CN104561343B

CN104561343B - 区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的引物及试剂盒

Info

Publication number: CN104561343B
Application number: CN201510035284.2A
Authority: CN
Inventors: 刘爱红; 刘军龙; 关贵全; 谢俊仁; 罗建勋; 殷宏
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2015-01-24
Filing date: 2015-01-24
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2035-01-24
Also published as: CN106434861A; CN106434860A; CN104561343A

Abstract

本发明公开一种可区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的引物及检测试剂盒。本发明的引物序列和试剂盒内的引物分别为：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5的引物和探针引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.6。使用本发明进行检测具有灵敏度高、速度快、特异性强等优点，可在病原体的定性和定量检测方面得到了广泛应用。

Description

区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测动物寄生虫的引物对及试剂盒。确切讲，本发明涉及一种可区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的引物及检测试剂盒。

背景技术

现已报道的巴贝斯虫有100多个种，其中命名并被公认感染羊的巴贝斯虫有绵羊巴贝斯虫（B.ovis）、莫氏巴贝斯虫（B.motasi）、粗糙巴贝斯虫（B.crassi）和一些巴贝斯虫未定种。绵羊巴贝斯虫由扇头蜱属（Rhipicephalus）的硬蜱传播，是强致病性的小型巴贝斯虫，其生物学特性与牛巴贝斯虫基本一致；粗糙巴贝斯虫是一种致病力低的大型巴贝斯虫，以四***或二***的方式进行繁殖，其传播媒介蜱和传播方式尚不清楚，目前仅在伊朗和土耳其发现；而莫氏巴贝斯虫是感染羊的巴贝斯虫中分布最为广泛、分类特征最为复杂的虫体，其致病性因其分布的不同而不同，如在南欧和地中海沿岸分离的具有较强的致病性，而在北欧分离的致病性较弱，且这两种莫氏巴贝斯虫均是由刻点血蜱（Haemaphysalispunctata）传播的大型巴贝斯虫，在非洲撒哈拉沙漠分离的莫氏巴贝斯虫，形态上介于已知的莫氏巴贝斯虫和绵羊巴贝斯虫之间，但其传播媒介不是血蜱属的蜱。依据巴贝斯虫的致病性、对绵羊和山羊感染力的差异、形态学、血清学和分子分类进化关系分析结果，Uilenberg (2006)认为莫氏巴贝斯虫中至少含有两个或两个以上的种或亚种。

我国在1996年以前，只有2-3例羊巴贝斯虫病的报道，而后分别在甘肃、河北、辽宁、云南、山西、河南和新疆等地出现发病的报道。本病的流行范围呈逐年扩大趋势，可能与媒介蜱分布范围的广泛有一定关系。本研究团队于上世纪末开始，对我国部分省区羊巴贝斯虫病的发生进行了选点调查。通过血液接种和蜱传播实验，先后在我国辽宁、河北、甘肃、湖北、新疆等地分离获得了9株羊的巴贝斯虫地方株。流行病学调查发现该病在我国流行广泛，一些地方危害严重，阳性率在30%以上，病原对外地引进的良种羊和羔羊致病性较强，严重制约羊的品种改良和养羊业的发展。以梨形虫（包括巴贝斯虫和泰勒虫）的核糖体18SrRNA基因进行分子分类研究发现，甘肃临潭、麻当、天祝和宁县以及河北、湖北和辽宁的分离株均与莫氏巴贝斯虫有较近的亲缘关系，所以定名为莫氏巴贝斯虫(Liu et al.,2007;Guan et al., 2009)，而以核糖体28S rRNA和转录间隔区ITS基因、线粒体CoI基因等进行分子分类的研究中发现:中国的莫氏巴贝斯虫又可分为两个亚支；一是低致病性的莫氏巴贝斯虫临潭株和莫氏巴贝斯虫天祝株，二是高致病性的莫氏巴贝斯虫宁县株和莫氏巴贝斯虫河北株(Niu et al., 2009a)。2010 年，Guan 等(Guan et al., 2010e)证实莫氏巴贝斯虫临潭株全虫抗原与莫氏巴贝斯虫天祝株感染绵羊的阳性血清有强烈的交叉反应，而与莫氏巴贝斯虫宁县株和河北株的阳性血清没有交叉反应。这些结果与 Uilenberg 的结论相符：中国的莫氏巴贝斯虫也可能至少存在两个不同的亚种。经传播实验证实，莫氏巴贝斯虫不同亚种之间的传播媒介也不相同，有些亚种的传播媒介目前尚未研究清楚。

