CN114480682A - 一种检测结核分枝杆菌的组合物、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种检测结核分枝杆菌的组合物、试剂盒及其应用。包括针对结核分枝杆菌保守序列的RAA引物和结核分枝杆菌特异性crRNA；所述crRNA序列包括如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中的任一种所示。本发明利用crRNA的特异性有效保证对细菌特征序列核酸检测的正确度，且37℃下1小时内即可通过荧光或试纸确定样品中是否存在MTB。本发明可方便快速地对MTB进行检测，且不需要复PCR仪器等复杂设备，只需要一个恒温装置及简易荧光检测装置即可快速获得可观测的结果，为MTB的检测提供更低成本，更加快速方便的检测方法，对于MTB感染的早期监测与防控有重要的意义。

Description

一种检测结核分枝杆菌的组合物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种检测结核分枝杆菌的组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是一种可以通过气溶胶传播引起人畜共患病的细菌，据《2021年全球结核病报告》显示，全球约有20亿人感染结核分枝杆菌，990万人患有结核病，其中印度、中国和俄罗斯负担最重，中国作为全球耐多药结核病负担第二大的地区，开发新型抗结核药物和研究结核分枝杆菌耐药机制成为中国防治结核病的重点工作。

由于结核分枝杆菌生长缓慢，目前传统的结核病检测及耐药检测方法耗时长达数月，而相对快速的方法需要复杂仪器或进口试剂，以上因素极大的阻碍了我国对结核病的有效防控。CRISPR全称Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成簇的规律间隔的短回文重复序列，是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族。近些年来，CRISPR/Cas***被开发成了进行基因编辑的强大工具，可以对基因进行定点的精确编辑。我们利用CRISPR/Cas***建立了结核分枝杆菌特异性检测方法，同时联合重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification，RAA)提高检测***的灵敏度，实现检测信号的“两级”放大化。

2020年全球结核病患者登记数较2019年下降了18％，由710万例降至580万例。此外，新冠肺炎大流行也导致接受治疗的耐多药/利福平耐药结核病患者数下降了15％，接受预防性治疗的患者下降了22％，用于结核病预防诊断和治疗服务的费用下降了9％，由于基本结核病服务中断，估计造成了2020年全球结核病死亡的患者数约增加了10万例，所以快速、精确、价格适宜的结核分枝杆菌检测技术亟待开发。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是克服现有MTB早期监测防控技术的缺陷和不足，提供一种高灵敏度、高特异性、操作方法简单、快速、精准检测MTB的组合及试剂盒，无需昂贵仪器设备和专业标准实验室，实现MTB的监测与防控。

本发明为实现上述目的采用的技术方案是：一种检测结核分枝杆菌的组合物，包括针对结核分枝杆菌保守序列的RAA引物和结核分枝杆菌特异性crRNA；

所述crRNA序列包括如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中的任一种所示。

进一步的，所述引物包括如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列，或所述引物包括如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的序列。

本发明还包括一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，包括上述的检测结核分枝杆菌的组合物。

进一步的，还包括Cas12a蛋白、报告单链DNA分子探针。

进一步的，所述Cas12a蛋白为LbCas12a；所述报告单链DNA分子探针序列为：5′-FAM-TTTTTT-BHQ1-3′。

进一步的，还包括RAA扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系试剂；

本发明还包括上述的检测结核分枝杆菌的组合物在开发和/或制备具有结核诊断和/或预后评估用途的产品中的应用。

本发明还包括一种检测结核分枝杆菌的试纸条，包括上述的检测结核分枝杆菌的组合物和/或利用上述的试剂盒中的组分构建得到。

本发明还包括一种非诊断治疗目的的检测结核分枝杆菌的方法，包括如下步骤：

(1)取待测样品，提取MTB基因组；

(2)RAA等温扩增：以上述的引物，通过RAA方法扩增步骤(1)中得到的基因组；

(3)CRISPR/Cas12a检测：取步骤(2)中的扩增产物，加入报告单链DNA分子探针、Cas12a蛋白和上述的crRNA，进行CRISPR/Cas12a检测，并读取检测信号。

