量分别为5.47ng/μL，表明特异性良好且敏感性较高，重复性高，能够用于临床检测和流行病学调查。
以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (3)
1.一种梨形虫PCR的检测方法，其特征是：包括以下步骤：
S1、样品采集：采集24只牛羊的血液共24份分别置于抗凝管中，并将其于-20℃保存；
S2、引物的设计及全血DNA的提取：
A、采用DNAStar7.1软件对检索自NCBI的泰勒虫18S rRNA基因序列进行比对，然后采用Premier6.0软件设计通用引物P-1和P-2；
B、使用基因组DNA纯化试剂盒提取步骤S1中所述的24份牛羊血液的全血DNA，并将其于-20℃中保存，备用；
S3、PCR的扩增：
1)以吕氏泰勒虫全血样本DNA为模板，采用引物P-1/P-2进行PCR扩增，其中，扩增体系为：PCR预混液10μL，dd H2O 6μL，上、下游引物各1μL，模板DNA2μL；扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸8min；
2)用引物P-1/P-2分别扩增中华泰勒虫、环形泰勒虫、尤氏泰勒虫、双芽巴贝斯虫、莫氏巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫和牛巴贝斯虫，并将PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，验证所述引物能否扩增梨形虫；
S4、阳性质粒的构建：
将步骤S3中电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外分析仪中，并将目的条带切下后放入1.5mL的EP管中，然后进行DNA胶回收试剂盒的操作，最后测量胶回收产物的浓度；并将胶回收产物与pMD18-T载体连接后转化到DH-5α感受态细胞中，经过氨苄青霉素阳性LB培养基的筛选，挑取单个菌落，并将其于37℃、200r/min摇床培养3-5h，将获得的浑浊菌液使用试剂盒进行菌液提取质粒，分光光度计测其浓度，并进行测序，鉴别其是否为目的产物，剩余质粒与甘油混合后保存备用；将鉴定为目的产物的质粒命名为pMD-TH；
S5、根据步骤S1-步骤S4,对采集的牛羊血液临床样品提取DNA，进行梨形虫检测和琼脂糖凝胶电泳。
2.如权利要求1所述的一种梨形虫PCR的检测方法，其特征是：步骤S2中所述的引物序列为：
P-1：5＇-CGGCTACCACATCTAAGGAAGG-3＇；
P-2：5＇-CAAGGTGCTGAAGGAGTCGTAA-3＇。
3.如权利要求1所述的一种梨形虫PCR的检测方法，其特征是：步骤S2中对检索自NCBI的泰勒虫18S rRNA基因序列进行比对的基因序列包括东方泰勒虫MH208642.1、环形泰勒虫MF287948.1、尤氏泰勒虫JF719835.1、羊泰勒虫MN493111.1、路氏泰勒虫LC326007.2、分歧巴贝斯虫MT539381.1、双芽巴贝斯虫KY805824.1、牛巴贝斯虫KP710223.1、卵形巴贝斯虫MN900525.1。
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