人的巴贝斯虫病最早报道于1960年，主要由两种感染人的巴贝斯虫病病原—田鼠巴贝斯虫（B.microti）和分歧巴贝斯虫(B.divergens)引起，患者常伴有严重贫血、间歇高热、肌肉酸痛、抽搐等并发各种综合症，严重感染时可引起死亡。近年的研究表明以前不感染人的巴贝斯虫，由于虫媒分布范围的不断广泛,携带人巴贝斯虫致病性病原的宿主范围也在扩大，新的人巴贝斯虫致病性病原在不断出现（Schnittger L,et al., 2012），该病已逐步成为一种世界性的人类新发寄生虫病受到公众关注。据目前文献记载，现主要有四大类巴贝斯虫具有***共患的能力，第一类为田鼠巴贝斯虫，它是一种与啮齿类动物密切相关的***共患寄生虫，美国大部分人感染巴贝斯虫病例都是由其造成的；第二类为新命名的B.duncani，形态类似田鼠巴贝斯虫，但是二者亲缘关系较远；第三类包括分歧巴贝斯虫（B.divergence）和类分歧巴贝斯虫、B.venatorum（也被称为ＥＵ１）；第四类为韩国新发现的巴贝斯虫ＫＯ１型，与中国的莫氏巴贝斯虫河北株病原形态很相似，分子分类分析表明两者的同源性高达98%，且核苷酸序列只差13个碱基。

现阶段，我国主要存在两个种的羊巴贝斯虫—莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株。然而莫氏巴贝斯虫不同地方分离株之间，由于其致病性、传播媒介和血清学存在一定差异，结合分子分类学表明莫氏巴贝斯虫存在两个不同的亚种，即低致病性的莫氏巴贝斯虫亚种，如临潭株和天祝株；高致病性的莫氏巴贝斯虫亚种，如宁县株和河北株。

巴贝斯虫检测的金标准是采用血涂片染色镜检的方式，但血涂片染色镜检结果受到很多因素的影响，检出率低，准确性较差。常规 PCR、套式PCR以及基于SYBR Green染料的实时荧光PCR等核酸方法虽有应用，但常规 PCR 存在灵敏度低，特异性差，检测周期长等缺点；套式PCR 灵敏度高，但两步的PCR 反应繁琐、易污染，不适用于大规模的流行病学调查。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足，能区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的引物及试剂盒。

本发明的区分检测低致病性莫氏巴贝虫的引物对基因序列为：SEQ ID No.1和SEQID No.2；区分检测高致病性莫氏巴贝虫的引物对基因序列为：SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5。

本发明的区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的试剂盒内包括序列为：SEQID No.1、SEQ ID No.2 、SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5的引物和探针引物 SEQ ID No.3和SEQ ID No.6。

为方便使用，本发明的区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的试剂盒内还有：标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-18S rRNABLT和pGEM-Teasy-18S rRNABNX。

本发明的区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的试剂盒进行PCR扩增的条件是：

用本发明的引物及试剂盒进行扩增的条件是：

低致病性的莫氏巴贝斯虫PCR扩增的条件是：95℃预变性30s，然后95℃ 5s、58℃10s、72℃ 30s，40个循环；

高致病性的莫氏巴贝斯虫PCR扩增的条件是：95℃预变性30s，然后95℃ 5s、60℃10s、72℃ 30s，40个循环。

本发明在具体应用时建议应有如下三部分组成：1）特异性检测低致病性的莫氏巴贝斯虫亚种的标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-18S rRNABLT、正向引物SEQ ID No.1和反向引物SEQ ID No.2（10μΜ）各0.5μL，荧光探针SEQ ID No.3（5μM）1.0μL；2）特异性检测高致病性的莫氏巴贝斯虫亚种的标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-18S rRNABNX、正向引物SEQ IDNo.4和反向引物SEQ ID No.5（10μΜ）各0.5μL，荧光探针SEQ ID No.6（5μM）1.0μL；3）适用于两种检测方法的公用试剂荧光定量PCR反应液、阴性质控标准品。其中的荧光定量PCR反应液由Premix Ex TaqTM（2×）12.5μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.5μL，灭菌蒸馏水8.0μL。