进一步的，所述方法能够区分出10⁶CFU/mL、10⁷CFU/mL MTB荧光值梯度的RAA扩增时间。

本发明一种检测结核分枝杆菌的组合物、试剂盒及其应用的有益效果是：

本发明筛选到效果最好的crRNA，使本发明建立的方法灵敏度进一步提高。CRISPR/Cas12a检测方法的核心在于crRNA，故crRNA与灵敏度、精准度直接相关。在4个crRNA中，通过CRISPR/Cas12a检测，crRNA2反应速度最快，荧光值最高，效果最好，灵敏度最高。

本发明建立的CRISPR/Cas***联合RAA等温扩增技术能够实现对病原菌快速筛查，除了能够利用酶标仪等仪器进行精确检测外，还能利用试纸条方法进行辅佐验证，操作简便，能够实现结核分枝杆菌的快速检测，具有非常广阔的市场前景和社会效益。

附图说明

图1为本发明实施例4条crRNA对MTB进行CRISPR/Cas12a检测30min荧光值测定结果图；

图2为本发明实施例对7种不同的菌株进行CRISPR/Cas12a检测的荧光值测定结果图；

图3为本发明实施例对不同浓度样本分别进行RAA扩增30min后进行CRISPR/Cas12a检测的荧光值测定结果；

图4为本发明实施例CRISPR/Cas12a检测体系中Cas12a蛋白、crRNA、探针最佳终浓度的荧光值测定结果；

图5为本发明实施例对2-15min RAA扩增时间，对10⁶CFU/mL、10⁷CFU/mL的MTB分别进行CRISPR/Cas12a***检测的荧光值测定结果图；

图6为本发明实施例对不同浓度的RAA扩增产物进行试纸条验证的结果图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

针对结核分枝杆菌保守序列的RAA引物和结核分枝杆菌特异性crRNA：

CRISPR/Cas12a检测方法的核心在于crRNA，故crRNA质量与检测方法灵敏度、精确度直接相关。为了筛选效率更高的crRNA，针对MTB两个保守序列IS6110、IS1081设计了2条crRNA(表1)。

表1crRNA

实施例2：

针对结核分枝杆菌保守序列的RAA引物和结核分枝杆菌特异性crRNA：

CRISPR/Cas12a检测方法的核心在于crRNA，故crRNA质量与检测方法灵敏度、精确度直接相关。为了筛选效率更高的crRNA，针对MTB两个保守序列IS6110、IS1081选取了2条crRNA(表2)，引物序列为表3。

表2 crRNA

表3引物序列

实施例3：

RAA等温扩增和CRISPR/Cas12a检测MTB方法的建立

1、提取MTB基因组

采用水煮裂解法提取MTB基因组。

2、RAA等温扩增

表4 RAA扩增体系

2.1向装有反应干粉的检测单元管中加入41.5μL A Buffer、2.0μL上游引物(10μM)、2.0μL下游引物(10μM)；

2.2向检测单元管中加入2.0μL经步骤1处理得到的待测DNA样本；

2.3再向检测单元管盖上加入2.5μL的B Buffer，盖上管盖，上下颠倒充分混匀5-6次，低速离心10sec(注：本步骤“是否充分混匀”将决定实验结果的重复性)；

