CN110551837A - 一种马梨形虫病巢式pcr检测方法 - Google Patents

一种马梨形虫病巢式pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种马梨形虫病巢式PCR检测方法，包括如下步骤：（1）对马梨形虫病两种病原18S核糖体RNA编码基因进行保守性分析，选择保守区域设计两对引物，（2）待测DNA的提取；（3）将步骤（2）中提取的DNA为模板，使用步骤（1）中所设计的外侧引物配制PCR反应体系；PCR产物进行电泳检测，在1036bp区域若无目的条带则进行第二次扩增；（4）将步骤（3）第一轮巢式PCR产物作为模板，使用步骤（1）中所设计的外侧引物配制PCR反应体系；PCR产物进行电泳检测，在370bp区域是否出现目的条带，若出现则判定为阳性。本方法具有很强的特异性和较好的抗干扰性，可靠性高，实用性强。

Description

一种马梨形虫病巢式PCR检测方法
技术领域
本发明涉及一种马梨形虫病的检测方法，具体为一种马梨形虫病巢式PCR检测方法。.
背景技术
马梨形虫病(Equine Piroplasmosis，EP)，是一种由梨形虫寄生于马属动物的红细胞 中，引发马属动物发生一系列临床症状甚至死亡的血液原虫病。本病的主要临床特点是急性 溶血性贫血，其他特点包括高热，呼吸困难，贫血和黄疸。
马梨形虫病的命名，来源于梨形虫在红细胞内复制时所展现的类似“梨子型”的形态外 观。研究发现感染马属动物、导致马梨形虫病发生的梨形虫病原体包括顶复亚门(Apicomplexa)孢子虫纲(Sporozoasida)梨形虫亚纲(Piroplasmasina)的巴贝斯虫科(Babesiidae)的驽巴贝斯虫(Babesia caballi)和归属于泰勒虫科(Theileriidae)的 马泰勒虫(Theileria equi)，这两种虫体主要靠中间宿主“硬蜱”的叮咬感染马属动物。
马梨形虫病呈世界性分布，主要集中在热带，亚热带和一些温带地区。研究表明该病的 分布区域与硬蜱的活动范围密切相关。
马梨形虫病给马属动物，特别是给马带来的危害十分严重。当马感染梨形虫时，不仅会 导致患病马匹流产、身体机能下降、甚至会导致患畜死亡，对马的养殖产业造成的巨大的经 济损失；还会因检疫不合格影响马在进出口贸易或参加国际马术运动项目等有关方面受到限 制。
近年来，国内外学者对其建立了显微镜检测技术、等温扩增技术、荧光抗体试验、普通 PCR诊断，SYBRGreen实时荧光定量PCR等技术对马梨形虫病进行检测。普通PCR方法成本较低， 操作方便，得到了广泛应用。但普通PCR诊断存在灵敏度较低的问题，马梨形虫病会存在一 定的潜伏期，普通PCR灵敏度较差，易造成漏检。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种快速简便的马梨形虫病巢式PCR检测方法，其具有特异性强、灵敏度高的特点，且成本较低，检测周 期短，有良好的应用前景
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种马梨形虫病巢式PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)对马梨形虫病两种病原18S核糖体RNA编码基因进行保守性分析，选择保守区域设计两对引物，外侧引物：18S-OUT-F；18S-OUT-R；内侧引物：18S-IN-F；18S-IN-R；
(2)待测DNA的提取；
(3)将步骤(2)中提取的DNA为模板，使用步骤(1)中所设计的外侧引物配制PCR 反应体系；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s， 35个循环，72℃延伸6min，PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，在1036bp区域 是出现目的条带，若无目的条带则进行第二次扩增；
(4)将步骤(3)第一轮巢式PCR产物作为模板，使用步骤(1)中所设计的外侧引物配制PCR反应体系；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性15s，56℃退火15s， 72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸6min，PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测， 在370bp区域是否出现目的条带，若出现则判定为阳性。
所述的步骤(1)中，引物序列为
18S Out-F：CACATCTAAGGAAGGCAGCA
18S Out-R：CAGGACATCTAAGGGCATCA
18S In-F：TTGGAGGGCAAGTCTGGT
18S In-R：TTTCGCAGTAGTTCGTCTTT。
所述的步骤(2)中，使用真空抗凝管于待测马颈部静脉采血，离心30分钟，取白细胞 层处血液，使用DNA提取试剂盒提取DNA，测定浓度备用。
所述的步骤(3)中，PCR反应体系20μl，其中Ex Taq 10μL，18S Out-F、18S Out-R各0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O补足余量。
所述的步骤(4)中，PCR反应体系20μl，其中Ex Taq10μL，18S In-F与18S In-R各0.5μL，DNA模板0.5μL，ddH2O补足余量。
本发明的优点及有益效果为：(1)本发明所提供的巢式PCR检测引物是针马梨形虫病病 原，马泰勒虫及驽巴贝斯虫的18S核糖体RNA编码基因序列设计出的4条特异性引物，通 过实验验证，采用该引物的巢式PCR检测方法其具有很强的特异性和较好的抗干扰性。
(2)本方法可靠性高，实用性强，可用于对组织样本、血清、血浆等样本的检测，适用 于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。
巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增目的片段。经过两次PCR扩 增，可以极大程度的提高普通PCR的灵敏度，且二次PCR引物发生非特异性结合的概率极低。 18S核糖体RNA在物种内具有很好的保守性，可作为诊断马梨形虫病的靶基因。
附图说明
图1为本发明特异性试验结果示意图。
图2为本发明临床样本检测结果示意图。
图1中，M：DL2000DNA Marker；1：马梨形虫病标准阳性样本；2：中华泰勒虫样本；3：马梨形虫病阴性样本；4：空白对照。
图2中，Marker：DL2000DNA Marker；1-20：临床样本；21：阴性样本；22：空白对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：下面将结合实施例对本发明做进一步的描述，但并不是限制本发明的范围，仅作 示例说明。
实施例1
马梨形虫病巢式PCR检测方法的建立。
(1)引物设计，对马梨形虫病两种病原18S核糖体RNA编码基因进行保守性分析，选择保守区域设计两对引物，分别为外侧引物18S Out-F、18S Out-R和内侧引物18S In-F、
18S In-R，参照表1，其序列如下：
18S Out-F：CACATCTAAGGAAGGCAGCA
18S Out-R：CAGGACATCTAAGGGCATCA
18S In-F：TTGGAGGGCAAGTCTGGT
18S In-R：TTTCGCAGTAGTTCGTCTTT
(2)采样与DNA提取，使用真空抗凝管于待测马颈部静脉采血，离心30分钟，取白细胞层处血液200μL使用DNA提取试剂盒提取DNA，测定浓度备用。
(3)PCR扩增与电泳检测，
A：用外侧检测引物18S Out-F、18S Out-R进行第一次PCR扩增。按照表2所示配 制反应体系，PCR反应体系(20μl)为Ex Taq 10μL，18S Out-F、18S Out-R各0.5μL，DNA 模板1μL，ddH2O补足余量；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性15s，56℃退火 15s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸6min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检 测，若无1036bp条带则进行第二次扩增。
B：用内侧检测引物18S In-F、18S In-R对第一次扩增产物模板进行第二次扩增。按 照表3所示配制反应体系，PCR反应体系(20μl)为：Ex Taq10μL，18S In-F与18S In-R各0.5μL，DNA模板0.5μL，ddH2O补足余量；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性 30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环，72℃延伸6min。PCR产物用0.8％的琼脂糖 凝胶进行电泳检测是否有370bp条带。
(4)结果分析，根据巢式PCR扩增结果判定：在第一次PCR扩增后电泳检测到目标条带则报告为阳性，且检测样本带毒量较高；第二次PCR扩增后电泳检测到目标条带的也判断为阳性，两巢式PCR后检测均无目的条带的则报告为阴性。
实施例2
巢式PCR引物特性检测。
(1)特异性试验：按10倍梯度稀释，将标准阳性质粒稀释成不同浓度(1×10-1至1×10-9ng/μL)的模板进行巢式PCR扩增，来确定能检测到的最低检测效率并 计算拷贝数。
根据所对应条带亮度确定最终检测浓度所对应的模板浓度，通过使用拷贝数 计算公式计算出本试验所建立的马梨形虫病套式PCR检测方法的最低检测效 率。
使用马梨形虫病的标准阳性样本、中华泰勒虫DNA样本，并用马梨形虫病 阴性样本作为对照组，来进行套式PCR扩增试验，来评价试验的特异性。试验 结果见图1。
(2)敏感性试验：对实施例2所获得的阳性质粒进行10倍倍比稀释，选取各稀释度质 粒当做模板用引物18S Out-F、18S Out-R进行第一次PCR扩增，PCR产物用0.8％琼脂糖胶检测，第一次PCR扩增电泳结果显示，外侧引物可检测到1x10-5，且扩增特异性好。扩 增产物作为相应梯度的模板用引物18S In-F、18S In-R做第二次PCR扩增，扩增产物用 0.8％琼脂糖胶进行检测，结果如图2所示，经过巢式PCR两次扩增后所能检测到的最低质 粒浓度为1x10-5ng/μL。
表1巢式PCR引物序列及位置
表2巢式PCR第一轮反应体系
表3巢式PCR第二轮反应体系