本发明是一种TaqMan实时荧光定量PCR技术。荧光PCR技术敏感性高、特异性强、检测速度快。 TaqMan探针荧光定量PCR技术是在PCR扩增加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在 DNA任意一条单链上； PCR 扩增时，Taq 酶的 5 ’ 到3 ’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测***可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该方法敏感性高、特异性强、检测周期短，与常规 PCR 相比，不存在交叉污染和核酸染料对人体的危害等缺点，近年来逐渐应用于各种病原体的检测。

本发明是以梨形虫（包括泰勒虫和巴贝斯虫）核糖体18S rRNA为靶标，发掘适合作为病源鉴别诊断的靶基因18S rRNA，建立能同时在动物宿主和自然媒介蜱体内区分我国现存的莫氏巴贝斯虫不同亚种，即低致病性的莫氏巴贝斯虫临潭、天祝株和高致病性的莫氏巴贝斯虫宁县、河北株的TaqMan实时荧光定量PCR诊断技术。该技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点，可在病原体的定性和定量检测方面得到了广泛应用。且该方法是在封闭体系中进行扩增和实时检测,避免了环境污染,缩短了检测时间,尤其适用于急性及亚临床感染的大批量样品的检测与诊断。

附图说明

图1 低致病性的莫氏巴贝斯虫亚种实时荧光定量PCR特异性扩增曲线。

图2 高致病性的莫氏巴贝斯虫亚种实时荧光定量PCR特异性扩增曲线。

具体实施方式

1.构建重组质粒标准品。

（1）根据感染羊的莫氏巴贝斯虫临潭株核糖体18S rRNA基因序列，使用Primerpremier 5.0和Oligo 7设计引物，预获得的目的片段大小分别是莫氏巴贝斯虫亚种临潭株661bp和莫氏巴贝斯虫亚种宁县株666bp,由宝生物生物工程（大连）有限公司合成。引物对序列为：BLTC-S（正向引物）：5’-AGAAACGGCTACCACATC-3’ SEQ ID No.7，BLTC-AS（反向引物）： 5-CTTGCGACCATACTCCC-3’ SEQ ID No.8。

（2）以实验室保存的莫氏巴贝斯虫亚种临潭株和莫氏巴贝斯虫亚种宁县株的DNA为模板进行扩增，采用50μL的PCR反应体系，反应条件为94℃预变性4min，然后94℃1min、56℃1min、72℃1min，30个循环，72℃延伸7min。取5μL扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的PCR产物用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒（TaKaRa，大连）进行纯化回收，将回收产物连接到pGEM-Teasy载体（Promega，America）后转化到大肠杆菌感受态细胞JM-109（TaKaRa，大连）中，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆（白班）进行PCR和测序鉴定。

（3）对鉴定为阳性的克隆提取质粒，使用NanoDrop 2000/2000C（ThermoScientific，America）超微量分光光度计测定质粒浓度，并将其换算成拷贝/μL，以此作为质粒标准品。将构建好的质粒标准品，系列稀释为终浓度为1.0×10⁹ -1.0×10⁰拷贝/μL,以便进行实时荧光定量PCR扩增。

2.实时荧光定量PCR方法

（1）反应性分析

1）低致病性的莫氏巴贝斯虫亚种临潭、天祝株:定量PCR反应体系为25μL：PremixEx Taq^TM（2×）12.5μL ，正向引物SEQ ID No.1和反向引物SEQ ID No.2（10μΜ）各0.5μL，荧光探针SEQ ID No.3（5μM）1.0μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.5μL，基因组DNA模板2μL，灭菌蒸馏水8.0μL。反应条件为：95℃预变性30s，然后95℃ 5s、58℃ 10s、72℃ 30s，45个循环。