2.4将检测单元管放入39℃恒温金属浴(或恒温水浴锅、恒温培养箱等)中，孵育30min。

2.5反应结束后，取5-10μL反应体系进行电泳检测。

3、RAA反应条件：反应体系为50μL体系，反应温度为39℃，恒温孵育30min。

4、CRISPR/Cas12a检测MTB方法的建立

4.1.操作步骤

4.1.1取出Cas12a蛋白、crRNA、F-Q探针、10×C buffer、H₂O于冰上缓缓解冻；

4.1.2分别取2μL Cas12a蛋白、crRNA、F-Q探针、10×C buffer加入体系中，充分混合；

4.1.3加入7μL H₂O于上述试剂混合液中；

4.1.4加入5μL RAA扩增产物补充反应体系至20μL；

4.1.5将混合后的样品放入荧光定量PCR仪中，37℃恒温反应，实时监测荧光信号(注：整个CRISPR反应需要避光进行，冰上操作，以保护各种成分的活性)；

4.2.CRISPR反应条件：反应体系为20μL体系，反应温度为37℃，恒温扩增1h，每隔1min进行一次荧光信号采集。

4.3.体系和浓度

所述CRISPR/Cas12a检测体系如下：

表5 CRISPR/Cas12a检测体系

本发明将CRISPR/Cas***联合RAA等温扩增技术“两级放大”反应用于结核分枝杆菌的检测。通过RAA等温扩增与Cas12a蛋白的偶联，能够实现“序列扩增”(RAA完成)加上“酶促级联”(Cas酶完成)的两级放大，从而超越qPCR这种单级扩增的灵敏度，同时因RAA等温扩增和CRISPR/Cas***的高效性，缩短了检测的时间，其超高的特异性与灵敏度使得直接对结核分枝杆菌进行检测成为可能。

实施例4：

一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，包括针对结核分枝杆菌保守序列的RAA引物、结核分枝杆菌特异性crRNA、Cas12a蛋白、报告单链DNA分子探针和RAA扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系试剂。

所述Cas12a蛋白为LbCas12a；所述报告单链DNA分子探针序列为：5′-FAM-TTTTTT-BHQ1-3′。

RAA扩增体系为表4所示，CRISPR/Cas12a检测体系为表5所示。

试剂盒的检测方法如实施例3所示。

当MTB核酸与Cas12a、crRNA形成三元复合体时，该复合物中Cas12a的RuvC结构域行使DNase活性，切割带荧光信号标记的单链DNA(ssDNA reporter)，通过检测荧光即可得知待检样品中是否含有MTB核酸。基于此，本发明构建了一种基于CRISPR/Cas12a联合RAA等温扩增的快速精准检测MTB的试剂盒，设计了精准度最高、效率最高、灵敏度最高的优质crRNA，保证了MTB检测效果。

本发明针对检测方法，设计和制作简单的检测试剂盒与器械设备。本发明所建立的检测方法除了可以利用实时荧光定量PCR仪进行精确定量外，还可以设计出依赖手机摄像头的APP等，同时开发出结核分枝杆菌检测试剂盒，实现便携式快速定性检测。

实施例5：

一种检测结核分枝杆菌的试纸条。包括实施例1或2检测结核分枝杆菌的组合物和/或利用实施例4的试剂盒中的组分构建得到。

试纸条的制备：试纸条包括吸样区、FAM抗体结合区、生物素亲和素结合区(质控线，C线)、FAM抗体捕获区(检测线，T线)、吸收垫五个部分。将所有垫片进行预处理后，沿硝化纤维膜的胶粘部分一次组装，重叠2mm，然后切成0.4cm宽的条，室温干燥保存备用。

试纸条快速检测：

1.操作步骤

1.1根据检测样品数量取出相应数量的试纸条，并在吸收垫上做好标记。每根试纸条只能用于单次、单个样品的检测；

1.2 CRISPR反应结束后，打开反应管，将试纸条吸样区端***反应管，液面不得超过结合区最上端，待判读区全部浸润(约需1-2min，外界环境温度较低时，会降低吸水速度，判读区浸润时间将会延长)，待质控线(C线)显色后，可以将试纸条拿出。根据试纸条显色情况直接读取检测结果；

1.3质控线(C线)显色后10min内观察结果，10min后判读无效；

1.4记录检测结果，将试纸条密封丢弃在安全处。

2.推荐体系和浓度如表5所示，切割反应于37℃恒温条件下反应30min即可。

本发明建立了低成本纸层析法试纸条快速检测。利用Cas12a蛋白的反式切割作用，设计由FAM、Biotin双标记探针(F-B探针)，1h内即可得到精确的检测结果。更重要的是，试纸条成本低廉，为感染率较高的广大发展中国家和经济不发达的地区的结核分枝杆菌感染预警提供了可能。