Claims (5)

1.一种马梨形虫病巢式PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)对马梨形虫病两种病原18S核糖体RNA编码基因进行保守性分析，选择保守区域设计两对引物，外侧引物：18S-OUT-F；18S-OUT-R；内侧引物：18S-IN-F；18S-IN-R；
(2)待测DNA的提取；
(3)将步骤(2)中提取的DNA为模板，使用步骤(1)中所设计的外侧引物配制PCR反应体系；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸6min，PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，在1036bp区域是出现目的条带，若无目的条带则进行第二次扩增；
(4)将步骤(3)第一轮巢式PCR产物作为模板，使用步骤(1)中所设计的外侧引物配制PCR反应体系；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸6min，PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，在370bp区域是否出现目的条带，若出现则判定为阳性。
2.根据权利要求1所述的一种马梨形虫病巢式PCR检测方法，其特征在于所述的步骤(1)中，引物序列为：
18S Out-F：CACATCTAAGGAAGGCAGCA
18S Out-R：CAGGACATCTAAGGGCATCA
18S In-F：TTGGAGGGCAAGTCTGGT
18S In-R：TTTCGCAGTAGTTCGTCTTT。
3.根据权利要求1所述的一种马梨形虫病巢式PCR检测方法，其特征在于所述的步骤(2)中，使用真空抗凝管于待测马颈部静脉采血，离心30分钟，取白细胞层处血液，使用DNA提取试剂盒提取DNA，测定浓度备用。
4.根据权利要求1所述的一种马梨形虫病巢式PCR检测方法，其特征在于所述的步骤(3)中，PCR反应体系20μl，其中Ex Taq 10μL，18S Out-F、18S Out-R各0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O补足余量。
5.根据权利要求1所述的一种马梨形虫病巢式PCR检测方法，其特征在于所述的步骤(4)中，PCR反应体系20μl，其中Ex Taq10μL，18S In-F与18S In-R各0.5μL，DNA模板0.5μL，ddH2O补足余量。
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