2）高致病性的莫氏巴贝斯虫亚种宁县、河北株:定量PCR反应体系为25μL：PremixEx Taq^TM（2×）12.5μL ，正向引物SEQ ID No.4和反向引物SEQ ID No.5（10μΜ）各0.5μL，荧光探针SEQ ID No.6（5μM）1.0μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.5μL，基因组DNA模板2μL，灭菌蒸馏水8.0μL。反应条件为：95℃预变性30s，然后95℃ 5s、60℃ 10s、72℃ 30s，45个循环。在1）与2)的反应体系当中，在每一个循环的延伸温度结束时设定荧光信号采集点进行实时检测，每个模板浓度做3个重复，取平均值计算变异系数，实验均设阴性对照。其结果显示：模板量与对应的Ct值呈线性相关，扩怎曲线呈S型。

（2）特异性分析

1)低致病性的莫氏巴贝斯虫亚种临潭、天祝株:利用上述所建立的实时荧光定量PCR方法，每个样品重复三次分别检测莫氏巴贝斯虫亚种临潭株和天祝株；同时设莫氏巴贝斯虫亚种宁县株和河北株、羊巴贝斯虫未定种新疆株、羊的吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、绵羊无浆体、干净羊基因组和灭菌水为阴性对照。结果显示:只有1-莫氏巴贝斯虫亚种临潭株、2-莫氏巴贝斯虫亚种天祝株呈阳性反应，莫氏巴贝斯虫亚种宁县株和河北株，羊巴贝斯虫未定种新疆株、羊的其它相关病原和水均呈阴性（图1）。

2)高致病性的莫氏巴贝斯虫亚种宁县、河北株:利用上述所建立的实时荧光定量PCR方法，每个样品重复三次检测莫氏巴贝斯虫亚种宁县株和河北株，同时设莫氏巴贝斯虫亚种临潭株和天祝株，羊巴贝斯虫未定种新疆株；羊的吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、绵羊无浆体、干净羊基因组和灭菌水为阴性对照。结果显示:只有1-莫氏巴贝斯虫亚种宁县株和2-莫氏巴贝斯虫亚种河北株呈阳性反应，而莫氏巴贝斯虫亚种临潭株、天祝株，羊巴贝斯虫未定种新疆株和羊的其它相关病原和水均呈阴性（图2）。

（3）稳定性与重复性分析

就不同的检测方法而言，进行分析时所选浓度亦不同；对低致病性的莫氏巴贝斯虫亚种临潭、天祝株，取浓度为1.0×10⁹ -1.0×10⁷ 拷贝/μL的3个浓度的标准品进行稳定性分析；对高致病性的莫氏巴贝斯虫亚种宁县、河北株，取浓度为1.0×10⁹ -1.0×10⁸ 拷贝/μL的2个浓度的标准品进行稳定性分析。两种方法均先进行批内重复性试验，对同一批次稀释的标准品，每个浓度重复检测四次，分析Ct值的变异系数。然后再进行批间重复性试验，对3个不同批次的稀释的标准品进行检测，经分析Ct值变异系数来判定其稳定性。反复重复这两个实验三次，获得的数据差异无显著意义，说明其不同批次之间的检测结果具有其可比性，具有良好的重复性。

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的引物及试剂盒

<160> 8

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（正向引物 OBLMT-S）

<400>

tgccggttca tgaatttg 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（反向引物 OBLMT-AS）

<400>

gcaagtcata ctgcgtatc 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（探针引物 OBLMT-Prob）

<400>

ctgcgtcctt catcgttgtg t 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（正向引物 OBHN-S）

<400>

aggcagtaat tgctaagtg 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（反向引物 OBLMT-AS）

<400>

gcgaaaccaa atggtaatc 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（探针引物 OBHN-Prob）

<400>

cgctcactaa tggagaccgc 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（正向引物 BLTC-S）

<400>

agaaacggct accacatc 18

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（反向引物 BLTC-AS）

<400>

cttgcgacca tactccc 17

Claims

1.区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的试剂盒，其特征在于试剂盒内包括序列为：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2 、SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5的引物和两个探针：SEQ IDNo.3和SEQ ID No.6。