实施例6：

筛选出效率最高的crRNA

对MTB采用水煮裂解法提取核酸。再按实施例3中RAA扩增方法和条件，进行RAA扩增。最后按照实施例3中CRISPR/Cas12a检测MTB方法和条件进行反应，反应体系中crRNA分别用实施例1和2的4个crRNA，反应时间为30min，反应结束后用实时荧光定量PCR仪读取荧光值。

结果如图1所示：在反应时间30min后，IS6110-crRNA2的反应速度最快，荧光值相对较高，说明在4条crRNA中，这一条效果最好。

实施例7：

CRISPR/Cas12a检测MTB特异性

实验材料：人结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌，购买于北京科展生物科技有限公司。

水煮裂解法分别提取以上菌株的基因组，再按实施例3中RAA扩增方法和条件，进行RAA扩增。最后按照实施例3中CRISPR/Cas12a检测MTB方法和条件进行反应，反应结束后用实时荧光定量PCR仪读取荧光值。

结果如图2所示：耻垢分枝杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌荧光值极低，而两种结核分枝杆菌荧光值在200以上，且与其余五种菌株有极显著差异(P＜0.0001)。以上结果表明，本发明构建的检测MTB方法具有很强的特异性，与其他核酸无交叉反应。

实施例8：

CRISPR/Cas12a检测MTB灵敏度

将菌株培养至10⁷CFU/mL，然后将菌株进行等比稀释一千万倍至10⁰CFU/mL，得到8组不同浓度的菌液。将八组菌液分别进行水煮法提基因组，再按实施例3中RAA扩增方法和条件，进行RAA扩增。最后按照实施例4中CRISPR/Cas12a检测MTB方法和条件进行反应，反应结束后用实时荧光定量PCR仪读取荧光值。

结果如图3所示：随着浓度十倍的增加，荧光曲线依次增高，通过测定的荧光信号值做出荧光强度相对于靶序列浓度的标准曲线计算出CRISPR/Cas***对于结核分枝杆菌的检测线为10¹CFU/mL的结核分枝杆菌，表现出极高的灵敏度。

实施例9：

CRISPR/Cas检测***各成分的最佳终浓度

对CRISPR体系中的三种成分(Cas12a蛋白、crRNA、F-Q探针)进行最佳终浓度的探究。提取10⁶CFU/mL的菌株基因组再按实施例3中RAA扩增方法和条件，进行RAA扩增。最后按照实施例3中CRISPR/Cas12a检测MTB方法和条件进行反应，反应结束后用实时荧光定量PCR仪读取荧光值。

结果如图4所示：可以看到，在Cas12a蛋白终浓度为200nM、crRNA终浓度为200nM，F-Q探针终浓度为500nM时，所得的荧光信号值最高。

实施例10：

不同RAA扩增时间对CRISPR/Cas***检测荧光值的影响

因RAA扩增效率较高，对于高浓度的基因组扩增30min就能得到CRISPR/Cas***无法区别荧光值梯度的扩增产物，如实施例8所述的图3，10⁶CFU/mL、10⁷CFU/mL的MTB进行RAA扩增30min后，是无法通过CRISPR/Cas***测得的荧光值进行区分的。故为解决梯度区分问题，对10⁶CFU/mL、10⁷CFU/mL的MTB分别进行2-15min RAA扩增。最后按照实施例3中CRISPR/Cas12a检测MTB方法和条件进行反应，反应结束后用实时荧光定量PCR仪读取荧光值。

图5所示，A-H分别为RAA扩增进行2、3、4、5、6、9、12、15min的荧光检测结果。RAA反应2min、3min时，二者均特异性扩增；RAA反应4min、5min时，二者可以通过CRISPR/Cas***区分；RAA反应6-15min时，二者都较高效率的特异性扩增，但无法区分出梯度。

实施例11：

试纸条验证

利用试纸条法进行辅佐验证。按照实施例5中的操作步骤进行，设计FAM-Biotin双标记探针，通过Cas12a反式切割作用，探针被切割，依次流经FAM抗体结合区、亲和素结合区(质控线)、FAM抗体捕获区(检测线)。若是阳性，检测线因捕获了已被切割的FAM抗体而出现红色条带；若是阴性，FAM与Biotin未分离，一起停滞在生物素亲和素结合区，不会达到显检测线，故而检测线无红色条带；若试纸条中没有任何条带显色，则判定无效。

结果如图6所示：针对不同浓度的目的片段进行验证，可以看到试纸条都显示出明显的检测线，阴性对照(NC)的检测线不显色，说明试纸条方法检测也具有较高的特异性与灵敏度。试纸条检测1h内可获得精确的结果，操作较为简单，针对一些检测设施不够完善的检测机构来讲，对于结核分枝杆菌的初步筛查是非常有帮助的。

上述实施例中引物由广州艾基生物技术有限公司合成；crRNA、报告单链DNA分子探针由广州博徕斯生物科技股份有限公司合成；Cas12a蛋白购自广州博徕斯生物科技股份有限公司。

上述实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

上述实施例的统计学分析：所有实验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用T检验分析。所有统计分析均采用P＜0.0001作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为GraphPad Prism 8。

在本发明的制备方法中，各种材料的加成顺序和具体反应步骤可由本领域技术人员进行调整，不仅适用于实验室的小规模制备，也适用于化工厂的工业化大规模生产。在工业批量生产中，具体反应参数可由本领域技术人员通过实验确定。

若无特殊说明，上述实施例中所用到的试剂、材料等，均可从商业途径获到或由商业途径所获原料合成。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 潍坊医学院

<120> 一种检测结核分枝杆菌的组合物、试剂盒及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uaauuucuac uaaguguaga uaucagcucg gucuuguaua g 41

<210> 2

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

uaauuucuac uaaguguaga uaaccagucg acccagcgcg c 41

<210> 3

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

uaauuucuac uaaguguaga ugaccaggcg cuccauccgg c 41

<210> 4

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uaauuucuac uaaguguaga uccggacugg cugcugcagc g 41

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtcggaagc tcctatgaca atgcactagc c 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgagcgtag taggcagcct cgagttcgac 30

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccaagctgcg ccagggcagc tatttcccgg ac 32

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttggccatga tcgacacttg cgacttgga 29

Claims (10)

1.一种检测结核分枝杆菌的组合物，其特征在于：包括针对结核分枝杆菌保守序列的RAA引物和结核分枝杆菌特异性crRNA；

所述crRNA序列包括如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中的任一种所示。

2.根据权利要求1所述的检测结核分枝杆菌的组合物，其特征是：所述引物包括如SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列，或所述引物包括如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的序列。

3.一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-2任一项所述的检测结核分枝杆菌的组合物。

4.根据权利要求3所述的检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征是：还包括Cas12a蛋白、报告单链DNA分子探针。

5.根据权利要求4所述的检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于：所述Cas12a蛋白为LbCas12a；所述报告单链DNA分子探针序列为：5′-FAM-TTTTTT-BHQ1-3′。

6.根据权利要求3所述的检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于：还包括RAA扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系试剂。

7.根据权利要求1-2任一项所述的检测结核分枝杆菌的组合物在开发和/或制备具有结核诊断和/或预后评估用途的产品中的应用。

8.一种检测结核分枝杆菌的试纸条，其特征在于：包括权利要求1-2任一项所述的检测结核分枝杆菌的组合物和/或利用权利要求3-6任一项所述的试剂盒中的组分构建得到。

9.一种非诊断治疗目的的检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取待测样品，提取MTB基因组；

(2)RAA等温扩增：以权利要求1-2任一项中的引物，通过RAA方法扩增步骤(1)中得到的基因组；

(3)CRISPR/Cas12a检测：取步骤(2)中的扩增产物，加入报告单链DNA分子探针、Cas12a蛋白和权利要求1-2任一项中的crRNA，进行CRISPR/Cas12a检测，并读取检测信号。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法能够区分出10⁶CFU/mL、10⁷CFU/mL MTB荧光值梯度的RAA扩增时间。

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